JP2019154310A - 核酸検出方法及び核酸検出装置、並びに、核酸検出キット - Google Patents

Abstract

【課題】標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化シトシンであることを簡便で迅速かつ定量的に検出することができる核酸検出方法の提供。【解決手段】標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化シトシンであることを検出するための核酸検出方法であって、前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換工程と、前記核酸試料に対し、前記核酸試料の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いて伸長核酸断片を得る核酸伸長工程と、前記伸長核酸断片のうち、前記標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出する検出工程と、を含む核酸検出方法である。【選択図】なし

Description

本発明は、核酸検出方法及び核酸検出装置、並びに、核酸検出キットに関する。

生物を構成する個々の細胞は、同一の塩基配列を有するにも関わらず、細胞種によって固有の性質（表現型）を示している。この表現型は、体細胞分裂の後も継承され、細胞固有の遺伝子発現パターンによって決定されていることがわかってきている。この遺伝子発現パターンの制御には、ＤＮＡのメチル化が重要な役割を担っている。

ＤＮＡのメチル化は、ほとんどの場合、シトシンに生じ、遺伝子の発現抑制をする。
動物のゲノムＤＮＡでは５’−ＣＧ−３’配列（「ＣＧ配列」、「シトシン−リン酸−グアニンサイト」、又は「ＣｐＧサイト」などと称することがある）中のシトシン（Ｃ）がメチル化されることがわかっている。
ゲノム中には、ＣｐＧサイトが高頻度に存在するＣｐＧアイランドと呼ばれる領域があり、ヒトではＣｐＧアイランド中のＣｐＧサイトの約６０％から約９０％がメチル化されていることが知られている。ＣｐＧアイランドは遺伝子の転写調節領域で多く発見されており、遺伝子の転写調節に重要な役割を果たしている。

近年、様々な疾病を分析するのに、その疾病に関与する遺伝子領域におけるシトシン（Ｃ）のメチル化パターンを解析することが試みられている。
メチル化パターンの解析方法としては、例えば、メチル化シトシンを有する標的核酸中のシトシンをウラシルに変換する変換処理を行い、変換処理を行った標的核酸をＰＣＲで増幅し、得られた増幅産物に対して、２’，３’−ジデオキシシチジン三リン酸（ｄｄＣＴＰ）、又は２’，３’−ジデオキシグアノシン三リン酸（ｄｄＧＴＰ）を用いてＤＮＡ伸長反応を行い、解析することにより、標的核酸中のメチル化シトシンの位置を決定する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

本発明は、標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化シトシンであることを簡便で迅速かつ定量的に検出することができる核酸検出方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段としての本発明の核酸検出方法は、
標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化シトシンであることを検出するための核酸検出方法であって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換工程と、
前記核酸試料に対し、
前記核酸試料の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いて伸長核酸断片を得る核酸伸長工程と、
前記伸長核酸断片のうち、前記標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出する検出工程と、を含む。

本発明によると、標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化シトシンであることを簡便で迅速かつ定量的に検出することができる核酸検出方法を提供することができる。

図１は、変換工程における非メチル化シトシン及びメチル化シトシンの反応を示す図である。 図２は、標的核酸中の全てのＣｐＧサイト（５箇所）のシトシンが非メチル化シトシンである一例を示す図である。 図３は、変換工程により標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して得られた核酸試料の一例を示す図である。 図４は、核酸伸長工程により使用する伸長反応プライマーが核酸試料にアニールする位置の一例を示す図である。 図５は、核酸伸長工程により得られた伸長核酸断片の一例を示す図である。 図６は、検出工程に用いるプライマーの位置の一例を示す図である。 図７は、検出工程の一例を示す図である。 図８は、検出工程の他の一例を示す図である。 図９は、標的核酸中のＣｐＧサイトにメチル化シトシンを有する一例を示す図である。 図１０は、変換工程により標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して得られた核酸試料の一例を示す図である。 図１１は、核酸伸長工程により使用する伸長反応プライマーが核酸試料にアニールする位置の一例を示す図である。 図１２は、核酸伸長工程により得られた伸長核酸断片の一例を示す図である。 図１３は、検出工程の一例を示すである。 図１４は、標的核酸中のＣｐＧサイトのシトシンが全て非メチル化シトシンである場合の核酸伸長断片と核酸伸長断片の３’末端の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーとの位置の一例を示す図である。 図１５は、図１４において核酸伸長を行った伸長核酸断片の一例を示す図である。 図１６は、図１５において得られた伸長核酸断片に対する検出工程の一例を示す図である。 図１７は、標的核酸中のＣｐＧサイトにメチル化シトシンを有する場合の核酸伸長断片と核酸伸長断片の３’末端の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーとの位置の一例を示す図である。 図１８は、図１７において核酸伸長を行った伸長核酸断片の一例を示す図である。 図１９は、図１８において得られた伸長核酸断片に対する検出工程の一例を示す図である。 図２０は、検出工程の一例を示す図である。 図２１は、検出工程のその他の一例を示す図である。 図２２は、検出結果の一例を示す図である。 図２３は、検出結果のその他の一例を示す図である。

（核酸検出方法及び核酸検出装置）
本発明の核酸検出方法は、
標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化シトシンであることを検出するための核酸検出方法であって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換工程と、
前記核酸試料に対し、
前記核酸試料の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いて伸長核酸断片を得る核酸伸長工程と、
前記伸長核酸断片のうち、前記標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出する検出工程と、を含み、さらに必要に応じてその他の工程を含む。

本発明の核酸検出装置は、
標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化シトシンであることを検出するための核酸検出装置であって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換手段と、
前記核酸試料に対し、
前記核酸試料の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いて伸長核酸断片を得る核酸伸長手段と、
前記伸長核酸断片のうち、前記標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出する検出手段と、を有し、更に必要に応じてその他の手段を有する。

本発明者らは、標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化シトシンであることを検出するための核酸検出方法について検討したところ、以下の知見を得た。
上記特許文献１に記載の技術では、ＰＣＲ法による標的核酸の増幅の後に、断片的に伸長核酸断片を増幅してから電気泳動を行い塩基長毎に分画し、標的配列中のメチル化シトシンの位置を決定するため、増幅が起こりやすい配列ほど効率よく増幅されてしまうＰＣＲの反応効率（ＰＣＲバイアスと称することもある）を考慮する必要があり、非メチル化シトシンを含有する標的核酸を定量することができないという問題がある。
さらに、上記特許文献１の技術では、ＰＣＲ増幅反応、核酸伸長反応、及び電気泳動などの簡便な手法を組み合わせて行われているが、電気泳動によりメチル化シトシンの位置を決定するためには、数塩基の差を区別可能な分解能を有するバイオアナライザーなどの専用の装置を必要するため、簡便に行うことができないという問題がある。

本発明においては、標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換し、得られた核酸試料に対して相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマーとｄｄＧＴＰを含有する基質を用いて伸長反応を行い、標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出することによって、標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化シトシンであることを簡便で迅速かつ定量的に検出することができる。
なお、定量的とは、絶対定量でも相対定量でもよい。

なお、本発明において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを使用することができる。

本発明において、標的核酸とは、解析対象とする核酸を意味する。
標的核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ増幅産物、人工合成した塩基配列などが挙げられる。

＜変換工程及び変換手段＞
変換工程は、標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る工程であり、変換手段により好適に実施することができる。

標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、重亜硫酸塩を用いるバイサルファイト法などが挙げられる。
また、変換工程には、後述する本発明の核酸検出キットにおける変換試薬を用いることが好ましい。

図１は、重亜硫酸のナトリウム塩を用いたバイサルファイト法による非メチル化シトシン及びメチル化シトシンの反応を示す図である。図１に示すように、非メチル化シトシンでは、重亜硫酸ナトリウムによる脱アミノ化反応が起こり、最終的にシトシンがウラシルに変換されるが、メチル化シトシンの場合、変換反応が生じず、メチル化シトシンが未反応のまま残存する。
このように、標的核酸中の非メチル化シトシンのみを選択的にウラシルに変換することができる。

＜核酸伸長工程及び核酸伸長手段＞
核酸伸長工程は、核酸試料に対して、核酸試料の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いて伸長核酸断片を得る工程であり、核酸伸長手段によって好適に実施される。

標的核酸の非メチル化シトシンは、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方において、変換反応で塩基部分のシトシンがウラシルに変換された核酸試料となっている。核酸伸長工程では、この核酸試料のセンス鎖又はアンチセンス鎖に相補的な伸長反応プライマー、並びにｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄｄＧＴＰ（ジデオキシグアノシン三リン酸）を使用して核酸伸長反応を行う。
ｄｄＧＴＰは、リボースの２位及び３位のヒドロキシ基を水素に置換したグアノシン三リン酸であり、３位の位置に酸素を有していないため、隣り合う５’側のリン酸との脱水縮合が行われず、核酸伸長反応が終結する。このため、標的核酸、即ち、核酸試料がメチル化シトシンを有している場合には、メチル化シトシンと相補的なグアニンを有するｄｄＧＴＰが取り込まれ、核酸伸長反応を終結する。よって、標的核酸にメチル化シトシンを有する場合には、得られる伸長核酸断片は、鋳型となる核酸断片の塩基長よりも短くなり、標的核酸に非メチル化シトシンのみを有する場合には、ｄｄＧＴＰが取り込まれず、鋳型となる核酸試料と同じ塩基長となる。

核酸伸長手段としては、後述する本発明の核酸検出キットに用いる核酸伸長試薬を好適に用いることができる。具体的には、核酸試料のセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するプライマー、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰなどの基質、ＤＮＡポリメラーゼ、塩などが挙げられる。これらについては、後述する本発明の核酸検出キットにて詳細に説明する。

また、標的核酸が極めて少量である場合には、伸長反応を行う前に、核酸増幅反応を行うことが好ましい。核酸増幅反応を行う場合には、増幅サイクル数を１０サイクル程度とすることにより、後の検出工程に影響を与えることなく、定量的に検出することができる。

＜検出工程及び検出手段＞
検出工程は、前記伸長核酸断片のうち、前記標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出する工程であり、検出手段により好適に実施することができる。

検出手段としては、伸長核酸断片を検出することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リアルタイムＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、蛍光標識プローブ法などが挙げられる。
検出手段が、リアルタイムＰＣＲであると、標的核酸中の全てのＣｐＧサイトが非メチル化されている核酸断片をバイオマーカーとした経過観察や、サンプル間での比較検討が可能になる。
また、検出手段が、アガロースゲル電気泳動であると、特別な実験装置を用いなくとも非メチル化シトシンを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片をのみの増幅を簡便に確認することで検出することができる。

蛍光標識プローブ法は、伸長核酸断片の一部に相補的な塩基配列と、蛍光物質及び消光物質とを有するプローブを用いる。蛍光標識プローブ法に用いるプローブでは、蛍光物質及び消光物質が近接している状態、即ち同一分子上に存在する場合では、蛍光物質に対する励起光を照射しても、消光物質への蛍光エネルギー移動により蛍光が検出できない。しかし、伸長核酸断片の一部にアニールしたプローブをエクソヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性により分解することで、蛍光物質と消光物質を分離することにより、蛍光物質の蛍光を検出することができるようになる。なお、エキソヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性としては、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性などを利用することができる。
蛍光標識プローブにおける伸長核酸断片の一部に相補的な塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、伸長核酸断片に含まれる全てのＣｐＧサイトよりも３’側の塩基配列に相補的な配列とすることが好ましい。伸長核酸断片に含まれる全てのＣｐＧサイトよりも３’側の塩基配列に相補的な配列とすることにより、伸長核酸断片を特異的に検出することができる。
蛍光標識プローブ法を用いることにより、恒温槽、ヒートブロックなどにより検出を行うことができるため、サーマルサイクラーなどの特別な装置を用いる必要がなく、簡便に行うことができる。

また、検出工程には、後述する本発明の核酸検出キットにおける検出試薬を好適に用いることができる。検出試薬については、後述する本発明の核酸検出キットにて詳細に説明する。

本発明は、検出工程までの間にＰＣＲバイアスを生じさせる核酸増幅を行わずに検出をおこなうため、簡便で迅速であり、定量性に優れる検出方法とすることができる。

＜その他の工程及びその他の手段＞
その他の工程及びその他の手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、伸長核酸断片回収工程及び伸長核酸回収手段などが挙げられる。

＜＜伸長核酸断片回収工程及び伸長核酸断片回収手段＞＞
伸長核酸断片回収工程は、伸長核酸断片回収手段により伸長核酸断片を回収する工程である。

伸長核酸断片回収工程は、鋳型である核酸試料と伸長核酸断片の混合物から伸長核酸断片のみを回収することにより、検出工程における検出精度を向上させることができる。

伸長核酸回収手段ついては、本発明の核酸検出キットにおける伸長核酸回収手段を好適に用いることができる。伸長核酸回収手段ついては、本発明の核酸検出キットと同様のものを用いることができるため、後述する本発明の核酸検出キットにて詳細に説明する。

以下、本発明の核酸検出方法について、図面を参照して詳細に説明する。

図２から図８は、標的核酸中の全てのＣｐＧサイト（５箇所）のシトシンが非メチル化シトシンである場合の本発明の核酸検出方法の一例を示す模式図である。
図２は、標的核酸中の全てのＣｐＧサイト（５箇所）のシトシンが非メチル化シトシンである一例を示す図であり、図３は、変換工程により標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して得られた核酸試料の一例を示す図であり、図４は、核酸伸長工程により使用する伸長反応プライマーが核酸試料にアニールする位置の一例を示す図であり、図５は、核酸伸長工程により得られた伸長核酸断片の一例を示す図であり、図６は、検出工程に用いるプライマーの位置の一例を示す図であり、図７は、検出工程の一例を示す図であり、図８は、検出工程の他の一例を示す図である。

図２に示すように、標的核酸中のセンス鎖１０１及びアンチセンス鎖１０２の二本鎖核酸１０３において、全てのＣｐＧサイトのシトシンが非メチル化シトシン１０５である場合、変換工程を行うことにより、図３に示すように、標的核酸中の全ての非メチル化シトシンが、ウラシル１０７に変換された核酸試料１０８が得られる。
次に、得られた核酸試料１０８の３’末端の塩基配列に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー１０９と、ＤＮＡポリメラーゼ、並びに基質としてｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄｄＧＴＰを用いて核酸伸長反応を行う。伸長反応プライマー１０９は、ＣｐＧサイトを含まないように設計することにより、ＣｐＧサイトのシトシンのメチル化状態に依存せずにアニールできるようにする。このとき、鋳型となる核酸試料１０８は、変換工程により、シトシンがウラシルに変換されているため、図５に示すように、生成する伸長核酸断片には、核酸試料１０８のウラシルの位置に相補的なアデニンを有するｄＡＴＰ１１０が取り込まれる。
次に、図６に示すように、伸長核酸断片の５’末端付近と同じ塩基配列のプライマー１１２と、伸長核酸断片の３’末端と相補的なプライマー１１３を用いて、伸長核酸断片の検出を行う。この場合、図７に示すような標的核酸中の５箇所のＣｐＧサイトであった部位がｄＴＴＰ１１４に置換された核酸断片を合成し、検出することができる。
また、図６及び図７に示すような核酸増幅反応により検出工程を行う方法の他に、図８に示すような蛍光標識プローブ１１９を用いた検出方法を用いることもできる。また、図８に示すように、蛍光標識プローブ１１９の伸長核酸断片の一部に相補的な塩基配列は、伸長核酸断片の３’末端に相補的な配列とすることにより、標的核酸１０１中の全てのＣｐＧサイトのシトシンが非メチル化シトシンである場合のみ蛍光を検出するようにすることができる。

図９から図１３は、標的核酸中にメチル化シトシンを有する場合の本発明の核酸検出方法の一例を示す模式図である。
図９は、標的核酸中のＣｐＧサイトにメチル化シトシンを有する一例を示す図であり、図１０は、変換工程により標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して得られた核酸試料の一例を示す図であり、図１１は、核酸伸長工程により使用する伸長反応プライマーが核酸試料にアニールする位置の一例を示す図であり、図１２は、核酸伸長工程により得られた伸長核酸断片の一例を示す図であり、図１３は、検出工程の一例を示す図である。

図９に示すように、標的核酸中のセンス鎖１０１及びアンチセンス鎖１０２の二本鎖核酸１０３において、標的核酸はＣｐＧサイトのシトシンが非メチル化シトシン１０５、及びメチル化シトシン１０６である核酸を有している。この標的核酸に対して変換反応を行うことにより、図１０に示すように、標的核酸中の非メチル化シトシン１０５は、ウラシル１０７に変換され、メチル化シトシン１０６はメチル化シトシン１０６のまま存在する核酸試料１０８が得られる。
次に、得られた核酸試料１０８の３’末端の塩基配列に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー１０９と、ＤＮＡポリメラーゼ、並びに基質としてｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄｄＧＴＰを用いて核酸伸長反応を行う。伸長反応プライマー１０９は、ＣｐＧサイトを含まないように設計することにより、ＣｐＧサイトのシトシンのメチル化状態に依存せずにアニールできるようにする。このとき、鋳型となる核酸試料１０８は、変換工程により、シトシンがウラシルに変換されているため、図１２に示すように、核酸試料１０８のウラシルの位置には相補的なアデニンを有するｄＡＴＰ１１０が、メチル化シトシンの位置には相補的なグアニンを有するｄｄＧＴＰが取り込まれた伸長核酸断片を生成する。このとき、ｄｄＧＴＰが取り込まれると、それに続く核酸伸長反応が終結するため、鋳型となる核酸試料よりも短い伸長核酸断片が得られる。
次に、検出工程における一例を説明する。図１３に示すように、伸長核酸断片の５’末端付近及び３’末端と相補的なプライマー１１２及びプライマー１１３を用いて、伸長核酸断片の検出を行う場合、得られた伸長核酸断片には３’末端に相補的な塩基配列を有さないため、核酸増幅反応を起こさない。これにより、標的核酸に非メチル化シトシンのみを有する場合にのみ核酸増幅が行われるため、非メチル化シトシンを有する標的核酸を特異的に検出することができる。

図１４から図１９は、伸長核酸プライマーにタグ配列と標識体を修飾した場合の核酸伸長工程、及び検出工程の一例を示す模式図である。
図１４は、標的核酸中のＣｐＧサイトのシトシンが全て非メチル化シトシンである場合の核酸伸長断片と核酸伸長断片の３’末端の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーとの位置の一例を示す図であり、図１５は、図１４において核酸伸長を行った伸長核酸断片の一例を示す図であり、図１６は、図１５において得られた伸長核酸断片に対する検出工程の一例を示す図であり、図１７は、標的核酸中のＣｐＧサイトにメチル化シトシンを有する場合の核酸伸長断片と核酸伸長断片の３’末端の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマーとの位置の一例を示す図であり、図１８は、図１７において核酸伸長を行った伸長核酸断片の一例を示す図であり、図１９は、図１８において得られた伸長核酸断片に対する検出工程の一例を示す図である。

図１４に示すように、伸長反応プライマー１１５は、その５’末端側に図示しないタグ配列と標識体１１７を有している。この伸長反応プライマー１１５を用いて得られた伸長核酸断片は図１５に示すように、５’末端に標識体１１７を有している。標識体１１７は、伸長核酸断片回収工程において、伸長核酸断片回収手段により使用される標識となるため、伸長核酸断片を特異的に回収するのに用いることができる。
次に、図１６に示すように、伸長核酸断片の５’末端に付加されたタグ配列の少なくとも１部分に対して相補的な塩基配列を有するプライマー１１６と、伸長核酸断片の３’末端と相補的なプライマー１１３を用いて、検出工程を行う。この場合、プライマー１１３及び１１６は標的核酸の全てのＣｐＧサイトを含む領域を増幅できるように設計する。図１６に示すように、得られた伸長核酸断片にメチル化シトシンが含まれない場合にのみ核酸増幅を検出することができる。

図１７から図１９は、図１１において伸長核酸断片の５’末端に付加されたタグ配列の少なくとも１部分に対して相補的な塩基配列を有するプライマー１１６を用いた場合の核酸伸長工程及び検出工程の一例を示す図であり、標識体１１７を用いることにより、図１８に示すように鋳型となる核酸試料よりも短い伸長核酸断片となる。そのため、図１９に示すように、得られた伸長核酸断片には３’末端に相補的な塩基配列を有さないため、核酸増幅反応を起こさない。これにより、標的核酸に非メチル化シトシンのみを有する場合にのみ、核酸増幅が行われるため、非メチル化シトシンのみを有する標的核酸を特異的に検出することができる。

（核酸検出キット）
本発明の核酸検出キットは、本発明の核酸検出方法に用いられる核酸検出キットであって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換工程と、
前記核酸試料に対し、
前記核酸試料の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを含み、核酸伸長反応を行う核酸伸長試薬と、
前記核酸伸長反応により得られた前記伸長核酸断片のうち、前記標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出する検出試薬と、を有する。

−変換試薬−
変換試薬は、標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換する試薬である。

変換試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、重亜硫酸塩などが挙げられる。
重亜硫酸塩としては、例えば、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウムなどが挙げられる。

−核酸伸長試薬−
核酸伸長試薬は、核酸試料に対し、
前記核酸試料の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを含み、核酸伸長反応を行う試薬を有し、その他の成分を含有する。

伸長反応プライマーとしては、核酸試料のセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有しており、Ｔｍ値、得られる伸長核酸断片の長さなどを考慮して適宜設計することができる。

伸長反応プライマーに使用できる核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、ＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡなどの人工的に合成した核酸類似体（人工核酸とも称することがある）などの核酸などが挙げられる。

また、本発明の核酸検出キットを用いる本発明の核酸検出方法では、伸長核酸断片のみを回収し、後述する検出工程を行うために、核酸試料のセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有するプライマーには、標識体を化学修飾させることが好ましい。

−−標識体−−
標識体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、アデノシンが連続的に結合しているポリＡ配列などが挙げられる。

さらに、核酸試料のセンス鎖又はアンチセンス鎖の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマーの５’末端には、核酸試料のセンス鎖又はアンチセンス鎖に含まれない塩基配列であるタグ配列を有するように設計することもできる。伸長反応プライマーの５’末端にタグ配列を有すると、後述する検出工程において、核酸伸長工程により得られた伸長核酸断片を特異的に検出することができる。なお、伸長反応プライマーにタグ配列を有している場合においても、鋳型となる核酸試料にハイブリダイゼーションすることができる。
また、プライマーに標識体を化学修飾する場合には、伸長反応プライマーの５’末端と標識体との間にタグ配列を有することが好ましい。

タグ配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後の検出工程において、非特異増幅を起こさない配列であることが好ましい。
タグ配列の長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、１０塩基対以上が好ましく、２０塩基対以上がさらに好ましい。タグ配列の長さが１０塩基対以上であると、検出工程においてタグ配列と相補的な塩基配列を検出用のプライマーとして用いることができる。

その他の成分としては、核酸伸長反応を行う酵素、バッファー、水などが挙げられる。

核酸伸長反応を行う酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、α型ＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼ、改変α型ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。

α型ＤＮＡポリメラーゼとは、超好熱始原菌由来のファミリーＢ（α型）に属するＤＮＡポリメラーゼである。α型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばパイロコッカス・フリオサス(Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ)、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｉ(Ｖｅｎｔ)ポリメラーゼ）、パイロコッカス・コダカラエンシス(Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ)ＫＯＤ１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ)などが挙げられる。

α型ＤＮＡポリメラーゼは、ウラシルに対して強く結合するウラシル結合ポケットを有しているため、鋳型核酸中にウラシルが含まれているとウラシルと結合し、ポリメラーゼ活性を大きく阻害する。そのため、核酸試料中に、ウラシルを有していても核酸伸長反応が進むα型以外のＤＮＡポリメラーゼ、又はウラシルとの結合性が改変され、ウラシルによってポリメラーゼ活性が阻害されない、改変α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。

α型ＤＮＡポリメラーゼ以外のポリメラーゼとしては、例えば、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）などが挙げられる。

バッファーとしては、例えば、１０ｘ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社製）などが挙げられる。

−検出試薬−
検出試薬は、回収した前記伸長核酸断片のうち、前記標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出する検出試薬である。

検出試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、通常のＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼ、基質、バッファー、プライマーなどの試薬、通常のアガロースゲル電気泳動法によるＤＮＡの検出に用いるアガロース、エチジウムブロミドなどの試薬、通常のリアルタイムＰＣＲに用いることができるプライマーなどの試薬、蛍光標識プローブ法に用いる蛍光標識プローブ及びエキソヌクレアーゼ（例えば、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ、タカラバイオ株式会社製）などの試薬などが挙げられる。

検出に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。α型ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型となる核酸にウラシルが含まれている場合にはポリメラーゼ活性が大きく阻害される。そのため、バイサルファイト処理により非メチル化シトシンがウラシルに変換された核酸試料が混入している場合においても、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、伸長核酸断片からの特異的な増幅を行なうことができる。よって、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、検出精度を向上させることができる。

検出試薬のプライマーに使用できる核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、ＰＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡなどの人工的に合成した核酸類似体（人工核酸とも称することがある）などの核酸などが挙げられる。

アガロース電気泳動を用いることによって、得られた電気泳動によるバンドの画像処理を組み合せることにより、リアルタイムＰＣＲの装置などの特別な装置を用いることなく簡便に検出することができる。

−その他の試薬−
その他の試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、伸長核酸断片回収試薬などが挙げられる。

−−伸長核酸断片回収試薬−−
伸長核酸断片回収試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体などのビオチン結合タンパク質、抗ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）抗体、チミンが連続したオリゴｄＴなどが修飾された磁気ビーズ又はセファロースビーズなどが挙げられる。

以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。

標的核酸として、ヒト由来のＭｙｅｌｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）遺伝子の部分配列からなる１７０塩基の核酸断片（以下、ＭＢＰ１７０と称することがある）を用いた。このＭＢＰ１７０のアンチセンス鎖には、５’末端側から２７塩基目、３７塩基目、６７塩基目、７１塩基目、８８塩基目、１００塩基目、１３３塩基目にＣｐＧサイトのシトシンを７箇所有している(配列番号１参照)。
ＭＢＰ１７０の７箇所全てのＣｐＧサイトのシトシンが非メチル化シトシンであるＭＢＰ１７０＿Ｕ７、及びＭＢＰ１７０の７箇所全てのＣｐＧサイトのシトシンがメチル化シトシンであるＭＢＰ１７０＿ｍ７をＤＮＡ合成により人工的に作製した。また、ネガティブコントロールとして、全てのＣｐＧサイトのシトシンが非メチル化されたセンス鎖のＭＢＰ１７０＿Ｆｗを作製した。作製したＭＢＰ１７０＿Ｕ７、ＭＢＰ１７０＿ｍ７、及びＭＢＰ１７０＿Ｆｗを用いて、以下の工程による処理を行い、核酸を検出した。

＜変換工程＞
ＭＢＰ１７０＿Ｕ７、ＭＢＰ１７０＿ｍ７、及びＭＢＰ１７０＿Ｆｗをそれぞれ１μｇずつエッペンドルフチューブにとり、蒸留水で２０μＬとする。ＭＢＰ１７０＿Ｕ７、ＭＢＰ１７０＿ｍ７、及びＭＢＰ１７０＿Ｆｗの溶解液に、３ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム２．２μＬを加え、３７℃、１５分間静置する。次に、３１ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム／５ｍＭヒドロキノン（ｐＨ５．０）を２２０μＬ加え、８０℃、４５分間静置する。
その後、カラム（商品名：ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）に回収し、ｐＨ８．５〜１１．５の脱スルホン試薬を２０〜１００μＬ添加し、脱スルホン処理を行った。その後、カラム上で洗浄を洗浄バッファーによる洗浄を行なった後、溶出処理を行い、ＭＢＰ１７０＿Ｕ７の核酸試料Ｕ７、ＭＢＰ１７０＿Ｕ７の核酸試料ｍ７、及びＭＢＰ１７０＿Ｆｗの核酸試料Ｆｗを得た。

＜核酸伸長工程＞
次に、得られた核酸試料Ｕ７、核酸試料ｍ７、及び核酸試料Ｆｗを以下の反応液１の組成で調製し、図２０の反応条件にて伸長核酸反応を行い、伸長核酸断片を得た。なお、ｄｄＧＴＰ ｍｉｘには、ｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰが等量ずつ含まれている。また、伸長反応プライマー（配列番号２参照）の５’末端には標識体として、ビオチンが修飾したものを使用した。

−反応液１−
・核酸試料Ｕ７、核酸試料ｍ７、又は核酸試料Ｆｗ ：１μＬ
・Ｅｘ Ｔａｑ^＊１ ：０．０５μＬ
・伸長反応プライマー（５μｍｏｌ／Ｌ、配列番号２参照）：０．５μＬ
・１０ｘ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ^＊１ ：１．０μＬ
・ｄｄＧＴＰ ｍｉｘ^＊２ ：０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ｅａｃｈ
・Ｈ_２Ｏ ：ｕｐ ｔｏ １０μＬ
＊１：タカラバイオ株式会社製
＊２：Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｓｅｔ（Ｓｉｇｍａ社製）、及びＤｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｓｅｔ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、ｄｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰが１ｍＭとなるように蒸留水を用いて調製し、ｄｄＧＴＰ ｍｉｘとした。

伸長反応によって得られた伸長核酸断片は、得られた反応液中にＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）２．５μＬを添加し、回収した。回収したビーズを、水酸化ナトリウム条件下で、洗浄を行い、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒで懸濁後、９５℃、２分間熱処理して変性し回収した。

＜検出工程＞
回収した伸長核酸断片含有反応液を、リアルタイムＰＣＲを行い、検出した。条件は図２１及び以下の通りである。得られた結果を図２２に示す。
・ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）：１０μＬ
・プライマー１（配列番号３参照） ：４ｐｍｏｌ
・プライマー２（配列番号４参照） ：４ｐｍｏｌ
・ＲＯＸ ｄｙｅ（株式会社ニッポンジーン製） ：０．２μＬ
・ＥＶＡ ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製） ：１μＬ
・伸長核酸断片含有反応液 ：２μＬ
・Ｈ_２Ｏ ：ｕｐ ｔｏ ２０μＬ

図２２に示すように、ＭＢＰ１７０＿Ｕ７において、ＭＢＰ１７０＿ｍ７に対して有意に低いＣｔ値の値を得ることができた。このことから、非メチル化断片のみを検出することができることが示された。

さらに、反応液１中の核酸試料Ｕ７を４０ｆｇ／μＬ〜４０ｎｇ／μＬとなるように調製し、上記と同様の方法で伸長反応、リアルタイムＰＣＲを行い、伸長核酸断片の検出を行なった。結果を図２３に示す。

図２３に示すように、ＤＮＡ濃度依存的なＣｔ値の変化が見られており、定量性のある検出系であることが示された。

本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞ 標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化シトシンであることを検出するための核酸検出方法であって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換工程と、
前記核酸試料に対し、
前記核酸試料の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いて伸長核酸断片を得る核酸伸長工程と、
前記伸長核酸断片のうち、前記標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする核酸検出方法である。
＜２＞ 前記標的核酸中の前記非メチル化シトシンが、ＣＧ配列のシトシンである前記＜１＞に記載の核酸検出方法である。
＜３＞ 前記伸長反応プライマーの５’末端に標識体を有する前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の核酸検出方法である。
＜４＞ 前記伸長反応プライマーの５’末端と標識体との間に、前記核酸試料に含まれない塩基配列を有する前記＜３＞に記載の核酸検出方法である。
＜５＞ 前記標識体が、ビオチン、ジゴキシゲニン、ポリＡ配列である前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の核酸検出方法である。
＜６＞ 前記核酸伸長工程の後に、伸長核酸断片回収手段により前記伸長核酸断片を回収する伸長核酸断片回収工程をさらに含む前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の核酸検出方法である。
＜７＞ 前記伸長核酸断片回収手段が、前記標識体と結合可能な媒体である前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の核酸検出方法である。
＜８＞ 前記伸長核酸断片回収手段が、微粒子である前記＜６＞に記載の核酸検出方法である。
＜９＞ 前記伸長核酸断片回収手段が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体、抗ジゴキシゲニン抗体、及びオリゴＴが化学修飾された磁気ビーズ又はセファロースビーズである前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の核酸検出方法である。
＜１０＞ 前記伸長核酸断片を検出する検出手段が、アガロースゲル電気泳動、リアルタイムＰＣＲ、蛍光標識プローブ法である前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の核酸検出方法である。
＜１１＞ 標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化シトシンであることを検出するための核酸検出方法であって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換手段と、
前記核酸試料に対し、
前記核酸試料の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを含み、核酸伸長反応を行う、
核酸伸長手段と、
前記核酸伸長反応により得られた前記伸長核酸断片のうち、前記標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出する検出手段と、を有することを特徴とする核酸検出装置である。
＜１２＞ 前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに核酸検出方法に用いられる核酸検出キットであって、
前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換工程と、
前記核酸試料に対し、
前記核酸試料の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを含み、核酸伸長反応を行う核酸伸長試薬と、
前記核酸伸長反応により得られた前記伸長核酸断片のうち、前記標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出する検出試薬と、を有することを特徴とする核酸検出キットである。

前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の核酸検出方法、前記＜１１＞に記載の核酸検出装置、前記＜１２＞に記載の核酸検出キットによると、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。

特開２０１０−３５５３３号公報

１０１ 標的核酸のセンス鎖
１０２ 標的核酸のアンチセンス鎖
１０３ 標的核酸の二本鎖核酸
１０５ 非メチル化シトシン
１０６ メチル化シトシン
１０７ ウラシル
１０８ 核酸試料
１０９ 伸長反応プライマー
１１５ タグ配列を有する伸長反応プライマー
１１７ 標識体
１１９ 蛍光標識プローブ

Claims (12)

1. 標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化シトシンであることを検出するための核酸検出方法であって、
   前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換工程と、
   前記核酸試料に対し、
   前記核酸試料の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いて伸長核酸断片を得る核酸伸長工程と、
   前記伸長核酸断片のうち、前記標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出する検出工程と、を含むことを特徴とする核酸検出方法。
2. 前記標的核酸中の非メチル化シトシンが、ＣＧ配列のシトシンである請求項１に記載の核酸検出方法。
3. 前記伸長反応プライマーの５’末端に標識体を有する請求項１から２のいずれかに記載の核酸検出方法。
4. 前記伸長反応プライマーの５’末端と標識体との間に前記核酸試料に対して非相補的な塩基配列を有する請求項３に記載の核酸検出方法。
5. 前記標識体が、ビオチン、ジゴキシゲニン、ポリアデニル酸（ポリＡ）配列である請求項３から４のいずれかに記載の核酸検出方法。
6. 前記核酸伸長工程の後に、伸長核酸断片回収手段により前記伸長核酸断片を回収する伸長核酸断片回収工程をさらに含む請求項１から５のいずれかに記載の核酸検出方法。
7. 前記伸長核酸断片回収手段が、前記標識体と結合可能な媒体である請求項６に記載の核酸検出方法。
8. 前記伸長核酸断片回収手段が、微粒子である請求項６から７のいずれかに記載の核酸検出方法。
9. 前記伸長核酸断片回収手段が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、抗ビオチン抗体、抗ジゴキシゲニン抗体、及びオリゴＴが化学修飾された磁気ビーズ又はセファロースビーズである請求項６から８のいずれかに記載の核酸検出方法。
10. 前記伸長核酸断片を検出する検出手段が、アガロースゲル電気泳動、リアルタイムＰＣＲ、蛍光標識プローブ法である請求項１から９のいずれかに記載の核酸検出方法。
11. 標的核酸中の全てのシトシンが非メチル化シトシンであることを検出するための核酸検出方法であって、
    前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換手段と、
    前記核酸試料に対し、
    前記核酸試料の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを少なくとも用いて伸長核酸断片を得る核酸伸長手段と、
    前記伸長核酸断片のうち、前記標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出する検出手段と、を有することを特徴とする核酸検出装置。
12. 請求項１から１０のいずれかに記載の核酸断片検出方法に用いられる検出キットであって、
    前記標的核酸中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して核酸試料を得る変換工程と、
    前記核酸試料に対し、
    前記核酸試料の一部に相補的な塩基配列を有する伸長反応プライマー、並びに基質としてｄｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰを含み、核酸伸長反応を行う核酸伸長試薬と、
    前記核酸伸長反応により得られた前記伸長核酸断片のうち、前記標的核酸中に非メチル化シトシンのみを有する標的核酸から得られた伸長核酸断片を検出する検出試薬と、を有することを特徴とする核酸検出キット。