CN104955960A - 用于修饰的核苷酸的氧化剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及金属(Ⅵ)氧基络合物的对催化将多核苷酸中的5hmC残基选择性氧化为5fC残基的用途。这可能对从包含样本核苷酸序列的多核苷酸群体中识别修饰的胞嘧啶残基是非常有用的。用金属(Ⅵ)氧基络合物氧化所述群体的第一部分，然后用重亚硫酸盐处理所述群体的第一部分和第二部分。处理后识别对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的第一部分和第二部分中的残基，然后用这些残基的类别测定样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基的修饰。提供了方法、试剂和试剂盒。

Description

用于修饰的核苷酸的氧化剂
本发明涉及尤其是氧化剂的试剂，用于检测修饰的胞嘧啶残基、以及分析和/或测序包含修饰的胞嘧啶残基的核酸。
5-甲基胞嘧啶(5mC)是充分研究的、在基因沉默和基因组稳定性中起重要作用的表观遗传DNA标记，并发现其富集于CpG二核苷酸中(1)。在后生动物中，5mC可通过10-11易位(TET)家族的酶被氧化成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)(2,3)。5hmC的整体水平大概比5mC的整体水平低10倍，并在组织之间变化(4)。相对高数量的5hmC(所有胞嘧啶～0.4％)存在于胚胎干(ES)细胞中，其中5hmC被认为在建立和/或维护多能性中发挥作用(2,3,5-9)。5hmC已被提议在活跃的DNA脱甲基中作为中间体，例如通过脱氨基，或经由利用TET酶进一步将5hmC氧化为5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5cC)、随后是涉及胸腺嘧啶-DNA糖基酶(TDG)的碱基切除修复或在复制中未被保持标记(10)。然而，5hmC本身也可构成表观遗传标记。
在总基因组DNA中，通过包括薄层色谱法和液相色谱-串联质谱法的分析方法检测和定量5hmC的水平是可能的(2,11,12)。因此，映射5hmC的基因组位置迄今为止是通过富集法实现的，该富集法采用用于DNA片段的5hmC特异性沉淀的化学物质或抗体，然后对DNA片段进行测序(6-8、13-15)。这些拉下(pull-down)方法具有相对较差的分辨率(10s至100s的核苷酸)，并且只给出相对的定量信息，这在富集中有可能受到分布式偏见。可量化的5mC的单核苷酸序列已使用重亚硫酸盐测序(BS-Seq)完成，所述重亚硫酸盐测序利用重亚硫酸盐介导的脱氨基作用将胞嘧啶转化为尿嘧啶，对应于这种脱氨基作用的5mC的转化是较慢的(16)。但是，人们已经认识到，5mC和5hmC在重亚硫酸盐反应中脱氨基都是很慢的，因此这两个碱基不能够被区分(17，18)。两个相对新的和简洁的单分子方法在单核苷酸分辨率中检测5mC和5hmC时显示出希望。单分子实时测序(SMRT)已经示出能在基因组DNA中检测衍生的5hmC(19)。然而，必须对包含5hmC的DNA片段进行富集，但该富集将导致定量信息损失(19)。即使SMRT具有较低的精确度(19)，但仍可通过其检测5mC。此外，SMRT具有相对高的测序错误比率(20)，且修饰的峰值呼叫(calling)是不精确的(19)，并且平台还不能测序整个基因组。蛋白质和固态纳米孔可以溶解5hmC中的5mC，并且，利用进一步的开发，有可能测序未扩增的DNA分子(21,22)。
已经报道了使用“氧化重亚硫酸盐”测序(“oxidative bisulfite”sequencing)(oxBS-Seq)的方法(23)在单核苷酸分辨率上对基因组DNA中的5hmC和5mC进行定量映射。这些方法涉及使用高钌酸钾(KRuO4)将5hmC特异性氧化为5fC。
本发明的发明人已经意识到例如为钌酸根的金属(Ⅵ)氧基络合物(metal(Ⅵ)oxo complexe)在催化将多核苷酸中的5hmC残基选择性氧化为5fC残基时是有用的。例如，这在“氧化重亚硫酸盐”分析和测序的方法中可能是有用的。
一方面，本发明提供了一种识别样本核苷酸序列中修饰的胞嘧啶残基的方法，所述方法包括：
(ⅰ)提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，
(ⅱ)用金属(Ⅵ)氧基络合物处理所述群体的第一部分，
(ⅲ)用重亚硫酸盐处理所述群体的所述第一部分和所述群体的第二部分，然后
(ⅳ)识别对应于所述样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述群体的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中的残基。
在某些实施例中，所述残基可通过测序被识别。例如，一种识别样本核苷酸序列中修饰的胞嘧啶残基的方法，所述方法可以包括：
(ⅰ)提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，
(ⅱ)用金属(Ⅵ)氧基络合物处理所述群体的第一部分，
(ⅲ)用重亚硫酸盐处理所述群体的所述第一部分和所述群体的第二部分，
(ⅳ)在步骤ⅱ)和步骤ⅲ)之后，测序所述群体的第一部分和第二部分中的多核苷酸，以分别产生第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，然后
(ⅴ)识别对应于所述样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列中的残基。
合适的测序方法在本领域中是已知的，并在下文详细描述。
在第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中被识别的残基可以表明样本核苷酸序列中对应位置处的修饰的胞嘧啶，即，样本核苷酸序列中某一位置处的修饰的胞嘧啶的存在可以根据位于第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中相同位置处的残基的类别(identity)来测定。
例如，胞嘧啶残基可以存在于样本核酸序列中一个或多个位置处。在第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的对应位置处的残基可以被识别。可以由样本核苷酸序列中胞嘧啶所在位置处的分别在第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中被识别的残基的组合(即C和C、U和U、C和U、或者U和C)来测定样本核苷酸序列中胞嘧啶上例如5-取代的修饰的存在，例如5-甲基或5-羟甲基取代。通过不同组合所表明的胞嘧啶的修饰如表1所示。
用金属(Ⅵ)氧基络合物进行处理能将多核苷酸的第一部分中的5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)残基氧化为5-甲酰基胞嘧啶(5fC)残基。随后通过步骤(ⅲ)的重亚硫酸盐处理能将多核苷酸的第一部分中的5fC残基转化为尿嘧啶。在一些实施例中，用金属(Ⅵ)氧基络合物进行处理可以进一步将一些或所有5-甲酰基胞嘧啶(5fC)残基氧化为5-羧基胞嘧啶(5caC)残基。通过步骤(ⅲ)的重亚硫酸盐处理也能将多核苷酸的第一部分中的5caC残基转化为尿嘧啶。
金属(Ⅵ)氧基络合物包括与一个或多个氧原子相配位的+6价氧化态的金属原子(M)。
金属(Ⅵ)原子可以是三配位的或四配位的，即M6+原子可以与三个氧原子相配位(例如氧化铼Rh(VI)O3)，或在含氧阴离子中与四个氧原子相配位(例如钌酸根Ru(VI)O4 2-)。
在优选实施例中，金属(Ⅵ)原子在含氧阴离子(MO4 2-)中与四个氧原子相配位，优选以四面体构型相配位。合适的金属(Ⅵ)氧基络合物包括锰酸根(Mn(VI)O4 2-)、高铁酸根(Fe(VI)O4 2-)、锇酸根(Os(VI)O4 2-)、钌酸根(Ru(VI)O4 2-)或钼酸根(Mo(VI)O4 2-)。
在一些优选实施例中，金属(Ⅵ)氧基络合物为钌酸根(Ru(VI)O4 2-)或锰酸根(Mn(VI)O4 2-)，更优选为钌酸根(Ru(VI)O4 2-)。
可以通过任意合适的技术制备金属(Ⅵ)氧基络合物，并且本领域中多种方法都是可用的。
例如，在氧化羟甲基胞嘧啶(hmC)时适合使用的金属(Ⅵ)氧基络合物(M(VI)O4 2-)可以通过相应的金属(VII)氧基络合物或金属(VIII)氧基络合物(例如M(VII)O4 -或M(VIII)O4)的还原来制备。可以采用任何合适的还原方法，例如加热或使用氢氧化物或过氧化离子进行处理。适合的金属(Ⅵ)氧基络合物(M(VI)O4 2-)也可以通过金属氧化物和氧基络合物(例如MO2)的氧化来制备。
例如，可以通过还原过钌酸根(Ru(VII)O4 -)或四氧化钌(Ru(VIII)O4)很方便地制备钌酸根(Ru(VI)O4 2-)，例如使用碘化物、氢氧根(OH-)、过氧根(O2 2-)或通过加热来还原。还可以通过钌化合物的氧化很方便地制备钌酸根，例如使用KMnO4或HClO(次氯酸)来氧化。也可以由三氧化钌(RuO3)制备钌酸根(Ru(VI)O4 2-)，例如使用碱水和过硫酸盐来氧化。
可以通过使用氢氧根(OH-)、过氧根(O2 2-)或加热来还原高锰酸根(Mn(VII)O4 -)从而很方便地制备锰酸根(Mn(VI)O4 2-)。
可以通过使用氢氧根来还原Os(VIII)O4从而制备锇酸根([Os(VI)O4(OH)2]2-)，(Os(VIII)O4+2OH-->[Os(VI)O4(OH)2]2-)。
可以通过加热充满硝酸钾的铁屑、或在碱性条件下加热氢氧化铁(Ⅲ)和次氯酸盐、或通过碱性次氯酸氧化硝酸铁来制备高铁酸根(Fe(VI)O4 2-)。
可以通过在碱中分解三氧化钼来制备钼酸根(Mo(VI)O4 2-)，(MoO3+2NaOH→Na2MoO4·2H2O)。
下文会更详细地描述用于制备钌(Ⅵ)氧基络合物和锰(Ⅵ)氧基络合物的合适方法的实施例。
还可以由商业来源(例如，阿法埃莎(Alfa Aesar)，马萨诸塞州MA，美国USA；西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)，美国)获得金属(Ⅵ)氧基络合物。
用金属(Ⅵ)氧基络合物进行处理，以选择性地将多核苷酸群体的第一部分的5-羟甲基胞嘧啶残基氧化为5-甲酰基胞嘧啶残基。在多核苷酸中，基本上没有其它官能团被金属(Ⅵ)氧基络合物氧化。因此，所述处理没有导致所存在的任何胸腺嘧啶或5-甲基胞嘧啶残基进行反应。
可以用充足浓度的金属(Ⅵ)氧基络合物处理多核苷酸的第一部分，以选择性氧化多核苷酸中5-羟甲基胞嘧啶残基。可以使用标准技术很容易地测定用于选择性氧化5-羟甲基胞嘧啶的金属(Ⅵ)氧基络合物的合适浓度。例如，可以采用0.1mM至10mM，更优选大约1mM的钌酸根。
典型地，用于本文所述方法的金属(Ⅵ)氧基络合物以浓缩的贮存液进行储备，所述贮存液的浓度例如可以是处理多核苷酸的第一部分时所用浓度的5倍、10倍、100倍、150倍或500倍。典型的贮存液可以为100mM至150mM。
通过金属(Ⅵ)氧基络合物氧化hmC残基没有将第一部分中的多核苷酸降解或损害到会阻止第一部分进行后续扩增和/或测序的程度，即，在用金属(Ⅵ)氧基络合物进行处理后，第一部分包括足够的完整无缺的或未受损害的多核苷酸以允许扩增和/或测序，即第一部分没有被完全降解。
优选地，金属(Ⅵ)氧基络合物没有引起、或只引起最低限度的第一部分中多核苷酸的降解或损害，或没有引起很大程度上的多核苷酸的降解或损害。
多核苷酸的损害或降解可以包括磷酸二酯键的裂解、5’位脱磷酸和/或脱嘌呤。用金属(Ⅵ)氧基络合物进行处理可能不会引起很大程度上的第一部分中多核苷酸的磷酸二酯键的裂解、5’位脱磷酸、脱嘧啶和/或脱嘌呤，优选地只引起最低限度的、或没有引起磷酸二酯键的裂解、5’位脱磷酸和/或脱嘌呤。
用金属(Ⅵ)氧基络合物进行处理可能导致形成一些对应的5-羧基胞嘧啶产物以及5-甲酰基胞嘧啶。这些产物的形成不会对本文所述的识别方法产生负面影响。在将5-甲酰基胞嘧啶转化为尿嘧啶所使用的重亚硫酸盐的反应条件下，观察到5-羧基胞嘧啶也被转化为尿嘧啶。可以理解的是，所提及的通过氧化5-羟甲基胞嘧啶而获得的5-甲酰基胞嘧啶可以是还包含有也通过氧化5-羟甲基胞嘧啶而获得的5-羧基胞嘧啶的产物。
有利地，处理条件还可以使多核苷酸维持在变性状态，即可以采用变性条件。合适的条件能在没有引起多核苷酸损害或降解的情况下引起变性。例如，可以在碱性条件下，例如50mM至500mM的NaOH或50mM至500mM的KOH条件下，用金属(Ⅵ)氧基络合物处理多核苷酸。
在用金属(Ⅵ)氧基络合物处理之后，可以对第一部分的多核苷酸进行纯化。可以使用任何合适的核酸纯化技术进行纯化。合适的核酸纯化技术包括旋转柱层析(spin-column chromatography)。
多核苷酸可以经受进一步的、用金属(Ⅵ)氧基络合物处理的重复处理。进行这样的步骤以最大化地将5-羟甲基胞嘧啶转化为5-甲酰基胞嘧啶。这对多核苷酸具有足够的、能够进行再热处理的二级结构可能是必要的。多核苷酸的任何热处理过的部分均可以限制或阻止金属(Ⅵ)氧基络合物进入到那部分的结构中，这具有保护5-羟甲基胞嘧啶免受氧化的效果。
在一些实施例中，多核苷酸群体的第一部分例如可以经受用金属(Ⅵ)氧基络合物处理、然后进行纯化的多个循环。例如，可以进行一个、两个、三个或三个以上这样的循环。
在用金属(Ⅵ)氧基络合物处理之后、或者在用金属(Ⅵ)氧基络合物处理并进行纯化之后，再用重亚硫酸盐处理所述群体的第一部分。也用重亚硫酸盐处理还未被氧化的所述群体的第二部分。
重亚硫酸盐处理将多核苷酸中的胞嘧啶和5-甲酰基胞嘧啶酰基都转化为尿嘧啶。如上所述，当存在有任何5-羧基胞嘧啶(作为氧化步骤的产物)时，在重亚硫酸盐处理中也能将这种5-羧基胞嘧啶转化为尿嘧啶。在不希望受理论约束的情况下，可以认为：持续进行5-甲酰基胞嘧啶反应以通过减少甲酰基来产生胞嘧啶，然后进行后续去氨基以形成尿嘧啶。5-羧基胞嘧啶被认为经过一系列去羧基和去氨基步骤后形成尿嘧啶。可以在本文所述多核苷酸中的胞嘧啶和5-甲酰基胞嘧啶或5-羧基胞嘧啶残基都被转化为尿嘧啶的条件下进行重亚硫酸盐处理。
可以通过与重亚硫酸根离子(HSO3 2-)一起保温(incubation)来用重亚硫酸盐处理多核苷酸。使用重亚硫酸根离子(HSO3 2-)将核酸中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶在本领域中是常规的，并且合适的试剂和条件对本领域技术人员均是已知的(52-55)。许多合适的协议和试剂也是市售可得的(例如，EpiTectTM、Qiagen NL；EZ DNA甲基化TM酶研究公司，加拿大；极速重亚硫酸盐处理试剂盒(CpGenome Turbo BisulfiteModification Kit)；密理博(Millipore))。
OxBS方法的特点是能将未甲基化的胞嘧啶(可以由5-甲酰基胞嘧啶或5-羧基胞嘧啶原位产生)转化为尿嘧啶。通过使用重亚硫酸盐可以典型地实现这一反应。然而，在本发明的一般方面中，可以使用任何试剂或反应条件来影响胞嘧啶至尿嘧啶的转化。选择这样的试剂和条件以便使很少的5-甲基胞嘧啶进行反应、或没有5-甲基胞嘧啶进行反应，更具体地，以便使很少的5-甲基胞嘧啶反应而形成尿嘧啶、或没有5-甲基胞嘧啶反应形成尿嘧啶。该试剂或者其它试剂还可以影响5-甲酰基胞嘧啶或5-羧基胞嘧啶至胞嘧啶或尿嘧啶的转化。
在多核苷酸的一部分与重亚硫酸根离子一起保温后，可以对多核苷酸的这部分进行固定、洗涤、脱磺酸基、洗脱和/或所需的其它处理。
如本文所述的使用金属(Ⅵ)氧基络合物的方法可以用于识别和/或辨别样本核苷酸序列中的胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。例如，所述方法可以用于从包括胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的组中将其中一种残基从该组中的其它残基中辨别出来。
优选地，所述群体第一部分的修饰的胞嘧啶(例如5-羟甲基胞嘧啶)残基在步骤ⅱ)的氧化或还原之前是未标记的，所述标记为例如具有取代基，如葡萄糖。
将第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列中某一位置处的残基识别为第一核苷酸序列和/或第二核苷酸序列中的胞嘧啶，这表明样本核苷酸序列中那一位置处的胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。
可以在样本核苷酸序列中识别5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。在对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶的位置处，第一核苷酸序列中的尿嘧啶残基、以及第二核苷酸序列中相同位置处的胞嘧啶表明了样本核苷酸序列中那一位置处的胞嘧啶残基为5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)。
一种识别样本核苷酸序列中5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)残基、或在样本核苷酸序列中从胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶和5-甲酰基胞嘧啶(5fC)中辨别5-羟甲基胞嘧啶的方法，所述方法可以包括：
(ⅰ)提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，
(ⅱ)用金属(Ⅵ)氧基络合物处理所述群体的第一部分，
(ⅲ)进一步用重亚硫酸盐处理所述群体的所述第一部分和所述群体的第二部分，然后
(ⅳ)识别与样本核苷酸序列中胞嘧啶残基相同位置处的所述群体的第一部分和第二部分中的残基，
其中，第一部分中尿嘧啶残基的存在和第二部分中胞嘧啶的存在表明了样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基为5-羟甲基胞嘧啶。
例如，一种识别样本核苷酸序列中5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)或在样本核苷酸序列中从胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶和5-甲酰基胞嘧啶(5fC)中辨别5-羟甲基胞嘧啶的方法，所述方法可以包括：
(ⅰ)提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，
(ⅱ)用金属(Ⅵ)氧基络合物处理所述群体的第一部分，
(ⅲ)进一步用重亚硫酸盐处理所述群体的所述第一部分和所述群体的第二部分，然后
(ⅳ)在步骤ⅱ)和步骤ⅲ)之后，测序所述群体的第一部分和第二部分中的多核苷酸，以分别产生第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，然后，
(ⅴ)识别对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中的残基，
其中，第一核苷酸序列中尿嘧啶的存在和第二核苷酸序列中胞嘧啶的存在表明了样本核苷酸序列中所述胞嘧啶残基为5-羟甲基胞嘧啶。
可以在样本核苷酸序列中识别5-甲基胞嘧啶(5mC)。在对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶的位置处，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中的胞嘧啶表明了样本核苷酸序列中所述胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶(5mC)。
一种识别样本核苷酸序列中5-甲基胞嘧啶或在样本核苷酸序列中从胞嘧啶(C)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)和5-甲酰基胞嘧啶(5fC)中辨别5-甲基胞嘧啶的方法，所述方法可以包括：
(ⅰ)提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，
(ⅱ)用金属(Ⅵ)氧基络合物处理所述群体的第一部分，
(ⅲ)进一步用重亚硫酸盐处理所述群体的所述第一部分和所述群体的第二部分，然后
(ⅴ)识别与样本核苷酸序列中胞嘧啶残基相同位置处的所述群体的第一部分和第二部分中的残基，
其中，第一部分和第二部分中胞嘧啶的存在表明了样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶(5mC)。
例如，一种识别样本核苷酸序列中5-甲基胞嘧啶或在样本核苷酸序列中从胞嘧啶(C)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)和5-甲酰基胞嘧啶(5fC)中辨别5-甲基胞嘧啶的方法，所述方法可以包括：
(ⅰ)提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，
(ⅱ)用金属(Ⅵ)氧基络合物处理所述群体的第一部分，
(ⅲ)进一步用重亚硫酸盐处理所述群体的所述第一部分和所述群体的第二部分，然后
(ⅳ)在步骤ⅱ)和步骤ⅲ)之后，测序所述群体的第一部分和第二部分中的多核苷酸，以分别产生第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，然后，
(ⅴ)识别对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中的残基，
其中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中胞嘧啶的存在表明了样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶(5mC)。
在对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的位置处，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中的尿嘧啶残基表明了样本核苷酸中的胞嘧啶残基既不是5-甲基胞嘧啶也不是5-羟甲基胞嘧啶，即，所述胞嘧啶残基为未修饰的胞嘧啶或5-甲酰基胞嘧啶。
样本核苷酸序列中某一位置处的胞嘧啶修饰通过第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中所述位置处的胞嘧啶和尿嘧啶的特异性结合来表明，所述修饰的汇总示出于表1中。
可以用重亚硫酸盐处理多核苷酸群体的第一部分和第二部分，和/或同时对其进行测序、或之后对其进行测序。
在一些实施例中，对于识别或辨别样本核苷酸序列中修饰的胞嘧啶残基来说，对第二部分的处理不是必须的。例如，表1示出了对多核苷酸群体的第一部分的氧化处理或重亚硫酸盐处理就足以识别样本核苷酸序列中的5-甲基胞嘧啶。一种识别样本核苷酸序列中5-甲基胞嘧啶或在样本核苷酸序列中从胞嘧啶(C)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)和5-甲酰基胞嘧啶(5fC)中辨别5-甲基胞嘧啶的方法，所述方法可以包括：
(ⅰ)提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，
(ⅱ)用金属(Ⅵ)氧基络合物处理所述群体的第一部分，
(ⅲ)进一步用重亚硫酸盐处理群体的所述第一部分，
(ⅳ)识别与样本核苷酸序列中胞嘧啶残基相同位置处的被处理的多核苷酸第一部分中的残基(即，对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的第一部分中的残基)，
其中，在被处理的第一部分的位置中胞嘧啶的存在表明了样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶(5mC)。
例如，一种识别样本核苷酸序列中5-甲基胞嘧啶或在样本核苷酸序列中从胞嘧啶(C)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)和5-甲酰基胞嘧啶(5fC)中辨别5-甲基胞嘧啶的方法，所述方法可以包括：
(ⅰ)提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，
(ⅱ)用金属(Ⅵ)氧基络合物处理所述群体的第一部分，
(ⅲ)进一步用重亚硫酸盐处理群体的所述第一部分，
(ⅳ)在步骤ⅱ)和步骤ⅲ)之后，对所述群体的多核苷酸进行测序，以产生被处理的核苷酸序列，然后，
(ⅴ)识别对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述被处理的核苷酸序列中的残基，
其中，所述被处理的核苷酸序列中胞嘧啶的存在表明了样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶(5mC)。
在一些实施例中，根据上述任一方面或任一实施例所述的方法可以包括对已进行过氧化处理和重亚硫酸盐处理的多核苷酸的第一部分、以及已进行过重亚硫酸盐处理的多核苷酸的第二部分进行测序。
例如，该方法可以包括：
(ⅰ)提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，
(ⅱ)提供所述群体的第一部分和第二部分，
(ⅲ)用金属(Ⅵ)氧基络合物处理所述群体的第一部分，
(ⅳ)用重亚硫酸盐处理所述群体的第一部分和第二部分，
(ⅴ)在步骤ⅱ)、ⅲ)和ⅳ)之后，测序所述群体的第一部分和第二部分中的多核苷酸，以分别产生第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，然后，
(ⅵ)识别对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中的残基。
样本核苷酸序列可以是已知的或者是被测定的。样本核苷酸序列是群体中未被处理的多核苷酸(即没有被氧化、还原、重亚硫酸盐处理的多核苷酸)的序列重亚硫酸盐。在样本核苷酸序列中，修饰的胞嘧啶未与胞嘧啶辨别开来。5-甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶都表明为或识别为样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基。例如，根据上述任一方面或任一实施例所述的方法可以进一步包括：
提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体的第三部分，然后
测序第三部分的多核苷酸以产生样本核苷酸序列。
第三部分的多核苷酸序列可以通过任何合适的测序技术进行测定。
可以测定样本核苷酸序列中一个或多个胞嘧啶残基的位置。这可以通过标准序列分析进行。因为修饰的胞嘧啶没有与胞嘧啶辨别开来，所以，样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基可以是胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。
可以将第一核苷酸序列和第二核苷酸序列(即第一部分和第二部分的核苷酸序列)与样本核苷酸序列相对比。例如，在对应于样本核苷酸序列中一个或多个胞嘧啶残基的位置处，第一序列和第二序列中的残基可以被识别。
在一些实施例中，与样本核苷酸序列中胞嘧啶残基相同位置处的第一部分和第二部分的残基可以被识别。
可以根据第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中对应位置处的核苷酸(即，与第一部分和第二部分的核苷酸序列中的胞嘧啶残基相同位置处的核苷酸)的识别测定样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的修饰。
群体中的多核苷酸都包含相同的样本核苷酸序列，即，样本核苷酸序列在群体中的所有多核苷酸中都是等同的。
如本文所述，然后可以测定不同的处理对样本核苷酸序列内的胞嘧啶残基的影响。
样本核苷酸序列可以是遗传序列。例如，该序列可以包括全部或部分的基因序列，所述基因序列包括外显子、内含子、或上游或下游调节元件；或者该序列可以包括与基因无关的遗传序列。在一些实施例中，样本核苷酸序列可以包括一个或多个CpG岛。
合适的多核苷酸包括DNA，优选基因组DNA；和/或RNA，例如基因组RNA(例如哺乳动物、植物或病毒的基因组RNA)、mRNA、tRNA、rRNA和非编码RNA。
可以从细胞样本中获得或分离出包括样本核苷酸序列的多核苷酸，该细胞样本例如为哺乳动物细胞，优选人细胞。
合适的样本包括分离的细胞和组织样本，例如活体组织检查切片(biopsy)。
已在包括胚胎干细胞(ESC)和神经细胞在内的细胞类型范围内检测出包括5hmC和5fC在内的修饰的胞嘧啶残基(2，3，11，45，46)。
合适的细胞包括体细胞和生殖细胞。
合适的细胞可以处于任意的发育阶段，包括完全分化的细胞、或部分分化的细胞、或未分化的细胞、或多能细胞，包括干细胞，例如成体干细胞(adult or somatic stem cell)、胎体干细胞或胚胎干细胞。
合适的细胞还包括诱导多能干细胞(iPSC)，该诱导多能干细胞可以根据标准技术由任意类型的体细胞衍生而来。
例如，可以由下述细胞中获得或分离出包括样本核苷酸序列的多核苷酸：神经细胞(包括神经元和神经胶质细胞)、收缩肌细胞(contractile muscle cell)、平滑肌细胞、肝细胞、激素合成细胞(hormonesynthesising cell)、皮脂腺细胞、胰岛细胞、肾上腺皮质细胞、成纤维细胞、角化细胞、内皮细胞、膀胱上皮细胞、骨细胞和软骨细胞。
合适的细胞包括疾病相关的细胞，例如癌细胞，如上皮瘤(carcinoma)细胞、肉瘤细胞、淋巴瘤细胞、母细胞瘤细胞或生殖系统肿瘤细胞。
合适的细胞包括具有遗传学疾病的基因型的细胞，例如亨廷顿病、囊性纤维化、镰状细胞病、苯丙酮尿症、唐氏综合征或马方综合征。
从细胞样本中提取并分离基因组DNA和RNA的方法在本领域中是已知的。例如，可以使用任何便捷的分离技术分离基因组DNA或RNA，如苯酚/氯仿抽提及乙醇沉淀、氯化铯密度梯度离心、固相阴离子交换层析和以硅胶为基础的技术。
在一些实施例中，从细胞中分离出的整个基因组DNA和/或RNA在分离后可以直接被用作本文所述的多核苷酸群体。在其它实施例中，所分离的基因组DNA和/或RNA可以进一步经受准备步骤。
通过超声波、剪切或内切核酸酶降解等，可以将基因组DNA和/或RNA分割，以产生基因组DNA片段。如本文所述可以使用基因组DNA和/或RNA片段。合适的基因组DNA和/或RNA片段可以以大小或其它标准为基础。在一些实施例中，如本文所述可以使用部分富集在CpG岛(CGI)的基因组DNA和/或RNA片段。
基因组DNA和/或RNA可以被变性，例如通过加热或用变性试剂处理。用于基因组DNA和/或RNA变性的合适方法在本领域中是已知的。
在根据上述任一方面或任一实施例所述的方法中，为了在氧化处理和重亚硫酸盐处理、或单独的重亚硫酸盐处理之前进行测序和/或其它分析，可以改编基因组DNA和/或RNA。改编的性质取决于所采用的测序方法或分析方法。例如，对于一些测序方法，在分割基因组DNA和/或RNA之后，可以将引物结扎到所述基因组DNA和/或RNA片段的自由端。合适的引物可以包含5mC，以防止引物序列在如本文所述的氧化处理和重亚硫酸盐处理、或单独的重亚硫酸盐处理期间改变。在其它实施例中，为了在如本文所述的氧化处理和/或重亚硫酸盐处理之后进行测序，可以改编基因组DNA和/或RNA。
在分割、变性、改编和/或其它准备步骤之后，可以通过任意便捷的技术纯化基因组DNA和/或RNA。
在准备步骤之后，为了如本文所述的进一步处理，可以以合适的形式提供多核苷酸群体。例如，多核苷酸群体在如本文所述的处理之前可以是无缓冲物的水溶液。
如本文所述所使用的多核苷酸可以是单链的或双链的。
多核苷酸群体可以被划分为两个、三个、四个或更多的分离部分，每一部分都包含包括样本核苷酸序列的多核苷酸。这些部分可以独立地进行如本文所述的处理和测序。
优选地，在所述多核苷酸部分进行氧化和/或还原之前，不对所述多核苷酸部分进行处理，以向样本核苷酸序列中的5-羟甲基胞嘧啶残基加入标记或取代基，例如葡萄糖。
在根据上述任一方面或任一实施例所述的方法中，在如上所述的处理之后，可以对来自所述群体的多核苷酸第一部分和第二部分进行扩增。这可以有助于进一步的操作和/或测序。在扩增之后，保持了所述多核苷酸的第一部分和第二部分中的序列改变。合适的多核苷酸扩增技术在本领域中是已知的，并且该多核苷酸扩增技术包括聚合酶链反应(PCR)。多核苷酸第一部分和/或第二部分中某一位置处的尿嘧啶(U)残基的存在可以通过对应的被扩增的多核苷酸中那一位置处的胸腺嘧啶(T)的存在来表明或识别。可选地，多核苷酸部分可以在扩增前被纯化。
如上所述，在步骤ⅱ)和步骤ⅲ)之后，通过对所述群体的第一部分和第二部分的多核苷酸进行测序以分别产生第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，可以识别与样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基相同位置处的多核苷酸第一部分和第二部分中的残基。在氧化、还原和/或重亚硫酸盐处理后，可以改编多核苷酸以使其与测序技术或测序平台相兼容。改编的性质将取决于测序技术或测序平台。例如，对于索来萨-启迪(Solexa-llumina)测序，被处理的多核苷酸可以是被分割的多核苷酸(例如通过超声波或限制性内切酶处理进行分割)，且根据需要对多核苷酸的自由端进行修复，且将引物结扎到所述自由端。
可以使用任何便捷的低通量或高通量测序技术或测序平台对多核苷酸进行测序，包括桑格(Sanger)测序(38)、索来萨-启迪测序(39)、以结扎为基础的(Ligation-based)测序(SOLiDTM)(40)、焦磷酸测序(41)、单分子实时测序(SMRTTM)(42，43)和半导体阵列测序(Ion TorrentTM)(44)。
用于多核苷酸测序的合适协议、试剂和设备在本领域中是已知的，且在市场上可获得。
与样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基位于相同位置处的多核苷酸的第一部分和第二部分中的残基可以通过以杂交为基础的技术来识别。
在一些实施例中，可以使用特异性寡核苷酸探针识别残基，所述寡核苷酸探针以与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基位于相同位置处的胞嘧啶杂交至多核苷酸，但不能以这一位置处的任何其它残基杂交至多核苷酸；或者，以与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基位于相同位置处的尿嘧啶(或胸腺嘧啶)杂交至多核苷酸，但不能以这一位置处的任何其它残基杂交至多核苷酸。例如，可以通过下述步骤识别第一部分和第二部分的残基：
a)使所述群体的第一部分和第二部分的多核苷酸与检测寡核苷酸接触，
其中，所述检测寡核苷酸只特异性杂交至下列中的一个：ⅰ)在与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基相同的位置处具有胞嘧啶的所述部分的多核苷酸，和ⅱ)在与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基相同的位置处具有尿嘧啶的所述部分的多核苷酸中的一个；然后，
b)测定所述检测寡核苷酸至第一部分和第二部分中的多核苷酸的杂交。
检测寡核苷酸至多核苷酸的杂交的存在或数量表明对应于样本核苷酸序列的胞嘧啶残基的所述群体的第一部分和第二部分中的残基的类别。
在一些实施例中，可以应用两种或多种检测寡核苷酸。例如，一种方法可以包括使所述群体的第一部分和第二部分的多核苷酸与下述接触：
ⅰ)第一检测寡核苷酸，所述第一检测寡核苷酸特异性杂交至在与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基相同的位置处具有胞嘧啶的所述部分的多核苷酸；和
ⅱ)第二检测寡核苷酸，所述第二检测寡核苷酸特异性杂交至在与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基相同的位置处具有尿嘧啶的所述部分的多核苷酸；然后
b)测定第一检测寡核苷酸和第二检测寡核苷酸至第一部分的多核苷酸和第二部分的多核苷酸的杂交，
其中，第一检测寡核苷酸和第二检测寡核苷酸的杂交的存在或数量表明在与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基相同位置处的所述群体的第一部分和第二部分中的残基的类别。例如，第一检测寡核苷酸杂交而第二检测寡核苷酸未杂交表明残基为胞嘧啶，而第二检测寡核苷酸杂交而第一检测寡核苷酸未杂交则表明残基为尿嘧啶。
用于通过杂交识别核苷酸残基的合适协议、试剂和设备在本领域中是已知的且是市售可得的。合适技术包括动态等位基因特异性杂交(26)、分子信标(27)、以阵列为基础的技术(28)和TaqmanTM(36)。
在一些实施例中，可以使用杂交至第一部分和第二部分的多核苷酸的寡核苷酸探针识别第一部分和第二部分的残基。在杂交后，可以测定在对应于样本核苷酸序列的胞嘧啶残基的多核苷酸中对应位置处探针与多核苷酸之间的碱基错配的存在与否。例如，可以通过下述步骤识别第一部分和第二部分中的残基：
a)使所述群体的第一部分和第二部分的多核苷酸与特异性杂交至所述多核苷酸的检测寡核苷酸接触；然后
b)测定在样本核苷酸序列的胞嘧啶残基的所在位置处检测寡核苷酸与多核苷酸之间的碱基错配的存在与否。
可以通过任何合适的技术测定碱基错配。用于识别碱基错配的合适协议、试剂和设备在本领域中是已知的，且包括瓣状核酸内切酶和入侵检测(Invader assay)(32)、引物延伸分析(28)、寡核苷酸连接分析(28，37)，变性高效液相色谱法(DHPLC)和错配特异性核酸内切酶裂解(47，49，50，51)。
在一些实施例中，可以采用引物延伸技术去识别与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基相同位置处的多核苷酸的第一部分和第二部分中的残基。例如，一种方法可以包括：
a)使所述群体的第一部分和第二部分中的多核苷酸与检测寡核苷酸接触，所述检测寡核苷酸直接杂交至样本核苷酸序列的胞嘧啶残基的3’位多核苷酸；
b)延伸杂交的检测寡核苷酸以整合与多核苷酸中的残基互补的核苷酸，所述多核苷酸的残基与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基位于相同位置处；然后，
c)测定被整合的核苷酸的类别。
用于引物延伸分析的合适协议、试剂和设备在本领域中是已知的，且包括Infinium HD(启迪；33)和阵列引物延伸(APEX)(28,34,35)。
在一些实施例中，可以采用特异性扩增技术来识别对应于样本核苷酸序列的胞嘧啶残基的、多核苷酸的第一部分和第二部分中的残基。可以使用扩增引物来扩增第一部分和第二部分的多核苷酸，其中，只有当胞嘧啶残基存在于多核苷酸中与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基相同的位置处、而不是其它残基存在于这一位置时，所述扩增引物才会产生扩增产物；或者，只有当尿嘧啶残基存在于多核苷酸中与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基相同的位置处、而不是其它残基存在于这一位置时，所述扩增引物才会产生扩增产物。例如，一种方法可以包括：
a)用一种或多种扩增引物使所述群体的第一部分和第二部分进行扩增：
ⅰ)所述扩增引物扩增在对应于样本核苷酸序列的胞嘧啶残基的位置处具有胞嘧啶的所述部分的多核苷酸，以产生扩增产物，而并不扩增在这一位置处具有其它碱基的所述部分的多核苷酸；或
ⅱ)所述扩增引物扩增在对应于样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基的位置处具有尿嘧啶的所述部分的多核苷酸，以产生扩增产物，而并不扩增在这一位置处具有其它碱基的所述部分的多核苷酸；和
b)测定由所述扩增引物产生的扩增产物的存在。
合适的扩增技术在本领域中是已知的，且包括以PCR为基础的技术，例如扩增阻滞突变系统(ARMS)-PCR(29)、等位基因特异性PCR(30)、等位基因特异性扩增(ASA；31)和适配器连接介导的ASA(adaptor-ligation-mediated ASA)(48)。
在上述任一方法中，一种或多种检测寡核苷酸和/或扩增引物可以是被固定的，例如被固定在珠或阵列上。
可以采用用于识别与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基相同的位置处的多核苷酸的第一部分和第二部分中的残基的其它合适技术。例如，一种方法可以包括：
a)分割第一部分和第二部分的多核苷酸以产生第一部分和第二部分的片段，
b)测定片段的大小和/或质量，
c)由所述第一部分和第二部分的片段的大小和质量测定第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中的残基的类别。
可以通过任何合适的方法分割多核苷酸，这些合适的方法包括碱基特异性内切核酸酶技术(47,49,50,51)。用于测定多核苷酸片段的大小和/或质量的合适方法在本领域中也是已知的、且包括基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)。
在分割和检测技术中所使用的合适的协议、试剂和设备在本领域中是已知的、且包括iPLEX SNP基因分型(西格诺(Sequenom))(24,25)。
在其它实施例中，可以使用下述两者中的一个或两个来识别在与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基相同的位置处的、多核苷酸的第一部分和第二部分中的残基：(ⅰ)结合至在与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基相同的位置处具有胞嘧啶的所述部分的多核苷酸、但并不结合至在这一位置处不具有胞嘧啶的所述部分的多核苷酸的特异性结合分子(specific binding member)，和(ⅱ)结合至在与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基相同的位置处具有尿嘧啶的所述部分的多核苷酸、但并不结合至在这一位置处不具有尿嘧啶的所述部分的多核苷酸的特异性结合分子。
特异性结合分子可以与多核苷酸的第一部分和第二部分相接触，并且测定所述分子至多核苷酸的结合。这种结合的存在可以表明位于与样本核苷酸序列中胞嘧啶残基相同的位置处的多核苷酸的第一部分和第二部分中的残基的类别。
合适的特异性结合分子在本领域中是已知的，并且包括抗体分子(例如整个抗体和片段)和适配体。
在第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中的、在对应于样本核苷酸序列的胞嘧啶的位置处的残基可以被识别。
如上所述，可以根据第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中对应位置处的残基的类别来测定样本核苷酸序列中某一位置处的胞嘧啶残基的修饰。
可以测定样本核苷酸序列中胞嘧啶修饰的程度或数量。例如，可以测定样本核苷酸序列中5-羟甲基胞嘧啶和/或5-甲基胞嘧啶相对于未修饰的胞嘧啶的比例或数量。
在根据上述任一方面或任一实施例所述的方法中，多核苷酸，例如多核苷酸群体或所述群体的第一部分、第二部分和第三部分中的1个、2个或3个，可以被固定在固体支撑上。
相似地，检测寡核苷酸、扩增引物和特异性结合分子可以被固定在固体支撑上。
固体支撑是不溶性非凝胶体，该不溶性非凝胶体呈现出能够固定多核苷酸的表面。
合适的固体支撑的例子包括玻璃滑片、微孔板、薄膜或微珠。所述固体支撑可以是颗粒形式或固体形式，例如包括板、试管、珠、球、过滤器、织物、聚合物或薄膜。例如，多核苷酸可以被固定到惰性聚合物、96孔板、在核酸测序或其它研究环境中所使用的其它装置、设备或材料。将多核苷酸固定至固体支撑的表面在本领域中是已知的。在一些实施例中，固体支撑自身可以被固定。例如，微珠可以被固定在第二固体表面上。
在一些优选实施例中，第一、第二和/或第三多核苷酸可以被固定在磁珠上。这可以有助于多核苷酸在各步骤之间的纯化。
在根据上述任一方面或任一实施例所述的方法中，多核苷酸群体的第一部分、第二部分和/或第三部分可以在测序或其它分析之前被扩增。优选地，在用重亚硫酸盐处理之后扩增所述部分的多核苷酸。
用于扩增多核苷酸的合适方法在本领域中是已知的。
在扩增之后，可以对多核苷酸群体的被扩增部分进行测序或进行其它分析。在一些实施例中，可以采用特异性扩增引物，这样，被扩增部分的存在与否本身就表明了多核苷酸的部分中在位于与样本核苷酸序列的胞嘧啶残基相同的位置处的残基的类别。
使用以计算机为基础的序列分析，可以对核苷酸序列进行比较，并且可以识别在第一、第二和/或第三核苷酸序列中对应于样本核苷酸序列的胞嘧啶的位置处的残基。
可以识别胞嘧啶修饰大于阈值的核苷酸序列，例如CpG岛。例如，可以识别一个或多个超过1％、超过2％、超过3％、超过4％或者超过5％的胞嘧啶是被甲基化的核苷酸序列。
可以使用任何便捷的计算机系统和软件进行以计算机为基础的序列分析。
本发明另一方面提供了一种试剂盒，用于识别根据上述任一方面或任一实施例所述的修饰的胞嘧啶残基，尤其是5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，所述试剂盒包括：
(ⅰ)金属(Ⅵ)氧基络合物；和
(ⅱ)重亚硫酸盐试剂。
合适的金属(Ⅵ)氧基络合物和重亚硫酸盐在上文已经描述。例如，金属(Ⅵ)氧基络合物可以是锰酸根(MnO4 2-)、高铁酸根(FeO4 2-)、锇酸根(OsO4 2-)、钌酸根(RuO4 2-)或钼酸根(MoO4 2-)。
在一些优选实施例中，金属(Ⅵ)氧基络合物为钌酸根(RuO4 2-)或锰酸根(MnO4 2-)，优选钌酸根(RuO4 2-)。
可以以盐的形式提供金属(Ⅵ)氧基络合物，例如碱金属盐，如锂盐、钠盐或钾盐。优选地，可以以钾盐的形式提供金属(Ⅵ)氧基络合物。
在一些优选实施例中，试剂盒可以包括钌酸钾(K2RuO4)或锰酸钾(K2MnO4)。
可以以优选为水溶液的溶液形式提供金属(Ⅵ)氧基络合物及其盐。
所述溶液可以是在进行多核苷酸处理时被稀释至适宜工作浓度的浓缩液。
合适的金属(Ⅵ)氧基络合物溶液具有的浓度可以高于工作浓度至少2倍，例如2倍到100倍，优选大约10倍。例如，浓缩液可以包括0.1mM至10M、1mM至1M、或5mM至20M、优选大约10mM的金属(Ⅵ)氧基络合物。
优选地，金属(Ⅵ)氧基络合物的浓缩液是碱性的。例如，该溶液具有的pH可以为8至14。合适的溶液可以包括0.5M至5M的OH-。例如，金属(Ⅵ)氧基络合物可以溶解于0.5M至5M的NaOH或KOH中。
重亚硫酸盐试剂可以是重亚硫酸铵(NH4HSO3)或重亚硫酸钠(NaHSO3)。重亚硫酸盐试剂可以是溶液的形式。例如，试剂盒可以包括1M至10M的NH4HSO3或NaHSO3溶液。
试剂盒可以进一步包括对照多核苷酸群体，所述对照多核苷酸群体包括一种或多种修饰的残基，例如5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。在一些实施例中，可以将对照多核苷酸群体分割为一个或多个部分，且每个部分包括一种不同修饰的胞嘧啶残基。
一种用于识别修饰的胞嘧啶的试剂盒，所述试剂盒可以包括：一种或多种用于实施所述方法的协议和/或试剂，例如用于提供检测样本本身的工具(means)，包括DNA和/或RNA分离试剂和纯化试剂；以及样本处理容器(这种容器的构件通常为无菌的)。
例如，所述试剂盒可以进一步包括用于从细胞中分离和提取DNA或RNA的样本准备试剂。合适的样本准备试剂在本领域中是已知的，且包括固相离子交换色谱的试剂和装置。
试剂盒可以进一步包括用于结扎至多核苷酸群体分割后的末端的适配体或引物。适配体或引物的性质取决于所使用的测序方法。合适的引物可以包含有5mC，以预防所述引物序列在如上所述的氧化及重亚硫酸盐处理、或单独的重亚硫酸盐处理期间发生改变。在一些实施例中，适配体或引物可以包括例如为生物素的标记，以有助于多核苷酸的固定。
试剂盒可以进一步包括检测寡核苷酸和/或扩增引物，以用于识别对应于样本核苷酸序列的胞嘧啶的位置处的残基。所述检测寡核苷酸和/或扩增引物可以包括例如为生物素的标记，以有助于检测和/或固定。
试剂盒可以进一步包括纯化装置和纯化试剂，以用于在本文所述的处理之后识别和/或纯化多核苷酸的一部分。合适的纯化试剂在本领域中是已知的，且包括凝胶过滤柱和洗涤缓冲物。
试剂盒可以进一步包括扩增试剂，以用于在本文所述的处理之后对所述群体的第一部分、第二部分和/或第三部分进行扩增，优选进行PCR扩增。合适的扩增试剂在本领域中是已知的，且包括寡核苷酸引物、核苷酸、缓冲物和/或聚合酶。
在一些实施例中，试剂盒可以进一步包括用于固定多核苷酸的一个或多个部分的磁珠。所述磁珠可以涂覆有例如为链霉亲和素的特异性结合分子，以用于多核苷酸的附着。
试剂盒可以包括使用如上所述的识别修饰的胞嘧啶残基的方法的说明书。
试剂盒可以进一步包括一种或多种所述方法所需的其它试剂，例如缓冲液、测序试剂和其它试剂。
用于OxBs测序的方法和试剂盒发表在布斯(Booth)等(2012)的科学336934中以及PCT/GB2012/051819中，通过引用的方式将这些文献的用于所有目的的全部内容并入本文。
从本公开来看，本发明的各种进一步的方面和实施例对本领域技术人员来说将是简而易见的。
通过引用的方式将这一说明书中所提及的所有文件的全部内容并入本文。
本文所用的“和/或”被认为是明确公开了两个明确特征或成分中的每一个、或同时公开了两个。例如，“A和/或B”被认为是明确公开了下列情况中的每一种：(ⅰ)A、(ⅱ)B、(ⅲ)A和B，正如每一种均独立地在本文公开。
除非本文另有说明，否则上述所列特征的说明和限定不被限制在本发明的任何方面或任何实施例中，而是能够同等地应用到上述任一方面或任一实施例中。
以举例的方式并参照下述附图将示出本发明的某些方面和实施例。
图1示出了本发明的氧化重亚硫酸盐反应的流程图：用金属(Ⅵ)氧基络合物进行处理将5hmC氧化成5fC，然后用重亚硫酸盐处理和NaOH将5fC转化为U。R基团为DNA。
图2示出了概括了BS-Seq和oxBS-Seq技术的流程图和表格。BS-Seq包括：用重亚硫酸盐处理输入DNA，随后扩增，然后测序。oxBS-Seq包括：用金属(Ⅵ)氧基络合物处理输入DNA，然后重亚硫酸盐处理，之后扩增，随后测序。通过对比所述输入DNA，可以区分、映射并定量BS-Seq和oxBS-Seq的输出C、5mC以及5hmC。
图3示出了750μM RuO4 2-在50mM NaOH中的紫外/可见光谱。
图4示出了未氧化的核苷酸A、C、T和G的高效液相色谱法(HPLC)踪迹。
图5示出了包含三个5hmC残基的、未氧化的3H15BP寡核苷酸的HPLC踪迹。
图6示出了用Mn(VI)O4 2-氧化后的3H15BP寡核苷酸的HPLC踪迹。
图7示出了用Mo(VI)O4 2-氧化后的3H15BP寡核苷酸的HPLC踪迹。
图8示出了用Ru(VI)O4 2-氧化后的3H15BP寡核苷酸的HPLC踪迹。
表1示出了胞嘧啶和经受了各种处理的修饰的胞嘧啶的测序结果。
表2示出了胞嘧啶(1a)、5-甲基胞嘧啶(5mC；1b)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC；1c)和5-甲酰基胞嘧啶(5fC；1d)的结构。
实验
材料
制备M(Ⅵ)O 4 2- 的碱金属水溶液
从商业来源(阿法埃莎)获得尽可能最高纯度的高铁酸钾、锰酸钾、钌酸钾、脱水锇酸钾、氧化铼和钼酸钾的固体原料(stock)。
制备钌酸根(Ⅵ)
1、通过氢氧化物还原高钌酸钾(Ⅶ)。
通过将合适量的KRuO4溶解于500mM的NaOH中制备150mM的高钌酸钾溶液。通过漩涡振荡实现固体的完全溶解，得到金黄色/棕色的溶液。这一溶液在25℃下保温48小时。保温时期结束后，该溶液转变为深血红色并伴随有气体(O2)生成。
2KRuO4+2NaOH—>2KNaRuO4+H2O+1/2O2
通过紫外/可见(UV/Vis)分光光度法(图2)可以证明在48小时保温时期内已完全转变。
2、直接将钌酸钠溶解在氢氧化钠中。
对在500mM氢氧化钠中直接制备的150mM钌酸钾(Ⅵ)溶液进行检测。固体Na2RuO4是尤其不溶的，甚至在25℃下超过一周后仍不能得到在这些条件下的固体的完全溶解。获得确实溶解的轻微可溶部分的紫外/可见光谱，该紫外/可见光谱示出与文献中的钌酸盐的光谱相同，并且与通过方法1制备的钌酸盐的光谱也相同。
制备锰酸根(Ⅵ)
通过加热分解高锰酸钾(Ⅶ)
加热导致高锰酸钾固体根据下述方程式分解成锰酸盐，并伴有氧气释放：
2KMnO4—>K2MnO4+MnO2+O2
将固体K2MnO4溶解在500mM的NaOH中，得到了K2MnO4的绿色溶液。
UV/vis分光光度法
M(VI)O4 2-的某些碱性水溶液是很深色的，因此易于通过UV/vis分光光度法进行表征。
使用卡里瓦里安100型(Cary Varian 100)UV/vis分光光度计在1cm光程长(path length)的石英玻璃比色皿(1ml体积)中得到M(VI)O4 2-碱性水溶液的光谱。典型的溶液组成为50mM NaOH中750μMM(VI)O4 2-。在25℃下以1nm的分辨率在240-800nm的范围内收集紫外/可见光谱。所有的光谱都经受包括从每一个M(VI)O4 2光谱中减去50mM NaOH空白溶液的基线校正。
HPLC寡核苷酸的氧化以及消化(digest)分析
定性HPLC分析被用于将5-hmC到5-fC的氧化转化可视化。消化是将寡核苷酸切成核苷酸单体，这些核苷酸单体能够通过色谱分析法被唯一地解析(resolved)，且每个单体(A、C、G、T、U、5-fc、5-caC和5-hmC)均具有由分析条件限定的特征以及可预测的保留时间。这允许定性评估(例如)5-hmC至5-fC的氧化。
采用15个核苷酸的寡核苷酸3H15BP(5’GAGACGACGTACAGG-3’，其中C为5hmC)的100μM原料。3H15BP包含三个5-hmC残基。
寡核苷酸氧化
制备8μM 3H15BP的50mM NaOH溶液(20.75μL超纯水(MilliQwater)、1.25μL 1M NaOH、2μL 100μM 3H15BP)，并通过短暂的漩涡振荡进行混合。然后将其在37℃下保温5分钟以使任意二级结构变性，然后在冰水中快速(0℃)冷却5分钟。通过将2μL 15mMM(VI)O4 2-的50mM NaOH溶液加入到平衡的碱性寡核苷酸(oligo)溶液中，开始了氧化。一旦加入，通过短暂的漩涡振荡将氧化溶液进行混合，然后将其返回到冰水中60分钟。在所述60分钟氧化期间，在20分钟和40分钟后，通过两次漩涡振荡将所述氧化反应进行混合。在每次混合后，反应都返回到冰水中。
被氧化的寡核苷酸纯化
在60分钟氧化结束后，使用预洗的(4x 600μL超纯)罗氏寡核苷酸旋转柱(Roche oligo spin column)来纯化被氧化的寡核苷酸溶液。该旋转柱的洗脱物被用作消化反应的输入。
寡核苷酸的消化
使用消化混合物(22μL被氧化的寡核苷酸+23μL超纯水+5μL10x消化缓冲液+0.2μL消化混合物)在37℃下消化被氧化的寡核苷酸12小时。
消化混合物由156U核酸酶+100U碱性磷酸酶+0.15mU磷酸二酯酶I构成。
消化之后，通过离心使样本穿过3kDa超滤(Amicon)过滤器以从样本中除去酶。
HPLC分析
使用以1mL/min的流量流过Eclipse XDB-C183.5μm、3.0×150mm柱的安捷伦1100HPLC，通过HPLC对被消化的、被氧化的寡核苷酸进行分析。柱温维持在45度。洗脱缓冲液为缓冲液A(500mM乙酸铵(费舍尔(Fischer)pH为5)、缓冲液B(乙腈)和缓冲液C(H2O)。在整个过程中缓冲液A保持在1％，且剩余缓冲液的梯度为0min-0.5％B、2min-1％B、8min-4％B、10min-95％B。
2’-脱氧核苷酸的保留时间如下：2’-脱氧-5-羧基胞苷(1.0min)、2’-脱氧胞苷(1.8min)、2’-脱氧-5-羟甲基胞苷(2.1min)、2’-脱氧尿苷(2.7min)、2’-脱氧-5-甲基胞苷(4.0min)、2’-脱氧鸟苷(4.5min)、2’-脱氧-5-甲酰基胞苷(5.4min)、2’-脱氧胸苷(5.7min)、2’-脱氧腺苷(7.4min)。
在追踪用锰酸根、钼酸根和钌酸根进行的寡核苷酸氧化之后，HPLC分析的结果示出于图6-8中。发现钌酸根有效地将5hmC氧化成5mC。锰酸根将5hmC氧化成5mC的程度低于钌酸根。在这些条件下用钼酸根没有观察到5hmC的氧化。
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碱基 常规测序 重亚硫酸盐测序 氧化，然后重亚硫酸盐测序
C C U U
5mC C C C
5hmC C C U
表1
表2

Claims (45)

1.一种识别样本核苷酸序列中修饰的胞嘧啶残基的方法，所述方法包括：
(ⅰ)提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸群体，所述样本核苷酸序列包含胞嘧啶残基，
(ⅱ)用金属(Ⅵ)氧基络合物处理所述群体的第一部分，
(ⅲ)用重亚硫酸盐处理所述群体的所述第一部分和所述群体的第二部分，然后
(ⅳ)识别对应于所述样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述群体的第一部分和第二部分中的残基。
2.根据权利要求2所述的方法，其中，所述金属(Ⅵ)氧基络合物将所述多核苷酸群体的第一部分中的5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)残基转化为5-甲酰基胞嘧啶(5fC)残基和/或5-羧基胞嘧啶(5-caC)残基。
3.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述金属(Ⅵ)氧基络合物为具有式MO4 2-的含氧阴离子，其中，M为+6价氧化态的金属。
4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述金属(Ⅵ)氧基络合物为锰酸根(Mn(VI)O4 2-)、高铁酸根(Fe(VI)O4 2-)、锇酸根(Os(VI)O4 2-)、钌酸根(Ru(VI)O4 2-)或钼酸根(Mo(VI)O4 2-)。
5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述金属(Ⅵ)氧基络合物为锰酸根(Mn(VI)O4 2-)。
6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述金属(Ⅵ)氧基络合物为钌酸根(Ru(VI)O4 2-)。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，步骤ⅱ)包括用金属(Ⅵ)氧基络合物处理多核苷酸的第一部分并对所述多核苷酸的第一部分进行纯化的多个步骤。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，通过包括下列步骤的方法识别所述第一部分和所述第二部分中的残基：
a)在步骤ⅱ)和步骤ⅲ)之后，测序所述群体的第一部分和第二部分中的多核苷酸，以分别产生第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，然后
b)识别对应于所述样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列中的残基。
9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中，通过包括下列步骤的方法识别所述第一部分和所述第二部分中的残基：
a)使所述群体的第一部分和第二部分中的多核苷酸与检测寡核苷酸接触，
其中，所述检测寡核苷酸特异性杂交至下列中的一个：ⅰ)在对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的位置处具有胞嘧啶的所述部分的多核苷酸，和ⅱ)在对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的位置处包含有尿嘧啶的所述部分的多核苷酸，然后
b)测定所述检测寡核苷酸至所述第一部分和所述第二部分中的多核苷酸的杂交；或
测定所述检测寡核苷酸与在对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的位置处的第一部分和第二部分中的多核苷酸之间的碱基错配的存在与否；
其中，所述检测寡核苷酸的杂交、或碱基错配的存在或存在与否表明对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述群体的第一部分和第二部分中的残基的类别。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法包括：
a)使所述群体的第一部分和第二部分中的多核苷酸与下述接触：
ⅰ)第一检测寡核苷酸，所述第一检测寡核苷酸特异性杂交至在对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的位置处具有胞嘧啶的所述部分的多核苷酸；和
ⅱ)第二检测寡核苷酸，所述第二检测寡核苷酸特异性杂交至在对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的位置处具有尿嘧啶的所述部分的多核苷酸，
b)测定所述第一检测寡核苷酸和所述第二检测寡核苷酸至所述第一部分和所述第二部分中的多核苷酸的杂交，
其中，所述第一检测寡核苷酸和第二检测寡核苷酸的杂交表明对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述群体的第一部分和第二部分中的残基的类别。
11.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中，通过包括下列步骤的方法识别所述第一部分和第二部分中的残基：
a)使所述群体的第一部分和第二部分的多核苷酸与检测寡核苷酸杂交，所述检测寡核苷酸与样本核苷酸序列的3’位的胞嘧啶残基互补，
b)延伸所述检测寡核苷酸以整合与多核苷酸中的残基互补的核苷酸，所述多核苷酸的残基对应于样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基，然后
c)测定被整合的核苷酸的类别。
12.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中，通过包括下列步骤的方法识别所述第一部分和第二部分中的残基：
a)用一种或多种扩增引物使所述群体的第一部分和第二部分经受扩增反应，
ⅰ)所述扩增引物扩增在对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的位置处具有胞嘧啶的多核苷酸，以产生扩增产物，或者
ⅱ)所述扩增引物扩增在对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的位置处具有尿嘧啶或胸腺嘧啶的多核苷酸，以产生扩增产物；然后
b)测定通过所述扩增引物所产生的扩增产物的存在。
13.根据权利要求8-12任一项所述的方法，其中，所述检测寡核苷酸或扩增引物是被固定的。
14.根据权利要求8-12任一项所述的方法，其中，所述检测寡核苷酸或扩增引物被固定在珠或阵列上。
15.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中，通过包括下列步骤的方法识别所述第一部分和第二部分中的残基：
a)分割第一部分和第二部分的多核苷酸以产生所述第一部分和所述第二部分的片段，
b)测定所述片段的大小和/或质量，然后
c)由第一群体和第二群体的片段的大小和质量测定第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中的残基的类别。
16.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中，通过包括下列步骤的方法识别所述第一部分和第二部分中的残基：
a)使所述群体的第一部分和第二部分的多核苷酸与特异性结合分子接触，
其中，所述特异性结合分子特异性结合至下列中的一个：ⅰ)在对应于样本核苷酸中胞嘧啶残基的位置处具有胞嘧啶的所述部分的多核苷酸，和ⅱ)在对应于样本核苷酸中胞嘧啶残基的位置处包含有尿嘧啶的所述部分的多核苷酸；然后
b)测定所述特异性结合分子至所述第一部分和所述第二部分的多核苷酸的结合，
其中，所述特异性结合分子的结合表明对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的所述群体的第一部分和第二部分中的残基的类别。
17.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述群体的第一部分和第二部分是被固定的。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述群体的第一部分和第二部分被固定在珠或阵列上。
19.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，在第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中被识别的残基表明了在样本核苷酸序列中的对应位置处的修饰的胞嘧啶。
20.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述修饰的胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。
21.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，在对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的位置处，第一核苷酸序列中尿嘧啶的识别以及在第二核苷酸序列中相同位置处的胞嘧啶的识别表明所述样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。
22.根据权利要求1-21任一项所述的方法，其中，在对应于样本核苷酸序列中胞嘧啶残基的位置处，(ⅰ)第一核苷酸序列中或(ⅱ)第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中胞嘧啶的识别表明所述样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶(5mC)。
23.根据权利要求1-21任一项所述的方法，其中，在对应于样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基的位置处，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中尿嘧啶的识别表明所述样本核苷酸序列中的胞嘧啶残基为胞嘧啶5-甲酰基胞嘧啶(5fC)或5-羧基胞嘧啶(5caC)。
24.根据权利要求1-23任一项所述的方法，所述方法包括：
提供包括样本核苷酸序列的多核苷酸的所述群体的第三部分；然后，可选地，
测序所述第三部分中的多核苷酸以产生所述样本核苷酸序列。
25.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述多核苷酸为DNA。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述DNA为基因组DNA。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述基因组DNA为哺乳动物的基因组DNA。
28.根据权利要求1-24任一项所述的方法，其中所述多核苷酸为RNA。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述RNA为基因组RNA、mRNA、tRNA、rRNA或非编码RNA。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述基因组RNA为哺乳动物、植物或病毒的基因组RNA。
31.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述多核苷酸群体、或者所述群体的第一部分、第二部分和第三部分中的一个或多个是被固定的。
32.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，在步骤ⅲ)之后，扩增所述群体的第一部分、第二部分和第三部分中的一个或多个。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，在用重亚硫酸盐处理之后，扩增所述群体的第一部分、第二部分和第三部分中的一个或多个。
34.一种试剂盒，用于在根据权利要求1-33任一项所述的识别修饰的胞嘧啶残基的方法中使用，所述试剂盒包括：
(ⅰ)金属(Ⅵ)氧基络合物；和
(ⅱ)重亚硫酸盐试剂。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中，所述金属(Ⅵ)氧基络合物为锰酸根(MnO4 2-)、高铁酸根(FeO4 2-)、锇酸根(OsO4 2-)、钌酸根(RuO4 2-)或钼酸根含氧阴离子(MoO4 2-)。
36.根据权利要求34或35所述的试剂盒，其中，所述金属(Ⅵ)氧基络合物为钌酸根(RuO4 2-)。
37.根据权利要求34或35所述的试剂盒，其中，所述金属(Ⅵ)氧基络合物为锰酸根(MnO4 2-)。
38.根据权利要求32-37任一项所述的试剂盒，其中，所述金属(Ⅵ)氧基络合物为盐的形式。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中，所述盐为钠、钾、锂或其它碱金属的盐。
40.根据权利要求39所述的试剂盒，其中，所述盐为钾盐。
41.根据权利要求40所述的试剂盒，其中，所述盐为K2RuO4。
42.根据权利要求40所述的试剂盒，其中，所述盐为K2MnO4。
43.根据权利要求34-42任一项所述的试剂盒，其中，所述金属(Ⅵ)氧基络合物为碱金属水溶液。
44.根据权利要求34-43任一项所述的试剂盒，其中，所述重亚硫酸盐试剂包括重亚硫酸钠或重亚硫酸铵。
45.根据权利要求34-44任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括扩增试剂。
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