JP5919602B2 - 核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出方法及び検出キット - Google Patents
核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出方法及び検出キット Download PDFInfo
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Description
本発明は、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出方法及び検出キットに関する。
エピジェネティクスは、ゲノムを生理的に修飾するＤＮＡメチル化、ＤＮＡとタンパク質との複合体であるクロマチン、クロマチンを構成する多くのタンパク質の翻訳後修飾から成立しており、統合的に遺伝子発現を制御している。
クロマチン中のヒストンの修飾については、転写誘導の際に、ヒストン修飾によるクロマチン構造変換が重要な役割を果たす。例えば、ヒストンアセチル化酵素によるアセチル化が引き金となって、クロマチンのリモデリングが誘導され、基本転写因子とＲＮＡポリメラーゼによる転写が開始する。また、ヒストンのメチル化やリン酸化は、転写の制御、サイレンシング、クロマチン凝縮などを引き起こす。
クロマチン中のヒストンの修飾については、転写誘導の際に、ヒストン修飾によるクロマチン構造変換が重要な役割を果たす。例えば、ヒストンアセチル化酵素によるアセチル化が引き金となって、クロマチンのリモデリングが誘導され、基本転写因子とＲＮＡポリメラーゼによる転写が開始する。また、ヒストンのメチル化やリン酸化は、転写の制御、サイレンシング、クロマチン凝縮などを引き起こす。
また、多くの真核生物ではゲノム中のＣｐＧジヌクレオチドの６０−９０％が、シトシン５位炭素原子のメチル化を受けている。メチル化ＣｐＧは反復配列を多く含むヘテロクロマチンやトランスポゾンに見られており、ウイルスやトランスポゾンの活性化を抑えていると考えられる。また、ＣｐＧのメチル化とヒストン修飾とは、相互に協調している。
例外的に、多くの遺伝子のプロモーター領域にあるＣＧリッチな領域（ＣｐＧアイランド）ではメチル化を受けていない。さらにその例外として、インプリンティングされる遺伝子、女性の不活化Ｘ染色体ではＣｐＧアイランドがメチル化されている。また、がん細胞におけるがん抑制遺伝子のプロモーター領域でもＣｐＧアイランドがメチル化されている。従って、シトシンのメチル化は、癌の発生、再発、転移のマーカーとして使用することができ、遺伝子中のシトシンがメチル化されているか否かの簡単な検出方法が求められている。
このように、これまでに、ＤＮＡ中にはシトシン（Ｃ）がメチル化された５−メチルシトシンの存在が報告され、発生遺伝学的に重要な役割を果たしていることが知られていたが、新しい塩基（５−ヒドロキシメチルシトシン）が、プルキニエ細胞の研究で発見された（非特許文献１）。５−ヒドロキシメチルシトシンは、ＤＮＡ脱メチル化（初期化）のメカニズムを解く鍵と指摘されている。従って、ＤＮＡ中の５−ヒドロキシメチルシトシンの存在及びその位置を特定することは、がん・老化・再生医療など、エピジェネティクス技術に関わる全ての分野における、遺伝子機能の初期化を調べるための核心的技術として重要かつ不可欠なことである。
ＤＮＡ中のメチルシトシンを化学的に簡便に検出する方法として、種々の方法が提案されている。特許文献１には、シトシンとメチルシトシンを判別する方法が記載されている。また特許文献２には、標的ＤＮＡ中の５−メチルシトシン部位を選択的に切断し、５'断片を得、この５'断片とハイブリダイズし得るＦＲＥＴプローブおよびフラップエンドヌクレアーゼを用いて酵素反応を行い、蛍光を検出する方法が記載されている。
しかしこれらの方法を５−ヒドロキシメチルシトシンの検出にそのまま適用することはできない。
しかしこれらの方法を５−ヒドロキシメチルシトシンの検出にそのまま適用することはできない。
ＤＮＡ中の５−ヒドロキシメチルシトシンを検出する方法としては、断片化したＤＮＡサンプルを、抗５−ヒドロキシメチルシトシン抗体を用いて、従来の免疫沈降法を応用して検出する方法（非特許文献２及び３）や、５−ヒドロキシメチルシトシンを糖修飾する酵素を用いて、修飾し、分離する方法（非特許文献４）等が知られている。
しかし、いずれの方法も、ＤＮＡサンプルを予め断片化する必要があるとともに、５−ヒドロキシメチルシトシンを含む断片を分離しても、断片中の５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を特定することができないという問題がある。
しかし、いずれの方法も、ＤＮＡサンプルを予め断片化する必要があるとともに、５−ヒドロキシメチルシトシンを含む断片を分離しても、断片中の５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を特定することができないという問題がある。
従って、ＤＮＡ等の核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンを化学的に簡便に検出する方法が望まれている。
Science Vol.324, No.5929, pp.930-935 (2009)
Nature 466, 1129-1133 (2010)
Angew. Chem. Int. Ed. 49, 5375-5377 (2010)
Nature Biotechnol. 29, 68-72 (2011)
本発明の目的は、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出方法を提供することである。
本発明の他の目的は、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出キットを提供することである。
本発明の他の目的は、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出キットを提供することである。
本発明は以下に示す核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出方法及び検出キットを提供するものである。
１．下記の工程を有することを特徴とする核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出方法：
（１）核酸サンプルをタングステン酸系酸化剤で処理して存在する可能性のある５−ヒドロキシメチルシトシンを酸化する工程；及び
（２）核酸サンプル中の酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する工程。
２．タングステン酸系酸化剤が、
（１）ペルオキシタングステン酸、又はその塩
（２）タングステン酸又はその塩、及び
（３）ペルオキシタングステン酸、タングステン酸、又はそれらの塩と、再酸化剤との組み合わせ
からなる群から選ばれる少なくとも１種である上記１記載の方法。
３．タングステン酸系酸化剤が、Ｋ2［｛Ｗ（＝Ｏ）（Ｏ2）2（Ｈ2Ｏ）｝2（μ−Ｏ）］、Ｈ2ＷＯ4／Ｈ2Ｏ2、及びＫ2ＷＯ4／Ｈ2Ｏ2からなる群から選ばれる少なくとも１種であるである上記１記載の方法。
４．工程（２）が、酸化された核酸サンプルを脱アミン化処理して、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシン部位で切断し、この核酸断片の大きさを測定することにより、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する工程を含む上記１〜３のいずれか１項記載の方法。
５．工程（２）が、酸化された核酸サンプルをシーケンシングすることにより、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する工程を含む上記１〜３のいずれか１項記載の方法。
６．核酸がＤＮＡである上記１〜５のいずれか１項記載方法。
７．（１）ペルオキシタングステン酸、又はその塩、
（２）タングステン酸又はその塩、及び、
（３）ペルオキシタングステン酸、タングステン酸、又はそれらの塩と、再酸化剤との組み合わせ、
からなる群から選ばれる少なくとも１種のタングステン酸系酸化剤の、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出のための使用。
８．（１）ペルオキシタングステン酸、又はその塩、
（２）タングステン酸又はその塩、及び、
（３）ペルオキシタングステン酸、タングステン酸、又はそれらの塩と、再酸化剤との組み合わせ、
からなる群から選ばれる少なくとも１種のタングステン酸系酸化剤を含む、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出用キット。
９．さらに、酸化された核酸サンプルを脱アミン化処理するための試薬、及びｐＨ緩衝液からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む上記８記載のキット。
１．下記の工程を有することを特徴とする核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出方法：
（１）核酸サンプルをタングステン酸系酸化剤で処理して存在する可能性のある５−ヒドロキシメチルシトシンを酸化する工程；及び
（２）核酸サンプル中の酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する工程。
２．タングステン酸系酸化剤が、
（１）ペルオキシタングステン酸、又はその塩
（２）タングステン酸又はその塩、及び
（３）ペルオキシタングステン酸、タングステン酸、又はそれらの塩と、再酸化剤との組み合わせ
からなる群から選ばれる少なくとも１種である上記１記載の方法。
３．タングステン酸系酸化剤が、Ｋ2［｛Ｗ（＝Ｏ）（Ｏ2）2（Ｈ2Ｏ）｝2（μ−Ｏ）］、Ｈ2ＷＯ4／Ｈ2Ｏ2、及びＫ2ＷＯ4／Ｈ2Ｏ2からなる群から選ばれる少なくとも１種であるである上記１記載の方法。
４．工程（２）が、酸化された核酸サンプルを脱アミン化処理して、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシン部位で切断し、この核酸断片の大きさを測定することにより、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する工程を含む上記１〜３のいずれか１項記載の方法。
５．工程（２）が、酸化された核酸サンプルをシーケンシングすることにより、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する工程を含む上記１〜３のいずれか１項記載の方法。
６．核酸がＤＮＡである上記１〜５のいずれか１項記載方法。
７．（１）ペルオキシタングステン酸、又はその塩、
（２）タングステン酸又はその塩、及び、
（３）ペルオキシタングステン酸、タングステン酸、又はそれらの塩と、再酸化剤との組み合わせ、
からなる群から選ばれる少なくとも１種のタングステン酸系酸化剤の、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出のための使用。
８．（１）ペルオキシタングステン酸、又はその塩、
（２）タングステン酸又はその塩、及び、
（３）ペルオキシタングステン酸、タングステン酸、又はそれらの塩と、再酸化剤との組み合わせ、
からなる群から選ばれる少なくとも１種のタングステン酸系酸化剤を含む、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出用キット。
９．さらに、酸化された核酸サンプルを脱アミン化処理するための試薬、及びｐＨ緩衝液からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む上記８記載のキット。
本発明によれば、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの存在及びその位置を、化学的に簡便にかつ正確に検出することができる。従って、がん・老化・再生医療など、エピジェネティクス技術に関わる全ての分野における、遺伝子機能の初期化を調べるための核心的技術として極めて有用である。
本発明において「核酸」とは、図１に示すように、５−ヒドロキシメチルシトシンを構造の一部として含有し、本発明の方法により５−ヒドロキシメチルシトシンを検出することができるすべての化合物を意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸類縁体、ペプチド、上記以外の有機高分子等を意味する。特にＤＮＡが好ましい。本発明の方法は、任意の鎖長の核酸に適用できるが、好ましくは１〜１００００ｂｐ、さらに好ましくは１５〜１０００ｂｐである。
本発明に使用される「タングステン酸系酸化剤」とは、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンに選択的に作用してこれを酸化する能力を有する酸化剤であり、好ましいものは、（１）ペルオキシタングステン酸、又はその塩（例えば、カリウム塩、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩、アミン塩等）、（２）タングステン酸又はその塩（例えば、カリウム塩、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩、アミン塩等）、及び（３）ペルオキシタングステン酸、タングステン酸、又はそれらの塩と、再酸化剤との組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも１種である。
ペルオキシタングステン酸もしくはタングステン酸又はそれらの塩は、単独又は再酸化剤と組み合わせて、本発明の酸化剤として使用することができる。
ペルオキシタングステン酸もしくはタングステン酸又はそれらの塩の具体例としては、Ｋ2［｛Ｗ（＝Ｏ）（Ｏ2）2（Ｈ2Ｏ）｝2（μ−Ｏ）］、Ｈ2ＷＯ4、Ｋ2ＷＯ4、Ｎａ2ＷＯ4−ＮＨ2ＣＨ2ＰＯ3Ｈ2−［ＣＨ3（ｎ−Ｃ8Ｈ17）3Ｎ］ＨＳＯ4、［Ｃ5Ｈ5Ｎ（ｎ−Ｃ16Ｈ33）］3ＰＷ12Ｏ40、［（ｎ−Ｃ4Ｈ9）4Ｎ］2［ＰｈＰＯ3｛ＷＯ（Ｏ2）2｝］、｛ＷＺｎ［Ｍ（Ｈ2Ｏ）］2（ＺｎＷ9Ｏ34）2｝の塩（ここでのＭは、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｒｕ、Ｆｅなど）、Ｎａ2ＷＯ4−フラクトピラノシド等が挙げられる。
ペルオキシタングステン酸もしくはタングステン酸又はそれらの塩の具体例としては、Ｋ2［｛Ｗ（＝Ｏ）（Ｏ2）2（Ｈ2Ｏ）｝2（μ−Ｏ）］、Ｈ2ＷＯ4、Ｋ2ＷＯ4、Ｎａ2ＷＯ4−ＮＨ2ＣＨ2ＰＯ3Ｈ2−［ＣＨ3（ｎ−Ｃ8Ｈ17）3Ｎ］ＨＳＯ4、［Ｃ5Ｈ5Ｎ（ｎ−Ｃ16Ｈ33）］3ＰＷ12Ｏ40、［（ｎ−Ｃ4Ｈ9）4Ｎ］2［ＰｈＰＯ3｛ＷＯ（Ｏ2）2｝］、｛ＷＺｎ［Ｍ（Ｈ2Ｏ）］2（ＺｎＷ9Ｏ34）2｝の塩（ここでのＭは、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｒｕ、Ｆｅなど）、Ｎａ2ＷＯ4−フラクトピラノシド等が挙げられる。
再酸化剤の具体例としては、過酸化水素、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、フェリシアン化カリウム、過安息香酸類、酸素ガス等が挙げられる。
再酸化剤と組み合わせる場合の、ペルオキシタングステン酸もしくはタングステン酸又はそれらの塩対再酸化剤のモル比（ペルオキシタングステン酸もしくはタングステン酸又はそれらの塩／再酸化剤）は、好ましくは１／１０万〜１／１、さらに好ましくは１／１００〜１／１であり、通常は１／１０で良い。
再酸化剤と組み合わせる場合の、ペルオキシタングステン酸もしくはタングステン酸又はそれらの塩対再酸化剤のモル比（ペルオキシタングステン酸もしくはタングステン酸又はそれらの塩／再酸化剤）は、好ましくは１／１０万〜１／１、さらに好ましくは１／１００〜１／１であり、通常は１／１０で良い。
核酸の酸化処理工程
本発明において、核酸含有サンプルに本発明の酸化剤を接触させることにより、核酸中に存在する５−ヒドロキシメチルシトシンを選択的に酸化することができる。
この酸化反応では、５−ヒドロキシメチルシトシンのみが選択的に酸化され、シトシン、５−メチルシトシンは酸化されないため、５−ヒドロキシメチルシトシンのみを選択的に検出することができる。
本発明において、核酸含有サンプルに本発明の酸化剤を接触させることにより、核酸中に存在する５−ヒドロキシメチルシトシンを選択的に酸化することができる。
この酸化反応では、５−ヒドロキシメチルシトシンのみが選択的に酸化され、シトシン、５−メチルシトシンは酸化されないため、５−ヒドロキシメチルシトシンのみを選択的に検出することができる。
この酸化反応において、核酸サンプルの水溶液のｐＨは、特に制限されないが、好ましくは適当な緩衝液、例えば、リン酸ナトリウム、トリス塩酸、酢酸ナトリウム等により、好ましくはｐＨ１〜１０、さらに好ましくはｐＨ５〜９に調整することが望ましい。
また、核酸サンプルの濃度も特に制限されないが、好ましくは１０-7〜１０質量％、さらに好ましくは１０-5〜１０-1質量％である。
本発明の酸化剤の添加量も特に制限されないが、核酸サンプル１００質量部に対して、好ましくは０．１〜１０6質量部、さらに好ましくは１０2〜１０5質量部が望ましい。
酸化反応の反応時間は、好ましくは１分〜４８時間、さらに好ましくは１０分〜１０時間、温度は、好ましくは０〜１００℃、さらに好ましくは５〜７０℃である。
また、核酸サンプルの濃度も特に制限されないが、好ましくは１０-7〜１０質量％、さらに好ましくは１０-5〜１０-1質量％である。
本発明の酸化剤の添加量も特に制限されないが、核酸サンプル１００質量部に対して、好ましくは０．１〜１０6質量部、さらに好ましくは１０2〜１０5質量部が望ましい。
酸化反応の反応時間は、好ましくは１分〜４８時間、さらに好ましくは１０分〜１０時間、温度は、好ましくは０〜１００℃、さらに好ましくは５〜７０℃である。
酸化された核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する工程
酸化反応後、５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する。
この際、反応試薬の残渣が次の検出工程で増幅障害などの問題を生じる可能性がある場合には、検出工程の前に脱塩操作をする。脱塩操作は、ゲル濾過、ゲル電気泳動、HPLC精製、脱塩フィルター、イオン交換カラム、塩析など、公知の手法により行うことができる。脱塩処理により、後続の５−ヒドロキシメチルシトシンの位置決定の工程の精度を向上することができる。
酸化反応後、５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する。
この際、反応試薬の残渣が次の検出工程で増幅障害などの問題を生じる可能性がある場合には、検出工程の前に脱塩操作をする。脱塩操作は、ゲル濾過、ゲル電気泳動、HPLC精製、脱塩フィルター、イオン交換カラム、塩析など、公知の手法により行うことができる。脱塩処理により、後続の５−ヒドロキシメチルシトシンの位置決定の工程の精度を向上することができる。
酸化された核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する方法に特に制限はないが、例えば、以下の方法が挙げられる。
（Ａ）酸化された核酸サンプルを脱アミン化処理して、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシン部位で切断し、この核酸断片の大きさを測定することにより、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する方法。
（Ｂ）酸化された核酸サンプルをシーケンシングすることにより、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する方法。
（Ａ）酸化された核酸サンプルを脱アミン化処理して、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシン部位で切断し、この核酸断片の大きさを測定することにより、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する方法。
（Ｂ）酸化された核酸サンプルをシーケンシングすることにより、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する方法。
まず、方法（Ａ）について説明する。
酸化処理された５−ヒドロキシメチルシトシンは、シトシン４位の脱アミン化を誘起する反応条件下（例えば、ｐＨ４〜９の緩衝液中での加熱、臭化リチウムや臭化マグネシウムのような塩を含む水溶液中での加熱、水酸化ナトリウムやピペリジンのような塩基性物質を含む水溶液中での加熱など）で処理して、核酸を酸化された５−ヒドロキシメチルシトシン部位で切断し、この核酸断片の大きさを、電気泳動（ポリアクリルアミドゲルもしくはアガロースゲルなど）での泳動度や、質量分析（ＭＡＬＤＩもしくはＥＳＩなど）での質量変化により検出する。この核酸断片の大きさを、電気泳動での泳動度等により決定するためには、核酸サンプルを予め蛍光物質、32P-リン酸、ジゴキシゲニン等により標識しておくことが望ましい。
酸化処理された５−ヒドロキシメチルシトシンは、シトシン４位の脱アミン化を誘起する反応条件下（例えば、ｐＨ４〜９の緩衝液中での加熱、臭化リチウムや臭化マグネシウムのような塩を含む水溶液中での加熱、水酸化ナトリウムやピペリジンのような塩基性物質を含む水溶液中での加熱など）で処理して、核酸を酸化された５−ヒドロキシメチルシトシン部位で切断し、この核酸断片の大きさを、電気泳動（ポリアクリルアミドゲルもしくはアガロースゲルなど）での泳動度や、質量分析（ＭＡＬＤＩもしくはＥＳＩなど）での質量変化により検出する。この核酸断片の大きさを、電気泳動での泳動度等により決定するためには、核酸サンプルを予め蛍光物質、32P-リン酸、ジゴキシゲニン等により標識しておくことが望ましい。
さらに具体的には、酸化処理した核酸サンプルを、塩基性物質であるピペリジン、水酸化ナトリウム等（濃度は、好ましくは、３〜５０質量％、さらに好ましくは１０〜２０質量％程度）を含む水溶液中で、加熱処理（好ましくは７０〜１００℃で好ましくは５分〜５時間）すると、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの塩基と糖との間のＮ−グリコシド結合が分解されるとともに、その酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンを有するヌクレオチドと隣接するヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合も切断される。従って、塩基性物質で処理した後に、核酸断片をＰＣＲなどで増幅し、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により核酸断片の大きさを測定することにより、問題となる塩基の位置を特定することができる。すなわち、５−ヒドロキシメチルシトシンの存在箇所で核酸が切断され、核酸断片のバンドが観察できるので、配列のどの位置が５−ヒドロキシメチルシトシンなのか確定できる。
次に、方法（Ｂ）について説明する。
酸化処理された核酸を、シーケンシング反応（ＰＣＲ増幅の後もしくは直接、一般的なシーケンサや次世代シーケンサなど）にかけ、シーケンサでのＣからＴもしくはＧからＡへの塩基変換などにより５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を検出する。
すなわち、５−ヒドロキシメチルシトシンはグアニンと相補的塩基対を形成するが、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンは、グアニンではなくアデニンと相補的塩基対を形成するため、酸化する前の核酸サンプルと酸化された核酸サンプルをシーケンシングし比較することにより、５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を特定することができる。
酸化処理された核酸を、シーケンシング反応（ＰＣＲ増幅の後もしくは直接、一般的なシーケンサや次世代シーケンサなど）にかけ、シーケンサでのＣからＴもしくはＧからＡへの塩基変換などにより５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を検出する。
すなわち、５−ヒドロキシメチルシトシンはグアニンと相補的塩基対を形成するが、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンは、グアニンではなくアデニンと相補的塩基対を形成するため、酸化する前の核酸サンプルと酸化された核酸サンプルをシーケンシングし比較することにより、５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を特定することができる。
さらに具体的には、タングステン酸系酸化剤で酸化後、必要により脱塩処理し、ＰＣＲ増幅した生成物のシーケンシングプロファイルから、５−メチルシトシン及びシトシンに対応する相補部位にはその相補塩基であるグアニンが導入されるのに対して、５−ヒドロキシメチルシトシンに対応する相補部位にはグアニンだけでなくアデニンも導入されるため、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの存在位置を５−メチルシトシン及びシトシンと明確にかつ効率よく識別し、検出することができる。
酸化後、必要により脱塩処理した生成物をさらに、好ましくは１０〜０．１質量％の臭化リチウム、塩化リチウム、臭化マグネシウム等の水溶液（例えば、ｐＨ５〜９のリン酸ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムもしくはトリス塩酸緩衝液）中、５〜８０℃で０．５〜２４時間処理すると、５−ヒドロキシメチルシトシンに対応する相補部位に導入される塩基（グアニンとアデニン）中のアデニンの比率がさらに高くなり、ほぼアデニンのみとすることができ、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの存在位置を５−メチルシトシン及びシトシンとさらに明確にかつ効率よく識別し、検出することができる。
酸化後、必要により脱塩処理した生成物をさらに、好ましくは１０〜０．１質量％の臭化リチウム、塩化リチウム、臭化マグネシウム等の水溶液（例えば、ｐＨ５〜９のリン酸ナトリウムもしくは酢酸ナトリウムもしくはトリス塩酸緩衝液）中、５〜８０℃で０．５〜２４時間処理すると、５−ヒドロキシメチルシトシンに対応する相補部位に導入される塩基（グアニンとアデニン）中のアデニンの比率がさらに高くなり、ほぼアデニンのみとすることができ、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの存在位置を５−メチルシトシン及びシトシンとさらに明確にかつ効率よく識別し、検出することができる。
実施例１
配列番号１の塩基配列を有する蛍光標識したＤＮＡ １．２５マイクロｇを水５０ｍｌに溶解し、リン酸ナトリウム−塩化ナトリウム緩衝液でｐＨ７．０に調整し、これに表１に示す酸化剤をそれぞれ１６５マイクロｇ加え、５０℃で１２０分間反応させた。
反応混合物をマイクロバイオスピンカラム６Ｔｒｉｓ(バイオラッド社)により脱塩処理した。
次いで、この処理物にピペリジンを１０質量％となるように加え、９０℃で１２０分間加熱処理した。
処理物を凍結乾燥処理に付し、残留物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。
配列番号１：5’-Fluorescein-AAAAAAGXGAAAAAA-3’(X＝ｈｍＣ，ｍＣ，Ｃ）。
以下、ｈｍＣは５−ヒドロキシメチルシトシン、ｍＣは５−メチルシトシン、Ｃはシトシンを示す。
配列番号１の塩基配列を有する蛍光標識したＤＮＡ １．２５マイクロｇを水５０ｍｌに溶解し、リン酸ナトリウム−塩化ナトリウム緩衝液でｐＨ７．０に調整し、これに表１に示す酸化剤をそれぞれ１６５マイクロｇ加え、５０℃で１２０分間反応させた。
反応混合物をマイクロバイオスピンカラム６Ｔｒｉｓ(バイオラッド社)により脱塩処理した。
次いで、この処理物にピペリジンを１０質量％となるように加え、９０℃で１２０分間加熱処理した。
処理物を凍結乾燥処理に付し、残留物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析した。
配列番号１：5’-Fluorescein-AAAAAAGXGAAAAAA-3’(X＝ｈｍＣ，ｍＣ，Ｃ）。
以下、ｈｍＣは５−ヒドロキシメチルシトシン、ｍＣは５−メチルシトシン、Ｃはシトシンを示す。
配列番号１のＤＮＡを、Ｈ2ＷＯ4／Ｈ2Ｏ2で酸化処理し、次いでピペリジン処理した生成物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて解析した結果を図２に示す。
また、酸化剤としてＫ2［｛Ｗ（＝Ｏ）（Ｏ2）2（Ｈ2Ｏ）｝2（μ−Ｏ）］を使用し、同様に処理して得られた結果を図３に示す。
レーン１：反応前のＤＮＡ；
レーン２：酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンが反応した場合に生成するＤＮＡと同じ長さのＤＮＡ（７塩基）；
レーン３：５−ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡ；
レーン４：５−メチルシトシンを含むＤＮＡ；
レーン５：シトシンを含むＤＮＡ。
白抜けの矢印は、わずかに観察されるグアニンの酸化ダメージ（8−オキソグアニンやイミダゾロンへのグアニン塩基の酸化分解がピペリジン処理を通じて鎖切断を引き起こしたもの）を示す。
また、酸化剤としてＫ2［｛Ｗ（＝Ｏ）（Ｏ2）2（Ｈ2Ｏ）｝2（μ−Ｏ）］を使用し、同様に処理して得られた結果を図３に示す。
レーン１：反応前のＤＮＡ；
レーン２：酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンが反応した場合に生成するＤＮＡと同じ長さのＤＮＡ（７塩基）；
レーン３：５−ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡ；
レーン４：５−メチルシトシンを含むＤＮＡ；
レーン５：シトシンを含むＤＮＡ。
白抜けの矢印は、わずかに観察されるグアニンの酸化ダメージ（8−オキソグアニンやイミダゾロンへのグアニン塩基の酸化分解がピペリジン処理を通じて鎖切断を引き起こしたもの）を示す。
また、図２の「Ｘ−位切断断片」で示される処理断片の蛍光濃度の、「未処理ＤＮＡ」及び「Ｘ−位切断断片」の蛍光濃度に対する比（％）を表１に示す。表１には、Ｈ2ＷＯ4／Ｈ2Ｏ2以外の酸化剤で酸化処理し、同様にピペリジン処理した生成物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて解析した結果から得られた処理断片の蛍光濃度の「未処理ＤＮＡ」及び「Ｘ−位切断断片」の蛍光濃度に対する比（％）もあわせて示してある。
図２、図３及び表１に示す結果は、本発明の酸化剤が、他の酸化剤と比較して、特異的かつ選択的に５−ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡと反応してこれを酸化することを示している。これは、本発明の酸化剤が、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出試薬として極めて優れていることを明瞭に示すものである。
図２、図３及び表１に示す結果は、本発明の酸化剤が、他の酸化剤と比較して、特異的かつ選択的に５−ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡと反応してこれを酸化することを示している。これは、本発明の酸化剤が、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出試薬として極めて優れていることを明瞭に示すものである。
表１
peroxo-W：Ｋ2［｛Ｗ（＝Ｏ）（Ｏ2）2（Ｈ2Ｏ）｝2（μ−Ｏ）］
peroxo-Mo：Ｋ2［｛Ｍｏ（＝Ｏ）（Ｏ2）2（Ｈ2Ｏ）｝2（μ−Ｏ）］
peroxo-Mo：Ｋ2［｛Ｍｏ（＝Ｏ）（Ｏ2）2（Ｈ2Ｏ）｝2（μ−Ｏ）］
実施例２
NTS H-6 DNA/RNAシンセサイザーを使用し、汎用のホスホラミダイト法により配列番号２のＤＮＡ（ＣｐＧ、ｍＣｐＧ、又はｈｍＣｐＧを含むヒトＴＮＦ−β推定プロモーター領域ＤＮＡ断片）を合成した。この配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡ １．２５マイクロｇを水５０マイクロリットルに溶解し、リン酸ナトリウム−塩化ナトリウム緩衝液でｐＨ７．０に調整し、これに表１に示す酸化剤をそれぞれ１６５マイクロｇ加え、５０℃で１２０分間反応させた。
反応混合物をマイクロバイオスピンカラム６Ｔｒｉｓ(バイオラッド社)により脱塩処理し、処理物Ｉを得た。
次いで、処理物Ｉを水５０マイクロリットルに溶解し、４３５マイクロｇの臭化リチウムを加え、５０℃で５時間反応させ、処理物IIを得た。
処理物IIをマイクロバイオスピンカラム６Ｔｒｉｓ(バイオラッド社)により脱塩処理した。
次いで、この処理物I及びIIに、配列番号３の塩基配列を有するＰＣＲプライマーを１０質量％となるように加え、BigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社）を用いて配列解析を行った。
配列番号２：5’-TGCCTGCCAC GCTGCCACTG CXGCTTCCTC TATAAAGGGA CCTGAGCGTC CGGGCCCAGG GGCTCCGCAC AGCAGGTGAG GCTCTCCTGC CCCATCTCCT-3’(X＝ｈｍＣ，ｍＣ，Ｃ)。
配列番号３：5’-GGAGATGGGG CAGGAG-3’
NTS H-6 DNA/RNAシンセサイザーを使用し、汎用のホスホラミダイト法により配列番号２のＤＮＡ（ＣｐＧ、ｍＣｐＧ、又はｈｍＣｐＧを含むヒトＴＮＦ−β推定プロモーター領域ＤＮＡ断片）を合成した。この配列番号２の塩基配列を有するＤＮＡ １．２５マイクロｇを水５０マイクロリットルに溶解し、リン酸ナトリウム−塩化ナトリウム緩衝液でｐＨ７．０に調整し、これに表１に示す酸化剤をそれぞれ１６５マイクロｇ加え、５０℃で１２０分間反応させた。
反応混合物をマイクロバイオスピンカラム６Ｔｒｉｓ(バイオラッド社)により脱塩処理し、処理物Ｉを得た。
次いで、処理物Ｉを水５０マイクロリットルに溶解し、４３５マイクロｇの臭化リチウムを加え、５０℃で５時間反応させ、処理物IIを得た。
処理物IIをマイクロバイオスピンカラム６Ｔｒｉｓ(バイオラッド社)により脱塩処理した。
次いで、この処理物I及びIIに、配列番号３の塩基配列を有するＰＣＲプライマーを１０質量％となるように加え、BigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社）を用いて配列解析を行った。
配列番号２：5’-TGCCTGCCAC GCTGCCACTG CXGCTTCCTC TATAAAGGGA CCTGAGCGTC CGGGCCCAGG GGCTCCGCAC AGCAGGTGAG GCTCTCCTGC CCCATCTCCT-3’(X＝ｈｍＣ，ｍＣ，Ｃ)。
配列番号３：5’-GGAGATGGGG CAGGAG-3’
結果を図４に示す。図４は配列番号２のＤＮＡ（ＣｐＧ、ｍＣｐＧ、又はｈｍＣｐＧを含むヒトＴＮＦ−β推定プロモーター領域ＤＮＡ断片）を本発明のタングステン酸系酸化剤：Ｋ2［｛Ｗ（＝Ｏ）（Ｏ2）2（Ｈ2Ｏ）｝2（μ−Ｏ）］で酸化処理し、脱アミン化し、ＰＣＲ増幅した生成物のシーケンシングプロファイル（右側）及び処理前のプロファイル（左側）を示す図面であり、実線はアデニン、破線はグアニン、一点鎖線はシトシン、点線はチミンを示す。
タングステン酸系酸化剤で酸化後、脱塩処理し、ＰＣＲ増幅した処理物Iのシーケンシングプロファイル（図４の右側のプロファイル）から、５−メチルシトシン及びシトシンに対応する相補部位にはその相補塩基であるグアニンが導入されるのに対して、５−ヒドロキシメチルシトシンに対応する相補部位にはグアニンだけでなくアデニンも約３０〜１００モル％程度導入されることがわかる。
酸化後、脱塩処理した生成物をさらに臭化リチウムで処理し、そのＰＣＲ増幅した処理物IIのシーケンシングプロファイルから、５−メチルシトシン及びシトシンに対応する相補部位にはその相補塩基であるグアニンのみが導入されるのに対して、５−ヒドロキシメチルシトシンに対応する相補部位にはほぼアデニンのみ（５０〜１００モル％）が導入されることがわかる。
従って、タングステン酸系酸化剤で酸化後、必要により脱塩処理した生成物のシーケンシングを行い、このシーケンシングプロファイルを酸化処理前の核酸サンプルと比較することにより、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの存在位置を５−メチルシトシン及びシトシンと明確に識別し検出することができる。
タングステン酸系酸化剤で酸化後、必要により脱塩処理した後、さらに臭化リチウム処理すると、５−ヒドロキシメチルシトシンに対応する相補部位に導入される塩基（グアニンとアデニン）中のアデニンの比率がさらに高くなるため、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの存在位置を５−メチルシトシン及びシトシンとさらに明確にかつ効率よく検出することができる。
従って、タングステン酸系酸化剤で酸化後、必要により脱塩処理した生成物のシーケンシングを行い、このシーケンシングプロファイルを酸化処理前の核酸サンプルと比較することにより、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの存在位置を５−メチルシトシン及びシトシンと明確に識別し検出することができる。
タングステン酸系酸化剤で酸化後、必要により脱塩処理した後、さらに臭化リチウム処理すると、５−ヒドロキシメチルシトシンに対応する相補部位に導入される塩基（グアニンとアデニン）中のアデニンの比率がさらに高くなるため、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの存在位置を５−メチルシトシン及びシトシンとさらに明確にかつ効率よく検出することができる。
実施例３
実施例１において、配列番号１の塩基配列を有する蛍光標識したＤＮＡの代わりに、配列番号４〜１４の下記の塩基配列（Ａ）〜（Ｋ）を有するFluoresceinで蛍光標識したＤＮＡを使用し、実施例１と同様に、Ｋ2［｛Ｗ（＝Ｏ）（Ｏ2）2（Ｈ2Ｏ）｝2（μ−Ｏ）］で酸化処理し、次いでピペリジン処理した生成物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて解析した。
配列番号４：(A) Fluo-GATACTGXGT TGCAA
配列番号５：(B) Fluo-AGTGCATXGC AAGAA
配列番号６：(C) Fluo-GACATACXGA AGTGA
配列番号７：(D) Fluo-AAGTGCAXGA TGCGA
配列番号８：(E) Fluo-CACGTTTTTT AGTGATTTXG TCATTTTCAA GTCGTCAAGT
配列番号９：(F) Fluo-GAAAAACACA TACGTTGAAA ACXGGCATTG TAGAACAGTG
配列番号１０：(G) Fluo-GTTGTGAGGX GCTGCCCCCA
配列番号１１：(H) Fluo-GCAGGGCCCA CTACXGCTTC CTCCAGATGA
配列番号１２：(I) Fluo-GAGTGAGXAG TAAGA
配列番号１３：(J) Fluo-AGAGCAGXTG ATGAA
配列番号１４：(K) Fluo-AAGCCAGXCG TATGA
実施例１において、配列番号１の塩基配列を有する蛍光標識したＤＮＡの代わりに、配列番号４〜１４の下記の塩基配列（Ａ）〜（Ｋ）を有するFluoresceinで蛍光標識したＤＮＡを使用し、実施例１と同様に、Ｋ2［｛Ｗ（＝Ｏ）（Ｏ2）2（Ｈ2Ｏ）｝2（μ−Ｏ）］で酸化処理し、次いでピペリジン処理した生成物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて解析した。
配列番号４：(A) Fluo-GATACTGXGT TGCAA
配列番号５：(B) Fluo-AGTGCATXGC AAGAA
配列番号６：(C) Fluo-GACATACXGA AGTGA
配列番号７：(D) Fluo-AAGTGCAXGA TGCGA
配列番号８：(E) Fluo-CACGTTTTTT AGTGATTTXG TCATTTTCAA GTCGTCAAGT
配列番号９：(F) Fluo-GAAAAACACA TACGTTGAAA ACXGGCATTG TAGAACAGTG
配列番号１０：(G) Fluo-GTTGTGAGGX GCTGCCCCCA
配列番号１１：(H) Fluo-GCAGGGCCCA CTACXGCTTC CTCCAGATGA
配列番号１２：(I) Fluo-GAGTGAGXAG TAAGA
配列番号１３：(J) Fluo-AGAGCAGXTG ATGAA
配列番号１４：(K) Fluo-AAGCCAGXCG TATGA
結果を図５及び６に示す。図５の（Ａ）〜（Ｆ）は、配列番号４〜９のＤＮＡを使用した際の結果、図６の（Ｇ）〜（Ｋ）は、配列番号１０〜１４のＤＮＡを使用した際の結果をそれぞれ示すポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。
図５及び図６において各レーンは以下の試料を示す。
レーン１、４、７：シトシンを含むＤＮＡ；
レーン２、５、８：５−ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡ；
レーン３、６、９：５−メチルシトシンを含むＤＮＡ；
図５及び図６において各レーンは以下の試料を示す。
レーン１、４、７：シトシンを含むＤＮＡ；
レーン２、５、８：５−ヒドロキシメチルシトシンを含むＤＮＡ；
レーン３、６、９：５−メチルシトシンを含むＤＮＡ；
図５及び図６の結果は、本発明の方法によれば、５−ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を含むＤＮＡのみが検出され、５−メチルシトシン（ｍＣ）を含むＤＮＡは検出されず、ｈｍＣをｍＣと識別し、選択的に検出することができることを明瞭に示している。
本発明によれば、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの存在及びその位置を、化学的に簡便にかつ正確に検出することができる。従って、がん・老化・再生医療など、エピジェネティクス技術に関わる全ての分野における、遺伝子機能の初期化を調べるための核心的技術として極めて有用である。
Claims (9)
- 下記の工程を有することを特徴とする核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出方法：
（１）核酸サンプルをタングステン酸系酸化剤で処理して存在する可能性のある５−ヒドロキシメチルシトシンを酸化する工程；及び
（２）核酸サンプル中の酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する工程。 - タングステン酸系酸化剤が、
（１）ペルオキシタングステン酸、又はその塩
（２）タングステン酸又はその塩、及び
（３）ペルオキシタングステン酸、タングステン酸、又はそれらの塩と、再酸化剤との組み合わせ
からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１記載の方法。 - タングステン酸系酸化剤が、Ｋ2［｛Ｗ（＝Ｏ）（Ｏ2）2（Ｈ2Ｏ）｝2（μ−Ｏ）］、Ｈ2ＷＯ4／Ｈ2Ｏ2、及びＫ2ＷＯ4／Ｈ2Ｏ2からなる群から選ばれる少なくとも１種であるである請求項１記載の方法。
- 工程（２）が、酸化された核酸サンプルを脱アミン化処理して、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシン部位で切断し、この核酸断片の大きさを測定することにより、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する工程を含む請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
- 工程（２）が、酸化された核酸サンプルをシーケンシングすることにより、酸化された５−ヒドロキシメチルシトシンの位置を決定する工程を含む請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
- 核酸がＤＮＡである請求項１〜５のいずれか１項記載方法。
- （１）ペルオキシタングステン酸、又はその塩、
（２）タングステン酸又はその塩、及び、
（３）ペルオキシタングステン酸、タングステン酸、又はそれらの塩と、再酸化剤との組み合わせ、
からなる群から選ばれる少なくとも１種のタングステン酸系酸化剤の、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出のための使用。 - （１）ペルオキシタングステン酸、又はその塩、
（２）タングステン酸又はその塩、及び、
（３）ペルオキシタングステン酸、タングステン酸、又はそれらの塩と、再酸化剤との組み合わせ、
からなる群から選ばれる少なくとも１種のタングステン酸系酸化剤を含む、核酸中の５−ヒドロキシメチルシトシンの検出用キット。 - さらに、酸化された核酸サンプルを脱アミン化処理するための試薬、及びｐＨ緩衝液からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む請求項８記載のキット。
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