KR20160003629A - 단일 분자 조작에 의한 dna 변형 및 단백질 결합의 검출 방법 - Google Patents
단일 분자 조작에 의한 dna 변형 및 단백질 결합의 검출 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 단백질이 특이적 DNA 서열에 결합하는 지를 결정하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 특히 변형들을 특이적으로 인식하는 단백질의 결합(예를 들면 항체)을 통해 DNA 서열에 대한 변형(예를 들면 메틸화)을 동정하고, 또한, 다양한 단백질의 DNA 상의 결합 서열을 동정하는 데 유용하다.
Description
본 발명은 단백질이 특이적 DNA 서열에 결합하는 지를 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 변형들(modifications)을 특이적으로 인식하는 단백질의 결합(예를 들면 항체)을 통해 DNA 서열에 대한 변형들(예를 들면 메틸화)을 동정하고, 또한 다양한 단백질의 DNA 상의 결합 서열을 동정하는 데 유용하다.
DNA에 대한 단백질 결합은 생물학에서의 주요 현상이다; 이것은 세포 및 바이러스 기능을 조절하는 데 기본적인 역할을 한다. 이들은 기본적인 세포 공정, 예를 들면 DNA 복제, 전사, DNA 수선(repair), 및 DNA 재조합 뿐만 아니라, DNA 변형 또는 염색체 구조(architecture)의 유지를 포함한다.
게놈 발현 및 유지를 조절하기 위해 게놈 내 특이적 사이트에 결합하는 몇 가지 단백질들이 있다. DNA 결합 단백질들은 다양하고 중요한 생물학적 기능을 가진 단백질들의 거대 패밀리를 구성한다. DNA 결합 단백질들의 패밀리는, 박테리아, 고세균(archea) 및 진핵생물의 다양한 게놈 중 가장 인기있고 연구되고 있는 것 중 하나이다. 진핵세포 및 원핵세포의 전사 인자와 같은 이들 단백질들의 대부분은, DNA의 윤곽(contour)과 함께 이들의 인식(recongnition)을 수행하기 위해 독립적으로 접혀진 유닛(도메인(domain))을 포함한다. 이들은, DNA 및 RNA 폴리머라제(polymerase), DNA 리가아제(ligase), DNA 헬리카제(helicase), DNA 엔도뉴클레아제(endonuclease) 및 엑소뉴클레아제(exonuclease), 및 DNA 수선 및 재조합 단백질들과 같은, 전사 인자 및 DNA 프로세싱 단백질로서 알려진 중요한 유전자 조절 단백질들을 포함한다.
이들 단백질들에 의해 결합되는 사이트를 동정하는 것은, 힘든 일인 것으로 판명되었다. 예를 들면, 인간 게놈 내에, 700 이상의 예상되는 C2H2 아연-집게(finger) 전사 인자가 있지만(Tadepally et al., BMC Evol. Biol., 8: 176, 2008), 이들 중 오직 약 10% 만이 공지된 결합 모티프(motif)들을 가진다(Matys et al., Nucleic Acids Res., 34: D108-D110, 2006). 또한, DNA에 결합하는 단백질의 열역학적 평형(thermodynamical equilibrium) 특성은 잘 알려져 있는 반면, 이들의 결합 및 풀림(unbinding)의 반응속도론(kinetics)을 측정하는 것은 보다 도전적인 문제이다.
DNA-단백질 상호작용은 다양한 방법들, 예를 들면 겔 이동 분석(gel-shift assay), 족적법(footprinting) 및 전사 활성화(transcriptional activation)를 사용하여 연구된다(Carey et al., Cold Spring Harb Protoc, 2012(7): 733-57, 2012). 이들 방법 각각은 결합의 위치 또는 효과에 대한 명확한 정보에 기여할 수 있는 반면, 특이적 결합을 정량적으로 측정하는 간단한 방법을 제공하지 못한다. 형광 편광/이방법(anisotropy)은, 필터 결합, 전기 영동, 또는 침전 단계를 사용하지 않고, 용액 내에서 직접 DMA-단백질 결합을 정확히 측정하기 위한 빠르고, 비방사성인(non-redioactive) 방법을 제공한다(Guest et al., 1991; Heyduk and Lee, 1990; Letilly and Royer, 1993; Lundblad et al., 1996; Royer et al., 1992).
게놈 정보가 다른 생체 분자의 합성을 지향하는 분자 메카니즘은, 지난 30년에 걸쳐 많은 분자 생물학 연구의 초점이었다. 이전 연구들은, 생성되는 일반적인 원리 이어서 전사, 크로마틴 재편성(remodeling), 메신져 RNA 스플라이싱(splicing), DNA 복제 및 다수의 기타 게놈 공정으로의 이해를 제공함과 함께, 개개의 유전자에 전형적으로 집중해왔다. 비록 많은 이러한 원리들이 추가의 유전자가 조사될 때, 유효한 것으로 보이지만, 이들은 일반적으로 생물학적 기능에 대한 게놈적(genome-wide) 이해를 제공하지는 않았다. 반면, 전사 및 조절 정보의 시스템적 분석은 유전자 및 조절 영역(region)의 동정을 위해 필수적이고, 인간 생물학 및 질환의 연구를 위한 중요한 자원이다. 상기 분석은 또한, 유전자의 조직 및 가변성의 종합적인 관점 및 세포의 상황(context), 종(species) 및 개체(individuals)에 걸친 조절 정보를 제공할 수 있다.
예를 들면 인간 게놈 내 모든 전사-인자-결합 사이트를 동정하기 위한, 엔코드(encode) 프로젝트(DNA 요소 백과사전)와 같은 게놈적 노력은, 다루기 힘들고 매우 노동 집약적인 것으로 판명되었다(The ENCODE Project Consortium, Nature, 489:57-74, 2012).
이에 따라, 단백질/핵산 상호작용을 검출하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법에 대한 요구가 여전히 있다.
본 발명은 물리적 조작에 의해 핵산 분자에 대한 단백질의 결합의 결정을 위한 방법에 관한 것이다.
물리적 기술 및 전자적 처리에 기초한, 본 발명에 따른 방법은, 화학적인 또는 생화학적인 현재의 접근법과는 다르다. 이것은 종래 기술에 대해 다수의 이점을 제공한다:
1) 단일 핵산 분자에 대한 단일 단백질 또는 단백질 복합체(complex) 분자의 검출에 기초하기 때문에 매우 민감하다. 단일 분자를 사용하는 것은, 단백질이 그 핵산 타겟을 찾는 데 요구되는 시간 및 그 타겟에 머무르는 시간 뿐만 아니라 결합 사건(event)의 정확한 위치를 측정하는 능력을 제공한다.
2) (형광단(fluorophore) 또는 몇몇 다른 기들을 가진) 값비싼 표지(labelled) 뉴클레오티드를 사용하지 않는다.
3) 이중 가닥 핵산 분자의 2개의 말단 사이의 거리를 측정함에 의해, 이중 가닥 핵산을 따라 단백질 결합 사이트의 정확한 국재화(localization)(bp 로)를 측정할 수 있다.
4) 상기 측정은 초 시간 스케일에서 주기적으로 반복될 수 있고, 이에 따라 위양성(false positive)의 제거, 개선된 통계 및 기기 표류(instrumental drift)의 현저한 감소를 가져온다.
5) 상기 실험은 동일한 분자 상에서 수회 반복될 수 있고, 이에 따라 통계 및 측정의 신뢰성을 개선시킨다.
6) 임의의 핵산 결합 단백질의 검출을 가능하게 한다. 이에 따라 핵산의 구조적인 변형을 특이적으로 인식하는 단백질들이 동정될 수 있고, 상기 구조적인 변형의 사이트의 검출로 이어진다.
본 발명은, 단백질이 결합되는 서열화된 핵산 분자의 사이트 상의 물리적 국재화에 기초한, 핵산 서열에 대한 단백질의 결합의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 내용에서, '결합(binding)'은 거대분자들 사이(예를 들면 단백질 및 핵산 사이)의 비공유결합적 상호작용을 나타낸다. 이러한 상호작용은, 10-6 M-1 이하의 해리 상수(dissociation constant, Kd)에 의해 일반적으로 특성화된다. '친화성(affinity)'은 결합 강도를 나타낸다: 증가된 결합 친화성은 보다 낮은 Kd와 상호 관련성이 있다.
'핵산 분자에 대한 단백질의 결합의 검출'은, 본 명세서 내에서, 상기 단백질 및 상기 핵산 분자 사이의 상호작용의 존재 또는 부존재에 대한 일부 정보의 획득을 직접 또는 간접적으로 초래하는 모든 활동을 의미한다. 상기 결합의 검출은, 예를 들면 결합 반응의 반응속도론적 파라미터 또는 단백질에 의해 결합된 사이트의 서열과 같은 부가 정보의 결정에 관련될 수도 또는 관련되지 않을 수도 있다. 당업계의 통상의 기술자에게 명확하겠지만, 본 발명의 방법은 상기 결정이 용이하게 수행될 수 있도록 한다.
본 발명은 변성된(denatured) 이중 가닥 핵산의 두 가닥이 적절한 조건 하에서 재혼성화하는(re-hybridize) 것의 관찰에 기초한다. 만일 분자가 재생(re-naturation) 단계 동안 상기 변성된 이중 가닥 핵산 분자의 임의의 가닥에 결합되면, 상기 재혼성화는 오직 부분적일 것이다. 발명자들은 이제, 특정 조건 하에서, 영속적 또는 일시적인, 재혼성화 내 이러한 중지(pause)가 단백질과 상기 변성된 이중 가닥 핵산 분자 사이의 상호작용을 검출하기 위해 사용될 수 있음을 알았다. 본 발명에 따르면, 이중 가닥 핵산 분자의 재혼성화의 차단(blockage)을 검출하는 것이 가능하고; 상기 차단과 관련된 물리적 파라미터(예를 들면 차단의 지속(duration), 이중 가닥 핵산 분자 상의 차단의 위치)는 이어서 단백질과 핵산의 서열 사이의 상호작용을 검출하도록 한다.
이에 따라, 본 발명은 핵산 분자에 대한 단백질의 결합의 결정 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 변성된 이중 가닥 핵산 분자의 재생의 차단을 검출하는 단계를 포함한다.
'변성(denaturation)'은, 본 명세서 내에서, 가닥 사이의 수소 결합 대부분이 깨질 때 나타나는 이중 가닥 핵산 분자의 2개의 가닥의 분리 공정을 의미한다. 상기 변성 공정은, 본 명세서 내에서 이중 가닥 핵산 분자의 변성으로부터 나타나는 2개의 분리된 상보(complementary) 가닥을 의미하는, 변성된 핵산 분자를 얻는다. '재생'은, 본 명세서 내에서, 2개의 분리된 상보 가닥이 혼성화를 통해 이중 나선으로 개량하는 공정을 나타낸다. 본 명세서 내에서 사용된 바와 같이, '혼성화'는 핵산의 2개 이상의 상보 가닥 사이의 비공유결합(non-covalent), 서열 특이 상호작용을 단일 혼성체(hybrid)로 성립시키는 공정이다.
핵산을 변성시키기 위한 통상의 기술자에게 공지된 몇몇 가능성(possibilities)이 있다. 가장 바람직한 방식으로, 2개의 가닥을 물리적 힘을 받게 하여 분리시킨다. 본 발명에 따른 '물리적 힘'은, 움직임, 방향 또는 기하학적 작도(construction)에 관해, 물체가 특정 변화를 겪도록 하는 임의의 영향력이다. 본 발명에 따른 힘이 다른 물리학적 파라미터, 예를 들면 온도(그것에 가해지는 영향력이라기 보다는 물질의 직접적인 속성임)와는 다른 것임은 통상의 기술자에게 명확할 것이다. 본 발명에 따른 물리적 힘은 마찰, 장력(tension), 수직력(normal force), 공기저항력, 적용력(applied force) 및 탄성력과 같은 힘을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 물리적 힘은 장력이다. 이러한 구현예에 따라, 상기 이중 가닥 핵산의 자유(free) 말단을 잡아 찢을 수 있고, 이에 따라 염기 쌍 사이의 모든 결합을 끊고, 이중 가닥 핵산을 연다.
본 발명은 임의의 형태의 이중 가닥 핵산에 적용한다. 가장 흔하게, 상기 이중 가닥 핵산은 DNA일 것이지만, 본 발명은 또한, 완전히 쌍을 이루거나 완전히 쌍을 이루지는 않은 단일 가닥 DNA-단일 가닥 DNA 듀플렉스(duplex), 또는 대안적으로, 완전히 쌍을 이루거나 완전히 쌍을 이루지는 않은 단일 가닥 DNA-단일 가닥 RNA 듀플렉스, 또는 대안적으로, 완전히 쌍을 이루거나 완전히 쌍을 이루지는 않은 단일 가닥 RNA-단일 가닥 RNA 듀플렉스에 적용하는 것으로 이해된다. 또한, 상기 듀플렉스는 다른 기원의 샘플로부터 얻어진 2개의 단일 가닥의 적어도 부분적인 리페어링(re-pairing)으로 이루어질 수 있다. 마지막으로, 본 발명은 또한 단 하나의(sole) 단일 가닥 DNA 또는 단 하나의 단일 가닥 RNA의 이차 구조에 적용한다.
이에 따라, 본 발명의 방법은, 핵산 분자에 대한 단백질의 결합의 검출 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
- 분자에 물리적 힘을 적용시켜 이중 가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계; 및
- 상기 이중 가닥 핵산의 재생의 차단을 검출하는 단계
를 포함한다.
유리하게는, 상기 방법은 상기 차단의 위치를 결정하는 추가의 단계를 포함한다.
DNA 분자에 대한 단백질의 결합을 분석하기 위한 이러한 형태의 방법에서, 리페어링을 용이하게 하기 위해, 상기 이중 가닥 DNA 분자의 자유 말단(즉, 지지체에 부착되지 않은 말단)이, 잡아 찢기 전, 다른 것에 공유결합적으로 또는 준(quasi) 공유결합적으로 연결되기 위해 배열하는 것은 유리할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 헤어핀(hairpin)이다. 만일 상기 이중 가닥 핵산이 본 발명의 내용에 도식적으로 나타내어지는 것을 원한다면, 열린(또는 닫힌) "지퍼(zip fastener)"에 비유하는 것이 가능하다: 상기 이중 가닥 핵산의 변성은 언지핑(unzipping)이고, 상기 재생은 리지핑(re-zipping)이다.
본 발명자들은, 특정 조건 하에, 분자가 변성된 이중 가닥 핵산 분자에 결합될 때, 상기 이중 가닥 핵산 분자의 재생이 차단되는 것을 알았다. 결합된 분자는, 상기 변성된 이중 가닥 핵산 분자 상의 특이적 서열과 친화성을 가진 임의의 형태의 분자, 예를 들면 핵산, 단백질 또는 저분자(small molecule)일 수 있다.
본 발명의 제 1 태양에서, 단백질은 상기 이중 가닥 핵산의 재생을 차단하기 위해 사용된다.
본 명세서 내에서 사용된 바와 같은, 용어 '단백질', '단백질들', '폴리펩타이드' 및 '폴리펩타이드들'은 동의어이고, 펩타이드 결합을 통해 사슬로 공유결합으로 연결된 아미노산들의 고분자를 나타낸다. 펩타이드 결합은 하나의 아미노산의 카복실기와 다음 아미노산의 아미노기 사이에 형성된다. 상기 용어들은 또한 하나 이상의 아미노산들이 대응하는 자연적으로 나타나는 아미노산들의 변형된 유도체 또는 화학적 유사체인 아미노산 고분자에 적용한다. 용어 "아미노산들" 및 "아미노산"은 D 및 L 입체이성질체 형태로, 모두 자연적으로 나타나는 알파 아미노산들 및 이들의 유사체 및 유도체를 나타낸다. 유사체(analog)는 아미노산 내 원자의 보통 유사한 물성을 갖는 다른 원자로의 치환으로서 정의된다. 유도체(derivative)는 그것에 부착된 다른 분자 또는 원자를 가지는 아미노산으로서 정의된다. 유도체는, 예를 들면 아미노기의 아세틸화, 카복실기의 아민화, 또는 시스틴을 형성하기 위한 2개의 시스테인 분자의 황 잔기의 산화를 포함한다.
단백질은 몇 가지 기능을 가질 수 있다. '결합 단백질'은 다른 분자에 비공유결합으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들면 DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, (다합체(multimer)를 형성하기 위해) 그 자체에 결합할 수 있거나, 및/또는 다른 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자들에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 하나 이상의 형태의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들면 아연 집게 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 가진다. 이에 따라, 본 발명에 따른 '핵산-결합 단백질'은 핵산과 상호작용할 수 있는 단백질이다. 본 발명에 따른 '이중 가닥 핵산-결합 단백질'은 이에 따라 이중 가닥 핵산과 상호작용할 수 있는 단백질인 반면, 본 발명에 따른 '단일 가닥 핵산-결합 단백질'은, 이에 따라 단일 가닥 핵산과 상호작용할 수 있는 단백질이다.
상기 구현예에 따라, 본 발명의 방법은 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 대한 단백질의 결합의 결정 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
a) 상기 분자에 물리적 힘을 적용시켜, 상기 서열을 포함하는 상기 이중 가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계;
b) 상기 단백질을 제공하는 단계;
c) 상기 단백질의 존재 하에 상기 이중 가닥 핵산 분자를 재생하는 단계; 및
d) 상기 이중 가닥 핵산의 재생의 차단을 검출하는 단계
를 포함한다.
유리하게는, 상기 방법은 차단의 위치를 결정하는 추가의 단계를 포함한다.
당업계에 잘 알려져 있는 것과 같이, 핵산-결합 단백질들은 단일 가닥 핵산들(ssDNA 및 ssRNA)을 결합할 수 있는 지 또는 이중 가닥 핵산들(dsDNA, dsRNA, DNA/RNA 혼성체 등)을 결합할 수 있는 지로 구별될 수 있다.
본 발명의 방법의 제 1 구현예에서, 변성된 이중 가닥 핵산의 재생을 차단하기 위해 사용된 단백질은 단일 가닥 핵산을 결합할 수 있는 단백질이다.
단일 가닥 핵산에 대해 친화성을 가지는 핵산-결합 단백질들은, 변성된 이중 가닥 분자 그 자체와 상호작용할 수 있고, 이에 따라 상기 이중 가닥 핵산의 재생의 차단을 가져올 것이다. 통상의 기술자는, 비록 상기 단백질이 특이적 서열에 결합하지 않더라도, 본 발명이 결합 반응 속도론의 파라미터를 쉽고 정확하게 결정할 수 있게 하는 것임을 인식할 것이다. 실제로, 단일 가닥 핵산-결합 단백질들은, 가장 흔하게, 특이적 서열에 대해서 친화성을 갖지 않고, 오히려 일반적으로 핵산들에 대해 친화성을 갖는다. 예를 들면 헬리카제는 dsDNA를 풀기 위해 ssDNA 갭에 결합하는 것으로 알려져 있다. 박테리아 단일 가닥 DNA-결합 단백질들 또는 SSB는, 이른 어닐링(premature annealing)을 막고, 상기 단일 가닥 DNA가 뉴클레아제에 의해 절단되는 것을 보호하고, 상기 DNA로부터 2차 구조를 제거하기 위해, DNA의 단일 가닥 영역에 결합한다. DNA 이중 가닥 절단 복구(break repair) 및 상동재조합(homologous recombination)을 위해 중요한 단백질, Rad52 단백질은, 단일 가닥 DNA 말단들을 결합하고, 상보적인 DNA 가닥의 어닐링을 위해 필요한 DNA-DNA 상호작용을 중재한다.
이들 단일 가닥 핵산-결합 단백질들은 핵산에 대해 일반적인 친화성을 가지고, 이는 본 발명의 내용에서, 상기 핵산의 서열에 상관없이, 상기 단백질들이 단일 가닥 핵산을 결합할 수 있음을 의미한다. 상기 비서열특이성(non sequence-specific) 핵산 결합 단백질은, 다른 서열들에 대해 100폴드(fold) 미만, 보통 10폴드 미만으로 다양한 해리 상수를 가진 복수의 비관련(unrelated) DNA 서열에 결합한다.
한편, 몇몇 핵산-결합 단백질들은 특이적 서열을 함유하는 핵산 분자들에 대해 친화성을 갖는다(즉 이들은 오직 상기 서열을 포함하는 핵산을 인식하고 이에 결합한다). 전체적으로 상호작용이 서열 특이적인 한, 모든 성분들의 결합 상호작용이 서열 특이적일 필요는 없다(예를 들면 DNA 골격 내 포스페이트 잔기와 접촉). 실제로 많은 단일 가닥 핵산-결합 단백질들은 핵산들에 대해 오직 일반적인 친화성을 가지는 반면, 이들 단백질들의 일부는 특이적 서열에서 단일 가닥 핵산들에 결합할 수 있다. 서열특이적 핵산-결합 단백질은 이에 따라, 비관련 서열에 대해서 보다 적어도 100 폴드 큰 친화성을 가진, 서로에 높은 정도의 서열 동일성(identity)(예를 들면 적어도 약 80% 서열 동일성)을 나타내는 특이적 서열의 패밀리 또는 특이적 서열에 결합한다. 특이적 서열(들)에 대해 서열특이적인 핵산-결합 단백질의 해리 상수는 보통 약 100 nM 미만이고, 10 nM, 1nM, 1pM, 또는 1fM 만큼 작을 수 있다.
많은 핵산-결합 단백질들은 단일 가닥 핵산들을 결합할 수 없다. 이중 가닥 핵산들에 친화성을 갖는, 이들 단백질들은, 변성된 이중 가닥 분자 그 자체와 상호작용할 수 없을 것이다. 이들 단백질들은, 아마도 이들 조건 하에 상기 이중 가닥 핵산의 재생의 차단을 유발시키지 않을 것이다.
이들 단백질들 대부분은 특이적 이중 가닥 핵산 서열을 인식하고 결합한다. 예를 들면 이중 가닥 DNA-결합 단백질들은 새로운 단백질들의 발현의 조절에 있어서 중요한 역할을 한다. 이들 단백질들은 다양한 구조의 모티프들에 의해 DNA와 상호작용하고, 그들이 결합하는 DNA 서열의 물성 및 위치에 따라, 메신져 RNA의 전사를 자극하거나 억제할 수 있다.
이 경우에, 상기 이중 가닥 분자를 변성시킨 후, 단일 가닥 핵산 분자를 상기 이중 가닥 핵산-결합 단백질과 함께 제공하는 것이 유리할 수 있다. 실제로 상기 단일 가닥 핵산이 변성된 이중 가닥 핵산의 가닥 중 하나에 상보적인 서열과 함께 혼성화하고, 이에 따라 단백질에 의해 결합될 수 있는 이중 가닥 핵산 혼성체를 형성할 수 있음은 당업계에 잘 알려져 있다. 만일 재생 공정을 차단하기 위해 충분히 길다면, 이 단일 가닥 핵산은 임의의 길이일 수 있다. 바람직하게는 상기 단일 가닥 핵산의 길이는 3 내지 50 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 3 내지 45 뉴클레오티드, 3 내지 40 뉴클레오티드, 3 내지 35 뉴클레오티드, 3 내지 30 뉴클레오티드, 3 내지 25 뉴클레오티드, 3 내지 20 뉴클레오티드, 3 내지 15 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 3 내지 12에 포함될 것이다. 본 발명의 단일 가닥 핵산은 특히, 천연 또는 변형된, DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 상기 단일 가닥 핵산은 또한, 리보오스 모이어티(moiety)가 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 추가의 다리(extra bridge)로 변형된 뉴클레오티드인, 잠금 핵산(locked nucleic acid, LNA), 또는 골격이 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복하는 N-(2-아미노에틸)-글리신 유닛으로 구성된 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid, PNA)과 같은 변형된 뉴클레오티드들로 만들어질 수 있다.
단일 가닥 핵산 분자가 이에 따라 재생 전 변성된 이중 가닥 핵산에 첨가될 때, 재혼성화의 차단은 상기 단일 가닥 핵산 분자의 서열이 적어도 상기 이중 가닥 핵산 분자의 서열의 부분에 상보적인 것을 나타낸다.
본 발명자들은, 이중 가닥 핵산-결합 단백질이 존재할 때, 상기 변성된 이중 가닥 핵산 및 상기 단일 가닥 핵산 분자 사이에 형성된 혼성체를 결합할 수 있다는 것을 보여주었다. 상기 단백질과 상기 핵산 혼성체 사이의 상호작용은, 차단의 지속의 변화(alteration)를 가져온다. 보통 이러한 상호작용은 재생의 증가된 차단을 초래한다. 예를 들면, 프리마제(primase)는, 검출되기에 충분히 오랜 시간 동안 헤어핀 재혼성화를 차단하기 위해 다른 경우라면 충분히 안정되지 않았을 DNA 올리고들을 안정하게 할 것이다. 마찬가지로, 프라이머로서 사용된 작은 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 대한 DNA-폴리머라제의 결합은 그 안정성을 증가시킨다. 한편, 차단의 지속은 또한 감소될 수 있다. 실제로, 본 발명자들은, 몇몇 헬리카제의 결합이 상기 혼성체의 불안정화를 유발하는 것을 보여주었고, 이는 보다 짧은 차단 시간 내 번역된다(translated).
상기 바람직한 구현예에 따라, 본 발명의 방법은
a) 분자에 물리적 힘을 적용시켜, 특이적 서열을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계;
b) 상기 단백질 및 상기 핵산 서열에 대응하는 단일 가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
c) 상기 단백질 및 상기 단일 가닥 핵산 분자의 존재 하에 상기 이중 가닥 핵산 분자를 재생하는 단계; 및
d) 상기 이중 가닥 핵산의 재생의 차단을 검출하는 단계
를 포함한다.
상기 구현예는, 상기 이중 가닥 핵산 내에 포함된 서열에 대한 상기 단백질의 결합의 결정을 허용하기 때문에 특히 유리하다.
전형적인 형태에서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 2개의 고체 기재(substrate)(예를 들면 현미경 슬라이드, 마이크로피펫, 마이크로입자) 상에 특이적으로 고정될(anchored) 수 있다. 말단 중 하나는 표면에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있고, 다른 말단은 이동하는 표면에 직접 또는 간접적으로 부착된다. 상기 구현예에서, 지지체들이 멀어질 때 장력이 상기 이중 가닥 핵산의 양 말단에 적용된다. 상기 장력이 문턱(threshold) 값 보다 높을 때, 2개의 가닥이 분리되고, 상기 핵산 분자는 변성된다. 적용된 장력은 바람직하게는, 15 pN 이상이고, 보다 바람직하게는 16 pN 이상이고; 보다 더 바람직하게는 17 pN 이상이고; 매우 바람직한 태양에서 18 pN 이상이다. 이 힘은 온도, 뉴클레오티드 형태 및 버퍼에 따라 변할 수 있지만, 2 개의 가닥의 분리를 위해 통상의 기술자는 이들 파라미터들에 관해 상기 힘을 용이하게 적용시킬 것이다. 반명에, 상기 장력이 최소값 이하로 감소될 때, 변성된 이중 가닥 핵산의 2개의 가닥은 재혼성화할 수 있다. 상기 2개의 가닥의 재혼성화를 얻기 위해, 12 pN 이하의 장력이 바람직하게는 적용되고; 보다 바람직하게는 11 pN 이하이고; 보다 더 바람직하게는 10 pN 이하이다.
가장 바람직하게는, 상기 이중 가닥 핵산은 헤어핀이다. 본 명세서 내에서 사용된 바와 같이 '헤어핀'은, 하나의 가닥의 5' 말단이 쌍을 이루지 않은(unpaired) 루프를 통해 다른 가닥의 3' 말단에 물리적으로 연결된 이중 나선을 의미한다. 상기 물리적 연결은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 바람직하게는, 상기 물리적 연결은 공유 결합이다. 이에 따라, 헤어핀은 이중 가닥 스템(stem) 및 쌍을 이루지 않은 단일 가닥 루프로 이루어진다. 헤어핀에서, 루프 내 맞물려 있지 않은 2개의 가닥의 말단들은 자유롭고, 이에 따라 잡아 찢을 수 있다. 이것은 상기 이중 가닥 핵산의 쌍을 이루지 않도록 하고, 이에 따라 변성된 이중 가닥 핵산 분자를 얻는다. 문턱 값보다 높은 힘으로 상기 핵산 분자의 각 말단을 잡아당김에 의해 헤어핀 이중 가닥 핵산 분자를 완전히 여는 것이 가능하다. 분자에 적용된 장력이 최소값 미만으로 감소될 때, 상기 핵산 분자는 헤어핀을 변형하기 위해 재혼성화한다. 상기 변성된 핵산 분자(예를 들면 ssDNA)에 결합된 단백질의 존재는 재혼성화에서의 중지를 가져온다. 마찬가지로, 열린 페어핀의 핵산 가닥 중 하나에 혼성화된 단일 가닥 핵산 분자의 존재는 재혼성화에서 중지로 이어지고, 상기 중지의 지속은, 이중 가닥 핵산-결합 단백질이 복합체에 결합될 때 변형된다(즉 증가되거나 감소됨). 따라서, 상기 중지의 지속에서의 변화의 검출은 단백질이 적어도 이중 가닥 스템의 부분에 결합되는 것을 나타낸다.
이 점에 있어서, 상기 헤어핀이 짧은 시간 후, 예를 들면 1초 후 재접힘(refold)하도록 루프 서열 및 길이를 고안하는 것이 유리하다. 이 효과를 위한 방법은 종래 기술(예를 들면 Woodside et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103 (16): 6190-6195, 2006)에 기재되어 있다. 상기 힘이 열림에서부터 테스트 값까지 감소될 때, 열린 헤어핀의 연장(extension)은 단일 가닥 DNA의 탄성 때문에 다양하다. 헤어핀이 재접힘하기 전 약간의 지연은 사용자가 차단 상태를 검출하기 위해 사용된 것과 동일한 힘에서 헤어핀 연장을 결정하도록 한다.
헤어핀을 사용하는 것은 특히 쌍을 이룸 및 쌍을 이루지 않음의 사이클들을 수행하고, 이에 따라 신호/노이즈(signal/noise) 비를 개선시키는 것을 가능하게 한다.
이중 가닥 핵산의 자유 말단들이 함께 연결되도록 하는 기술은 공지되어 있고, 일부는 하기에 보다 상세히 기재될 것이다.
차단의 결정은, 본 명세서 내에서, 차단과 관련된 물리적 파라미터의 결정을 의미한다. 하나의 유용한 파라미터는 이중 가닥 핵산 분자 상의 차단의 위치이고, 상기 위치는 상기 열린 이중 가닥 핵산 분자 상의 단일 가닥 핵산 분자의 혼성화 또는 상기 열린 이중 가닥 핵산 분자에 대한 단백질의 결합의 위치에 대응한다. 실제로, 본 발명자들은 재생에서의 중지가 나타나는 이중 가닥 핵산 상의 위치는 정확히 결정될 수 있음을 알아냈다: 헤이핀의 사용은 통상의 기술자에게 변성/재생 공정 동안 언제라도 헤어핀의 두개의 자유 말단 사이에 물리적 거리를 측정하기 위한 수단을 제공한다.
이에 따라, 본 발명에 따라 상기 방법이 차단의 위치를 결정하는 추가의 단계를 포함하는 것은 특히 유리하다.
상기 바람직한 구현예에 따라, 본 발명은 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 대한 단백질의 결합의 결정 방법을 제공하고, 상기 방법은
a) 상기 분자에 물리적 힘을 적용시켜 핵산 서열을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계;
b) 상기 단백질을 제공하는 단계;
c) 상기 단백질의 존재 하에 상기 이중 가닥 핵산 분자를 재생하는 단계;
d) 상기 이중 가닥 핵산의 재생의 차단을 검출하는 단계; 및
e) 상기 이중 가닥 핵산 분자 상의 상기 차단의 위치를 결정하는 단계
를 포함한다.
'자유 말단'은, 본 명세서 내에서, 다른 가닥의 맨 끝에 공유결합으로 연결되지 않은 하나의 가닥의 말단을 의미한다: 상기 설명된 바와 같이 이들 자유 말단은 각각 다른 표면에 결합될 수 있다. 예를 들면 이들 표면 중 하나는 이동할 수 있는 반면, 다른 것은 이동하지 않을 수 있다. 이에 따라, 통상의 기술자는 헤어핀 이중 가닥 핵산의 자유 말단들 사이의 거리를 측정하기 위해, 두 표면 사이의 거리를 단순히 측정하는 것이 가능하다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
이 거리는, 상기 헤어핀 분자가 완전히 변성될 때, 상기 헤어핀 핵산이 이어서 완전히 연장되기 때문에, 최대(Zhigh(Fopen))이다; 상기 헤어핀 분자가 완전히 재생할 때 최소(Zlow(Ftest))이다. 상기 단일 가닥 핵산이 동일한 탄성 특성을 가지도록, 동일한 힘 Ftest에서 모든 길이 비교를 수행하는 것이 유리하다. 루프 닫힘에서의 지연을 사용하여, 통상의 사용자들은 Zhigh(Ftest)를 측정할 수 있다. 마찬가지로, 재생 공정이 일시적으로 중지될 때 2개의 자유 말단들 사이의 거리가 측정될 수 있다: 예상대로, 이 거리(z)는 Zhigh 내지 Zlow 사이에 포함된다(모든 z는 F=Ftest로 측정된다). 상기 거리(z)가, 단일 가닥 핵산이 상보적인 서열의 또는 단일 가닥 핵산-결합 단백질의 결합 사이트의 헤어핀 분자 내 국재화에 의해 변한다는 것은 곧 명백하다. 만일 상기 단백질이 헤어핀의 자유 말단 가까이에 위치되어 있는 서열에 결합되면, 자가(self) 재혼성화 공정은 완전한 헤어핀이 변형되기 전에 바로 차단되고; 이 경우에, zpause는 최소이다. 반면에, 만일 상기 단백질이 쌍을 이루지 않은 루프 가까이에 있는 헤어핀의 부분에 결합한다면, 재생 공정은 상기 헤어핀이 완전히 또는 거의 완전히 변성된 상황에서 저지될 것이고; 이 경우에 zpause는 최대이다. 마찬가지로, 만일 상기 단일 가닥 핵산이 헤어핀의 자유 말단 가까이에 위치된 서열과 혼성화하면, 자가 재혼성화 공정은 완전한 헤어핀이 변형되기 전 바로 차단되고; 이 경우에, zpause는 최소이다. 반면에, 만일 상기 단일 가닥 핵산이 쌍을 이루지 않은 루프 가까이에 있는 헤어핀의 부분과 혼성화한다면, 상기 재생 공정은, 상기 헤어핀이 완전히 또는 거의 완전히 변성된 상황에서 저지될 것이고; 이 경우에, zpause는 최대이다(도 1).
다수의 염기를 가진 이중 가닥 핵산 분자 내 물리적 거리를 정확히 상호 관련시키는(correlate) 것이 가능하다. 예를 들면, 0.8 nm의 거리는, 10 pN 힘 하에, 단일 가닥 핵산 내 2개의 연속적인 뉴클레오티드(1 bp)에 의해 걸쳐진(spanned) 거리에 대응한다. 힘에 대한 연장의 정확한 측정(calibration)은 단일 가닥 핵산의 탄성에 의해 주어진다. 따라서, 부분적으로 리지핑된 이중 가닥 핵산 분자의 2개의 자유 말단 사이의 거리를 단순히 측정함에 의해, 어디서 재생이 차단되는 지를 정확히 결정하는 것이 가능하다.
이에 따라, 일 구현예에서, 본 발명은 핵산 분자에 대한 단백질의 결합의 결정 방법으로 이루어지고, 여기서 상기 이중 가닥 핵산 분자는 우선 물리적 힘의 적용에 의해 변성되고, 이어서 상기 단백질, 그리고 선택적으로 단일 가닥 핵산의 존재 하에 재혼성화되고, 재혼성화에서 차단의 존재가 검출된다. 일 태양에서, 부분적으로 재생된 이중 가닥 분자의 2개의 말단 사이의 거리는 재생 공정이 차단될 때 결정된다. 바람직하게는 상기 분자의 2개의 말단 사이의 거리는, 상기 분자가 완전히 변성될 때 결정된다. 보다 바람직하게는, 2개의 거리들이 비교되고, 차단의 위치가 결정된다. 보다 바람직하게는, 완전히 연장된 루프 및 기준(reference) 혼성화 위치 사이의 거리가 측정되고 차단의 위치를 결정하기 위해 사용된다. 보다 더 바람직하게는, 2개의 기준 혼성화 위치 사이의 거리가 측정되고, 차단의 위치를 결정하기 위해 사용된다.
분자를 따라 그 위치 이외에, 재생시 상기 차단과 관련된 가장 유용한 파라미터는 상기 재생이 차단되는 동안의 기간이다(본 명세서 내에서 재생시 중지의 지속으로서 나타냄). 실제로, 상기 재혼성화가 차단되는 동안의 기간을 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 통상의 기술자는 이중 가닥 핵산의 2개의 말단 사이의 거리는 상기 정의된 바와 같이 z인 동안의 기간(즉 Zhigh 내지 Zlow 사이에 포함되는 중간값)을 결정할 수 있다.
상기 차단이 변성된 이중 가닥 핵산 및 상보적인 단일 가닥 핵산 사이의 혼성화에 의해 일어날 때, 상기 차단의 지속은 2개의 서열 사이의 상보성(complementarity)의 정도에 의존한다. 상보성이 보다 높을 수록, 2개의 분자 사이에 확립된 결합의 수도 커지고, 이에 따라 상기 지속이 길어진다. 또한 상기 차단 시간은 2개의 서열 사이의 상보성 영역의 길이에 의존될 것임은 명백하다. 상기 영역이 길수록, 2개의 분자 사이에 확립된 결합의 수도 커지고, 이에 따라 상기 지속이 길어진다. 따라서, 특정 조건 하에, 재생 중지의 지속이 거의 영속적일 것임은 용이하게 생각할 수 있다. 특히, 상기 단일 가닥 핵산이, 상기 변성된 이중 가닥 핵산과 혼성화할 수 있는, 20 초과의, 바람직하게는 25 초과의, 보다 더 바람직하게는 30 초과의 뉴클레오티드를 포함할 때, 상기 단일 가닥 핵산은 상기 이중 가닥 핵산에 적용된 힘이 Ftest로 감소될 때조차 (수분 동안) 이중 가닥 헤어핀에 계속 혼성화하고 있고, 이에 따라 상기 이중 가닥 헤어핀의 자가 재혼성화를 막는다. 상기 경우에, 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 배출하는 수초 동안 상기 힘이 0.5 또는 1pN으로 감소되는 제 3 상태(phase)를 추가시키기 위해 또는 상기 단일 가닥 핵산 분자를 꺼내기 위해 효소를 사용하는 것은 유리할 수 있다. 이에 따라 상기 단일 가닥 핵산 분자의 배출은 쌍을 이룸 및 쌍을 이루지 않음의 사이클을 수행하여 이에 따라 신호/노이즈 비를 개선하는 것을 가능하게 한다.
상기 중지의 지속은 또한 반응 조건에 따라 다양할 수 있다. 상기 지속은 온도가 증가할 때 감소될 것이다. 마찬가지로, 상기 버퍼 조건이 또한 상기 중지의 지속을 조절할 수 있다: 예를 들면, 마그네슘, 베타인 및 테트라메틸암모늄 클로라이드(TMAC는 몰 농도에서 사용됨)는 차단 시간을 증가시킨다. 이들 화합물은 GC 보다 AT 쌍을 보강하고, 이에 따라 이들 쌍들 사이의 강도에서의 차이를 저감시킨다. 그러나, 온도 및 버퍼가 고정될 때, 상기 중지의 지속은 오직 변성된 이중 가닥 핵산 상의 잡아당기는 힘 및 단일 가닥 핵산과의 상보성에 의존할 것이다. 사실, 본 발명자들은 힘이 저감됨에 따라 상기 차단 시간이 지수적으로(exponentially) 감소하는 것을 보여주었다.
마지막으로, 상기 중지의 지속은 또한 단백질, 변성된 이중 가닥 핵산 및 상보적인 단일 가닥 핵산 사이에 형성된 복합체의 물성에 따라 의존될 것이다. 상기 이중 가닥 핵산-결합 단백질의 존재는 상기 복합체를 안정화할 수 있다. 이중 가닥 핵산에 대한 친화성이 높아질수록 상기 중지는 더 오래 나타난다. 또한 상기 단백질이 상기 이중 가닥 핵산을 불안정화하여(예를 들면 RNA-폴리머라제의 열린 복합체(open-complex)에 대한 경우와 같이), 보다 짧은 중지를 초래하는 것이 가능하다.
마찬가지로, 변성된 이중 가닥 핵산에 결합할 수 있는 단백질의 존재는 상기 핵산 분자의 재생을 일시적으로 차단할 것이다. 이러한 차단의 지속은 또한 핵산에 대한 단백질의 친화성에 의존될 것이다. 상기 분자에 대한 높은 친화성을 갖는 단백질이 더 약한 친화성을 가진 단백질보다 더 오랜 지속을 가지게 할 것임은 명백하다.
통상의 기술자는, 상기 중지의 측정이, 실험 영역에서 설명되는 것처럼, 차단의 평균 시간 및 이에 따른 결합 반응의 반응속도론적 파라미터를 결정할 수 있게 한다는 것을 바로 인식할 것이다.
따라서, 하나의 특정 태양에서, 본 발명의 방법은
a) 상기 분자에 물리적 힘을 적용시켜 상기 이중 가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계;
b) 단백질 및, 선택적으로, 단일 가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
c) 상기 단백질 및, 선택적으로, 상기 단일 가닥 핵산 분자의 존재 하에 상기 이중 가닥 핵산 분자를 재생하는 단계;
d) 상기 이중 가닥 핵산 분자의 재생의 차단을 검출하는 단계; 및
e) 상기 중지의 지속을 결정하는 단계
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 방법은 차단의 위치를 결정하는 추가의 단계를 포함한다.
상기 구현예에서, 중지의 지속은 대조군(control)과 비교될 수 있다. 특히, 상기 단백질이 이중 가닥 핵산-결합 단백질일 때, 상기 중지를 상기 단백질의 존재 하에 상기 방법이 수행될 때 측정된 중지와 비교하는 것은 유리할 수 있다. 상기에서 설명한 바와 같이, 변성된 이중 가닥 핵산 및 상보적인 단일 가닥 핵산 사이에 형성된 복합체에 대한 상기 단백질의 결합은 재생의 차단의 지속을 변경한다. 상기 차단은 상기 중지의 지속에 있어서 (특이적 단백질에 따른) 증가 또는 감소로서 번역된다.
이에 따라, 하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은
a) 상기 분자에 물리적 힘을 적용시켜 상기 이중 가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계;
b) 단백질 및, 선택적으로, 단일 가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
c) 상기 단백질 및, 선택적으로, 상기 단일 가닥 핵산 분자의 존재 하에 상기 이중 가닥 핵산 분자를 재생하는 단계;
d) 상기 이중 가닥 핵산 분자의 재생의 차단을 검출하는 단계;
e) 상기 중지의 지속을 결정하는 단계; 및
f) 단백질의 부재 하에서의 지속과 비교하는 단계
를 포함한다.
유리하게는, 상기 방법은 차단의 위치를 결정하는 추가의 단계를 포함한다.
비록 결합 사이트 서열에 대한 정보를 찾지 않고, 핵산에 대한 단백질의 결합을 검출하고 측정하는 것이 가능하지만, 일부 적용에서 상기 서열을 결정하는 것은 유용할 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질의 결합을 파괴하는 상기 결합 사이트의 돌연변이를 동정하는 것은 흥미로울 수 있다.
따라서, 하나의 바람직한 구현에에서, 본 발명의 방법은 이에 따라 핵산 서열을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자에 대한 단백질의 결합의 결정 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
a) 상기 분자에 물리적 힘을 적용시켜 상기 이중 가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계;
b) 상기 단백질 및, 선택적으로 적어도 상기 이중 가닥 핵산 분자의 부분에 상보적인 단일 가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
c) 상기 단백질 및, 선택적으로, 상기 단일 가닥 핵산의 존재 하에 상기 이중 가닥 핵산 분자를 재생하는 단계;
d) 상기 이중 가닥 핵산의 재생의 차단을 검출하는 단계; 및
e) 상기 단백질에 의해 결합된 핵산 서열을 시퀀싱(sequencing)하는 단계
를 포함한다.
유리하게는, 상기 차단의 위치를 결정하는 단계가 상기 재생의 차단의 검출에 이어진다.
바람직하게는, 상기 단백질 및 상기 단일 가닥 핵산 분자는 결합 사이트가 t서열화되기 전에 이중 가닥 핵산 분자를 씻어낸다.
본 발명의 방법이 단일 분자의 검출에 기초하기 때문에, 사전 증폭 없이 단일 분자를 시퀀싱할 수 있는 방법을 사용하는 것이 편리할 것이다. 상기 단일 분자 동정 및 시퀀싱 방법은 이미 기재되어 있다(WO 2011/147931; WO 2011/147929; Ding et al., Nautre Met, 9(4): 367-372, 2012). 이들 시퀀싱 방법은 변성된 이중 가닥 핵산 분자의 재생의 차단의 검출에 기초한다. 이에 따라, 본 발명에 따른 시퀀싱 방법은 바람직하게는
a) 상기 분자에 물리적 힘을 적용시켜 상기 핵산 서열에 대응하는 이중 가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계;
b) 단일 가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
c) 상기 단일 가닥 핵산 분자의 존재 하에 상기 이중 가닥 핵산 분자를 재생하는 단계; 및
d) 상기 이중 가닥 핵산 분자의 재생의 차단을 검출하는 단계
를 포함한다.
유리하게는, 상기 방법은 차단의 위치를 결정하는 추가의 단계를 포함한다.
이들 시퀀싱 방법은, 본 방법과 동일한 장치를 사용하기 때문에, 본 발명의 방법과 용이하게 결합될 수 있다. 헤어핀에 의해 묶여 있는 자성 비드들을 표면으로 잡아당김에 의해, 상기 분자는 언지핑될 수 있다. 이러한 열린 상태에서, 상보적인 단일 가닥 핵산과 혼성화할 수 있고, 이는 당기는 힘이 저감될 때 헤어핀 리지핑을 일시적으로 차단한다. 표면에서부터 차단된 헤어핀의 비드까지의 거리를 측정함에 의해, 거의 단일 염기 정확성으로 상기 분자를 따라 혼성체의 위치를 결정할 수 있고, 이에 따라 부분 서열(local sequence)이 무엇인지를 확립한다(용액 내 공지된 단일 가닥 핵산의 서열의 상보(complement)). 이에 따라 상기 단백질에 의해 결합된 분자를, 실험의 설정을 변경하지 않고, 단지 단백질 및 선택적으로 상보적인 단일 가닥 핵산을 함유하는 버퍼를, 상기 방법에 따른 시퀀싱에 적합한 버퍼에 의해 대체함에 의해, 바로 시퀀싱하는 것이 가능하다.
DNA 시스-조절인자(cis-regulatory element)의 효율적인 동정은 포스트 게놈 생물학의 주요 도전이다. 게놈 내 특이적 핵산-결합 단백질의 모든 결합 사이트의 동정은, 상기 단백질에 의해 발현이 잠재적으로 조절되는 모든 유전자들을 동정하기 때문에, 특히 유용하다. DNA 시스-조절 인자의 종합적인 동정은 전사 네트워크 동역학의 예측적 이해(predictive understanding)를 위해 결정적이다.
신규 알고리즘, 고속 처리(high-throughput) 기술, 및 전체 게놈 DNA 서열 데이터의 융합은 전사 조절 인자를 동정하고 특성화하는 우리의 능력을 빠르게 발전시킨다(Eisen et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. , 95: 14863-14868, 1998; Tavazoie et al. , Nat. Genet. , 22: 281 -285, 1999; Bussemaker et al. , Nat. Genet. , 27: 167-171 , 2001 ; Lee et al. , Science, 298: 799- 804, 2002). 그러나, 이들 접근법은 본질적인 한계를 가진다. 예를 들면, 유전자 발현 클러스터링(clustering) 및 시스 조절 모티프 발굴(discovery)을 사용하는 혼성 방법의 성공은, 연구실에서 사용된 생리학적 섭동(perturbation)의 범위에 의해 제한된다. 그들의 조절 역할에 의해 DNA-단백질 상호작용이 오직 특이적 환경 조건 하에 나타나는, 칩(chip) 기반 크로마틴 면역침강법(chromatin immunoprecipitation)(ChIP)과 같은 인 비보(in vivo) 접근법 또한 마찬가지이다(Lee et al. , Science, 298: 799-804, 2002). 이들 제한들은, 실험 데이터를 더 얻기 어려운, 후생동물(metazoan)의 진핵세포에 대해 보다 더 가혹하다.
본 방법은, 전사 인자의 게놈 내 결합 위치를 지도로 만들기 위한 ChIP(염색체 면역침강법) 및 DNAse I 족적법과 같은 종래 기술의 방법에 대한 대안을 제공한다(The ENCODE Project Consortium, Nature, 489: 57-74, 2012).
따라서, 다른 태양에 따라, 본 발명은 특이적 핵산-결합 단백질을 결합할 수 있는 서열을 포함하는 핵산 분자를 동정하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
a) 이중 가닥 핵산 분자의 집단(population)을 제공하는 단계;
b) 상기 기재된 방법에 의해 상기 핵산 분자에 대한 상기 단백질의 결합을 평가(test)하는 단계; 및
c) 상기 단백질을 결합할 수 있는 핵산 분자를 선택하는 단계
를 포함한다.
바람직하게는, 상기 방법은 상기 핵산 분자의 결합 사이트와 상보적인 단일 가닥 핵산의 제공을 포함한다.
상기 구현예에 따라, 본 발명은
a) 이중 가닥 핵산 분자의 집단을 제공하는 단계;
b) 상기 분자에 물리적 힘을 적용시켜 상기 이중 가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계;
c) 상기 단백질 및 상기 결합 사이트에 상보적인 단일 가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
d) 상기 단백질 및 상기 단일 가닥 핵산 분자의 존재 하에 상기 이중 가닥 핵산 분자를 재생하는 단계;
e) 상기 이중 가닥 핵산의 재생의 차단을 검출 또는 검출하지 않는 단계; 및
f) 재생이 일시적으로 또는 영속적으로 차단되는 핵산 분자를 선택하는 단계
를 포함한다.
유리하게는, 상기 방법은 차단의 위치를 결정하는 추가의 단계를 포함한다.
이에 따라, 단리될 핵산 분자들은, 상기 특이적 결합 서열을 포함하는, 핵산 분자의 집단에 대응한다. 이에 따라 이들은 상기 특이적 서열을 함유하는 점에서 다른 핵산 분자와는 다르다. 이들 분자들 모두는 상기 서열을 공유함에도 불구하고, 이들은 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 특정 구현예에서, 통상의 기술자가 상기 특이적 결합 서열 외에 다른 각 핵산 분자의 서열을 동정하는 것이 바람직할 수 있다. 실제로, 특이적 핵산-결합 단백질을 위한 하나 이상의 결합 사이트를 함유하는 핵산 분자를 동정할 때, 예를 들면 상기 기재된 시퀀싱 방법으로, 동정된 분자들을 시퀀싱하는 것이 유리할 수 있다. 이 단계에 의해 얻어진 정보는, 전체 게놈 상의 상기 분자의 국부화를 할 수 있고, 이에 따라 상기 결합 사이트에 의해 조절되거나 조절되지 않을 수 있는 발현 유닛을 동정할 수 있다. 이는 데이터베이스를 검색하기 위해 시퀀싱 단계에 의해 얻어진 정보를 주의 깊게 사용함에 의해 용이하게 얻을 수 있다: 당업계의 통상의 기술자는, 공중이 이용가능한 서열 데이터베이스(예를 들면 Genbank)의 도움으로, 시퀀싱에 의해 얻어진 서열을 함유하는 클론을 찾는 방법을 알고 있고, 이러한 요구들은 여기에 더 구체화되지 않는다.
바람직한 구현예에서, 이중 가닥 핵산 분자의 집단은 전체 게놈을 나타낸다.
이중 가닥 핵산 분자의 집단은 레어 커터(rare-cutter) 제한 효소에 의해 염색체를 우선 절단함에 의해 유리하게 얻어진다. 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 바와 같이, 레어 커터 제한 효소는 게놈에서 오직 드물게 나타나는 인식(recognition) 서열, 예를 들면 7 또는 8 염기를 포함하는 인식 서열을 갖는 제한 효소이다. 상기 레어 커터 효소의 예들은 Sfil, Xma I , Asc I , AsiS I (동일전달제한효소(isoschizomer) Sgf I ), Not I (동일전달제한효소 CciN I ), Sbf I (동일전달제한효소 Sse8387 I , Sda I ), Fse I , Pac I 등을 포함한다. 이들 모든 효소들은 상업적으로 입수가능하다. 두번째 단계에서, 얻어진 제한 단편(restriction fragment)은 보통의 6-염기 제한 효소, 예를 들면 EcoRI, BamHI, XhoI 등으로 절단된다. 생성된 선형 이중 가닥 단편들은 이어서 헤어핀으로 변형될 수 있다. 이중 가닥의 자유 말단들이 서로 연결되도록 하는 기술은 공지되어 있고, 일부는 이하에 보다 상세히 기재된다.
본 발명의 방법의 다른 특정 적용은, 후성적(epigenetic) 변형의 검출에서이다. 상기 평가는 현재 수행하기 매우 어렵고 많은 DNA 변형을 놓친다. 그러나 후성적 변형은 미생물 감염 및 종양학을 포함하는 다양한 병리학에서 매우 중요하다. 유리하게는, 상기 언급된 발명은 전체 또는 선택된 영역에서, 게놈의 DNA 상 변형에 대해 스크린하기 위해 사용될 수 있다.
DNA에 대한 후성적 변형은 거의 모든 생물의 게놈에 존재한다. 이들의 형태 및 위치는, 유기체, 조직 및 세포 형태에 따라; 시간에 걸쳐; 환경과의 상호작용을 통해 다양하다. 이들 변형에서 일부는 주의 깊게 제어된 세포 공정을 통해 발생한다. 다른 것은 DNA 손상의 결과이다.
상기 변형들은 DNA 내에 저장될 수 있는 정보의 양을 매우 확장한다. 예를 들면, Ecsherichia coli의 dam 유전자는 이중 가닥 DNA 내 -GATC- 서열에서의 아데닌을 메틸화(methylate)하고 유전자 발현을 조절하는, DNA 메틸트랜스퍼라제를 암호화한다(예를 들면 Calmann and Marinus, J. Bacteriol., 185(16): 5012-5014, 2003 참조). 반면에, 진행생물에서 가장 흔한 후성적 마커는 5-메틸시토신(5mC)이다. 이 특이적 변형은, 다양한 질환, 특히 특정 형태의 암에 관련된 인간 내 DNA 메틸화와 함께 매우 다양한 중요한 세포 및 폭넓은 생리학적 공정 및 문제들을 제어하고 조절하기 위해 요구된다. 5mC 외에, 매우 다양한 다른 DNA 변형들이 진핵 세포 내에 존재한다(Korlach and Turner, Curr.Opin. Struct. Biol. , 22: 251 -261 , 2012).
현재, 5mC 결정을 위한 골드 스탠다드(gold-standard)는, 변화되지 않은 채 남아있는 메틸화된 것들을 제외하고, 모든 시토신 잔기가 우라실로 전환되는 '중아황산염 전환(bisulfite conversion)'이다. DNA 생성물의 추가의 증폭은 우라실을 티민으로 전환시킨다. 이들 전환 변화는 이어서 DNA의 시퀀싱을 통해 검출될 수 있다(Song et al., Nature Biotechnol, 30(11): 1107-1116, 2012). 그러나, 이것은 복잡하고, 시간 소모가 크며(time consuming), 5-34%의 오류율(error rate)을 갖는 값비싼 공정이다(Beck, Nature Biotechnol, 10: 1026- 1028, 2010).
본 발명은 핵산의 후성적 변형을 검출하기 위한 용이한 방법을 제공한다. '후성적 변형(epigenetic modification)'은 본 명세서 내에서 핵산 분자의 합성 후 일어나는 핵산 분자를 구성하는 염기들의 변형을 나타낸다. 상기 후성적 변형은, 그 중에서도 DNA에서 4-메틸시토신(4mC), 5-메틸시토신(5mC), 5-히드록시메틸시토신(5hmC), 5-포름일시토신(5fC) 및 5-카복실시토신(5caC) 뿐만아니라 6-메틸아데노신(m6A), 및 RNA에서 5-히드록시메틸우라실(5hmU) 및 N6-메틸아데노신(m6A)을 포함한다.
이에 따라, 하나의 특정 태양에서, 본 발명은 이중 가닥 핵산 분자 내 포함되는 적어도 하나의 변형된 염기를 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은
a) 상기 이중 가닥 핵산을 제공하는 단계;
b) 상기 변형된 염기를 결합할 수 있는 단백질을 제공하는 단계; 및
c) 상기 기재된 방법에 의해 상기 핵산 분자에 대한 상기 단백질의 결합을 평가하는 단계
를 포함한다.
선택적으로, 본 발명의 방법은 상기 결과를 더 잘 입증하기 위해 가능한 변형의 사이트를 인식하는 간단한 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 평가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 그 항체와 함께 5mC 메틸화를 검출한 후, 올리고 NNTACGNN을 가진 서열 ATGC를 검출할 수 있다.
상기 방법은 가역 공정에서 변형되지 않은 결합 분자를 사용하기 때문에 특히 유리하다. 예를 들면, 5mC를 검출하기 위해 사용될 때, DNA 상에 어떠한 화학적(황산수소나트륨) 반응도 요구되지 않는다. 또한, 본 발명의 방법은, 단일 분자 염기 상의 변형된 염기의 검출을 고려하기 때문에, 임의의 종래의 방법보다 훨씬 더 민감하다.
바람직한 구현예에서, 상기 변형된 염기는 5-메틸시토신(5mC), 5-히드록시메틸시토신(5hmC), 5-포름일시토신(5fC), 5-카복실시토신(5caC), 5-히드록시메틸우라실(5hmU) 및 N6-메틸아데노신(m6A)에 의해 구성된 군에서 선택된다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 염기는 5mC 및 5hmC 사이에서 선택된다. 보다 더 바람직한 구현예에서 상기 염기는 5mC이다. 이들 변형된 염기에 특이적으로 인식하고 결합하는 단백질들은 기재되어 있다. 예를 들면, 5mC에 대해 지향된(directed) 항체들은 세포 기반 시각화(visualization)를 위해 상기 변형을 염색하여 사용되고 기재되어 있다(Ito et al., Nature, 466: 1129-1133, 2010; Ko et al., Nature, 468: 839-843, 2010; Szulwach et al., Nature Neurosci, 14: 1607-1611, 2011; Haffner et al,, Oncotarget, 2: 627-637, 2011; Inoue et al., Science, 334: 194, 2011; Inoue et al., Cell Res, 21: 1670-1676, 2011). 상기 항체들은 상업적으로 입수가능하다(예를 들면 clone 33D3; ref: Active Motif). 항체들 이외에, 흥미가 있는 뉴클레오티드와 특이적으로 인식하고 반응하는 효소들이 동정되었다(Song et al. , Nature Biotechnol, 30(11): 1107-1116, 2012). 예를 들면 T4 박테리오파지 효소 β-글루코실트랜스퍼라제(βGT)는 글루코오스 모이어티를 5hmC 상에 전달한다. Tet1-3 단백질들은 5mC의 5hmC로의 전환에 대해 책임을 지고 있다. 메틸-CpG-결합 단백질 2, (MeCP2)는 5-mC를 함유하는 DNA에 대한 친화성에 의해 우선 동정되었다. 바람직하게는 상기 단백질은 상기 염기를 특이적으로 인식하는 효소 또는 상기 변형된 염기에 대해 지향된 항체이다. 보다 바람직하게는, 상기 단백질은 항체이다.
동일한 방법이 핵산의 다른 변형의 검출에 적용될 수 있음은 명백하다. 예를 들면 이중 가닥 핵산 분자 내 존재하는 미스매치(mismatch)를 검출하는 것이 가능하다. 박테리아의 MutS와 같은 단백질은, 돌연변이가 된 DNA에 결합하고 딸가닥(daugater strand) 상에 미스매치된 염기를 인식하기 위해 오랜시간 동안 알려져왔다. 상기 특성은 이중 가닥 핵산 분자 내 임의의 미스매치를 동정하고 검출하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 이중 가닥 핵산 내 적어도 하나의 미스매치를 검출하기 위한 방법을 제공하는 것 또한 본 발명의 태양이고, 상기 방법은
a) 상기 이중 가닥 핵산을 제공하는 단계;
b) 미스매치된 염기를 결합할 수 있는 단백질을 제공하는 단계; 및
c) 상기 기재된 방법에 의해 상기 핵산 분자에 대한 상기 단백질의 결합을 평가하는 단계
를 포함한다.
MutS는 미스매치에 대해 이합체(dimer)로서 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에, 본 발명의 방법에서 MutS 이합체를 사용하는 것이 유리하다. 진핵생물에서, MutS 상동체(homologs)는 2개의 주요 이형이합체(heterodimer)를 형성한다:Msh2/Msh6 (MutSα) 및 Msh2/Msh3 (MutSβ). 바람직하게는, 상기 단백질은 MutS 이합체, Msh2/Msh6 (MutSα), 및 Msh2/Msh3 (MutSβ) 사이에서 선택된다.
단일 뉴클레오티드 다형성(polymorphism)(SNP, snip로 발음' 복수 snips)은 게놈 (또는 다른 공유 서열) 내 단일 뉴클레오티드 -A, T, C 또는 G-가 인간 내 염색체 쌍 또는 생물학적 종의 구성원 사이에 상이할 때 나타나는 DNA 서열 변화이다. 평균적으로, SNP는 1 퍼센트 초과의 인구에서 나타난다. 오직 약 3 내지 5 퍼센트의 사람의 DNA 서열이 단백질의 생성을 위해 암호화하고, 대부분의 SNP는 암호화 서열(coding sequence) 밖에서 발견된다. 암호화 서열 내에서 발견된 SNP는 단백질의 생물학적 기능을 변화시킬 가능성이 더 크기 때문에 특히 관심이 있다.
SNP를 포함하는 분자는 다수의 집단에서 발견된 서열을 포함하는 분자와 함께 혼성화될 때 미스매치를 형성할 것이다. 본 발명은 이에 따라 SNP의 용이한 검출을 가능하게 한다.
이에 따라 상기 구현예는 핵산 내 함유된 서열에서 SNP를 검출하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
a) 다수의 집단에서 발견된 서열을 포함하는 단일 가닥 핵산과 상기 핵산을 혼성화하는 단계; 및
b) 생성된 미스매치를 상기 방법에 의해 검출하는 단계
를 포함한다.
만일 평가될 핵산이 이중 가닥 핵산이면, 단계 a) 전, 상기 핵산을 변성하는 것이 유리할 수 있다.
이들 방법이 전체 게놈 스케일에서, 상기 기재된 방법의 단순한 적용에 의해 수행될 수 있음은 명백하다. 이것은, 예를 들면 특정 변형된 염기를 함유하는 게놈에서 모든 사이트들의 동정으로 이어질 것이다. 발현이 상기 변형된 염기에 의해 영향받기 쉬운 유전자들이, 상기 변형된 염기를 함유하는 핵산 분자를 시퀀싱함에 의해 동정될 수 있다. 또한, 후대(progeny)에 대한 상기 변형된 염기의 전달이 평가될 수 있다. 이들 정보는, 일부 유전자는 침묵(silent)으로 있는 반면 다른 것들은 세대를 통해 발현되는 것을 보장하는 것이 중요한, 동물 또는 식물 선택(selection)과 같은 분야에서 관심이 있을 수 있다.
다른 태양에서, 특이적 결합 서열에 대한 단백질의 결합을 차단하는 화합물들을 동정하기 위한 방법이 제공된다. 이들 화합물들은 그 결합 사이트에 대한 상기 단백질의 결합을 감소시키거나 파괴시킨다. 상기 화합물들은 치료법(therapeutics)으로서 유용할 수 있다. 예를 들면, 그 결합 사이트와 발암형(oncogenic forms)의 cMyc의 상호작용을 막는 화합물들은 암을 치료하는 데 유용할 것이다.
상기 구현예에 따라, 본 발명은 단백질과 그 결합 사이트 사이의 상호작용을 막을 수 있는 적어도 하나의 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은,
a) 상기 단백질 및 상기 결합 사이트에 대응하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 단계;
b) 화합물을 제공하는 단계; 및
c) 상기 기재된 방법에 의해 상기 핵산 분자에 대한 상기 단백질의 결합을 평가하는 단계
를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 화합물은 상기 핵산 분자에 대한 상기 단백질의 결합이 감소되거나 또는 파괴될 때 선택된다.
암에 관련된 대부분의 핵산 결합 단백질은 이중 가닥 핵산들을 결합하는 전사 인자들인 것이 명백하다. 따라서, 다른 바람직한 구현예에서, 상기 핵산 분자는 이중 가닥 핵산 분자이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 상기 이중 가닥 핵산 분자의 서열에 대해 상보적인 단일 가닥 핵산을 제공하는 단계를 더 포함한다. 물론, 이들 분자들은 결합의 평가를 하기 전에 제공된다.
본 발명의 방법의 수행은 특히 단일 분자 수준에서 실시간(real-time) 핵산 상호작용을 검사(probe)하기 위해 고안된 장치의 존재에 의해 가능하게 되었다. 상기 장치는 예를 들면, U.S. 특허 번호 7,052,650 및 7,244,391에 기재되어 있다. 거기에 기재된 기기는 마이크론 크기의 초상자성(superparamagnetic) 비드 상에 피코뉴턴 스케일의 힘을 적용하기 위해 자기 트랩(magnetic trap)을 사용한다. 간단히 말해서, 상기 기기는 광학 현미경, 자석, 및 PC를 포함한다. 상기 이중 가닥 핵산 분자들은 이동하지 않는 요소, 예를 들면 표면으로 일 말단에, 그리고, 이동할 수 있는 표면, 이 경우에서는 자성 비드로 다른 말단에 다수의 포인트에서 고정된다. 자석들은 비드 상에서의 작용을 위해 제공된다. 특히, 상기 자석들은 표면으로부터 상기 비드들을 다른 방향으로 잡아 당기기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법의 수행은 상기 기기로 제한되지 않는다. 완전히 연장하고 이어서 이중 가닥 핵산의 분자를 재접힘시키는 한편 동시에 상기 분자의 연장을 모니터링하도록 하는 임의의 장치가 본 발명의 방법의 수행을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 광학 집게(tweezer)가 사용될 수 있다; 그러나, 이들은 사전 힘 조절(force calibration)을 요구하고, 고수율 측정을 위해 용이하게 평행으로 되지 않는다. 추가의 단점들은, 핵산의 비틀림 제어를 조절하는 것의 복잡함 및 혼성화 조건을 변경할 수 있는 초점이 맞춰진(focussed) 레이저에 의한 용액의 가능한 국부 가열이다.
이중 가닥 핵산은 그 표지된(예를 들면 비오틴) 말단 중 하나에 의해 결합하는 적절한 비드들(예를 들면 스트렙타비딘 코팅된 것)의 용액 내에서 수분 동안 인큐베이션된다. 상기 비드들은 만일 광학 집게가 나중에 조작을 위해 사용된다면 투명할 수 있고, 만일 조작을 위해 자기 트랩 또는 집게를 사용한다면 자성일 수 있다.
상기 비드 핵산 조립체(assembly)는, 표면이 분자의 다른 표지 말단을 결합하도록 처리되어 있는(예를 들면 핵산의 Dig 표지 말단을 결합하기 위해 항-Dig로 코팅된 표면) 유체 챔버 내에 주입된다. 이에 따라 상기 비드들은 핵산 헤어핀을 통해 표면에 고정된다, 도 1a 참조. 상기 표면에 대한 비드의 거리는 이어서 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 수단에 의해 모니터링된다: 예를 들면 카메라 상의 이들 이미지의 회절 고리들(diffraction ring)은 이들의 거리를 추정하기 위해 사용될 수 있고, 또는 이버네센트 모드(evanescent mode)에서 조사될 때 이들이 산란하는 (또는 형광에 의해 발하는) 광도(light intensity)는 이들의 거리를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 이들이 생성하는 자기장은, 고정된(anchoring) 표면 상의 센서에 대한 이들의 거리를 추정하기 위해 측정될 수 있다(GMR 또는 홀(hall) 센서와 같은 자기 센서를 사용).
표면에 상기 비드를 고정하는 핵산 분자를 잡아 당기기 위해, 다양한 기술들이 기재되어 있다. 초점 근처에 투명한 비드를 포획(trap)하기 위해 초점을 맞춘 레이저 빔의 빛을 사용할 수 있다. 고정된 표면과 관련한 상기 빔의 상대적인 이행(translation)에 의해 묶여 있는 분자 상에 힘을 적용할 수 있다(전형적인 광학 집게 분석). 상기 묶여 있는 분자 상에 일정한 힘을 발휘하기 위해, 평형 위치로부터 상기 비드의 변위(displacement)에 비례하여 발휘된 힘은 포획한 빔 상의 피드백 루프를 요구한다.
비드 상에 일정한 힘을 발휘하기 위해, 상기 비드 주위의 흐름에 의해 생성된 유체역학적 항력(hydrodynamic drag)의 사용은 기재되어 있지만, 보통 낮은 공간 정확도(spatial accuracy)(> 100 nm)를 얻는다. 바람직한 구현예는, 상기 기재된 바와 같이 핵산 헤어핀에 의해 표면에 고정된 초상자성 비드를 잡아당기기 위해 자기 트랩을 사용한다. 이러한 배열에서, 샘플 위에 놓인 작은 자석들은 고정된 비드 상에 일정한 힘을 적용시키기 위해 사용되고, 그 위치는 (당기는 힘 및 유체역학적 항력으로 인한 소실(dissipation)에 따라) < 1 nm 정확도로 결정될 수 있다.
모든 경우에, 상기 묶여 있는 헤어핀은 약 16 pN보다 큰 힘으로 상기 비드들을 잡아 당김에 의해 기계적으로 완전히 언지핑될 수 있음을 인식할 것이다. 약 11 pN 이하로 분자 상의 장력을 저하시키는 것은 상기 헤어핀을 자발적으로 리지핑 하도록 할 것이다(상기 언지핑 전이(unzipping transition)는 이력이 가역적이다). 만일 언지핑 상태 동안, 용액 내 일부 분자들(예를 들면 단백질 또는 DNA, RNA, LNA 또는 PNA의 상보적인 올리고뉴클레오티드)이 늘려진 단일 가닥 핵산에 결합된다면, 이들 분자들은 힘이 11 pN 이하로 낮아질 때 상기 헤어핀이 리지핑을 차단할 것이다. 이에 따라 상기 분석의 원리는 2개의 힘 사이를 전환하는 것이다: 헤어핀을 열기 위한 큰 힘 Fopen 및 일시적인 차단에서 분자의 연장을 측정하고 다시 지퍼를 채우도록 하기 위해 사용되는 보다 작은 힘 Ftest. 차단 위치는 완전한 연장 및 차단되는 것 사이의 선형 관계에 의해 상기 서열에 관련된다. 최고의 정확도를 위해, 완전한 연장은 평가(test) 힘 Ftest에서 바람직하게 측정된다. 이것은, 힘이 Fopen에서 Ftest로 감소되면 즉시 재접힘하도록 상기 헤어핀 루프를 고안함에 의해 얻어진다.
핵산들을 표면 또는 지지체에 부착하기 위해, 당업계에 공지된 기술 중 임의의 하나를 사용할 수 있다. 본질적으로, 상기 핵산은 직접 상기 지지체, 예를 들면 마이크로 비드에 고정되고, 이는 상기 핵산의 기능화된 말단과 반응할 수 있는, 예를 들면 스트렙타비딘, COOH기 등으로 코팅함에 의한 상기 표면의 기능화와 관련된다.
상기 방법은, 일반적으로 상기 핵산, 특히 3' 및 5' 말단을 기능화하는 것, 다시 말하면 그들에 적절한 화학적 기들을 그라프트(graft)하는 것을 필요로 한다. 또한, 적절한 경우 반복될 수 있도록, 상기 작업의 마지막에 상기 가닥들이 풀리는 것을 막기 위해 루프에 의해 상기 분자의 다른 2개의 자유 말단을 연결하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해, 다른 방법들이 채택될 수 있다.
가장 간단한 것은, 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 2개의 다른 기능을 가진 이중 가닥 핵산의 말단 중 하나를 기능화하는 것이고(예를 들면 비오틴 및 아민), 이는 2개의 다른 전 처리된 표면에 고정하는 것을 가능하게 한다. 다른 말단에서 2개의 가닥은 루프의 형태로 부분적으로 쌍을 이룬 합성 뉴클레오티드를 사용하여 연결될 수 있다. 이 방식에서, 쌍을 이룬, 단일 가닥 핵산, 즉 헤어핀은 이중 가닥 핵산으로부터 생성된다. 이 방법의 장점은 (유전자 또는 염색체의 분류에 의해 얻어진 것과 같이) 큰 핵산 단편들의 이형 집단을 기능화하기 위한 수용력에 있고, 이어서 이것은 동시에 분석될 수 있다. 이 경우에, 상기 핵산 샘플은 2개(또는 그 이상)의 제한 효소들을 사용하여 분류되고, 이는 소집단(subpopulation)이 모든 단편들에 대해 유사한, 그 말단에 2개의 다른 제한 사이트를 가지고 얻어질 수 있도록 한다. 이것은 2개의 말단이 다르게 처리될 수 있도록 한다(예를 들면 그 말단에 적절한 제한 사이트를 갖는 루프의 형태로 하나의 말단을 올레고뉴클레오티드에 연결함에 의해). 이 방법의 단점은 2개의 인접한 기능기 사이의 입체적 간섭(steric interference)에 있고, 이는 상기 표면들에 커플링하는 것을 어렵도록 할 수 있다. 이 문제를 해결하기 위해, 헤어핀 분자의 각각의 자유 말단에서 "스페이서(spacer)" 서열의 염기를, 기능기가 이어서 추가되는 말단으로 추가하는 것이 유리할 수 있다; 상기 2개의 스페이서 서열은 비상보적이고, 그 전용(dedicated) 표면에 결합하기 위해 충분한 공간을 각 기능기에 제공한다. 보다 유리하게는, 각 스페이서 서열의 서열은, 본 발명의 시퀀싱 방법에서 공지된 서열의 단일 가닥 시퀀싱 프라이머를 사용하기 위해 고안된다. 상기 이중 가닥 핵산 분자에 대한 루프 및/또는 스페이서들의 추가는 분자 생물학에서 흔히 사용되는 임의의 방법들로 수행될 수 있다. 이 방법들은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 이에 따라 여기에서 이들을 상세히 설명할 필요가 없다.
실제 고정 기술과 관련하여, 많은 것들이 있고, 이들은 상업적으로 이용가능한 전처리된 표면들에 거대 분자(단백질, DNA 등)를 고정하기 위한 기술로부터 얻는다. 대부분의 이들 기술은, 면역 테스트, 및 단백질들의 카복시(--COOH) 또는 (--NH2) 말단과 반응할 수 있는 기들(--COOH, --NH2, --OH 등)을 갖는 표면들에 대한 링크 단백질들(면역글로불린)을 위해 개발되었다.
핵산의 공유결합적 고정은, 상기 분자의 5' 말단의 자유 포스페이트를 통해 직접 수행될 수 있고, 이것은 2차 아민(스트라스부르에서 Polylabo에 의해 시판된 Covalink --NH 표면)과 반응하여 공유결합을 형성한다. 또한 아민기로 DNA를 기능화하고, 이어서 단백질과 함께 진행하는 것이 가능하다.
또한 스트렙타비딘(Dynal 비드 등)으로 코팅된 표면들이 있고, 이는 스트렙타비딘 및 비오틴화된 DNA 분자 사이에 준 공유결합적 고정을 가능하게 한다. 마지막으로, (상기 언급된 방법에 의해) 표면 상에 디곡시게닌(digoxigenin)에 대해 지향된(directed) 항체를 그라프트함에 의해, 디곡시게닌으로 기능화된 핵산을 고정할 수 있다. 이는 단지 많은 가능한 고정 기술의 샘플을 나타낸다.
부착 및 고정 기술들 중, 예를 들면 셀룰로오스와 같은 고체 지지체에 DNA의 부착을 위해 효소 커플링을 사용하는 특허 EP 152 886에 기재된 기술이 또한 언급될 것이다.
특허 EP 146 815 또한 지지체에 대한 DNA의 부착의 다양한 방법들을 기재한다.
유사하게, 특허 출원 WO 92/16659는 DNA를 부착하기 위한 고분자를 사용하는 방법을 제안한다.
물론, 상기 핵산은 지지체에 직접 부착될 수 있지만, 필요한 경우, 특히 표면의 영향을 제한하기 위해, 예를 들면 특허 EP 329 198에 기재된 바와 같이, 상기 핵산이 펩타이드 또는 다른 종류(nature)의 불활성 팔(inert arm)의 말단에 부착될 수 있다.
이하의 실시예들은 본 발명의 다른 특징 및 장점을 명확하게 할 것이다.
도 1: 헤어핀 DNA 상의 상보적인 서열에 대한 올리고 뉴클레오티드의 혼성화의 검출 원리. 표면에 비드를 고정하는 상기 헤어핀 DNA(a)는 16 pN 이상의 값으로 비드 상에서 잡아당기는 힘을 증가시켜 잠깐 동안 언지핑된다. 이러한 상태에서, 용액 내 상보적인 단편은 상기 열린 DNA 헤어핀 상의 타겟에 혼성화하고, 이에 따라 힘이 그 초기 값으로 다시 저감될 때 일시적으로 상기 헤어핀의 리지핑을 막는다(b). 차단 포인트 및 상기 헤어핀 초기 길이 사이의 상기 분자의 연장에서의 변화(zhigh-z)로부터, 상기 헤어핀을 따라 상보적인 서열이 쌍을 이루는(paired) 것으로 추정한다. 상기 차단의 평균 시간 간격으로부터 상기 혼성체를 따라 이들의 위치 및 미스매치의 가능한 존재에 대해 알 수 있다. (c) 힘이 11.4 pN에서 17.8 pN으로 증가되고, 이어서 그 초기 값으로 다시 감소됨에 따라 헤어핀의 연장의 시간 추적. 약 10s의 재혼성화 동안 중지의 존재를 주목한다. 상기 중지는 길이 > 7 뉴클레오티드(여기서 상기 신호는 10mer로 인한 것이다)의 상보적인(또는 거의 상보적인) 올리고머의 용액 내 존재에서 오직 관찰된다.
도 2: a) Ftest = 9 pN에서 얻어진 10 nt 올리고뉴클레오티드의 차단 시간의 지수 분포. b) 9 nt 올리고뉴클레오티드에 대해 얻어진 Toff 대 Ftest의 지수 의존성(exponential dependence).
도 3: 그 상보적 사이트를 찾기 위해 12-nt 올리고뉴클레오티드에 의한 열린 상태 Topen의 지속과 함께 차단 확률 Pblock = 차단된 Nb. 사이클/ Nb. 사이클의 전개(evolution). 핏(fit)은, 상기 올리고뉴클레오티드 농도가 20 nM일 때 상기 분자가 타겟을 찾기 위해 요구되는 시간 Ton이 전형적으로 15s 인 것을 입증한다. 상기 시간은 평가 상태에서 사용된 힘에 의존하지 않는다. 파라미터 a(F)는 만일 모든 사건들이 측정된다면 1일 것이지만, 짧은 사건들을 놓치기 때문에, 특히 Ftest가 작을 때, a(F)는 1보다 작다.
도 4: 차단 확률은 올리고뉴클레오티드 농도와 함께 증가하고 포화된다(saturate). 여기서 27.5 nM의 농도에서 12 nt-올리고뉴클레오티드는, Ftest = 8pN 및 10s 지속하는 열린 상태에 대해 2 사이클마다 한번 나타나는 차단을 초래한다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, Pblock의 포화는 1에 상당히 미치지 못한다; 이는 아주 짧은 차단을 놓치고 있기 때문이다.
도 5: 버퍼의 이온 강도의 함수로서 그 상보적 기재에 대한 12 nt 올리고뉴클레오티드의 결합 특성을 정의하는 반응속도론적 파라미터. kon은 강한 의존성을 나타내는 반면, koff는 이온 강도에 의해 거의 변하지 않는다. kon은 Mg2 +를 첨가함에 의해 인자(factor) 3까지 증가된다. 평형 상수 kd는 반응속도론적 파라미터들 모두로부터 계산될 수 있다.
도 6: 프라이밍(priming) DNA 서열에 상보적인 5 nt-RNA 올리고뉴클레오티드를 안정화하는 프리마제에 의한 헤어핀의 차단. b) 서열을 따라 차단 사건의 위치. c) Ftest = 9pN으로 관찰된 프라이밍 공정에서 오합체(pentamer) RNA 올레고뉴클레오티드를 안정화하는 T4 프리마제에 의해 생성된 차단 시간의 분포. 상기 5 nt-RNA 올리고뉴클레오티드는 상기 헤어핀이 시각적 방식에서 재접힘하는 것을 차단하지 않는다. T4 프리마제 WT와 함께, 상기 차단은 서열을 따라 예상된 위치에서 나타나고, 차단 시간은 5s 이다. E248Q 돌연변이와 함께, 동일한 현상을 관찰하지만, 차단 시간은 현저히 저감된다.
도 7: 3개의 상태와 함께 ssDNA에 대한 헬리카제 RecQ 결합을 평가하는 사이클의 시리즈: Fopen = 20 pN에서 열림, Ftest = 10 pN에서 평가 및 Fclean = 0.5 pN에서 클리닝(cleaning) 상태. 10개의 경로(trace)는 하나의 사이클에 대해 수개의 존재하는 차단 사건이 함께 보여진다. 낮은 힘에서 상기 클리닝 상태는 결합된 임의의 효소가 주형으로부터 제거되는 것을 보장한다. ATP의 부재 하에, RecQ가 결합하고, 상기 재접힘을 차단하며, 재접힘 포크(fork)의 압력은, 이어지는 단계에 의해 차단 위치가 감소하는 헬리카제의 미끄러짐을 생성한다.
도 8: RecQ의 차단 확률 대 그 농도의 전개. 농도가 증가함에 따라 Pblock은 증가하고 포화되며, 이것은 226 pM의 특성 농도를 정의한다.
도 9: 주형(template)을 따라 ATP 없는 RecQ 헬리카제의 차단 위치의 분포.
도 10: 1.2 kb DNA 헤어핀을 따라 메틸화 시토신에 대한 항체에 의해 생성된 차단의 미가공(raw) 신호. 3개의 경로가 5 사이클에 걸친 헤어핀의 연장을 보여준다. 각 사이클은 20 pN의 힘과 함께 5.5 s 동안 헤어핀 열림에 의해 시작하고, 이어서 평가 상태를 F=6.5 pN에서 37s 동안 지속한다.
주로 상기 사이클은 차단이 존재하지 않고 (1), 하나의 헤어핀은 동일한 사이클 동안 연속적인 차단이 존재할 수 있고 (2), 상기 차단은 수회의 사이클에 걸쳐 연장할 수 있다. [Ac] 항체 농도는 35 nM이고, 버퍼는 비특이적 결합을 막기 위해 0.2%의 BSA를 가진 Tris 100 mM이다.
경로들은 명확성을 위해 y에서 이동되었다.
도 11: 인간 DNA 메틸-트랜스퍼라제에 의해 메틸화된 후, 1.2 kb 헤어핀의 서열을 따라 메틸화 위치의 히스토그램. 다른 비드들의 4개의 히스토그램이 보여진다. 결합 위치에 대한 합의(consensus)가 있고; DNA가 원래 생성된 E.coli에 의해 행해진 메틸화에 대응하는 882에서의 것뿐만 아니라, 진핵생물 메틸화에 관한 4개의 예상된 결합 위치를 관찰한다.
도 12: 올라가기 위한 2s 및 내려가기 위한 2s로 시행하는 매끄러운 램프(smooth ramp)와 함께 헤어핀을 열고 닫는 30사이클의 기록. 상기 사이클에서 대표적인 점들은 F=1.5 pN 및 Z=0에서 출발하여 반시계 방향으로 돌아간다(화살표 참조); 힘이 증가함에 따라 연장은 힘이 15 pN에 이를 때까지 매우 작게 유지하고, 분자는 열리고, Z는 1.3 ㎛에 이른다. 힘이 램프와 함께 감소될 때, Z는 F=11 pN일 때까지 천천히 감소하고, 이 점에서 헤어핀은 12-nt 올리고뉴클레오티드에서 충돌할 때까지 재접힘한다. 힘이 계속해서 감소함에 따라 Z의 차단 또한 그렇지만, 힘이 감소함에 따라 다이아몬드 부호에 의한 Z 표시에서 빠른 감소에 의해 보여지는 것처럼 곧 올리고뉴클레오티드가 방출되는(expelled) 점에 이른다. 상기 올리고뉴클레오티드 분리에 대응하는 힘의 분포가 우측에 보여지고; 7 pN 주위의 최대값은 Toff가 1초의 몇 분의 1인 힘에 대응한다.
도 13: 인간 세포로부터 얻어진 인간 DNA 상의 메틸화 사이트의 검출. 헤어핀 DNA는 2.5 kb 인간 게놈 DNA 분자로부터 제조되었다. A) 측정 사이클을 통해 적용된 힘의 변화: 상기 헤어핀은 19 pN 힘에 의해 5초 동안 열리고; 힘은 이어서 10초 동안 8.5 pN으로 저감된다. B) 분자의 언지핑, 이어서 일시적인 차단에 의해 중지되는 리지핑을 보여주는, 5mC에 대해 지향된 항체들의 존재 하에 ca. 20 사이클 상에서 얻어진 신호들의 중첩(superposition). 이들 차단은 5mC에 대한 항체의 결합에 의해 초래된다. C) 차단 위치의 히스토그램은 5mC의 존재에 대응하는 명확한 위치를 보여준다. 약 20개의 위치가 있고, 이는 ca. 100 염기마다 메틸화를 암시한다.
도 2: a) Ftest = 9 pN에서 얻어진 10 nt 올리고뉴클레오티드의 차단 시간의 지수 분포. b) 9 nt 올리고뉴클레오티드에 대해 얻어진 Toff 대 Ftest의 지수 의존성(exponential dependence).
도 3: 그 상보적 사이트를 찾기 위해 12-nt 올리고뉴클레오티드에 의한 열린 상태 Topen의 지속과 함께 차단 확률 Pblock = 차단된 Nb. 사이클/ Nb. 사이클의 전개(evolution). 핏(fit)은, 상기 올리고뉴클레오티드 농도가 20 nM일 때 상기 분자가 타겟을 찾기 위해 요구되는 시간 Ton이 전형적으로 15s 인 것을 입증한다. 상기 시간은 평가 상태에서 사용된 힘에 의존하지 않는다. 파라미터 a(F)는 만일 모든 사건들이 측정된다면 1일 것이지만, 짧은 사건들을 놓치기 때문에, 특히 Ftest가 작을 때, a(F)는 1보다 작다.
도 4: 차단 확률은 올리고뉴클레오티드 농도와 함께 증가하고 포화된다(saturate). 여기서 27.5 nM의 농도에서 12 nt-올리고뉴클레오티드는, Ftest = 8pN 및 10s 지속하는 열린 상태에 대해 2 사이클마다 한번 나타나는 차단을 초래한다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, Pblock의 포화는 1에 상당히 미치지 못한다; 이는 아주 짧은 차단을 놓치고 있기 때문이다.
도 5: 버퍼의 이온 강도의 함수로서 그 상보적 기재에 대한 12 nt 올리고뉴클레오티드의 결합 특성을 정의하는 반응속도론적 파라미터. kon은 강한 의존성을 나타내는 반면, koff는 이온 강도에 의해 거의 변하지 않는다. kon은 Mg2 +를 첨가함에 의해 인자(factor) 3까지 증가된다. 평형 상수 kd는 반응속도론적 파라미터들 모두로부터 계산될 수 있다.
도 6: 프라이밍(priming) DNA 서열에 상보적인 5 nt-RNA 올리고뉴클레오티드를 안정화하는 프리마제에 의한 헤어핀의 차단. b) 서열을 따라 차단 사건의 위치. c) Ftest = 9pN으로 관찰된 프라이밍 공정에서 오합체(pentamer) RNA 올레고뉴클레오티드를 안정화하는 T4 프리마제에 의해 생성된 차단 시간의 분포. 상기 5 nt-RNA 올리고뉴클레오티드는 상기 헤어핀이 시각적 방식에서 재접힘하는 것을 차단하지 않는다. T4 프리마제 WT와 함께, 상기 차단은 서열을 따라 예상된 위치에서 나타나고, 차단 시간은 5s 이다. E248Q 돌연변이와 함께, 동일한 현상을 관찰하지만, 차단 시간은 현저히 저감된다.
도 7: 3개의 상태와 함께 ssDNA에 대한 헬리카제 RecQ 결합을 평가하는 사이클의 시리즈: Fopen = 20 pN에서 열림, Ftest = 10 pN에서 평가 및 Fclean = 0.5 pN에서 클리닝(cleaning) 상태. 10개의 경로(trace)는 하나의 사이클에 대해 수개의 존재하는 차단 사건이 함께 보여진다. 낮은 힘에서 상기 클리닝 상태는 결합된 임의의 효소가 주형으로부터 제거되는 것을 보장한다. ATP의 부재 하에, RecQ가 결합하고, 상기 재접힘을 차단하며, 재접힘 포크(fork)의 압력은, 이어지는 단계에 의해 차단 위치가 감소하는 헬리카제의 미끄러짐을 생성한다.
도 8: RecQ의 차단 확률 대 그 농도의 전개. 농도가 증가함에 따라 Pblock은 증가하고 포화되며, 이것은 226 pM의 특성 농도를 정의한다.
도 9: 주형(template)을 따라 ATP 없는 RecQ 헬리카제의 차단 위치의 분포.
도 10: 1.2 kb DNA 헤어핀을 따라 메틸화 시토신에 대한 항체에 의해 생성된 차단의 미가공(raw) 신호. 3개의 경로가 5 사이클에 걸친 헤어핀의 연장을 보여준다. 각 사이클은 20 pN의 힘과 함께 5.5 s 동안 헤어핀 열림에 의해 시작하고, 이어서 평가 상태를 F=6.5 pN에서 37s 동안 지속한다.
주로 상기 사이클은 차단이 존재하지 않고 (1), 하나의 헤어핀은 동일한 사이클 동안 연속적인 차단이 존재할 수 있고 (2), 상기 차단은 수회의 사이클에 걸쳐 연장할 수 있다. [Ac] 항체 농도는 35 nM이고, 버퍼는 비특이적 결합을 막기 위해 0.2%의 BSA를 가진 Tris 100 mM이다.
경로들은 명확성을 위해 y에서 이동되었다.
도 11: 인간 DNA 메틸-트랜스퍼라제에 의해 메틸화된 후, 1.2 kb 헤어핀의 서열을 따라 메틸화 위치의 히스토그램. 다른 비드들의 4개의 히스토그램이 보여진다. 결합 위치에 대한 합의(consensus)가 있고; DNA가 원래 생성된 E.coli에 의해 행해진 메틸화에 대응하는 882에서의 것뿐만 아니라, 진핵생물 메틸화에 관한 4개의 예상된 결합 위치를 관찰한다.
도 12: 올라가기 위한 2s 및 내려가기 위한 2s로 시행하는 매끄러운 램프(smooth ramp)와 함께 헤어핀을 열고 닫는 30사이클의 기록. 상기 사이클에서 대표적인 점들은 F=1.5 pN 및 Z=0에서 출발하여 반시계 방향으로 돌아간다(화살표 참조); 힘이 증가함에 따라 연장은 힘이 15 pN에 이를 때까지 매우 작게 유지하고, 분자는 열리고, Z는 1.3 ㎛에 이른다. 힘이 램프와 함께 감소될 때, Z는 F=11 pN일 때까지 천천히 감소하고, 이 점에서 헤어핀은 12-nt 올리고뉴클레오티드에서 충돌할 때까지 재접힘한다. 힘이 계속해서 감소함에 따라 Z의 차단 또한 그렇지만, 힘이 감소함에 따라 다이아몬드 부호에 의한 Z 표시에서 빠른 감소에 의해 보여지는 것처럼 곧 올리고뉴클레오티드가 방출되는(expelled) 점에 이른다. 상기 올리고뉴클레오티드 분리에 대응하는 힘의 분포가 우측에 보여지고; 7 pN 주위의 최대값은 Toff가 1초의 몇 분의 1인 힘에 대응한다.
도 13: 인간 세포로부터 얻어진 인간 DNA 상의 메틸화 사이트의 검출. 헤어핀 DNA는 2.5 kb 인간 게놈 DNA 분자로부터 제조되었다. A) 측정 사이클을 통해 적용된 힘의 변화: 상기 헤어핀은 19 pN 힘에 의해 5초 동안 열리고; 힘은 이어서 10초 동안 8.5 pN으로 저감된다. B) 분자의 언지핑, 이어서 일시적인 차단에 의해 중지되는 리지핑을 보여주는, 5mC에 대해 지향된 항체들의 존재 하에 ca. 20 사이클 상에서 얻어진 신호들의 중첩(superposition). 이들 차단은 5mC에 대한 항체의 결합에 의해 초래된다. C) 차단 위치의 히스토그램은 5mC의 존재에 대응하는 명확한 위치를 보여준다. 약 20개의 위치가 있고, 이는 ca. 100 염기마다 메틸화를 암시한다.
실험
실시예
발명의 배경
DNA에 대한 단백질 결합은 생물학에서의 주요 현상이다; 이것은 많은 반응을 제어하는 데 기본적인 역할을 한다. 이러한 메카니즘의 열역학적 평형 특성은 잘 알려져 있는 반면, 그 반응속도론을 측정하는 것은 보다 도전적인 문제이다. 단일 분자를 사용하는 것은, 단백질이 그 DNA 타겟을 찾는 데 요구되는 시간을 측정하는 능력을 제공한다. 우리는 여기에 이들 목적을 달성하는 새로운 단일 분자 분석을 제공한다.
비록 상기 분석이 광범위하지만, 우선 특이적 올리고뉴클레오티드의 결합 및 ssDNA에 대한 헬리카제의 비특이적 결합에 대한 적용을 설명한다.
마지막으로, DNA 내 메틸화된 사이트를 인식하는 항체의 특이적 결합을 논의한다.
요약
본 발명은 DNA 헤어핀의 재혼성화의 차단의 기계적 검출에 기초한 광범위한 DNA의 변형 및 DNA-단백질 결합 사건의 검출을 위한 신규한 공정에 관한 것이다. 상기 분석은 단일 분자 결합의 통계적 정보를 제공하는 일련의 사이클에 의존한다. 하나의 사이클 동안, 약 16 pN보다 큰 힘 Fopen으로 그 맨끝을 잡아당김에 의해 시간 Topen 동안 단일 DNA 헤어핀이 풀려 있는 언지핑 상태에 의해 시작한다. Ttest를 지속하는 제 2 평가 상태에서, 장력 Ftest는 약 11 pN 이하로 저감되고 상기 헤어핀이 리지핑 하도록 한다. 만일 용액 내 존재하는 분자가 일정한(definite) 서열에 또는 열린 헤어핀 상에 비특이적으로 결합할 수 있다면(예를 들면 변형되든 안되든, 특이적 단일 또는 이중 가닥 서열을 인식할 수 있는 단백질), 확률 Pblock으로 DNA에 결합할 것이고, 이 사건에서, 힘이 약 11 pN이하로 저감될 때 그 리지핑을 일시적으로 차단할 것이다. 이러한 장애(obstruction)는 3개의 파라미터로 이어지는 헤어핀의 혼성화시 일정한 위치에서 일어나는 중지로서 용이하게 검출될 수 있다:
- 인식되는 서열의 특성인, 연장된 DNA를 따라 상기 중지의 위치 Zblock;
- 상기 분자가 DNA에 결합되어 있는 동안의 시간을 특성화하는 차단의 지속 Toff;
- 상기 분자가 그 결합 사이트를 찾기 위해 요구되는 시간 Ton에 관련된 차단의 확률 Pblock.
Ton 및 Toff는 DNA 및 차단하는 분자 사이의 상호작용의 강도의 양쪽의 특성이다. 이에 따라 (하나의 말단에서는 비드에, 다른 말단에서는 표면에 헤어핀으로서 결합되는) 단백질 또는 항체 DNA 서열을 인식하는 메틸화로 검사함에 의해, (재혼성화시 상기 헤어핀 중 일부의 차단의 존재를 통해) 상기 검사된 메틸화 사이트의 존재를 헤어핀의 열림 또는 닫힘의 반복된 사이클에 의해 동정할 수 있다. 유사하게, 단백질의 존재 vs. 부존재에서 상보적인 올리고뉴클레오티드 사이의 혼성체의 안정성에 있어서의 증가를 측정함에 의해 추정상의 dsDNA 사이트에 대한 단백질의 결합을 측정할 수 있다.
본 발명은 중아황산 반응 및 PCR 증폭 단계를 거치지 않고, 게놈 DNA 상의 DNA 변형을 검출하게 한다. 이는 표면에 비드를 결합하기 위해 사용될 수 있는 헤어핀 단편들로 처리하기 위해 필요한 몇몇 DNA의 전처리(pre-processing)를 요구한다(적절한 단편들로 분열(fragmentation) 및 연결(ligation)). 본 발명은 단백질들 또는 DNA의 형광 표지를 요구하지 않는다. 현재 인식에서, 상기 기술은 재혼성화 동안 상기 헤어핀의 차단을 검출하기 위한 광학(현미경)을 필요로 한다.
구체적인 기술의 설명
(예를 들면 게놈 DNA의 기계적인 전단(shearing) 또는 제한 컷트로부터 얻어진) 수십 내지 수천 염기쌍 사이에 포함되는 크기의 이중 가닥(ds) DNA 단편이 그 맨끝 중 하나에서 DNA 루프에 연결된다. 다른 맨끝은, 다르게 코팅된 표면들에 2개의 가닥이 결합하도록 하는 dsDNA 단편에 연결된다. 예를 들면, 하나의 가닥의 자유 3' 말단은 스트렙타비딘 코팅된 비드에 결합하도록 하는 비오틴으로 표지될 수 있는 반면, 반대편 가닥 상의 5' 말단은 항-Dig 항체로 코팅된 표면에 결합하도록 하는 디곡시게닌으로 표지될 수 있다. 이러한 말단 표지는 당업계의 기술자에게 공지된 다양한 방법, 예를 들면 비오틴(또는 dig) 변형된 뉴클레오티드들을 추가하기 위한 터미널(terminal) 트랜스퍼라제의 사용 또는 적절히 표지된 올리고 뉴클레오티드와 혼성화에 의해 행해질 수 있다.
이러한 DNA 구성체(construct)는 표지된(예를 들면 비오틴) 말단 중 하나에 의해 결합되는 적절한 비드들(예를 들면 스트렙타비딘 코팅된 것)의 용액 내에서 수분 동안 인큐베이션된다. 상기 비드들은 만일 광학 집게가 나중에 조작을 위해 사용된다면 투명할 수 있고, 만일 조작을 위해 자기 트랩 또는 집게를 사용한다면 자성일 수 있다.
비드-DNA 조립체는 유체 챔버 내에 주입되고, 그 표면은 분자의 다른 표지된 말단을 결합하도록 처리된다(예를 들면 DNA의 Dig 표지된 말단을 결합하기 위해 항-Dig로 코팅된 표면). 상기 비드들은 이에 따라 DNA-헤어핀을 통해 표면에 고정된다(하기 도 1a 참조). 표면에 대한 상기 비드의 거리는 이어서 다양한 수단에 의해 모니터링된다. 예를 들면 카메라 상의 상기 비드 이미지의 회절 고리들은 이들의 거리를 추정하기 위해 사용될 수 있다.
이버네센트 모드에서 조사될 때 상기 비드들에 의해 산란된 (또는 형광으로서 방출된) 광도는 또한 이들의 거리를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 자기 비드들을 사용할 때, 생성된 자기장은 고정된 표면 상의 센서에 대한 비드 표면 거리를 추정하기 위해 (GMR 또는 홀 센서를 사용하여) 측정될 수 있다.
표면에 상기 비드를 고정하는 DNA 분자를 잡아 당기기 위해, 다양한 기술들이 기재되어 있다. 초점 근처에 투명한 비드를 포획(trap)하기 위해 초점을 맞춘(focused) 레이저 빔의 빛을 사용할 수 있다. 고정된 표면과 관련한 상기 빔의 상대적인 이동에 의해 묶여 있는 분자 상에 힘을 적용할 수 있다(전형적인 광학 집게 분석). 상기 묶여 있는 분자 상에 일정한 힘을 발휘하기 위해, 그 평형 위치로부터 상기 비드의 변위에 비례하여 발휘된 힘은 포획한 빔 상의 피드백 루프를 요구한다.
비드 상에 일정한 힘을 발휘하기 위해, 상기 비드 주위의 흐름에 의해 생성된 유체역학적 항력의 사용은 기재되어 있지만, 보통 낮은 공간 정확도(> 100 nm)를 얻는다. 바람직한 구현예는, 상기에서 기재된 바와 같이 DNA 헤어핀에 의해 표면에 고정된 초상자성 비드를 잡아당기기 위해 자기 트랩을 사용한다. 이러한 배열에서, 샘플 위에 놓인 작은 자석들은 고정된 비드 상에 일정한 힘을 적용시키기 위해 사용되고, 그 위치는 (당기는 힘 및 유체역학적 항력으로 인한 소실에 따라) ~ 1 nm 정확도로 결정될 수 있다.
모든 경우에, 상기 묶여 있는 헤어핀은 약 16 pN보다 큰 힘으로 상기 비드들을 잡아 당김에 의해 기계적으로 완전히 언지핑될 수 있음을 인식할 것이다. ~ 11 pN 이하로 분자 상의 장력을 저하시키는 것은 상기 헤어핀을 자발적으로 리지핑하도록 할 것이다(상기 언지핑 전이는 이력이 가역적이다).
만일, 언지핑 상태 동안, 용액 내 일부 분자들(예를 들면 단백질 및/또는 DNA, RNA, LNA 또는 PNA의 상보적인 올리고뉴클레오티드)이 늘려진 단일 가닥 (ss)DNA에 결합된다면, 이들 분자들은 힘이 ~11 pN 이하로 낮아질 때 상기 헤어핀의 리지핑을 일시적으로 차단할 것이다.
하나의 이들 리지핑의 중지 동안 일련의 사이클에 걸쳐 상기 DNA 분자의 연장 Z(t)(표면에 대한 상기 비드의 거리)을 측정함에 의해, 대략 1 nm 정확도로 차단의 위치(10 pN 힘 하에서 ssDNA 내 2개의 뉴클레오티드(1 bp)에 의해 걸쳐진 거리에 대응)를 결정할 수 있다. 또한, 차단의 평균 시간을 측정함에 의해, Toff = 1/koff를 결정할 수 있다. 상기 분자 농도[M]를 알고, Pblock을 측정함에 의해, Ton 및 이에 따른 kon에 접근하는 것이 가능하다. 이들 파라미터 중 하나 또는 양쪽 모두는 결합 성질을 특성화하는 것을 도와 준다. 예를 들면 상보적인 올리고뉴클레오티드와 완전한 혼성화로 인한 것인지, 또는 단백질이 혼성화를 안정화하는 지, 미스매치가 있다면 어디에 있는 지(예를 들면 혼성화된 올리고뉴클레오티드의 중앙에서 또는 그 말단 중 하나의 근처에서)를 결정하는 것이 가능하다.
이들 관찰은 DNA 변형의 검출, 보다 일반적으로 ss 또는 dsDNA와 단백질의 상호작용의 검출에서의 적용에 대한 다양한 인식을 제안한다.
재혼성화 동안 차단의 기계적 검출에 의한
DNA
변형의 검출
만일 DNA 헤어핀이 기계적으로 언지핑될 때 (7개의 뉴클레오티드보다 큰 길이의) 올리고뉴클레오티드들이 용액 내에 존재한다면, 이들 올리고뉴클레오티드들은 DNA 상의 이들의 상보적인 서열과 쌍을 이룰 수 있고, 힘이 11 pN 이하로 낮아질 때, 일시적으로 상기 헤어핀의 완전한 리지핑을 막을 수 있다(도 1b 참조). 동일한 분자 상의 일련의 언지핑/리지핑 사이클을 용이하게 수행할 수 있고, 언지핑 상태에서 DNA와 올리고뉴클레오티드의 쌍을 이룸으로 인한 리지핑시의 상기 차단(중지)을 검출할 수 있다.
차단 시간 지속은 전형적으로 평균 값 Toff가 Ftest와 함께 지수적으로 감소하는 지수 분포를 나타낸다. 이러한 확률 분포는 상기 분석의 단일 분자 성질을 연상시킨다. 이는 몇몇 결과를 가진다: 가장 개연성 있는 차단 시간은 0이고 이것은 우리의 실험 분해능(resolution) 보다 짧기 때문에 검출하지 못할 실질적인(substantial) 차단의 부분이 존재하는 것을 의미한다. 상기 헤어핀 재접힘을 차단하는 분자는 DNA 포크에서 벗어난 압력 하에 있다. 만일 Ftest가 15 pN(기계적 헤어핀 풀림 힘) 근처라면, 상기 압력은 약하고, 반대로 만일 Ftest가 저감되면, 상기 포크 압력은 상기 분자를 방출하면서 급격히 증가한다. 도 2에서 나타내는 바와 같이, Toff는 Ftest와 함께 지수적으로 감소하는 것을 알게 된다. 이러한 의존성은 매우 강해서 수 pN의 범위에서 Toff를 오직 측정할 수 있다. Toff(F)는 여기서 달성할 수 없는 Ftest = Funzip = 15pN일 때 자발적으로 결합이 풀리는 분자의 고전적인(classical) Toff와 오직 일치하는 것에 또한 주목한다.
차단 확률 Pblock은 지수 거동을 가진 열린 상태 Topen의 지속과 함께 증가한다: 도 3에 나타내는 바와 같이 Pblock = α(F).[1-exp(Topen/Ton)].
Pblock은 분자의 농도와 함께 증가하는 것을 예상할 수 있기 때문에, 도 4에서 12 nt 올리고뉴클레오티드에 대해, Pblock은 증가하고 [M]으로 포화되는 것을 보여준다.
Topen 및 분자 농도 [M]을 알 때, 다음의 관계식을 사용하여 Pblock으로부터 kon을 추정하는 것이 가능하다:
kon = -Log(1-Pblock/a(F))/([M]Topen).
결합의 강도(도 5 참조)는
kd -1 = -(Toff Log(1-Pblock/a(F))/([M]Topen)
에 의해 특성화될 수 있다.
차단의 평균 시간 Toff는 상기 올리고뉴클레오티드의 크기, 리지핑 동안 적용된 힘 Ftest, 온도에 의존하고, 사용된 버퍼의 이온 강도로부터 현저히 의존하지는 않는다.
Ton은 또한 온도의 올리고뉴클레오티드의 크기, 버퍼의 이온 강도에 의존하지만, Ftest에 현저히 의존하지는 않는다. 도 5에서 나타내는 바와 같이, 올리고뉴클레오티드와 기재 사이의 미스매치는 또한 이들의 반응속도 상수를 측정함에 의해 특성화될 수 있다. 예를 들면, 완전히 상보적인 12nt 올리고뉴클레오티드는 1.5 x 10-6M-1S-1의 kon을 나타내고, 하나의 말단으로부터 3 염기 떨어진 단일 미스매치를 도입하는 것은 kon을 많이 변경하지 않는다.
상기 미스매치를 올리고뉴클레오티드의 중앙으로 이동시키는 것은 kon을 인자 10까지 감소시킨다.
Toff는 또한 혼성체를 안정화할 수 있는 dsDNA 결합 단백질의 존재에 의존한다. 예를 들면 프리마제는, 검출되기에 충분히 오랜 시간 동안 헤어핀 재혼성화를 차단하기 위해 충분히 안정하지 않았던 DNA 올리고를 안정화할 것임을 보여주었다(도 6 참조). 유사한 방식으로, 프라이머로서 사용된 작은 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 폴리머라제의 결합은 그 안정성을 증가시킬 것이고; 이러한 분석은 그 프라이머 사이트에 대한 폴리머라제의 친화성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, 만일 단백질이 특이적 ssDNA 사이트(예를 들면 메틸화된 염기)에 결합한다면, 이는 검출되기에 충분히 오랫 동안 특이적 사이트에서 리지핑을 차단할 것이다.
상기 기술은 ss 또는 dsDNA를 따라 DNA 변형을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 이에 따라, 그 염기들 중 하나의 특이적 변형에 대해 지향된 항체(Ab)를 가진 표면에 상기 비드들을 고정하는 DNA 헤어핀을 검사함에 의해, 상기 헤어핀의 재혼성화시 Ab 결합으로부터 생기는 일시적인 차단을 통해 사슬을 따라 상기 변형된 염기의 존재 및 위치를 검출할 수 있다. 일련의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 가진 결합 사이트를 검사하는 것은 변형을 나타내는 DNA 단편의 동정을 가능하게 할 것이다.
ssDNA
주형에 대한
RecQ
의 결합 친화성의 검출
헬리카제는 dsDNA를 풀기 위해 ssDNA 갭(gap)에 결합한다. 이들 효소의 활성은 ssDNA에 대한 그 친화성에 직접 의존한다. 우리는 여기서 상기 파라미터를 직접 측정하거나 또는 분석하는 것을 제안한다. 이는 ATP 또는 ADP 또는 다른 유사체를 가지거나 가지지 않고 행해질 수 있다. 여기서 ATP 없이 E.coli로부터 RecQ 헬리카제에 관한 몇몇 결과들을 나타낸다. 전형적인 결합 신호는 도 7에 나타날 수 있고, 이는 하나의 헬리카제 농도에 대한 Pblock을 측정하도록 한다. Pblock 대 [RecQ]의 전개는 도 8에 나타내어진다. 우리는 [RecQ]의 특성 농도가 226 pM임을 관찰한다. 도 9에서 헬리카제는 비특이적으로 결합하는 것을 알게 된다. 마지막으로, 효소에 의한 차단은 저하(slippage) 거동을 나타낸다: Z 위치는 실제로 일정하지 않지만 다수의 단계에 의해 감소한다. 이러한 거동으로, Toff의 실제 값을 정의하는 것은 어렵고, 이에 따라 오직 Ton 및 kon을 측정할 수 있다.
Z=0에서의 피크는 차단에 대응하지 않고 단지 직접적인 재접힘에 대응한다. RecQ 차단은 주형을 따라 균일하게 발견되고, 0.9 ㎛에서의 감쇄(decay)는 다소 다른 연장을 가지는 분자의 평균에 기인한 것이다.
메틸화의 검출
도 11: 5mC에 대한 항체에 의한 차단 시간의 히스토그램. 대부분의 차단은 짧고 1.3s의 특성 시간과 함께 지수 분포에 상당히 잘 맞을 수 있다. 그러나 실질적인 수의 차단 17.5%는 30s를 초과한다. 이 조건에서 효소의 Toff를 결정하는 것은 매우 용이하지 않고, 우리는 2개의 다른 결합 메카니즘이 다른 것보다 더 강한 것과 경쟁하고 있다고 믿는다.
대안적으로, 변형을 인식하는 단백질(예를 들면, 메틸화된 시토신 또는 특이적으로 변형된 dsDNA에 대해 제안된(raised) 적절한 Ab를 인식하는 메틸 결합 도메인 단백질 1(MBD1))의 존재(또는 부재) 하에, 추정되는 변형 사이트에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 의해 공지된 DNA 변형의 존재에 대해 검사할 수 있다. 단백질의 존재 하에 상기 차단 시간은 현저히 증가되고, 변형된 염기의 위치 및 용이한 동정을 가져올 것이다.
미스매치 인식(mismatch-recognizing) 단백질을 사용함에 의해, 유사하게 상기 언급된 방법을 사용하여, DNA를 따라 미스매치(즉 SNP)를 동정할 수 있다. 또한 주어진 단백질/DNA 복합체의 안정성에 영향을 미칠 단백질들(또는 약물)을 검출하기 위해 상기 분석을 사용할 수 있다.
분석에 영향을 주는 파라미터
Fopen :많은 수의 비드들이 동시에 열리는 것을 보장하기 때문에 20 pN 값이 우수한 선택이다(이들의 자기화 및 이에 따라 10 내지 20%로 다양한 이들의 힘).
Topen은 분자 농도와 조합하여 중요한 파라미터로서 나타난다: 차단을 관찰하기 위해 하기 식에 따라 실질적인 값의 Pblock에 이르게 하는 양쪽 파라미터의 조합을 사용해야 한다:
Pblock = a(F).[1-exp(Topen·kon·[M])].
만일 kon을 측정하기를 원하면, Pblock이 포화되는 것을 피하는 것이 현명하고, 0.2 내지 0.5의 범위로 Pblock을 얻기 위해 [M] 및 Topen을 조정하는 것은 합리적인 통계를 얻기 위한 최소 수의 사이클을 보장할 것이다. Topen은 획득(acquisition) 프로그램에서 파라미터를 단순히 조정함에 의해 변형될 수 있고, 효소 농도의 변화는 흐름 챔버(flow chamber)에서 버퍼를 변화시키는 것을 요구한다. 반면에, 만일 kon이 측정되지 않는다면, Pblock을 포화시킬만한 가치가 있고, 이것은 차단의 최고의 통계를 얻을 것이다. 분자 농도는 그 공급에 의해 또는 원치않는 결합에 의해 제한될 수 있고, 예를 들면 5mC에 대한 항체를 사용하는 연구에서, 고농도에서 상기 효소는 그 풀림(unfolding)을 막는 근접한 상태로 상기 헤어핀의 이중 가닥 DNA에 결합한다. 35 nM 이하로 효소 농도를 제한하는 것이 이러한 사안을 해결하는 것을 알았다. 이들 실시예에서, Topen을 증가시키는 것이 Pblock을 증가시키는 유일한 방법이다.
파라미터 a(F)는 이론상 1에 근접하고, 그 값을 평가하기 위한 최선의 방법은, 도 3 및 4에서와 같이 Pblock이 점근적으로(asymptotically) a(F)에 도달할 때까지 Topen 또는 [M] 중 하나를 다양화하는 포화 분석(saturating assay)을 수행하는 것이다. 대안적으로, 하기 식으로 a(F)를 계산하는 것이 가능하다:
a(F) = exp(-Tdead/Toff)
여기서 Tdead는 검출 시스템의 데드(dead) 시간이고, Toff는 평균 차단 시간이다. 전형적으로 Tdead는 0.1s 오더(order)이다.
Ftest는 조정(adjust)을 위한 매우 중요한 파라미터이다: 그 범위는 사용된 헤어핀에 의존하지만, 전형적으로 [12 pN, 2 pN]에 걸친다. 12 pN보다 큰 힘에 대해 헤어핀 재접힘은 흥미로운 신호들을 가리는 ssDNA를 형성하는 2차 구조로 인해 이미 일부 차단이 나타난다. 낮은 힘에서, DNA의 연장은 매우 작아지고, 노이즈는 급격히 증가한다. 헤어핀 포크 압력은 분자들을 밀어 매우 효율적으로 탈혼성화시키고(dehybridized), Toff = T0 exp F/F0인 것을 관찰하고; 이에 따라 Ftest가 저감됨에 따라 Toff는 매우 빨리 감소한다. 예를 들면, 9 nt 올리고뉴클레오티드는 Ftest = 11pN 주위에서 1s 차단을 생성할 것이고, 9 pN 이하의 힘에서, 상기 차단은 거의 볼 수 없다(a(F)가 작아진다). 12 nt 올리고뉴클레오티드에 대해 상기 관찰 범위는 [10 pN, 6 pN]이다. 37 nt 뉴클레오티드에 대해, 상기 차단은 6 pN에서 영원히 지속하지만, Ftest = 3pN에서 수 초로 떨어진다. 단백질 결합에서도 동일한 것이 관찰된다: 결합이 강할수록, 차단이 관찰되는 힘은 더 낮아진다.
우리는 상기 차단 시간이 측정가능하지만(a(F) ~ 1), 많은 사이클이 만들어지도록 Ttest가 상대적으로 짧게 하기 위해 너무 길지는 않도록 Ftest를 조정한다.
이러한 분석에서, 0.2 s 내지 20 s의 범위에서 Toff를 측정할 수 있다. 빠른 비디오 카메라와 같은 보다 빠른 측정 장치로 더 짧은 시간이 관찰될 수 있고, 더 긴 시간은, 분포를 평균하기 위해 몇 개의 사이클들을 얻을 필요가 있기 때문에 매우 긴 획득을 이끈다. 올리고뉴클레오티드에 대해, Toff는 Ftest에 따라 지수적으로 달라진다; 이에 따라 사용가능한 범위에서 Toff를 가지도록 Ftest를 조정할 수 있다. 단백질에 대해, Ftest에 따른 Toff의 변화는 알려져 있지 않지만, Ftest의 감소는 보통 Toff를 급격히 감소시키는 것으로 관찰된다. 그러나, 연역적으로(a priori) Toff는 알려져 있지 않고, 넓은 범위에서 다양할 수 있다. Ftest의 전형적인 값의 착상을 얻기 위해, 도 12에서 행해진 바와 같이, 수 초에 걸쳐 램프를 따라 올라가고 감소하는 힘과 함께 일련의 사이클을 먼저 얻는 것이 편리하다는 것을 알았다. 차단 상태의 끝은 힘 Fc에 대응한다. Fc의 분포는 Toff가 상기 램프 지속의 오더인 값에 대해 정점에 달한다.
이어서, 측정 가능한 범위에서 Toff를 얻기 위해 <Fc>보다 약간 큰 Ftest와 함께 힘(Fopen 및 Ftest)에서 안정기(plateau)를 갖는 사이클과 함께 진행할 수 있다.
Ttest 및 Ncycles : Ttest는 Toff보다 2 또는 3배 커야만 한다. 마지막으로 사이클의 수는 측정의 종합적인 정확도를 정의한다. X% 정확도를 얻기 위해, X/100 = 1/Nblock 1 /2 와 Pblock = Nblock/Ncycle를 필요로 한다; Ncycle =10000/(X2Pblock).
상기 분석을 개선: 다양한 문제들이 자주 발생하고, 효소의 결합은 짧고 또한 매우 긴 사건들이 나타날 수 있다(도 9); 이러한 마지막 상황은 상기 차단이 여전히 활성인 반면 평가 상태의 마지막 및 새로운 사이클의 출발을 시작한다(도 7). 상기 차단은 열린 상태 동안 감추어져 있기 때문에, 이어지는 사이클에 걸쳐 연장하는 상기 차단은 개연성이 있지만 결코 입증된 사건이 아니다. 이러한 곤란한 상황을 피하기 위해, 낮은 힘에서 차단은 보통 매우 짧다는 사실을 이용하는 것이 가능하다. 이에 따라, 낮은 힘으로 평가한 후 제3 상태를 추가함에 의해 Fclean = 0.5 pN 및 Tclean = 2s로 임의의 결합된 분자의 헤어핀을 청소할 수 있고, 우리는 결합된 임의의 분자를 제거하고 다음 사이클을 위해 깨끗한 헤어핀을 준비한다. 분자는 또한 몇몇 결합 사이트를 나타낼 것이고, 이에 따라 차단 신호는 첫 번째 차단 후 분자가 두 번째 결합 사이트 등에서 차단하는 계단 모양을 가질 것이다(도 10). 두 번째 차단에 대한, 유효한 열린 상태는 Topen + Tblock1이다(도 10); 만일 Tblock1이 Topen보다 크다면, 첫 번째 것이 반응속도론적 파라미터의 측정을 망친 후, 두번째 차단을 관찰할 가능성이 많다. 이어서 이러한 효과를 최소화하기 위해 Ttest와 비교하여 큰 Topen을 사용하는 것이 더 낫다.
SEQUENCE LISTING
<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)
ECOLE NORMALE SUPERIEURE
UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE (PARIS 6)
David BENSIMON, Vincent CROQUETTE,Harold GOUET, Jean-Fran?is ALLEMAND, Fang-Yuan DING
<120> PROCESS FOR DETECTION OF DNA MODIFICATIONS AND PROTEIN BINDING BY
SINGLE MOLECULE MANIPULATION
<130> 364874D31906
<140> EP 13305074.0
<141> 2013-01-22
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide
<400> 1
acagccagcc ga 12
Claims (25)
- 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 대한 단백질의 결합을 결정하는 방법으로,
a) 상기 분자에 물리적 힘을 적용시켜 핵산 서열을 포함하는 이중 가닥 핵산 분자를 변성시키는 단계;
b) 상기 단백질을 제공하는 단계;
c) 상기 단백질의 존재 하에 상기 이중 가닥 핵산 분자를 재생하는(renaturing) 단계;
d) 상기 이중 가닥 핵산의 재생의 차단을 검출하는 단계; 및
e) 상기 이중 가닥 핵산 분자 상의 상기 차단의 위치를 결정하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 서열에 대응하는 단일 가닥 핵산 분자를 단계 b)에서 추가로 제공하는 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 이중 가닥 핵산 분자는 헤어핀인 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이중 가닥 핵산의 하나의 가닥의 염기 중 적어도 하나가 표면에 직접 또는 간접적으로 부착되고, 상기 이중 가닥 핵산 분자의 다른 가닥의 염기 중 적어도 하나가 이동하는 표면에 부착되는 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
이중 가닥 핵산은, 지지체들을 멀어지도록 하여, 단계 a)에서 변성시키는 방법. - 제5항에 있어서,
지지체들을 멀어지도록 하여, 15 pN 이상, 바람직하게는 17 pN 이상, 보다 바람직하게는 18 pN 이상의 물리적 힘이 이중 가닥 분자에 적용되는 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
변성된 이중 가닥 핵산은, 지지체들을 함께 모아, 단계 c)에서 재생되는 방법. - 제7항에 있어서,
지지체들을 함께 모아, 이중 가닥 분자에 적용되는 힘이 12 pN 이하, 바람직하게는 11 pN 이하, 보다 바람직하게는 10 pN 이하로 저감되는 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
지지체에 부착되지 않은 이중 가닥 핵산의 말단이 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 다른 것에 연결되는 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 a) 내지 d)가 (측정을 축적하고 신호/노이즈 비를 증가시키도록) 수 회 반복되는 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 d)의 검출은 지지체에 부착된 이중 가닥 핵산 분자의 두 말단 사이의 거리(z)를 측정하는 것을 포함하는 방법. - 제11항에 있어서,
상기 이중 가닥 핵산 분자가 변성될 때, 지지체에 부착된 이중 가닥 핵산 분자의 두 말단 사이의 거리(zhigh)를 측정하는 추가의 단계를 포함하는 방법. - 제12항에 있어서,
단계 e)는 z 및 zhigh를 비교하는 이전의 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
차단의 지속을 측정하는 추가의 단계를 포함하는 방법. - 제14항에 있어서,
기준 값과 차단의 지속을 비교하는 추가의 단계를 포함하는 방법. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질에 의해 결합된 핵산 서열을 시퀀싱(sequencing)하는 단계를 더 포함하는 방법. - 특이적 핵산 결합 단백질을 결합할 수 있는 서열을 포함하는 핵산 분자를 동정하는 방법으로,
a) 이중 가닥 핵산 분자의 집단을 제공하는 단계;
b) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 상기 핵산 분자에 대한 상기 단백질의 결합을 평가하는 단계; 및
c) 상기 단백질에 결합할 수 있는 핵산 분자를 선택하는 단계
를 포함하는 방법. - 이중 가닥 핵산 분자 내 포함된 적어도 하나의 변형된 염기를 검출하는 방법으로,
a) 상기 이중 가닥 핵산을 제공하는 단계;
b) 상기 변형된 염기를 결합할 수 있는 단백질을 제공하는 단계; 및
c) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 상기 핵산 분자에 대한 상기 단백질의 결합을 평가하는 단계
를 포함하는 방법. - 제18항에 있어서,
변형된 염기는 4-메틸시토신(4mC), 5-메틸시토신(5mC), 5-히드록시메틸시토신(5hmC), 5-포름일시토신(5fC), 5-카복실시토신(5caC), 5-히드록시메틸우라실(5hmU) 및 N6-메틸아데노신(m6A)으로 이루어진 군에서 선택되는 방법. - 제18항 또는 제19항에 있어서,
변형된 염기는 5mC인 방법. - 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질은 상기 변형된 염기를 결합할 수 있는 항체인 방법. - 이중 가닥 핵산 분자에서 적어도 하나의 미스매치(mismatch)를 검출하는 방법으로,
a) 상기 이중 가닥 핵산 분자를 제공하는 단계;
b) 미스매치된 염기를 결합할 수 있는 단백질을 제공하는 단계; 및
c) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 상기 핵산 분자에 대한 상기 단백질의 결합을 평가하는 단계
를 포함하는 방법. - 제22항에 있어서,
상기 단백질은 MutS 이합체, Msh2/Msh6 (MutSα), 및 Msh2/Msh3 (MutSβ)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법. - 핵산 분자 내 함유된 서열에서 SNP를 검출하는 방법으로,
a) 다수의 집단에서 발견된 서열을 포함하는 단일 가닥 핵산과 상기 핵산을 혼성화하는 단계; 및
b) 생성된 미스매치를 제22항 또는 제23항의 방법에 의해 검출하는 단계
를 포함하는 방법. - 단백질 및 그 결합 사이트 사이의 상호작용을 막을 수 있는 적어도 하나의 화합물을 동정하는 방법으로,
a) 상기 단백질 및 상기 결합 사이트에 대응하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 단계;
b) 화합물을 제공하는 단계; 및
c) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 상기 핵산 분자에 대한 상기 단백질의 결합을 평가하는 단계
를 포함하는 방법.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11785922B2 (en) | 2017-06-19 | 2023-10-17 | Seoul National University Hospital | Recombinant vector comprising ERT2 fused to CAS9 |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010037001A2 (en) | 2008-09-26 | 2010-04-01 | Immune Disease Institute, Inc. | Selective oxidation of 5-methylcytosine by tet-family proteins |
| ES2669214T3 (es) | 2011-12-13 | 2018-05-24 | Oslo Universitetssykehus Hf | Procedimientos y kits para la detección de estado de metilación |
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| US20170298412A1 (en) * | 2014-09-29 | 2017-10-19 | Fujirebio Inc | Method and kit for measuring target nucleic acid containing modified nucleobase |
| EP3090803B1 (en) | 2015-05-07 | 2019-08-07 | Paris Sciences et Lettres - Quartier Latin | Improved device for the analysis of nucleic acid molecules |
| CN107771222B (zh) | 2015-05-07 | 2019-06-04 | 巴黎科学与文学联大-拉丁区 | 使用力诱导的链侵入原位形成发夹 |
| US11459573B2 (en) | 2015-09-30 | 2022-10-04 | Trustees Of Boston University | Deadman and passcode microbial kill switches |
| EP3950957A1 (en) | 2017-08-08 | 2022-02-09 | Depixus | In vitro isolation and enrichment of nucleic acids using site-specific nucleases |
| CN110470844A (zh) * | 2018-05-09 | 2019-11-19 | 中国科学院物理研究所 | 基于解旋酶检测dna与蛋白质相互作用的方法 |
| CA3120176A1 (en) | 2018-11-16 | 2020-05-22 | Depixus | Optimization of in vitro isolation of nucleic acids using site-specific nucleases |
| IL283866B2 (en) | 2018-12-12 | 2023-02-01 | Depixus | Nucleic acid enrichment method using site-specific nuclei, which appear by capture |
| CN110396535B (zh) * | 2019-05-08 | 2022-12-23 | 南开大学 | 单分子技术检测cgi序列甲基化调控cxxc结构域位点特异性结合的方法 |
| CN111269911B (zh) * | 2020-01-23 | 2023-05-02 | 南开大学 | 包括CpG位点的发夹结构及测量CpG毗邻序列影响蛋白解离时间常数的单分子力学方法 |
| EP4034676A1 (en) | 2020-07-30 | 2022-08-03 | Cambridge Epigenetix Limited | Compositions and methods for nucleic acid analysis |
| EP4160199A1 (en) | 2021-10-04 | 2023-04-05 | Depixus | Apparatus for biomolecule analysis with a well and a cavity below the well |
| WO2023187759A1 (en) * | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Depixus SAS | Methods of screening compounds |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2390351A1 (en) * | 2010-05-27 | 2011-11-30 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | Method of DNA sequencing by hybridisation |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE48140T1 (de) | 1981-04-17 | 1989-12-15 | Univ Yale | Modifizierte nukleotide und verfahren zu ihrer herstellung und anwendung. |
| IL73577A (en) | 1983-12-12 | 1989-10-31 | Miles Lab | Method and reagent system for detecting dna or rna sequences in a test medium containing single stranded dna or rna using antibodies to intercalation complexes with double stranded nucleic acid |
| CA1223222A (en) | 1984-02-22 | 1987-06-23 | Nanibhushan Dattagupta | Immobilized nucleic acid-containing probes |
| EP0530357B1 (en) | 1991-03-21 | 1995-11-15 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes |
| US7244391B2 (en) | 1997-03-28 | 2007-07-17 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Apparatus and method for the manipulation and testing of molecules, and in particular of DNA |
| US7052650B2 (en) | 1997-03-28 | 2006-05-30 | Center National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Apparatus and method for the manipulation and testing of molecules, and in particular of DNA |
| US6238869B1 (en) * | 1997-12-19 | 2001-05-29 | High Throughput Genomics, Inc. | High throughput assay system |
| CA2372909A1 (en) * | 1999-03-30 | 2000-10-05 | Nanogen, Inc. | Single nucleotide polymorphic discrimination by electronic dot blot assay on semiconductor microchips |
| AU2005308916B2 (en) * | 2004-11-29 | 2011-07-21 | Sequenom, Inc. | Kits and methods for detecting methylated DNA |
| CN100424174C (zh) * | 2005-09-01 | 2008-10-08 | 上海交通大学 | 原子力显微镜诱导单分子dna定位突变方法 |
| EP2053379A1 (en) * | 2007-10-24 | 2009-04-29 | Nambition GmbH | Method and apparatus for analysis of force traces |
| EP2390350A1 (en) | 2010-05-27 | 2011-11-30 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | Method of DNA sequencing by polymerisation |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2390351A1 (en) * | 2010-05-27 | 2011-11-30 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | Method of DNA sequencing by hybridisation |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| NATURE CHEMICAL BIOLOGY, vol. 5, no. 12, pp. 904-912. * |
| NATURE, vol. 489, no. 7414, pp. 57-74. * |
| QUARTERLY REVIEWS OF BIOPHYSICS, vol. 43, no. 2, pp. 185-217 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11785922B2 (en) | 2017-06-19 | 2023-10-17 | Seoul National University Hospital | Recombinant vector comprising ERT2 fused to CAS9 |
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