ES2899693T3 - Método para la detección de fragmentos genómicos - Google Patents

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Abstract

Un método para analizar una muestra para detectar la presencia de un fragmento de ácido nucleico diana, que comprende (i) proporcionar una muestra de ácido nucleico fragmentado; (ii) proporcionar condiciones desnaturalizantes en las que el fragmento diana es monocatenario; (iii) poner en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico que comprende un oligonucleótido de direccionamiento que es más largo que el fragmento diana y contiene una secuencia interna complementaria a la diana, de modo que la hibridación entre el oligonucleótido de direccionamiento y el fragmento diana forma una secuencia bicatenaria ubicada entre una secuencia flanqueante corriente arriba y una secuencia flanqueante corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento, y, una secuencia de cabeza y una secuencia de cola que tienen extremos libres 5' y 3' respectivamente, en donde la secuencia de cabeza y la secuencia de cola son complementarias a las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo respectivamente; (iv) proporcionar condiciones de fusión en las que las secuencias de cabeza y cola se hibridan con las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo, y el fragmento diana, si está presente, hibrida con la secuencia complementaria de la diana, colocando así los extremos del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola; (v) proporcionar condiciones para la ligación de modo que, si el fragmento diana está presente, el extremo 3' del fragmento diana se liga al extremo 5' de la secuencia de cabeza para formar una primera unión de ligación, y el extremo 5' del fragmento diana se liga al extremo 3' de la secuencia de cola para formar una segunda unión de ligación, produciendo un producto de ligación que comprende una cadena circular de ácido nucleico que comprende las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana; y, (vi) detectar si el producto de ligación está presente, en donde la presencia del producto de ligación indica la presencia del fragmento diana en la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la detección de fragmentos genómicos
Campo de la invención
La presente descripción se refiere a las sondas para detectar secuencias específicas de ácido nucleico en las muestras biológicas, especialmente las sondas para su uso en los métodos multiplex para detectar múltiples secuencias específicas en paralelo, y a los métodos en los que tales sondas se usan para detectar fragmentos de ácido nucleico. En particular, la presente descripción se refiere a los fragmentos de ADN diana de cromosomas específicos para el análisis posterior.
Antecedentes
El genoma haploide humano contiene 3 mil millones de pares de bases empaquetados en 23 cromosomas, y el genoma diploide tiene 6 mil millones de pares de bases en 23 pares de cromosomas. La rapidez y la conveniencia de la tecnología de la secuenciación moderna permiten abordar muchas interrogantes del diagnóstico mediante el uso de la secuenciación de alto rendimiento del genoma completo de un individuo o de la cantidad total del ADN en una muestra. Sin embargo, para muchas aplicaciones de diagnóstico del ADN, solo es necesario investigar un subconjunto del genoma, centrándose en la región o las regiones que se sabe que se asocian con los trastornos particulares que están en investigación.
Se han descrito varias técnicas para reducir la complejidad del genoma antes del análisis. Cuando solo se requiere analizar una única región corta del genoma, esto puede hacerse mediante el uso de la PCR simple para amplificar la secuencia mediante el uso de cebadores para las regiones conocidas en cualquier lado. Sin embargo, cuando se desea amplificar muchas regiones de una muestra genómica para el análisis, pueden surgir artefactos de amplificación como resultado de realizar múltiples amplificaciones diferentes juntas en la misma mezcla de reacción.
Los documentos núms. WO2003/044216 (Parallele Bioscience, Inc.) y US20090004701A1 (Malek Faham) describen un método de amplificación multiplex de ácidos nucleicos diana, en el que se ligaron cebadores de oligonucleótidos comunes a los sitios internos a los fragmentos de ácido nucleico monocatenario. Los sitios de cebado comunes se agregaron a cada una de una pluralidad de secuencias diana diferentes para permitir su amplificación estequiométrica.
El documento núm. WO2005/111236 (OlinkAB) también describió un método para identificar secuencias en el genoma humano mediante la amplificación de secuencias diana específicas. El método implicó fragmentar la muestra genómica en fragmentos que tenían al menos una secuencia final definida. Los constructos selectores, que comprenden un motivo de par de cebadores, se pusieron en contacto con los fragmentos. Después de la ligación, las secuencias diana seleccionadas se amplificaron en paralelo mediante el uso de un par de cebadores específico para el motivo de par de cebadores común a los selectores. Los constructos selectores que se describen en el documento núm. WO2005/111236 tenían un oligonucleótido largo hibridado con un oligonucleótido corto, teniendo cada constructo selector uno o dos extremos sobresalientes complementarios a una secuencia final definida de un fragmento que contiene la secuencia diana. El contacto de los selectores con los fragmentos diana dio como resultado la hibridación del fragmento diana entre los extremos sobresalientes del selector o los selectores. En el caso de un solo selector con dos extremos sobresalientes, esta hibridación produjo un constructo circularizado. En el caso de un par de selectores, cada uno con un extremo sobresaliente, esto formó un constructo lineal. La ligación y la secuenciación de los constructos selectores que contienen los fragmentos diana permitió determinar la secuencia diana. Dado que los constructos selectores se hibridan solo con las partes finales del fragmento que contiene la secuencia diana (o con una parte final y una parte interna), el método permitió la selección de las secuencias diana que diferían en las partes que no hibridaban, de modo que cada molécula selectora podría hibridar con una variedad de secuencias diana diferentes. La identidad de la diana exacta se determinó luego mediante la amplificación y la secuenciación de los constructos. El documento núm. WO2005/111236 propuso usar los selectores en los métodos de análisis de la variabilidad genética o para medir el número de copias de ADN.
El documento núm. GB2492042 describió una variación del método selector, en el que los fragmentos se pusieron en contacto con una sonda bicatenaria parcialmente que comprende un oligonucleótido selector y al menos un oligonucleótido vector. El oligonucleótido selector contenía dos regiones no adyacentes específicas para el fragmento diana y una región específica no diana que comprendía al menos dos sitios de unión para el oligonucleótido vector. El oligonucleótido vector no era complementario a la secuencia diana e incluía una secuencia de nucleótidos complementaria al sitio de unión del vector en el oligonucleótido selector. El oligonucleótido vector también contenía los elementos para la detección/enriquecimiento. En el método, las partes complementarias de los oligonucleótidos sonda se hibridaron con el fragmento diana, seguido de la ligación del oligonucleótido o los oligonucleótidos vector y la diana para producir un híbrido sonda-fragmento diana, que luego se detectó.
Un desarrollo de la tecnología del selector se describió en el documento núm. WO2011/009941 (Olink Genomics AB), que describe la ligación de un extremo de un fragmento de ADN genómico digerido a una sonda. En comparación con las sondas selectoras anteriores, que implicaban la unión a dos regiones del fragmento diana y donde la secuencia a aislar estaba típicamente unida por dos regiones de secuencia conocida, las sondas en el documento núm. WO2011/009941 se describieron para su uso donde solo había una región conocida de la secuencia. Algunas realizaciones de las sondas en el documento núm. WO2011/009941 contenían elementos para la inmovilización a una fase sólida. La ligación del fragmento de ácido nucleico diana a la sonda dio como resultado una captura estable del fragmento diana y permitió el uso de etapas de lavado muy estrictos para eliminar los fragmentos no ligados, lo que dio como resultado una alta especificidad.
También se conocen las sondas de candado. Las sondas de candado son oligonucleótidos lineales con secuencias complementarias a la diana en los extremos y una secuencia no complementaria a la diana en el medio. Cuando se hibrida con la secuencia correcta del ADN diana, los dos extremos de la sonda se unen de la cabeza a la cola y pueden unirse mediante la ADN ligasa. La ligación se inhibe por los emparejamientos erróneos en la unión de ligación, por lo que la ligación exitosa de la sonda de candado depende de una hibridación altamente específica con la secuencia diana, lo que permite a la sonda distinguir entre las secuencias diana muy similares y bloquear selectivamente su diana exacta. Como consecuencia de la naturaleza helicoidal del ADN bicatenario, la molécula de sonda circularizada se encadena a la cadena de ADN diana.
Se conocía para amplificar las sondas de candado circularizadas mediante el uso de la replicación en círculo rodante, también conocida como amplificación en círculo rodante. La replicación en círculo rodante se describió en el documento núm. US 5,854,033 (Lizardi). La replicación en círculo rodante es una amplificación de una molécula de ácido nucleico circular mediante el uso de una cadena que desplaza a la ADN polimerasa, lo que da como resultado grandes moléculas de ADN que contienen repeticiones en tándem de la secuencia amplificada. La ADN polimerasa cataliza la extensión del cebador y el desplazamiento de la cadena en una reacción de polimerización en círculo rodante que se desarrolla tanto tiempo como se desee. Esto da como resultado una amplificación de la secuencia de la sonda circularizada en órdenes de magnitud superiores a un solo ciclo de replicación por la PCR y otras técnicas de amplificación en las que cada ciclo se limita a duplicar el número de copias de una secuencia diana. Puede obtenerse una amplificación adicional mediante el uso de una cascada de reacciones de desplazamiento de la cadena.
Fredriksson et al., (Nucleic Acids Res. 35(7):e472007) describieron "Gene-Collector", un método para la amplificación multiplex de ácidos nucleicos mediante el uso de sondas colectoras que contienen secuencias adyacentes complementarias a las secuencias finales del cebador afines de los productos de PCR deseados, de modo que la unión de las sondas colectoras a los productos de PCR trae los extremos de los productos de PCR juntos para formar un círculo de ADN. A continuación, se realiza la amplificación universal mediante el uso de la amplificación en círculo rodante para generar un producto final de concatémeros de las secuencias diana. Este método permite que los amplicones correctos en una reacción de PCR multiplex se detecten selectivamente, porque las secuencias finales de los amplicones correctos son un par de cebadores afines y están circularizados por la sonda colectora, mientras que los artefactos de PCR que combinan un cebador de un par con un cebador de otro par no están circularizados.
Nautiyal et al. (PNAS 107 (28): 12587-12592) divulga un método para detectar un fragmento de ácido nucleico diana que comprende hibridarlo con un panel de sondas de captura dU, que comprenden secuencias complementarias a la diana flanqueadas por dos regiones comunes, así como oligonucleótidos adaptadores complementarios a las regiones comunes en las sondas dU, y ligando los adaptadores a los extremos del ADN genómico.
Resumen de la invención
La invención está definida por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgación proporciona las sondas y los métodos mejorados para analizar los fragmentos de ácido nucleico, tales como el ADN genómico fragmentado. Algunas realizaciones se refieren a las sondas y a su uso en los métodos de análisis de muestras para detectar la presencia de fragmentos de ácido nucleico monocatenario diana. Algunas realizaciones se refieren a las sondas que comprenden
un oligonucleótido de direccionamiento que contiene una secuencia complementaria a la diana que es el complemento del fragmento diana y una secuencia flanqueante adyacente a la secuencia complementaria a la diana, y
una secuencia de oligonucleótidos que tiene un extremo 5' o 3' libre,
en donde la hibridación entre el fragmento y la sonda moldea el fragmento diana para la ligación al extremo 5' o 3' libre de la secuencia de oligonucleótidos.
Algunas realizaciones se refieren además a las sondas que se hibridan a lo largo de la longitud de un fragmento de ácido nucleico monocatenario y se ligan a cada extremo del fragmento. Tales sondas comprenden una secuencia de oligonucleótidos que tiene un extremo 5' libre y una secuencia de oligonucleótidos que tiene un extremo 3' libre, para la ligación a cada extremo del fragmento diana. A continuación, se detecta el producto de la ligación, lo que permite un direccionamiento y detección altamente específica de los fragmentos de ácido nucleico definidos.
Un método de acuerdo con algunas realizaciones puede comprender digerir el ADN en fragmentos con secuencia definida, desnaturalizar los fragmentos de ADN resultantes en fragmentos monocatenarios (dianas) y mezclar las dianas con las sondas como se describe en la presente descripción. La hibridación de las dianas con las sondas produce moldes para la ligación para conectar específicamente la diana a una sonda correspondiente para generar un círculo o un producto de la ligación lineal. A continuación, los productos de la ligación pueden enriquecerse, por ejemplo, mediante exonucleasas o química en fase sólida, y opcionalmente amplificarse mediante la amplificación en círculo rodante, la PCR u otros métodos de amplificación de ADN.
Una ventaja clave de algunas realizaciones radica en el análisis de una multitud de fragmentos de ADN en paralelo. Una multitud de fragmentos de ADN pueden dirigirse específicamente y seleccionarse para el análisis posterior. Esto es particularmente útil para las pruebas prenatales no invasivas (NIPT) de ADN fetal libre de células en el torrente sanguíneo materno, donde el recuento de miles de fragmentos de ADN específicos de cromosomas produce una cuantificación muy precisa.
En un aspecto, se proporciona un método para analizar una muestra para determinar la presencia de un ácido nucleico diana. El método típicamente implica generar los fragmentos de ácido nucleico diana definidos al poner en contacto la muestra con una sonda que hibrida a lo largo de la longitud del fragmento diana y proporciona uniones ligables en los extremos 3' y 5' del fragmento, ligar el fragmento diana a la sonda tanto en el extremo 3' como en el 5', y luego detectar la nueva molécula de ácido nucleico formada por el evento de doble ligación.
Un aspecto proporciona un método para analizar una muestra para detectar la presencia de un ácido nucleico diana, que comprende:
(i) proporcionar una muestra de ácido nucleico fragmentado
(ii) proporcionar las condiciones de desnaturalización bajo las cuales el fragmento diana es monocatenario
(iii) poner en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico que comprende
un oligonucleótido de direccionamiento que es más largo que el fragmento diana y contiene una secuencia interna complementaria a la diana, de modo que la hibridación entre el oligonucleótido de direccionamiento y el fragmento diana forma una secuencia bicatenaria ubicada entre las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento, y
las secuencias de cabeza y cola que tienen los extremos 5' y 3' libres respectivamente, en donde las secuencias de cabeza y cola son complementarias a las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo respectivamente,
(iv) proporcionar las condiciones de fusión en las que las secuencias de cabeza y cola se hibridan con las secuencias flanqueantes, y el fragmento diana, si está presente, hibrida con la secuencia complementaria a la diana, lo que coloca de esta manera los extremos del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola
(v) proporcionar las condiciones para la ligación de modo que, si el fragmento diana está presente, el extremo 3' del fragmento diana se liga al extremo 5' de la secuencia de cabeza para formar una primera unión de ligación, y el extremo 5' del fragmento diana se liga al extremo 3' de la secuencia de cola para formar una segunda unión de ligación, lo que produce un producto de la doble ligación que comprende una cadena continua de ácido nucleico que comprende las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana, y
(vi) detectar si el producto de la doble ligación está presente,
en donde la detección del producto de la doble ligación indica la presencia del fragmento diana en la muestra.
En contraste con la mayoría de los otros enfoques de selección y detección de ADN, el presente método puede ser particularmente útil cuando el fragmento de ácido nucleico completo está predefinido o predeterminado, es decir, cuando la secuencia del fragmento diana se conoce de antemano. En algunas implementaciones del presente método, el fragmento diana es el producto de una fragmentación específica de ácido nucleico, en lugar de una fragmentación aleatoria como la que puede producirse por medios físicos tales como el cizallamiento o la sonicación. La fragmentación específica de ácido nucleico se puede lograr mediante el uso de enzimas de restricción, la PCR u otra definición de extremo de fragmento dirigido a la secuencia.
Es conveniente que el oligonucleótido de direccionamiento entre en contacto con el fragmento diana completo, para asegurar la unión específica de la secuencia diana precisa. Esto contrasta con los enfoques anteriores en los que las sondas se diseñaron para hibridar con un extremo o extremos del fragmento y/o una región interna, pero no para unirse a lo largo del fragmento diana. De hecho, la unión limitada al fragmento diana fue una característica de diseño deliberada en muchas sondas anteriores, ya que esto permitía que los fragmentos se dirigieran y detectaran cuando su secuencia solo se conocía en parte. Al dirigirse específicamente a los fragmentos de secuencia conocida, sujeto a la posibilidad de una ligera variabilidad de secuencia resultante de diferentes alelos en una población, cuando corresponda, las sondas y los métodos del presente método pueden permitir la unión precisa y la detección del fragmento diana deseado con un riesgo muy bajo de resultados falsos positivos.
La doble ligación del fragmento diana puede contribuir además a la alta especificidad del método. La sonda se liga a la secuencia diana en cada extremo, es decir, a los extremos 5' y 3' del fragmento monocatenario de ácido nucleico. Por tanto, los extremos de la diana que se generaron específicamente mediante fragmentación pueden detectarse específicamente mediante la ligación específica de secuencia a las secuencias de cabeza y cola. La naturaleza específica de la secuencia de la ligación se logra mediante el requisito de hibridación tanto del fragmento diana como de las secuencias de cabeza y cola con el oligonucleótido de direccionamiento, y mediante la sensibilidad de la ADN ligasa que se inhibe por los emparejamientos erróneos de pares de bases. La hibridación del fragmento diana con el oligonucleótido de direccionamiento contribuye a la especificidad de la unión, pero, a diferencia de las reacciones de ligación que proporcionan la mayor selectividad con respecto a los emparejamientos erróneos en los extremos 3' y 5' del fragmento diana, la hibridación se desestabiliza más por los emparejamientos erróneos internos en la parte central de la diana.
El oligonucleótido de direccionamiento actúa para la ligación de molde del fragmento diana a las secuencias de cabeza y cola. Las secuencias de cabeza y cola se hibridan con las secuencias flanqueantes, lo que define un espacio entre el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola. El fragmento diana se hibrida con la secuencia complementaria a la diana en el espacio, lo que coloca de esta manera los extremos del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola. Preferentemente, la fusión del fragmento diana y las secuencias de cabeza y cola con la sonda genera dos uniones ligables perfectamente emparejadas. El producto de la doble ligación es entonces una cadena continua de ácido nucleico que comprende las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana.
Se contemplan varios diseños posibles de la sonda. Por ejemplo, los extremos 5' y 3' para la ligación al fragmento diana pueden proporcionarse por las secuencias de cabeza y cola en dos oligonucleótidos de cadena principal separados, o por las secuencias de cabeza y cola en los extremos respectivos de un solo oligonucleótido de la cadena principal que forma bucles para posicionar el fragmento diana entre los extremos 5' y 3'.
En el primer caso (dos oligonucleótidos de la cadena principal separados), la ligación del fragmento diana a los dos oligonucleótidos de la cadena principal produce una cadena lineal de ácido nucleico que comprende el fragmento diana entre las secuencias de cabeza y cola.
En el segundo caso (oligonucleótido de la cadena principal en bucle único), la ligación del fragmento diana produce un círculo de ácido nucleico que comprende la secuencia diana entre las secuencias de cabeza y cola.
En versiones adicionales, una o ambas secuencias de cabeza y cola pueden proporcionarse en el propio oligonucleótido de direccionamiento, de modo que el oligonucleótido de direccionamiento forma una estructura en bucle en las condiciones de fusión. Dependiendo del diseño, el producto de la doble ligación en tales casos puede ser una molécula de ácido nucleico lineal o circular.
La detección del producto depende de la ligación exitosa del fragmento diana a las secuencias de cabeza y cola para formar una cadena continua de ácido nucleico. En general, el producto de la doble ligación se detecta mediante el uso de un enfoque que requiere que ocurran ambos eventos de ligación para generar una señal. Por ejemplo, la detección puede comprender la amplificación a través de ambas uniones de ligación (por ejemplo, mediante la PCR o, por realizaciones circulantes de la sonda, la replicación en círculo rodante), o la captura de la cadena continua de ácido nucleico en un extremo y la detección de su otro extremo. La unión covalente del fragmento diana a la sonda por ligación forma un enlace fuerte, por lo que puede usarse un lavado riguroso para eliminar los ácidos nucleicos no ligados en los que las secuencias de cabeza y cola no están unidas covalentemente, siendo su hibridación mutua con el oligonucleótido de direccionamiento interrumpida por el lavado.
Estas características del método y la sonda permiten una selección muy específica de los fragmentos diana. Cuando los métodos se aplican para la detección multiplex de una pluralidad de fragmentos diana en paralelo, es posible una detección y cuantificación muy precisas del ácido nucleico diana. Como resultado de su alta especificidad, el presente método puede ser especialmente adecuado para uso diagnóstico en muestras pequeñas y/o para detectar diferencias muy pequeñas en cantidades relativas de diferentes ácidos nucleicos diana, por ejemplo en el diagnóstico de aneuploidías en cromosomas fetales de una muestra de sangre materna o en la detección de la presencia de trazas de ADN tumoral en una muestra de tejido normal de un paciente o la detección de fragmentos de ácido nucleico de agentes infecciosos.
Tener un reconocimiento altamente específico de los fragmentos diana permite el uso de una concentración de la sonda relativamente alta sin generar señales falsas positivas, lo que aumenta de esta manera el rendimiento y la eficiencia de la reacción. Esto puede ser de gran importancia en las aplicaciones de diagnóstico donde la baja variabilidad es importante y las dianas pueden estar presentes en números bajos, por ejemplo, en NIPT mediante el análisis de ADN libre de células, la detección de ADN tumoral circulante libre de células y la detección de ADN de agentes infecciosos. Algunas realizaxiones del presente método permiten un análisis altamente específico de fragmentos cortos de ADN, lo cual es de importancia en aplicaciones para el análisis de ADN fragmentado como el ADN libre de células en la sangre, o el ADN incrustado en parafina fijado con formalina.
Con referencia a las Figuras 3 y 4, se proporciona en la presente descripción, entre otras cosas, un método para procesar una muestra de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el método puede comprender: a) hibridar una muestra (por ejemplo, una muestra que se ha digerido con una enzima de restricción) que comprende un fragmento diana (un "ADN diana") con una sonda de ácido nucleico que comprende: i. una secuencia de cabeza y una secuencia de cola, en donde las secuencias de cabeza y cola están en los extremos de una primera molécula de oligonucleótido; y ii. una secuencia de tablilla (donde el término "secuencia de tablilla" pretende hacer referencia a una secuencia en un oligonucleótido que, cuando se híbrida con dos o más polinucleótidos, actúa como una "tablilla" para colocar los polinucleótidos uno al lado del otro para que puedan ligarse entre sí, como se ilustra en las Figuras 3 y 4). Como se muestra en las Figuras 3 y 4, la secuencia de tablilla (que se denomina "oligonucleótido de direccionamiento" en algunos casos) usada en este método contiene una secuencia flanqueante corriente arriba que es complementaria a la secuencia de cabeza; una secuencia complementaria a la diana que es complementaria al fragmento diana; y una secuencia flanqueante corriente abajo que es complementaria a la secuencia de cola. Esta etapa de hibridación produce un producto de hibridación en el que los extremos del fragmento diana son adyacentes de manera ligable a los extremos de las secuencias de cabeza y cola en la primera molécula de oligonucleótido, donde el término "adyacente de manera ligable" en el contexto de dos secuencias que son adyacentes de manera ligable entre sí, significa que no hay nucleótidos intermedios entre dos oligonucleótidos y que pueden ligarse entre sí mediante el uso de una ligasa. La siguiente etapa del método comprende b) ligar los extremos del fragmento diana a los extremos de las secuencias de cabeza y cola de la primera molécula de oligonucleótido, lo que produce de esta manera un producto cíclico que comprende el fragmento diana y las secuencias de cabeza y cola. Esta etapa de ligación se ilustra en la Figura 1 (aunque, como se ilustra en las Figuras 3 y 4, el método puede implementarse de varias formas diferentes y, como tal, la sonda de ácido nucleico usada en la primera etapa del método puede estar compuesta por uno o dos oligonucleótidos).
Los productos circularizados proporcionan una ventaja significativa para la detección porque pueden amplificarse mediante la amplificación en círculo rodante (RCA). La RCA produce cientos o miles de copias de un producto circularizado en una sola molécula, lo que amplifica de esta manera eficazmente el producto circularizado y lo hace relativamente fácil de detectar mediante el uso de, por ejemplo, los oligonucleótidos marcados que hibridan con un motivo en el producto.
Como se ilustra en la Figura 1, el método puede comprender además amplificar el producto cíclico por la amplificación en círculo rodante mediante el uso de un cebador que hibrida con una secuencia en la sonda de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia de cabeza, una secuencia de cola o una secuencia entre ellas). En estas realizaciones, el método puede comprender además cuantificar el número de productos de la amplificación en círculo rodante producidos, lo que proporciona de esta manera una estimación de la cantidad de dicho fragmento diana en la muestra. En estas realizaciones, los productos pueden amplificarse mediante la amplificación en círculo rodante mediante el uso de un cebador que es complementario a una secuencia en algún lugar del producto cíclico) para producir una pluralidad de productos de la RCA, por ejemplo, el producto correspondiente a un solo fragmento "clonado". El número de productos de la amplificación en círculo rodante puede estimarse, por ejemplo, al distribuir los productos de la RCA en la superficie de un soporte (un portaobjetos), hibridar los productos de la RCA mediante el uso de oligonucleótidos marcados (por ejemplo, oligonucleótidos marcados con fluorescencia) y luego contar el número de señales en un área del soporte por microscopía, por ejemplo, microscopía de fluorescencia. El marcaje puede realizarse antes o después de que los productos se hayan distribuido en el soporte y, dado que cada producto de la RCA contiene miles de copias de las mismas secuencias, debería haber miles de sitios de unión para los oligonucleótidos marcados, lo que aumenta de esta manera la señal. En realizaciones multiplex (por ejemplo, en las que se cuentan los productos de la RCA correspondientes a dos cromosomas diferentes), los productos de la RCA correspondientes a un cromosoma pueden marcarse con un fluoróforo y los productos de la RCA correspondientes a otro cromosoma pueden marcarse con un fluoróforo diferente, lo que permite de esta manera que los diferentes productos de la RCA se cuenten por separado.
La cuantificación de señales de los productos de la RCA individuales es importante porque, en muchas aplicaciones (por ejemplo, el diagnóstico prenatal no invasivo mediante el análisis del ADN libre de células), es necesario determinar el número de fragmentos correspondientes a cromosomas particulares (por ejemplo, cromosoma 21) con precisión y sin sesgos. Los métodos de análisis típicos usan la PCR que, como se conoce bien, es un procedimiento muy sesgado en el sentido de que algunas secuencias se amplifican con eficiencias mucho más altas que otras. Esto hace que las estrategias basadas en la PCR no sean prácticas para muchos esfuerzos de diagnóstico.
En realizaciones alternativas y como se ilustra en la Figura 1, el fragmento diana puede amplificarse mediante la PCR y cuantificarse. Como sería evidente, las secuencias flanqueantes que se añaden al fragmento diana y/o los cebadores de PCR pueden ser compatibles con el uso en, por ejemplo, el método de terminación reversible de Illumina, el método de pirosecuenciación de Roche (454), la secuenciación por ligación de Life Technologies (la plataforma SOLiD) o la plataforma Ion Torrent de Life Technologies. Los ejemplos de tales métodos se describen en las referencias siguientes: Margulies et al., (Nature 2005 437: 376-80); Ronaghi et al., (Analytical Biochemistry 1996 242: 84-9); Shendure (Science 2005309: 1728); Imelfort et al., (Brief Bioinform. 200910:609-18); Fox et al., (Methods Mol Biol. 2009;553:79-108); Appleby et al., (Methods Mol Biol. 2009;513:19-39) y Morozova (Genomics. 2008 92:255-64). En estas realizaciones, los productos cíclicos pueden amplificarse y secuenciarse, y la abundancia de los fragmentos en la muestra puede estimarse mediante el recuento del número de lecturas de secuencia correspondientes a los fragmentos.
En determinadas realizaciones y como se ilustra en la Figura 3, la secuencia de tablilla puede estar en una molécula diferente a las secuencias de cabeza y cola, es decir, una "segunda" molécula de oligonucleótido. Como tal, la sonda de ácido nucleico usada al comienzo del método puede estar compuesta por dos oligonucleótidos (un oligonucleótido de "cadena principal" y un oligonucleótido de "direccionamiento", como se ilustra en la Figura 3).
En otras realizaciones y como se ilustra en la Figura 4, la secuencia de tablilla puede estar en la misma molécula que las secuencias de cabeza y cola, es decir, en la "primera" molécula de oligonucleótido. Como tal, la sonda de ácido nucleico usada al comienzo del método puede estar compuesta por un único oligonucleótido.
La secuencia complementaria a la diana puede tener cualquier longitud, lo que depende de la longitud de la secuencia complementaria a la diana en la sonda de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la secuencia complementaria a la diana tiene de 10 a 100, por ejemplo, de 10 a 50 o de 10 a 30 nucleótidos de longitud. Como se indica a continuación, la secuencia complementaria a la diana contiene uno o más emparejamientos erróneos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 o más, hasta 10 o más) con el fragmento diana y, en determinados casos, el complemento inverso de la secuencia complementaria a la diana puede ser al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica al fragmento diana.
Las secuencias flanqueantes pueden tener cualquier longitud, dependiendo del diseño. En algunas realizaciones, las secuencias flanqueantes tienen una longitud de 10 y 40 nucleótidos, por ejemplo, de 10 y 30 nucleótidos.
En algunas realizaciones, la muestra puede contener fragmentos de ADN genómico, por ejemplo, ADN genómico de prácticamente cualquier organismo, que incluye, pero no se limita a, plantas, animales (por ejemplo, reptiles, mamíferos, insectos, gusanos, peces, etc.), muestras de tejido, bacterias, hongos (por ejemplo, levadura), fagos, virus, tejido cadavérico, muestras arqueológicas/antiguas, etc. En determinadas realizaciones, el ADN genómico usado en el método puede derivar de un mamífero, donde en determinadas realizaciones el mamífero es un ser humano. En realizaciones ilustrativas, la muestra genómica puede contener ADN genómico de una célula de mamífero, tal como una célula humana, de ratón, de rata o de mono. La muestra puede prepararse a partir de células cultivadas o células de una muestra clínica, por ejemplo, una biopsia de tejido, raspado o lavado o células de una muestra forense (es decir, células de una muestra recogida en la escena del crimen). En realizaciones particulares, la muestra de ácido nucleico puede obtenerse de una muestra biológica tal como células, tejidos, fluidos corporales y heces. Los fluidos corporales de interés incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, plasma, saliva, mucosidad, flema, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, lágrimas, líquido del conducto lactal, linfa, esputo, líquido sinovial, orina, líquido amniótico y semen. En realizaciones particulares, puede obtenerse una muestra de un sujeto, por ejemplo, un ser humano. En algunas realizaciones, la muestra analizada puede ser una muestra de ADN libre de células obtenida de la sangre, por ejemplo, de la sangre de una mujer embarazada. En determinadas realizaciones, el ADN genómico puede amplificarse, por ejemplo, mediante el uso de un método de amplificación del genoma completo, antes de la fragmentación.
En realizaciones, en las que la secuencia de tablilla está en una segunda molécula de oligonucleótido (como se muestra en la Figura 3), el segundo oligonucleótido puede comprender adicionalmente un resto de captura que puede emplearse para enriquecer el producto cíclico. En estas realizaciones, el método puede comprender: c) inmovilizar el producto cíclico mediante la unión del resto de captura a una fase sólida; y d) lavar la fase sólida para eliminar el ácido nucleico no ligado et al., componentes de la reacción; lo que enriquece de esta manera para el producto cíclico. Por ejemplo, el segundo oligonucleótido puede contener un resto de biotina, por ejemplo, biotina o un análogo de biotina tal como la destiobiotina, oxibiotina, 2'-iminobiotina, diaminobiotina, sulfóxido de biotina, biocitina, etc., con o sin un conector, por ejemplo, -LC-biotina, -LC-LC-biotina, -SLC-biotina o -PEGn-biotina donde n es 3-12, y los productos cíclicos pueden enriquecerse mediante el uso de un sustrato que se acopla a la estreptavidina. La biotina se une a la estreptavidina con una afinidad de al menos 10'8M.
Para las realizaciones de pruebas prenatales no invasivas, el fragmento diana puede ser del cromosoma humano 21, 13 o 18.
En algunas realizaciones, el método comprende hibridar la muestra con un conjunto de al menos 50 (por ejemplo, al menos 100, al menos 200, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000 o al menos 5000) de dichas sondas, en donde dichas sondas se dirigen a diferentes fragmentos en el mismo cromosoma (por ejemplo, cromosoma humano 21, 13 o 18), y en donde el método da como resultado una pluralidad de productos cíclicos que comprenden los fragmentos diana. El número de productos cíclicos producidos puede cuantificarse, por ejemplo, por la amplificación de estos mediante el uso de la RCA y el recuento del número de productos de la r Ca , como se describió anteriormente.
En algunas realizaciones, el método comprende hibridar la muestra con un primer conjunto y un segundo conjunto de dichos conjuntos de sondas de ácido nucleico, en donde el primer y segundo conjunto de sondas se dirigen a (es decir, se hibridan con fragmentos y se ligan para producir productos cíclicos, como se describió anteriormente) un primer cromosoma en la muestra y un segundo cromosoma en la muestra, respectivamente, amplificar los productos cíclicos mediante la amplificación en círculo rodante (RCA) y comparar el número de productos de la RCA correspondientes al primer cromosoma con el número de productos de la RCA correspondientes al primer cromosoma, lo que proporciona de esta manera una estimación de las cantidades relativas del ADN de los cromosomas en la muestra.
En algunas realizaciones, el método comprende hibridar la muestra con un primer conjunto y un segundo conjunto de dichos conjuntos de sondas de ácido nucleico, en donde el primer y el segundo conjunto de sondas se dirigen a (es decir, se hibridan con fragmentos y se ligan para producir productos cíclicos, como se describió anteriormente) una primera región y una segunda región de un cromosoma en la muestra, respectivamente, amplificar los productos cíclicos mediante la amplificación en círculo rodante (RCA) y comparar el número de productos de la RCA correspondientes a la primera región cromosómica con el número de productos de la RCA correspondientes a la segunda región cromosómica, lo que proporciona de esta manera una estimación de las cantidades relativas del ADN de las regiones cromosómicas en la muestra. Esta realización puede usarse para identificar, por ejemplo, deleciones o duplicaciones, por ejemplo.
También se proporciona en la presente descripción una composición que comprende una sonda de ácido nucleico que comprende: i. una secuencia de cabeza y una secuencia de cola, en donde las secuencias de cabeza y cola están en los extremos opuestos de una primera molécula de oligonucleótido; y ii. una secuencia de tablilla que comprende, en orden: una secuencia flanqueante corriente arriba que es complementaria a la secuencia de cabeza, una secuencia complementaria a la diana que es complementaria a un fragmento diana en el genoma humano; y una secuencia flanqueante corriente abajo que es complementaria a la secuencia de cola; en donde la sonda se diseña de modo que, cuando el primer oligonucleótido, la secuencia de tablilla y el fragmento diana se hibridan entre sí, los extremos del fragmento diana son adyacentes de manera ligable a los extremos de las secuencias de cabeza y cola en la primera molécula de oligonucleótido. En determinadas realizaciones, la composición puede comprender un primer conjunto de al menos 50 (por ejemplo, al menos 100, al menos 200, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000 o al menos 5000) de las sondas de ácido nucleico, en donde las secuencias complementarias a la diana de las sondas son complementarias a diferentes fragmentos diana de un primer cromosoma humano (por ejemplo, el cromosoma es 21, 13 o 18).
En determinadas realizaciones, la composición puede comprender un segundo conjunto de al menos 50 (por ejemplo, al menos 100, al menos 200, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000 o al menos 5000) de dichas sondas de ácido nucleico, en donde las secuencias complementarias a la diana de las sondas en el segundo conjunto de sondas son complementarias a diferentes fragmentos diana de un segundo cromosoma humano. En algunas realizaciones, el primer cromosoma humano puede ser el cromosoma 21 y el segundo cromosoma humano puede ser el cromosoma 13 o 18. En algunos casos, el segundo cromosoma humano no es el cromosoma 21, 13 o 18.
Breve descripción de los dibujos
El experto entenderá que las figuras, descritas más abajo, son solamente para propósitos de ilustración. No se pretende que las figuras limiten el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna forma.
La Figura 1 ilustra esquemáticamente una realización del método objeto en el que se forma una molécula de ADN circular y se amplifica mediante RCA o PCR.
La Figura 2 ilustra esquemáticamente una realización del método objeto en el que se forma un producto de la ligación lineal y se enriquece con los reactivos en fase sólida.
La Figura 3 muestra una sonda que comprende un oligonucleótido de la cadena principal circularizado unido a su fragmento diana. La sonda se ilustra en dos versiones, A y B.
La Figura 4 muestra una sonda de oligonucleótido única circularizada con un fragmento diana unido.
La Figura 5 muestra una sonda en bucle doble circularizada compuesta por un oligonucleótido de direccionamiento y un oligonucleótido de la cadena principal en bucle, con un fragmento diana unido.
La Figura 6 muestra una sonda en bucle lineal compuesta de un oligonucleótido de direccionamiento y un oligonucleótido de la cadena principal lineal, con un fragmento diana unido.
La Figura 7 muestra una sonda lineal que comprende dos oligonucleótidos de la cadena principal, con el fragmento diana unido.
La Figura 8 es una imagen de un gel que muestra la especificidad del método que se describe en la presente descripción.
La Figura 9 es un gráfico que muestra la precisión del método que se describe en la presente descripción.
El panel A de la Figura 10 muestra una imagen de los productos de la RCA marcados en la superficie de un portaobjetos; el panel B muestra cómo pueden determinarse con precisión las relaciones de los fragmentos de diferentes cromosomas mediante el recuento de los productos de la RCA individuales.
Descripción detallada
El fragmento de ácido nucleico diana
El fragmento diana que está unido por la sonda es un fragmento monocatenario de ácido nucleico. En algunas realizaciones, los presentes métodos unen fragmentos diana cuya secuencia está predefinida. Puede conocerse la secuencia del fragmento completo, incluidos los extremos. Los fragmentos conocidos de la secuencia predefinida pueden producirse mediante la fragmentación específica, en lugar de aleatoria, del ácido nucleico. Los métodos de fragmentación específicos incluyen la digestión con las enzimas de restricción, la PCR (por ejemplo, la PCR multiplex) et al., métodos de definición de extremo de fragmento dirigido a la secuencia, que incluyen otras enzimas, ribozimas o una combinación de tales técnicas.
Un método de fragmentación es la digestión con una endonucleasa de restricción o una combinación de dos o más endonucleasas de restricción. Por tanto, la muestra de ácido nucleico fragmentado puede ser un digerido de enzima de restricción y el fragmento diana puede ser un fragmento de restricción.
Se conoce una variedad de enzimas de escisión de ácido nucleico específicas y puede usarse cualquier enzima adecuada en el método divulgado, incluidas las enzimas que escinden en una posición predefinida dentro de una secuencia específica de ácido nucleico, o las enzimas endonucleolíticas que escinden después o antes de una secuencia específica de reconocimiento de ácidos nucleicos y las enzimas de muesca. Los ácidos nucleicos catalíticos, como las ribozimas, también pueden usarse para la fragmentación del ADN. Las enzimas pueden escindir un ácido nucleico bicatenario para producir un extremo romo o cohesivo, o pueden escindir una cadena sencilla de ácido nucleico. Se conocen varios tipos de enzimas de restricción, que incluyen el Tipo I, Tipo II, Tipo III, Tipo IV y Tipo V. Pueden seleccionarse las enzimas o las combinaciones de enzimas adecuadas para su uso en el método según se desee. Por ejemplo, el ácido nucleico de una muestra (por ejemplo, 10 ng de a Dn ) puede digerirse con la enzima de restricción (por ejemplo, 1 U) en el amortiguador correspondiente compatible con la enzima de restricción. La reacción puede incubarse en condiciones adecuadas (por ejemplo, 37 °C durante 1 hora), seguido de la desactivación enzimática (por ejemplo, a 80 °C durante 20 minutos).
Otro método conveniente para proporcionar el ácido nucleico fragmentado es usar cebadores para la amplificación de las secuencias lineales específicas del ácido nucleico. Puede usarse la PCR multiplex, tratando el ácido nucleico con múltiples pares de cebadores específicos para amplificar los múltiples fragmentos específicos. En este caso, los extremos del fragmento diana corresponden a las secuencias del par de cebadores.
Para muchas aplicaciones de diagnóstico y otras, la muestra es una muestra de cromosomas fragmentados (por ejemplo, cromosomas humanos o cromosomas microbianos). El fragmento diana puede ser un fragmento de genoma específico de un cromosoma del genoma de un organismo. En otras palabras, el fragmento diana puede encontrarse solo en un cromosoma del genoma y no en otros cromosomas de ese genoma. Normalmente, el método se usará para el análisis del genoma humano, en cuyo caso el fragmento diana puede ser un fragmento específico de un cromosoma humano, es decir, que se encuentra en ese cromosoma y no en otros cromosomas humanos. Por ejemplo, el fragmento puede ser específico del cromosoma 21.
El fragmento diana puede ser específico de un locus de un cromosoma. En consecuencia, puede encontrarse en ese locus cromosómico y no en otro loci del mismo cromosoma u otros cromosomas del mismo genoma. Por ejemplo, el fragmento puede ser específico de un locus de un cromosoma humano.
Una determinada especie de ácido nucleico en una muestra puede abarcar cierta variabilidad, por ejemplo, una muestra puede comprender los cromosomas de diferentes individuos, como el ácido nucleico obtenido de la sangre materna que contiene el ADN materno y el ADN fetal. Aquí, la especie de interés puede ser un cromosoma particular, pero es conveniente detectar todas las copias de ese cromosoma, ya sean de origen fetal o materno. Por tanto, una especie de interés puede ser un cromosoma o un locus cromosómico, y las secuencias diana se encuentran en ese cromosoma o locus en las copias tanto materna como fetal del cromosoma o el locus cromosómico.
Las muestras de ácido nucleico pueden proporcionarse de cualquier forma adecuada, por ejemplo, como muestras de tejido biológico o fluido de pacientes. Las muestras pueden ser muestras de sangre, sangre completa, plasma o suero, muestras de tejido, por ejemplo, muestras de tejido embebidas en parafina fijadas con formalina, o pueden ser muestras de ácido nucleico extraídas de sangre o tejido.
La muestra puede ser cualquier muestra que contenga ácido nucleico. El ácido nucleico contenido en la muestra puede ser ADN y/o ARN. La muestra puede ser compleja, por ejemplo, ADN genómico completo o ADNc de un organismo completo, tejido o población celular, o una fracción de estos. Con respecto a esto, puede ser, por ejemplo, un producto directo de un procedimiento de aislamiento de ácidos nucleicos, o de un procedimiento de lisis celular, o puede fraccionarse o purificarse de alguna manera, por ejemplo, puede contener ácidos nucleicos que se han separado parcial o completamente de alguna manera, o se han tratado de cualquier manera, por ejemplo, ARN para producir ADNc. La muestra puede ser de cualquier fuente eucariota, procariota o viral, por ejemplo, puede ser microbiana (por ejemplo bacteriana o fúngica), vegetal o animal. Preferentemente, la muestra es de origen humano, por ejemplo, ADN genómico humano. La muestra puede ser una muestra de tejido o sangre de un animal, donde el ácido nucleico a detectar es microbiano, por ejemplo, bacteriano, viral o fúngico. Para los métodos relacionados con el diagnóstico prenatal no invasivo, la muestra proviene de la sangre de una mujer embarazada y comprende el ADN fetal. En otros ejemplos, el ácido nucleico a detectar o cuantificar es el ADN asociado a tumores.
Por lo general, el método puede realizarse en las muestras in vitro. En consecuencia, los métodos generalmente no incluyen el diagnóstico realizado in vivo en el cuerpo humano o animal o los métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia. Sin embargo, los resultados de los métodos de diagnóstico in vitro pueden usarse para informar el tratamiento posterior de los pacientes.
Desnaturalización del ácido nucleico diana
La sonda reconoce y une el ácido nucleico diana en forma monocatenaria, mediante la hibridación entre el fragmento monocatenario y la secuencia complementaria a la diana del oligonucleótido de direccionamiento. Por lo tanto, si el fragmento diana en la muestra no es ya monocatenario, deben proporcionarse condiciones de desnaturalización para separar el fragmento diana monocatenario de su cadena de ácido nucleico complementaria.
Las condiciones de desnaturalización pueden ser una temperatura suficientemente alta para separar el fragmento diana de su secuencia complementaria. Las condiciones de desnaturalización pueden ser la incubación a 95 °C durante un tiempo adecuado, por ejemplo, 10 minutos. Alternativamente, puede realizarse una desnaturalización química.
Complementariedad
Un método para analizar una muestra para detectar la presencia de un fragmento diana puede comprender poner en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico, en donde la sonda comprende
un oligonucleótido de direccionamiento que contiene una secuencia complementaria a la diana, que es el complemento del fragmento diana, y una secuencia flanqueante adyacente a la secuencia complementaria a la diana y
una secuencia de oligonucleótidos que tiene un extremo 5' o 3' libre, en donde la secuencia de oligonucleótidos es complementaria a la secuencia flanqueante.
Las concentraciones adecuadas de las sondas pueden determinarse sobre la base de la concentración (o concentración esperada) del fragmento diana o los fragmentos diana en la muestra. Como se ilustra en los ejemplos, las sondas pueden añadirse a la muestra a una concentración de 10 pM por sonda. Cuando una muestra se pone en contacto con múltiples sondas (por ejemplo, un conjunto de sondas), las concentraciones de las sondas individuales pueden ser de 10 pM. Preferentemente, las sondas se usan en exceso de la concentración esperada de la especie de ácido nucleico de interés a detectar o cuantificar. El uso de un exceso de sonda debe garantizar que se reconozcan todas las copias de las secuencias diana presentes en la muestra. Esto maximiza la sensibilidad de la detección. Además, cuando los métodos implican la cuantificación, esto asegura que la detección de los productos de la ligación o la señal acumulativa de un conjunto de sondas sea proporcional a la cantidad de secuencias diana en la muestra.
En condiciones de fusión, el fragmento diana (si está presente) hibrida con la secuencia complementaria a la diana de la cadena de direccionamiento y la secuencia de oligonucleótidos hibrida con la secuencia flanqueante, de modo que el extremo libre 5' o 3' de la secuencia de oligonucleótidos está en yuxtaposición con el extremo 3' o 5' del fragmento diana, respectivamente. Por tanto, el oligonucleótido de direccionamiento moldea el fragmento diana para la ligación a la secuencia de oligonucleótidos. El extremo 3' del fragmento diana puede ligarse a un extremo 5' de una secuencia de cabeza y el extremo 5' del fragmento diana puede ligarse a un extremo 3' de una secuencia de cola en un evento de doble ligación.
En las sondas como se divulgan en el presente documento, se logra la máxima especificidad por el fragmento diana si la secuencia complementaria a la diana es el complemento exacto del fragmento diana, de modo que existe una hibridación perfecta entre ellos. Sin embargo, esto no es esencial en todos los casos, y puede aceptarse un pequeño grado de emparejamiento erróneo, por ejemplo, para permitir la detección de los fragmentos que exhiben variación alélica donde desea detectarse el fragmento independientemente del alelo exacto presente en la muestra. Alternativamente, pueden diseñarse múltiples sondas para las secuencias variantes. Esto puede permitir tanto la detección como la discriminación de diferentes alelos o mutaciones. Las sondas como se divulgan en el presente documento se usan de la forma más ventajosa en los métodos multiplex en los que se incluyen un gran número de sondas diferentes en una reacción. Dentro de tal pluralidad de sondas, se prevé que la mayoría de las sondas tendrán una complementariedad perfecta para sus fragmentos diana, pero algunas sondas pueden unirse a las dianas con emparejamientos erróneos menores.
Preferentemente, la secuencia complementaria a la diana tiene menos de 5 emparejamientos erróneos de pares de bases con el fragmento diana. Opcionalmente, puede haber uno, dos, tres o cuatro emparejamientos erróneos de pares de bases entre el fragmento diana y la secuencia complementaria a la diana. Un emparejamiento erróneo puede ser un punto en el que una base correspondiente está ausente de una secuencia, de modo que la secuencia complementaria forma un bucle en el punto del emparejamiento erróneo, o puede ocurrir cuando un nucleótido no complementario está presente en una secuencia y por lo tanto no se empareja con la base en la posición correspondiente de la otra secuencia. Cuando hay un emparejamiento de bases incorrecto, es decir, un emparejamiento de A o T con C o G, no se produce un enlace de hidrógeno entre las bases de las dos cadenas, aunque la hibridación seguirá teniendo lugar entre el fragmento diana y la secuencia complementaria a la diana del oligonucleótido de direccionamiento debido al emparejamiento de bases entre los nucleótidos vecinos al emparejamiento erróneo. Los emparejamientos erróneos pueden ser bases oscilantes. Una base oscilante correspondería normalmente a una posición en la secuencia complementaria a la diana que se empareja con una posición de variación genética conocida en el fragmento diana. La sonda puede sintetizarse mediante la adición de uno o varios didesoxinucleótidos durante el ciclo de síntesis específico para la posición de la base oscilante. Este es típicamente el caso de la síntesis tradicional de oligonucleótidos. Alternativamente, pueden producirse múltiples sondas separadas, una para cada variante genética. Este suele ser el caso si las sondas se sintetizan mediante el uso de la síntesis basada en microarreglos. Una base oscilante puede corresponder a diferencias de un solo nucleótido entre los codones, donde los diferentes codones codifican el mismo aminoácido.
En general, las secuencias complementarias a la diana más largas para hibridar con los fragmentos diana más largos pueden tolerar un mayor número de emparejamientos erróneos en comparación con las secuencias complementarias a la diana más cortas. La secuencia complementaria a la diana puede, por ejemplo, tener como máximo 1 en 8, 1 en 9 o 1 en 10 emparejamientos erróneos de pares de bases con el fragmento diana. Cualquiera de dichos emparejamientos erróneos debería restringirse a la región interna de la secuencia complementaria a la diana y el fragmento diana, de modo que no inhiban la ligación o la fragmentación de la diana específica de secuencia mediante, por ejemplo, digestión con enzimas de restricción. En consecuencia, preferentemente existe una complementariedad perfecta entre el fragmento diana y la secuencia complementaria a la diana en los 6 a 8 nucleótidos terminales, preferentemente los 10 nucleótidos terminales en cada extremo del fragmento diana.
Generalmente, el fragmento diana y la secuencia complementaria a la diana tienen la misma longitud. La longitud completa del fragmento diana está así unida por la secuencia complementaria a la diana. La hibridación del fragmento diana con el oligonucleótido de direccionamiento representa un único evento de unión entre las dos moléculas de ácido nucleico, en contraste con las sondas que se unen a los dos extremos de una molécula diana o a dos regiones no adyacentes de la diana.
La secuencia complementaria a la diana puede tener una longitud de al menos 10 nucleótidos, por ejemplo, al menos 15 nucleótidos. Puede tener hasta 20, 25, 30, 35 o 40 nucleótidos de longitud. Los intervalos preferidos incluyen de 10 - 20 nucleótidos, 10 - 30 nucleótidos y 10 - 40 nucleótidos. Tales secuencias complementarias a la diana relativamente cortas son adecuadas para unir fragmentos correspondientemente cortos. La secuencia corta contribuye a la especificidad de la reacción de doble ligación, ya que la ADN ligasa es sensible a los emparejamientos erróneos de pares de bases y preferentemente ligará secuencias perfectamente emparejadas. Cuando hay emparejamientos erróneos presentes en la huella de la ADN ligasa unida a la secuencia bicatenaria, las secuencias pueden no estar ligadas, lo que proporciona una etapa de corrección adicional que asegura una alta especificidad en la detección del fragmento diana con preferencia a los fragmentos de secuencia diferente pero similar. La ADN ligasa típicamente tiene una huella de 6 a 8 bases en cada lado de la muesca. Por tanto, si el fragmento tiene 20 bases, de 12 a 16 de las bases estarán cubiertas por la especificidad de la ligasa.
La hibridación de la sonda discriminará los emparejamientos erróneos, especialmente en la parte central de la secuencia hibridada, mientras que la ligación discriminará los emparejamientos erróneos en los extremos del fragmento diana. En conjunto, esto genera una detección de fragmentos altamente específica.
El oligonucleótido de direccionamiento es más largo que el fragmento diana, ya que incluye las secuencias flanqueantes, así como también la secuencia complementaria a la diana, y puede incluir además una o más secuencias personalizadas. Una secuencia personalizada no es complementaria a otras regiones de la sonda o al fragmento diana; en otras palabras, no hibrida con otras regiones de la sonda (fuera de la secuencia personalizada) o con el fragmento diana en condiciones de fusión. La región flanqueante corriente arriba está corriente arriba o 5' de la secuencia complementaria a la diana en el oligonucleótido de direccionamiento. La región flanqueante corriente abajo está corriente abajo o 3' de la secuencia complementaria a la diana en el oligonucleótido de direccionamiento. En consecuencia, la secuencia complementaria a la diana es interna al oligonucleótido de direccionamiento y no incluye un extremo del oligonucleótido de direccionamiento, ya que está flanqueada por las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo.
La secuencia bicatenaria producida por la hibridación del fragmento diana y la secuencia complementaria a la diana puede considerarse una secuencia híbrida bicatenaria, ya que es un híbrido de la diana y la sonda. Típicamente, la secuencia bicatenaria adopta una conformación de doble hélice, en la que el fragmento diana es una cadena y el oligonucleótido de direccionamiento es la otra cadena de la doble hélice. La secuencia bicatenaria híbrida está flanqueada por las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento, que a su vez se hibridan con las secuencias de cabeza y cola para producir las secuencias bicatenarias. De nuevo, estos adoptan típicamente la conformación de doble hélice normal del ácido nucleico bicatenario.
Las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo son preferentemente diferentes entre sí, es decir, preferentemente tienen secuencias diferentes. Se prefiere que la secuencia de cabeza sea complementaria a la secuencia flanqueante corriente arriba pero no a la secuencia flanqueante corriente abajo, y que la secuencia de cola sea complementaria a la secuencia flanqueante corriente abajo pero no a la secuencia flanqueante corriente arriba. Esto asegura que las secuencias de cabeza y cola hibridan sólo con las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo, respectivamente.
La secuencia de cabeza tendrá normalmente la misma longitud que la secuencia flanqueante corriente arriba. La secuencia de cola normalmente tendrá la misma longitud que la secuencia flanqueante corriente abajo.
Las longitudes normales de las secuencias flanqueantes están entre 10 y 40 nucleótidos, por ejemplo, 10 - 20 o 10 -30 nucleótidos. Las secuencias flanqueantes pueden tener la misma longitud entre sí. Una o ambas secuencias flanqueantes pueden tener la misma longitud que la secuencia complementaria a la diana. Por tanto, la secuencia flanqueante corriente arriba y/o corriente abajo puede tener una longitud de al menos 10 nucleótidos, por ejemplo al menos 15 nucleótidos. Puede tener hasta 20, 25, 30, 35 o 40 nucleótidos de longitud.
Preferentemente, la secuencia de cabeza es el complemento de la secuencia corriente arriba. Preferentemente, la secuencia de cola es el complemento de la secuencia corriente abajo. Es conveniente un emparejamiento perfecto de las secuencias para una unión óptima de la sonda de modo que las secuencias de cabeza y cola estén ubicadas correctamente para la ligación al fragmento diana. Sin embargo, opcionalmente puede haber uno, dos, tres o cuatro emparejamientos erróneos de pares de bases entre la secuencia de cabeza y la secuencia flanqueante corriente arriba, y/o entre la secuencia de cola y la secuencia flanqueante corriente abajo. Preferentemente, hay menos de 5 emparejamientos erróneos de pares de bases.
Aparte de la secuencia complementaria a la diana, la sonda normalmente no debe ser complementaria al fragmento diana o a otros ácidos nucleicos que puedan estar presentes en la muestra. Esto es para evitar la hibridación no deseada de la sonda con un ácido nucleico distinto de la diana. Por tanto, si la sonda es para unir un fragmento de ADN genómico humano, la sonda puede diseñarse de modo que las secuencias distintas de la secuencia complementaria a la diana no sean complementarias al ADN genómico humano, de modo que la sonda solo hibrida con el fragmento diana y no a otro ácido nucleico en la muestra.
Fusión y ligación
El fragmento diana se liga en una reacción muy específica en ambos extremos. Dado que el fragmento diana es típicamente el producto de una fragmentación específica de ácido nucleico, estos extremos normalmente tendrán una secuencia predeterminada específica. En la etapa de ligación, estos extremos se detectan específicamente mediante la ligación dependiente de la secuencia a las secuencias de cabeza y cola, respectivamente. Preferentemente, la unión del fragmento diana a la sonda genera dos uniones ligables perfectamente emparejadas, una entre el extremo 3' del fragmento diana y el extremo 5' de la secuencia de cabeza y otra entre el extremo 5' del fragmento diana y el extremo 3' de la secuencia de cola.
La ligación de un extremo 5' del ácido nucleico a un extremo 3' del ácido nucleico puede ocurrir cuando los dos extremos se emparejan por bases con nucleótidos adyacentes de una secuencia complementaria. El emparejamiento de bases de los respectivos nucleótidos terminales con los nucleótidos adyacentes forma una cadena de ácido nucleico que contiene una muesca entre los dos extremos. La ligación de los dos extremos puede catalizarse por la ADN ligasa. Por lo tanto, proporcionar las condiciones para la ligación comprenderá normalmente proporcionar una enzima ADN ligasa y las condiciones de reacción en las que la ADN ligasa liga los dos extremos para formar una cadena continua de ácido nucleico que cierra la muesca. Existen en el mercado diversas enzimas ligasa, como la ampligasa (Epicentre), para las cuales las condiciones adecuadas son añadir 1 U de enzima e incubar a 55 °C durante 1 hora en el amortiguador de la ligasa.
El oligonucleótido de direccionamiento moldea el fragmento diana para la ligación a las secuencias de cabeza y cola, debido a la ubicación de la secuencia complementaria a la diana entre las secuencias flanqueantes. En condiciones de fusión en presencia del fragmento diana, las secuencias de cabeza y cola se hibridan con las secuencias flanqueantes, lo que define un espacio entre el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola. El fragmento diana se hibrida con la secuencia complementaria a la diana en el espacio. Por lo tanto, la hibridación de las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana con el oligonucleótido de direccionamiento coloca el extremo 3' del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 5' de la secuencia de cabeza, y coloca el extremo 5' del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 3' de la secuencia de cola.
La colocación de dos extremos en yuxtaposición proporciona un sustrato para que la ADN ligasa ligue los extremos. Es preferible que el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' del fragmento diana se hibriden con los nucleótidos adyacentes del oligonucleótido de direccionamiento, y que el extremo 3' de la secuencia de cola y el extremo 5' del fragmento diana se hibriden con los nucleótidos adyacentes del oligonucleótido de direccionamiento. En consecuencia, la secuencia flanqueante corriente arriba puede ser inmediatamente adyacente a la secuencia complementaria a la diana, sin nucleótidos intermedios. De manera similar, la secuencia flanqueante corriente abajo puede ser inmediatamente adyacente a la secuencia complementaria a la diana, sin nucleótidos intermedios. Los extremos 3' y 5' adyacentes pueden ligarse directamente por la ADN ligasa mediante el sellado de la muesca entre ellos para formar una cadena continua de ácido nucleico.
El producto de la doble ligación, es decir, el producto de ligar tanto la secuencia de cabeza como la secuencia de cola al fragmento diana, es una cadena continua de ácido nucleico. Es continuo en el sentido de que no contiene muescas ni espacios, por lo que todos los nucleótidos de la cadena están unidos covalentemente.
La sonda puede diseñarse de modo que la cadena continua de ácido nucleico, que comprende las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana, sea un círculo de ácido nucleico. El término círculo en la presente descripción se refiere a que la topología de la cadena es un bucle cerrado, sin extremo libre.
En condiciones de fusión en presencia del fragmento diana, las secuencias de cabeza y cola se hibridan con las secuencias flanqueantes, lo que define un espacio entre el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola. El fragmento diana se híbrida con la secuencia complementaria a la diana en el espacio, lo que coloca de esta manera los extremos del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola, y lo que completa un círculo de ácido nucleico que comprende el fragmento diana y las secuencias de cabeza y cola.
Las moléculas de ácido nucleico que forman el círculo tienen sus extremos en yuxtaposición. La ligación de los extremos produce la cadena circular continua de ácido nucleico que comprende al menos las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana.
Las sondas que forman un círculo de ácido nucleico incluyen las sondas en las que las secuencias de cabeza y cola se proporcionan en una única molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, además del oligonucleótido de direccionamiento, la sonda puede comprender un oligonucleótido de la cadena principal que tiene las secuencias de cabeza y cola en sus extremos 5' y 3' respectivamente, en donde las secuencias de cabeza y cola del oligonucleótido de la cadena principal se unen en trans a las secuencias flanqueantes del oligonucleótido de direccionamiento en las condiciones de fusión. El oligonucleótido de la cadena principal puede comprender una secuencia personalizada entre las secuencias de cabeza y cola. La Figura 3 ilustra las realizaciones de tales sondas. Alternativamente, las secuencias de cabeza y cola del oligonucleótido de la cadena principal pueden ser adyacentes, sin una secuencia personalizada entre ellas.
En otro ejemplo, las secuencias de cabeza y cola pueden estar en los extremos del oligonucleótido de direccionamiento y unirse en cis a las secuencias flanqueantes en las condiciones de fusión. El oligonucleótido de direccionamiento puede comprender una secuencia personalizada entre el oligonucleótido de direccionamiento y la secuencia de cabeza y/o cola. La Figura 4 ilustra una realización de dicha sonda.
Las sondas que forman un círculo de ácido nucleico también incluyen las sondas en las que las secuencias de cabeza y cola se proporcionan en diferentes moléculas de ácido nucleico. En tales casos, el círculo de ácido nucleico que se forma en las condiciones de fusión comprenderá al menos tres moléculas de ácido nucleico: el fragmento diana, la secuencia de cabeza y la secuencia de cola. Los extremos de las moléculas de ácido nucleico estarán todos en yuxtaposición, como se señaló anteriormente. Se requieren más de dos reacciones de ligación para formar la cadena circular continua de ácido nucleico en tales casos. Un ejemplo es cuando la secuencia de cola es el extremo 3' del oligonucleótido de direccionamiento y la sonda comprende un oligonucleótido de la cadena principal que tiene la secuencia de cabeza en su extremo 5'. En las condiciones de fusión, la secuencia de cola se une en cis a la secuencia flanqueante corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento, y la secuencia de cabeza del oligonucleótido de la cadena principal se une en trans a la secuencia flanqueante corriente arriba del oligonucleótido de direccionamiento. La unión en cis significa que la unión tiene lugar en la misma molécula de ácido nucleico, es decir, una sola cadena de ácido nucleico forma una estructura tridimensional en la que diferentes regiones se juntan e hibridan. La unión en trans significa que la unión tiene lugar entre diferentes moléculas de ácido nucleico. Opcionalmente, el oligonucleótido de la cadena principal comprende un par de secuencias repetidas invertidas que forman una estructura de horquilla en condiciones de fusión, lo que coloca de esta manera el extremo 3' del oligonucleótido de la cadena principal en yuxtaposición con el extremo 5' del oligonucleótido de direccionamiento. Hay una muesca entre los dos extremos. Una sonda de este tipo se ilustra en la Figura 5. Cuando se proporcionan las condiciones para la ligación, el extremo 5' del oligonucleótido de direccionamiento se liga al extremo 3' del oligonucleótido de la cadena principal. El producto de la doble ligación es un círculo de ácido nucleico que comprende el oligonucleótido de direccionamiento, el fragmento diana y el oligonucleótido de la cadena principal. Alternativamente, donde hay un espacio entre el extremo 5' del oligonucleótido de direccionamiento y el extremo 3' del oligonucleótido de la cadena principal, la sonda que se muestra en la Figura 5 no se circularizará por la ligación, sino que la cadena continua de ácido nucleico que comprende las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana es una cadena lineal de ácido nucleico.
La sonda puede disponerse alternativamente en la orientación opuesta de modo que la secuencia de cabeza esté en el extremo 5' del oligonucleótido de direccionamiento y la sonda comprenda un oligonucleótido de la cadena principal que tenga la secuencia de cola en su extremo 3'. En este caso, en las condiciones de fusión, la secuencia de cabeza se une en cis a la secuencia flanqueante corriente arriba del oligonucleótido de direccionamiento, y la secuencia de cola del oligonucleótido de la cadena principal se une en trans a la secuencia flanqueante corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento. De nuevo, el oligonucleótido de la cadena principal puede comprender un par de secuencias repetidas invertidas que forman una estructura de horquilla en condiciones de fusión para colocar el extremo 5' del oligonucleótido de la cadena principal en yuxtaposición con el extremo 3' del oligonucleótido de direccionamiento. A continuación, el extremo 3' del oligonucleótido de direccionamiento se liga al extremo 5' del oligonucleótido de la cadena principal de modo que el producto de la doble ligación es un círculo de ácido nucleico que comprende el oligonucleótido de direccionamiento, el fragmento diana y el oligonucleótido de la cadena principal. Alternativamente, como se indicó anteriormente, la hibridación puede colocar el extremo 5' del oligonucleótido de la cadena principal cerca del extremo 3' del oligonucleótido de direccionamiento pero separados por un espacio de uno o más nucleótidos. El producto ligado será entonces una cadena lineal continua de ácido nucleico que comprende las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana.
El oligonucleótido de la cadena principal puede comprender una secuencia personalizada entre la secuencia repetida invertida, de modo que, en las condiciones de fusión, el oligonucleótido de la cadena principal forma un bucle en horquilla, como se ilustra en la Figura 5.
Como se señaló, las sondas pueden diseñarse de modo que la cadena continua de ácido nucleico que comprende las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana sea una cadena lineal de ácido nucleico. En condiciones de fusión en presencia del fragmento diana, las secuencias de cabeza y cola se hibridan con las secuencias flanqueantes, lo que define un espacio entre el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola. El fragmento diana se hibrida con la secuencia complementaria a la diana en el espacio, lo que coloca de esta manera los extremos del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola, y lo que completa una cadena de ácido nucleico que comprende el fragmento diana y las secuencias de cabeza y cola. Las moléculas de ácido nucleico que forman la cadena tienen sus extremos en yuxtaposición. El término yuxtaposición se ha discutido en otra parte. Hay una muesca entre los extremos que van a ligarse. La ligación de los extremos produce la cadena continua de ácido nucleico que comprende al menos las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana.
La sonda puede comprender un oligonucleótido de direccionamiento que tiene la secuencia de cola en su extremo 3' y un oligonucleótido de la cadena principal lineal que tiene la secuencia de cabeza en su extremo 5'. En condiciones de fusión, la secuencia de cola se une en cis a la secuencia flanqueante corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento, y la secuencia de cabeza del oligonucleótido de la cadena principal se une en trans a la secuencia flanqueante corriente arriba del oligonucleótido de direccionamiento. El oligonucleótido de direccionamiento puede comprender una secuencia personalizada entre la secuencia flanqueante corriente abajo y la secuencia de cola, de modo que en las condiciones de fusión, el oligonucleótido de direccionamiento forma un bucle en horquilla. La cadena lineal de ácido nucleico formada en condiciones de fusión comprende el oligonucleótido de la cadena principal, el fragmento diana y el oligonucleótido de direccionamiento. La Figura 6 ilustra esta disposición.
La sonda puede disponerse igualmente en la orientación inversa, donde la secuencia de cabeza está en el extremo 5' del oligonucleótido de direccionamiento, y la sonda comprende un oligonucleótido de la cadena principal que tiene la secuencia de cola en su extremo 3'. En este caso, la secuencia de cabeza se une en cis a la secuencia flanqueante corriente arriba del oligonucleótido de direccionamiento y la secuencia de cola del oligonucleótido de la cadena principal se une en trans a la secuencia flanqueante corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento.
Otra forma de sonda que forma una cadena de ácido nucleico lineal como el producto de la ligación es una sonda que comprende las secuencias de cabeza y cola en oligonucleótidos de la cadena principal separados. Dicha sonda puede comprender un oligonucleótido de la cadena principal que comprende una secuencia de cabeza que tiene un extremo 5' libre, y un oligonucleótido de la cadena principal que comprende una secuencia de cola que tiene un extremo 3' libre, en donde en las condiciones de fusión, las secuencias de cabeza y cola se unen en trans a las secuencias flanqueantes del oligonucleótido de direccionamiento. Uno o ambos oligonucleótidos de la cadena principal pueden comprender además una secuencia personalizada. La Figura 7 ilustra este tipo de sondas.
Preferentemente, los oligonucleótidos de la sonda en su forma no ligada son lineales. Por tanto, preferentemente el oligonucleótido de direccionamiento es una molécula de ácido nucleico lineal. Para las sondas que incluyen uno o más oligonucleótidos de la cadena principal, estos también son preferentemente lineales. Esto permite una diferenciación conveniente entre las sondas ligadas y las no ligadas en las que se forma un círculo de a Dn sólo como resultado de la ligación satisfactoria de las realizaciones circulantes de la sonda. Las moléculas de ácido nucleico lineales no se amplifican mediante la replicación en círculo rodante.
Detección:
Después de proporcionar las condiciones en las que el fragmento diana, si está presente, se liga a la sonda, se realiza una etapa de detección para determinar si se ha producido o no dicha ligación. Esto indica si el fragmento diana estaba presente en la muestra o no. Por tanto, la detección del producto depende de la ligación satisfactoria del fragmento diana a las secuencias de cabeza y cola para formar la cadena continua de ácido nucleico. Por lo tanto, la etapa de detección generalmente implica detectar una señal que requiere la presencia de ambas uniones de ligación. Por ejemplo, la detección puede comprender la amplificación a través de ambas uniones de ligación (por ejemplo, mediante la PCR o, por realizaciones circulantes de la sonda, la replicación en círculo rodante), o la captura de la cadena continua de ácido nucleico en un extremo y la detección de su otro extremo.
Opcionalmente, un método puede incluir enriquecer el producto de la doble ligación antes de la detección. Los productos pueden enriquecerse mediante la amplificación y/o mediante la química en fase sólida. Los productos de ácido nucleico circulares pueden enriquecerse selectivamente al tratar la muestra con una exonucleasa (por ejemplo, la exonucleasa Lambda) para digerir los productos de ácido nucleico lineales. En general, la degradación de las exonucleasas puede usarse para enriquecer los productos de la ligación cuando los productos de la ligación se protegen de la degradación de las exonucleasas. A continuación, la exonucleasa debe desactivarse (por ejemplo, mediante calor) antes de cualquier etapa posterior que implique la polimerización, por ejemplo, antes de la amplificación en círculo rodante. Como se ilustra en el Ejemplo 1, puede añadirse 1 U de la exonucleasa para eliminar las sondas y los fragmentos que no reaccionaron. Las condiciones adecuadas son la incubación a 37 °C durante 1 hora en el amortiguador correspondiente de la exonucleasa, seguido de la inactivación de la enzima a 80 °C durante 20 minutos. Cuando se usan los métodos de captura/detección, los productos de la ligación pueden enriquecerse mediante la captura de los productos en una fase sólida a través del resto de captura. Como se ilustra en el Ejemplo 2, una solución que contiene los productos de la ligación lineales puede mezclarse con 10 ml de perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina M-280 (Invitrogen) en Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 3,5 mM y Tween-20 al 0,07 % en un volumen final de 200 ml y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la incubación, las perlas se recogen mediante el uso de un imán de anillo y se elimina el sobrenadante. Otras formas de enriquecimiento para los productos de la ligación incluyen los productos de la ligación que seleccionan específicamente por el tamaño.
Una forma conveniente de detectar el producto de la doble ligación para proporcionar las condiciones para la amplificación y para probar la presencia del producto de la amplificación. Son posibles varios enfoques de amplificación, tales como NASPA, LAMP, amplificación de T7, PCR o la replicación en círculo rodante donde la cadena continua es un círculo. La etapa de detección del producto de la doble ligación puede comprender proporcionar las condiciones para la amplificación a través de la primera y la segunda uniones de ligación de la cadena continua de ácido nucleico y detectar si está presente un producto de la amplificación. Los productos de la ligación pueden amplificarse mediante la amplificación clonal. Las técnicas de amplificación adecuadas incluyen la amplificación en círculo rodante (ver más abajo), la PCR puente (Adessi C, et al.,, Nucleic Acids Res. 15 de octubre de 2000; 28(20):E87), la PCR en emulsión (la PCR digital en emulsiones se describió por Dressman et al.,, Proc Natl Acad Sci USA. 22 de julio de 2003; 100(15):8817-22. Publicación electrónica del 11 de julio de 2003) y la PCR digital (Vogelstein y Kinzler, Proc Natl Acad Sci USA. 3 de agosto de 1999; 96(16):9236-41). La amplificación clonal localizada en geles se describió por Mitra y Church, Nucleic Acids Res. 15 de diciembre de 1999; 27(24):e34.
Cuando el producto de la doble ligación es un círculo de ácido nucleico, una forma conveniente de detectar el producto es proporcionar las condiciones para la replicación en círculo rodante y detectar si está presente un producto de la replicación en círculo rodante. El producto de la replicación en círculo rodante depende de la doble ligación para proporcionar el círculo de ácido nucleico para la amplificación. La replicación en círculo rodante se describió en el documento núm. 5,854,033 (Lizardi) y Fire y Xu, Proc Natl Acad Sci USA. 9 de mayo de 1995; 92(10):4641-5. La replicación en círculo rodante es una amplificación de una molécula de ácido nucleico circular mediante el uso de una cadena que desplaza a la ADN polimerasa, lo que da como resultado grandes moléculas de ADN que contienen repeticiones en tándem de la secuencia amplificada. La ADN polimerasa cataliza la extensión del cebador y el desplazamiento de la cadena en una reacción de polimerización en círculo rodante que se desarrolla tanto tiempo como se desee. Esto da como resultado una amplificación de la secuencia de la sonda circularizada en órdenes de magnitud superiores a un solo ciclo de replicación por la PCR y otras técnicas de amplificación en las que cada ciclo se limita a duplicar el número de copias de una secuencia diana. Puede obtenerse una amplificación adicional mediante el uso de una cascada de reacciones de desplazamiento de la cadena. La replicación en círculo rodante puede ser una replicación en círculo rodante hiperramificada. La RCA hiperramificada se describió por Lizardi et al.,, Nat Genet. julio de 1998;19(3):225-32. Las condiciones para la replicación en círculo rodante se ilustran en los ejemplos, por ejemplo, la incubación con 1 U de la polimerasa phi29 (New England Biolabs) puede añadirse en el amortiguador correspondiente de phi29 y los nucleótidos (dNTP) a 37 °C durante 1 hora.
Después de la replicación en círculo rodante, las secuencias de sonda amplificadas pueden detectarse y cuantificarse mediante el uso de cualquiera de los sistemas de detección convencionales para ácidos nucleicos, como la detección de marcadores fluorescentes, los sistemas de detección ligados a enzimas, la detección de marcadores mediada por anticuerpos y la detección de marcadores radiactivos. Preferentemente, un producto de la amplificación en círculo rodante se detecta mediante la hibridación de un oligonucleótido de detección marcado con un motivo en el producto de la RCA, por ejemplo, un motivo en una secuencia personalizada de la sonda. Debido a que el producto amplificado es directamente proporcional a la cantidad de la secuencia diana presente en una muestra, las mediciones cuantitativas representan de manera confiable la cantidad de la secuencia diana en una muestra. Las principales ventajas de este método son que la etapa de la ligación puede manipularse para obtener una discriminación alélica, la etapa de replicación del ADN es isotérmica y las señales son estrictamente cuantitativas porque la reacción de amplificación es lineal y está catalizada por una enzima altamente procesadora. En los ensayos multiplex, el oligonucleótido cebador usado para la reacción de la ADN polimerasa puede ser el mismo para todas las sondas.
Para las sondas en las que las secuencias de cabeza y cola están en las moléculas de ácido nucleico separadas, puede ser conveniente usar los métodos de captura/detección. El producto de la doble ligación contiene las secuencias de cabeza y cola en una sola molécula de ácido nucleico (la cadena continua), mientras que las sondas no ligadas no. En consecuencia, el producto de la doble ligación puede detectarse específicamente mediante la captura de la molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de cabeza, el lavado para eliminar el ácido nucleico de la sonda no ligada y luego la detección de la presencia de la secuencia de cola en la fracción capturada. Alternativamente, el producto de la doble ligación puede detectarse mediante la captura de la molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de cola, el lavado para eliminar el ácido nucleico de la sonda no ligada y luego la detección de la presencia de la secuencia de cabeza en la fracción capturada. La detección es específica de las sondas ligadas, ya que las secuencias de cabeza y cola en las sondas no ligadas se conectan solo por la hibridación entre los ácidos nucleicos y se separan mediante el lavado, mientras que las sondas ligadas contienen las secuencias de cabeza y cola en una cadena de ácido nucleico continua, es decir, unidas covalentemente.
Una sonda puede modificarse para que lleve un resto de captura. El resto de captura puede permitir la unión a un sustrato sólido como una perla. Un resto de captura adecuado es la biotina, que se empareja con la estreptavidina, lo que permite aislar el ácido nucleico de la sonda modificada en el sustrato sólido recubierto con la estreptavidina. Cuando una sonda comprende un oligonucleótido de la cadena principal que contiene la secuencia de cabeza o cola, y un ácido nucleico separado (oligonucleótido de direccionamiento o un segundo oligonucleótido de la cadena principal) que contiene la cola o la cabeza respectivamente, cualquiera de estas moléculas de ácido nucleico puede llevar un resto de captura, por ejemplo puede estar biotinilado. Puede ser conveniente proporcionar la sonda con el resto de captura antes de combinar la sonda con la muestra. Alternativamente, el resto de captura puede introducirse después de la etapa de la ligación.
Cuando una molécula de ácido nucleico en la sonda lleva un resto de captura, la otra puede llevar un marcador. Es posible usar la propia secuencia de ácido nucleico como marcador, por ejemplo, para detectar específicamente la presencia de la secuencia de cabeza (donde se captura la cola) o la secuencia de cola (donde se captura la cabeza) o para detectar una secuencia personalizada que es exclusiva de la molécula de ácido nucleico que se va a detectar. Puede usarse un oligonucleótido complementario para la detección. Alternativamente, el ácido nucleico puede llevar un marcador heterogéneo, como un fluoróforo. El marcador heterogéneo no forma parte del ácido nucleico en sí. Otros marcadores que pueden usarse incluyen puntos cuánticos, bioluminiscencia, cascadas de enzimas generadoras de señales como amplificación de señales de tiramida y restos radiactivos. El método puede comprender entonces detectar la presencia del marcador, por ejemplo, detectar la fluorescencia, detectar los puntos cuánticos, detectar la bioluminiscencia, detectar la señal generada por la enzima o detectar la radiactividad, respectivamente.
Como ejemplo, la etapa de detección si el producto de la doble ligación está presente puede comprender capturar un oligonucleótido de la cadena principal de la sonda en un sustrato a través del resto de captura, lavar el sustrato para eliminar las sondas no ligadas y retener una fracción capturada que comprende el sustrato y el oligonucleótido de la cadena principal capturado, y probar la presencia del producto de la doble ligación en la fracción capturada. Cuando el producto de la doble ligación lleva un marcador, esto puede comprender probar la presencia del marcador en la fracción capturada. El resto de captura puede ser una molécula de biotina con afinidad por un sustrato de estreptavidina. Otros marcadores de afinidad adecuados incluyen los marcadores de polihistidina con afinidad por iones metálicos inmovilizados, tales como el cobalto, el níquel, el cobre que pueden usarse para la purificación de las secuencias que contienen histidina, por ejemplo, los oligonucleótidos de la cadena principal. Por tanto, el resto de captura puede ser parte de la secuencia a capturar, por ejemplo, una secuencia de marcador-His, o puede ser un resto heterogéneo que no es parte del ácido nucleico en sí.
Un sustrato sólido adecuado es una perla, por ejemplo, perlas magnéticas para facilitar el enriquecimiento de los productos capturados mediante el uso de un imán. El sustrato puede recubrirse con un miembro de unión para el resto de captura, por ejemplo, pueden usarse perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina con sondas biotiniladas.
Una ventaja de algunas realizaciones del presente método es que no se basa en la secuenciación de ácidos nucleicos, ni en la p Cr , lo que provoca resultados sesgados porque algunas secuencias se amplifican de forma más eficaz que otras. Sin embargo, opcionalmente, la detección puede comprender una etapa de validación de la identidad del fragmento ligado mediante la secuenciación del producto. Una de las ventajas de la presente invención es que, al incorporar el fragmento diana real en el producto de la doble ligación, el producto puede secuenciarse para confirmar que las sondas reaccionaron con la diana correcta. Esta es una ventaja en comparación con otros enfoques basados en la doble ligación como el documento núm. US20130172212 (Ariosa).
Multiplexación
Pueden detectarse múltiples fragmentos de ácido nucleico diana diferentes mediante el uso de una pluralidad de sondas en paralelo. Por ejemplo, una muestra de cromosomas fragmentados puede ponerse en contacto con un conjunto de sondas para unir múltiples fragmentos de un cromosoma, en donde cada sonda del conjunto es para unir un fragmento diana diferente específico a ese cromosoma. Las sondas pueden compartir una secuencia personalizada común, que puede usarse como un código de barras para identificar las sondas que se unen específicamente a ese cromosoma. La multiplexación puede incluir oligonucleótidos de direccionamiento multiplex y un oligonucleótido de la cadena principal común, pero también varios conjuntos de oligonucleótidos de direccionamiento en los que cada subconjunto hibrida con oligonucleótidos de la cadena principal separados.
Pueden usarse múltiples sondas para proporcionar una señal detectable, donde la magnitud de la señal es proporcional al número de sondas que reconocen sus fragmentos diana. Las señales individuales de la pluralidad de sondas se convierten en una única señal acumulativa detectable, lo que amplifica las señales individuales a través del sondeo multiplex. Diez o más sondas producen una amplificación de la señal de diez veces o más. Las señales generadas dependen de las sondas que reaccionan correctamente tras el reconocimiento de la diana, mediante el uso de la hibridación específica de secuencia y la ligación para generar los productos de la doble ligación específicos a partir de los cuales se obtiene la señal.
Cada sonda que reconoce su fragmento diana genera un producto de la ligación, y los productos de la ligación producidos por cada hibridación de las sondas pueden detectarse individualmente, de modo que puede obtenerse una señal individual de cada una. Sin embargo, una característica elegante de la presente divulgación es que estas señales individuales no necesitan detectarse individualmente, sino que se fusionan en una señal acumulativa y se detecta la señal acumulativa. La señal acumulativa es una combinación de las señales individuales y, por tanto, puede usarse para detectar y/o cuantificar los productos de la ligación, que representan la presencia o la cantidad de las especies de ácido nucleico que están en investigación. Algunas implementaciones del presente método permiten una fusión más temprana de las señales de la sonda en comparación con los métodos que implican la secuenciación y los microarreglos, en los que se generan señales individuales para múltiples sondas en una región y luego la señal se fusiona en el análisis para representar una región. La señal puede fusionarse antes de la detección, de modo que las señales individuales no se mapeen o interroguen por separado. Esto permite un formato de lectura más simple.
Puede obtenerse una señal individual a partir de cada producto de la doble ligación que se forma como resultado de la hibridación de la sonda con cada fragmento diana. Entonces, por ejemplo, cuando un conjunto de sondas comprende 10 sondas diferentes que reconocen 10 fragmentos diana de una especie de interés en una muestra, habrá 10 productos de la ligación, incluidas las uniones de ligación, y puede detectarse una señal acumulativa, que es la combinación de las señales individuales de los 10 productos de la ligación. Por supuesto, en este ejemplo, el número real de las sondas de moléculas, fragmentos diana y productos de la ligación puede ser superior a 10 porque normalmente habrá varias copias de cada fragmento diana en una muestra y la muestra se pondrá en contacto con varias copias de cada sonda.
El método de la amplificación de la señal mediante la multiplexación puede usarse para detectar las especies de ácido nucleico de interés en una muestra, por ejemplo, cuando una especie de ácido nucleico es un componente menor o traza en una muestra de ácido nucleico compleja. La amplificación por la multiplexación permite una detección confiable. Esto puede usarse, por ejemplo, para detectar ácido nucleico microbiano en muestras, como muestras de pacientes, con fines de diagnóstico. Las muestras pueden probarse con sondas específicas para ácidos nucleicos microbianos de múltiples especies, para detectar e identificar los presentes. Esto es útil para la detección de los agentes de enfermedades infecciosas, tales como bacterias, virus y hongos. Pueden detectarse transcritos de ácido nucleico específicos. La amplificación por la multiplexación también puede usarse para cuantificar las especies de ácido nucleico. Al sondear dos o más especies de ácido nucleico, una o más especies de interés y una o más especies de ácido nucleico de referencia, el método permite la cuantificación de las cantidades relativas de las dos especies en la muestra. El método es especialmente útil cuando se aplica a la detección o la cuantificación de cromosomas o loci cromosómicos, por ejemplo, para la detección del número de copias cromosómicas. Una aplicación de particular valor es el uso de tales métodos para identificar defectos cromosómicos, que incluye el diagnóstico de cánceres y aneuploidías congénitas. Se describe específicamente el uso para el diagnóstico prenatal no invasivo (NIPT).
Puede detectarse una especie de ácido nucleico en una muestra al poner en contacto la muestra con un conjunto de sondas como se divulga en el presente documento, en donde cada sonda reconoce específicamente una secuencia diana distinta en la especie de ácido nucleico que se va a detectar. Las secuencias diana corresponden a los fragmentos diana de la especie de ácido nucleico. El reconocimiento de cada secuencia diana por cada sonda genera un producto de la doble ligación como se describe en la presente descripción. A continuación, puede detectarse una señal acumulativa, que es una combinación de señales de los productos. La detección de la señal indica la presencia de la especie de ácido nucleico en la muestra. La especie de ácido nucleico puede cuantificarse mediante la cuantificación de la señal acumulativa para determinar un nivel de señal, en donde el nivel de señal es proporcional a la cantidad de especies de ácido nucleico en la muestra, y determinar de esta manera la cantidad de especies de ácido nucleico en la muestra. Una primera especie de ácido nucleico puede cuantificarse con relación a una segunda especie de ácido nucleico o una de referencia al poner en contacto la muestra con un primer conjunto de sondas y un segundo conjunto de sondas, en donde las sondas del primer conjunto reconocen cada una específicamente una secuencia diana distinta dentro de la primera especie de ácido nucleico y en donde las sondas del segundo conjunto reconocen cada una específicamente una secuencia diana distinta dentro de la segunda especie de ácido nucleico o una de referencia. Se detectan la primera y la segunda señales acumulativas, la primera señal acumulativa es una combinación de las señales individuales de los productos generados por las sondas del primer conjunto que reconocen sus secuencias diana, y la segunda señal acumulativa es una combinación de las señales individuales de los productos generados por las sondas del segundo conjunto que reconocen sus secuencias diana. La primera y la segunda señales se cuantifican para determinar los niveles de la primera y la segunda señal, respectivamente, siendo estas proporcionales a las cantidades de la primera y la segunda especie de ácido nucleico en la muestra. Por tanto, las cantidades relativas de la primera y la segunda especies de ácido nucleico en la muestra pueden determinarse por la comparación de los niveles de la señal de la primera y la segunda.
Por ejemplo, la señal acumulativa puede ser la enumeración resumida de los productos clonalmente amplificados y/o marcados de las sondas que reconocen sus secuencias diana, por ejemplo, los productos de la amplificación en círculo rodante, o una señal fluorescente emitida por todos los productos donde cada producto emite una señal fluorescente. Para cuantificar las cantidades relativas de las múltiples especies de ácidos nucleicos, se usan diferentes señales para cada especie, por ejemplo, los productos de un conjunto de sondas pueden emitir una longitud de onda o espectro de fluorescencia diferente en comparación con los productos de otro conjunto de sondas.
Una especie de ácido nucleico en una muestra puede detectarse en un método, que comprende
poner en contacto la muestra con un conjunto de sondas, en donde cada sonda reconoce específicamente una secuencia diana distinta dentro de la especie de ácido nucleico que se va a detectar,
proporcionar las condiciones desnaturalizantes en las que las secuencias diana en las especies de ácido nucleico son monocatenarias,
proporcionar las condiciones para la fusión y la ligación, en las que las sondas se hibridan con sus secuencias diana y generan los productos de la ligación, y
detectar una señal acumulativa que es una combinación de señales individuales de todos los productos de la ligación, en donde la detección de la señal indica la presencia de la especie de ácido nucleico en la muestra.
Los detalles de la muestra, el ácido nucleico diana, las etapas del método (por ejemplo, la fusión, la hibridación, la ligación) y las sondas se describen en otra parte en la presente descripción. El método puede comprender:
(i) proporcionar una muestra en la que la especie de ácido nucleico se fragmente en los fragmentos diana,
(ii) proporcionar las condiciones de desnaturalización en las que los fragmentos diana sean monocatenarios (iii) poner en contacto la muestra con un conjunto de sondas, en donde cada sonda reconoce específicamente una secuencia diana distinta dentro de la especie de ácido nucleico que se va a detectar, en donde las secuencias diana son secuencias de los fragmentos diana, y en donde cada sonda comprende
un oligonucleótido de direccionamiento que es más largo que el fragmento diana y contiene una secuencia interna complementaria a la diana, de modo que la hibridación entre el oligonucleótido de direccionamiento y el fragmento diana forma una secuencia bicatenaria ubicada entre las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento, y
las secuencias de cabeza y cola que tienen los extremos 5' y 3' libres respectivamente, en donde las secuencias de cabeza y cola son complementarias a las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo respectivamente, (iv) proporcionar las condiciones de fusión en las que las secuencias de cabeza y cola se hibridan con las secuencias flanqueantes, y los fragmentos diana, si están presentes, se hibridan con la secuencia complementaria a la diana de las sondas, lo que coloca de esta manera los extremos del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola
(v) proporcionar las condiciones para la ligación de modo que, si está presente un fragmento diana, el extremo 3' del fragmento diana se liga al extremo 5' de la secuencia de cabeza para formar una primera unión de ligación, y el extremo 5' del fragmento diana se liga al extremo 3' de la secuencia de cola para formar una segunda unión de ligación, lo que produce un producto de la doble ligación que comprende una cadena continua de ácido nucleico que comprende las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana, y
(vi) detectar una señal acumulativa que es una combinación de las señales individuales de todos los productos, en donde la detección de la señal indica la presencia de la especie de ácido nucleico en la muestra.
La especie de ácido nucleico puede cuantificarse mediante un método que comprende
(i) proporcionar una muestra en la que la especie de ácido nucleico se fragmenta en los fragmentos diana
(ii) proporcionar las condiciones de desnaturalización en las que los fragmentos diana sean monocatenarios (iii) poner en contacto la muestra con un conjunto de sondas, en donde cada sonda reconoce específicamente un fragmento diana distinto de la especie de ácido nucleico a cuantificar, en donde cada sonda comprende un oligonucleótido de direccionamiento que es más largo que el fragmento diana y contiene una secuencia interna complementaria a la diana, de modo que la hibridación entre el oligonucleótido de direccionamiento y el fragmento diana forma una secuencia bicatenaria ubicada entre las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento, y
las secuencias de cabeza y cola que tienen los extremos 5' y 3' libres respectivamente, en donde las secuencias de cabeza y cola son complementarias a las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo respectivamente, (iv) proporcionar las condiciones de fusión en las que las secuencias de cabeza y cola se hibridan con las secuencias flanqueantes, y los fragmentos diana, si están presentes, se hibridan con la secuencia complementaria a la diana de las sondas, lo que coloca de esta manera los extremos del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola
(v) proporcionar las condiciones para la ligación de modo que, si está presente un fragmento diana, el extremo 3' del fragmento diana se liga al extremo 5' de la secuencia de cabeza para formar una primera unión de ligación, y el extremo 5' del fragmento diana se liga al extremo 3' de la secuencia de cola para formar una segunda unión de ligación, lo que produce un producto de la doble ligación que comprende una cadena continua de ácido nucleico que comprende las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana,
(vi) detectar una señal acumulativa que es una combinación de las señales individuales de todos los productos de la ligación, y
(vii) cuantificar la señal acumulativa para determinar un nivel de señal, en donde el nivel de señal es proporcional a la cantidad de la especie de ácido nucleico en la muestra, y
determinar de esta manera la cantidad de la especie de ácido nucleico en la muestra.
El método puede usarse para cuantificar una primera especie de ácido nucleico con relación a una segunda especie de ácido nucleico en una muestra. El método puede comprender:
(i) proporcionar una muestra en la que la primera y la segunda especie de ácido nucleico se fragmentan en los fragmentos diana
(ii) proporcionar las condiciones de desnaturalización en las que los fragmentos diana sean monocatenarios
(iii) poner en contacto la muestra con un primer conjunto de sondas y un segundo conjunto de sondas, en donde las sondas del primer conjunto reconocen específicamente distintos fragmentos diana de la primera especie de ácido nucleico y en donde las sondas del segundo conjunto reconocen específicamente distintos fragmentos diana de la segunda especie de ácido nucleico, en donde cada sonda comprende
un oligonucleótido de direccionamiento que es más largo que el fragmento diana y contiene una secuencia interna complementaria a la diana, de modo que la hibridación entre el oligonucleótido de direccionamiento y el fragmento diana forma una secuencia bicatenaria ubicada entre las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento, y
las secuencias de cabeza y cola que tienen los extremos 5' y 3' libres respectivamente, en donde las secuencias de cabeza y cola son complementarias a las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo respectivamente,
(iv) proporcionar las condiciones de fusión en las que las secuencias de cabeza y cola se hibridan con las secuencias flanqueantes, y los fragmentos diana, si están presentes, se hibridan con la secuencia complementaria a la diana de las sondas, lo que coloca de esta manera los extremos del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola
(v) proporcionar las condiciones para la ligación de modo que, si está presente un fragmento diana, el extremo 3' del fragmento diana se liga al extremo 5' de la secuencia de cabeza para formar una primera unión de ligación, y el extremo 5' del fragmento diana se liga al extremo 3' de la secuencia de cola para formar una segunda unión de ligación, lo que produce un producto de la doble ligación que comprende una cadena continua de ácido nucleico que comprende las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana,
(vi) detectar una primera señal acumulativa que es una combinación de las señales individuales de los productos de la ligación generados por las sondas del primer conjunto, y cuantificarla para determinar un primer nivel de señal, en donde el primer nivel de señal es proporcional a la cantidad de la primera especie de ácido nucleico en la muestra,
(vii) detectar una segunda señal acumulativa que es una combinación de las señales individuales de los productos de la ligación generados por las sondas del segundo conjunto, y cuantificarla para determinar un segundo nivel de señal, en donde el segundo nivel de señal es proporcional a la cantidad de la segunda especie de ácido nucleico en la muestra, y
(viii) comparar los niveles de señal de la primera y la segunda, lo que determina de esta manera las cantidades relativas de la primera y la segunda especie de ácido nucleico en la muestra.
Generalmente, el número de sondas será de al menos diez por cada especie de ácido nucleico a detectar o cuantificar. Por supuesto, el número se refiere al número de sondas diferentes, más que al número absoluto de las moléculas de la sonda. En consecuencia, el ácido nucleico contendrá al menos diez secuencias diana específicas diferentes, y la señal acumulativa es una combinación de las señales individuales de al menos diez sondas únicas, esta señal acumulativa representa la única especie de ácido nucleico. Pueden usarse altos niveles de multiplexación para obtener niveles correspondientemente altos de la amplificación de la señal. Por ejemplo, pueden usarse al menos 100, al menos 1000, al menos 10000 o incluso un número mayor de sondas para cada especie de ácido nucleico que se va a detectar o cuantificar.
El método puede comprender poner en contacto una muestra de cromosomas fragmentados con múltiples conjuntos de sondas para unir múltiples fragmentos de dos o más cromosomas, que comprende:
un primer conjunto de sondas para unir una pluralidad de fragmentos diana específicos de un primer cromosoma, y
un segundo conjunto de sondas para unir una pluralidad de fragmentos diana específicos de un segundo cromosoma, y opcionalmente
uno o más conjuntos adicionales de sondas para unir una pluralidad de fragmentos diana específicos a uno o más cromosomas adicionales.
Las sondas dentro de un conjunto pueden compartir una secuencia personalizada que es común a ese conjunto y difiere de las secuencias personalizadas de las sondas en otros conjuntos, lo que permite identificar cómodamente las sondas de cada conjunto. Cada conjunto de sondas puede contener al menos 500, 600, 700, 800, 900 o al menos 1000 sondas diferentes para unir una pluralidad de fragmentos diana específicos al cromosoma. Por ejemplo, un método puede usar 1000 oligonucleótidos de direccionamiento diferentes para cada uno de los cromosomas 21, 13 y 18, respectivamente, y tres oligonucleótidos de la cadena principal diferentes, uno para cada subconjunto de cromosomas.
Es posible determinar las cantidades relativas de los dos o más cromosomas en una muestra mediante la detección de los productos de la doble ligación para cada conjunto de sondas y la detección de las cantidades relativas de las secuencias personalizadas en dichos productos.
Mediante el uso de las sondas en las que el oligonucleótido de direccionamiento y los oligonucleótidos corriente arriba y corriente abajo forman un círculo, los motivos que codifican alelos y/o loci específicos pueden incorporarse en la secuencia personalizada en un multiplex alto.
Cariotipo digital y diagnóstico prenatal no invasivo
Algunas realizaciones del presente método pueden proporcionar ventajas particulares en campos donde se busca una cuantificación precisa del ADN diana. Esto incluye una serie de técnicas de diagnóstico basadas en ácidos nucleicos. Una de esas áreas es el análisis del ADN del cáncer en una muestra biológica (por ejemplo, la sangre) de un paciente. Otra de esas áreas es el diagnóstico prenatal no invasivo mediante el análisis del ADN libre de células (NIPT).
Un desafío con el NIPT es que debe contarse una gran cantidad de fragmentos de genoma específicos para lograr la confianza estadística necesaria para diagnosticar una anomalía en las aneuploidías cromosómicas (diferencias en el número de copias de los cromosomas). Dado que el ADN fetal se mezcla con el ADN materno y constituye del 4-30 % del material genético en el torrente sanguíneo de una mujer embarazada, la observación de una aneuploidía cromosómica en el ADN fetal requiere una medición muy precisa.
Las sondas que se describen en la presente descripción pueden usarse para analizar el ADN fetal circulante libre en muestras de la sangre materna. Mediante el uso de una pluralidad de sondas dirigidas a diferentes fragmentos de un cromosoma y una pluralidad de sondas dirigidas a diferentes fragmentos de un segundo cromosoma, las sondas permiten determinar con alta confianza un desequilibrio en el número relativo de los dos cromosomas en la muestra. Esto permite que las aneuploidías cromosómicas, como la trisomía, se diagnostiquen a partir del ADN fetal incluso en el contexto elevado del a Dn materno.
Las sondas que se describen en la presente descripción pueden usarse para analizar las muestras de la sangre materna de mujeres embarazadas para detectar el ácido nucleico fetal para el diagnóstico de anomalías cromosómicas como la trisomía, analizar las muestras de pacientes en busca de ADN tumoral para el diagnóstico o la monitorización de la presencia de un tumor en el paciente. Otros usos incluyen analizar las muestras de material para detectar la presencia de ácido nucleico microbiano, donde la detección del ácido nucleico microbiano indica la infección del material por el microbio, que puede ser un agente infeccioso tal como una bacteria, un virus o un hongo. La muestra puede ser una muestra de tejido o la sangre de un paciente.
De forma más general, mediante el uso de cientos o miles de sondas diferentes, el presente método puede lograr una alta precisión en la detección de cientos o miles de fragmentos de ácido nucleico específicos, lo que proporciona ventajas en una variedad de aplicaciones de diagnóstico. La detección de una multitud de fragmentos de ADN del cromosoma o loci cromosómicos asociados con una enfermedad particular permite medir la cantidad de ese cromosoma o locus con relación a un cromosoma o locus de control, de modo que incluso las diferencias más leves en una muestra pueden detectarse con seguridad.
Al analizar los fragmentos diana cortos, una gran proporción del ADN libre de células altamente fragmentado en la sangre materna puede analizarse con alta eficiencia. Esto es importante porque hay cantidades muy bajas del ADN libre de células en la sangre materna.
Un método para cuantificar un primer cromosoma o locus cromosómico con relación a un segundo cromosoma o locus cromosómico en una muestra de ácido nucleico obtenida de un individuo puede comprender
(i) proporcionar una muestra en la que el primer y segundo cromosoma o loci cromosómicos se fragmentan en los fragmentos diana
(ii) proporcionar las condiciones de desnaturalización en las que los fragmentos diana sean monocatenarios
(iii) poner en contacto la muestra con un primer conjunto de sondas y un segundo conjunto de sondas, en donde las sondas del primer conjunto reconocen específicamente distintos fragmentos diana del primer cromosoma y en donde las sondas del segundo conjunto reconocen específicamente distintos fragmentos diana del segundo cromosoma, en donde cada sonda comprende
un oligonucleótido de direccionamiento que es más largo que el fragmento diana y contiene una secuencia interna complementaria a la diana, de modo que la hibridación entre el oligonucleótido de direccionamiento y el fragmento diana forma una secuencia bicatenaria ubicada entre las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento, y
las secuencias de cabeza y cola que tienen los extremos 5' y 3' libres respectivamente, en donde las secuencias de cabeza y cola son complementarias a las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo respectivamente,
(iv) proporcionar las condiciones de fusión en las que las secuencias de cabeza y cola se hibridan con las secuencias flanqueantes, y los fragmentos diana, si están presentes, se hibridan con la secuencia complementaria a la diana de las sondas, lo que coloca de esta manera los extremos del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola
(v) proporcionar las condiciones para la ligación de modo que, si está presente un fragmento diana, el extremo 3' del fragmento diana se liga al extremo 5' de la secuencia de cabeza para formar una primera unión de ligación, y el extremo 5' del fragmento diana se liga al extremo 3' de la secuencia de cola para formar una segunda unión de ligación, lo que produce un producto de la doble ligación que comprende una cadena continua de ácido nucleico que comprende las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana,
(vi) detectar una primera señal acumulativa que es una combinación de las señales individuales de los productos de la ligación generados por las sondas del primer conjunto, y cuantificarla para determinar un primer nivel de señal, en donde el primer nivel de señal es proporcional a la cantidad del primer cromosoma o locus cromosómico en la muestra,
(vii) detectar una segunda señal acumulativa que es una combinación de las señales individuales de los productos de la ligación generados por las sondas del segundo conjunto, y cuantificarla para determinar un segundo nivel de señal, en donde el segundo nivel de señal es proporcional a la cantidad del segundo cromosoma o locus cromosómico en la muestra, y
(viii) comparar los niveles de la primera y la segunda señal, lo que determina de esta manera las cantidades relativas del primer y el segundo cromosoma o loci cromosómicos en la muestra.
El método puede usarse para diagnosticar una aneuploidía (por ejemplo, la trisomía) en un feto, donde la muestra de ácido nucleico es una muestra obtenida de la sangre materna y contiene el ADN fetal libre de células mezclado con el ADN materno, y en donde una relación desigual del primer y el segundo nivel de señal son indicativos de una aneuploidía (por ejemplo, la trisomía).
Sondas
Otros aspectos incluyen las sondas adecuadas para su uso en el presente método. Ya se han descrito anteriormente ejemplos de sondas y sus características. En la presente se describen algunas características y ejemplos adicionales.
El ácido nucleico de la sonda es preferentemente ADN. Sin embargo, puede ser otro ácido nucleico, de origen natural o no. Las bases estándar del a Dn son A, T, C y G, pero el ácido nucleico de la sonda puede incluir opcionalmente nucleótidos no estándar.
En general, una sonda como se divulga en el presente documento comprende un oligonucleótido de direccionamiento y las secuencias de cabeza y cola. Las secuencias de cabeza y cola pueden ser parte del oligonucleótido de direccionamiento, o una o ambas pueden estar en una molécula de ácido nucleico diferente. Opcionalmente, la sonda comprende el oligonucleótido de direccionamiento, un oligonucleótido de la cadena principal que comprende la secuencia de cabeza y un oligonucleótido de la cadena principal que comprende la secuencia de cola. Por tanto, una sonda puede comprender una, dos o tres moléculas de ácido nucleico en su forma no ligada.
El oligonucleótido de direccionamiento es más largo que el fragmento diana y contiene una secuencia interna complementaria a la diana, de modo que la hibridación entre el oligonucleótido de direccionamiento y el fragmento diana forma una secuencia bicatenaria ubicada entre las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento. Las secuencias de cabeza y cola tienen extremos 5' y 3' libres respectivamente, y son complementarias a las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo respectivamente. En las condiciones de fusión en presencia del fragmento diana, las secuencias de cabeza y cola se hibridan con las secuencias flanqueantes, lo que define un espacio entre el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola, en donde el fragmento diana hibrida con la secuencia complementaria a la diana en el espacio, lo que coloca de esta manera los extremos del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola.
Las sondas pueden diseñarse de modo que la hibridación del fragmento diana en el espacio complete un círculo de ácido nucleico, el círculo que comprende el fragmento diana y las secuencias de cabeza y cola.
La secuencia de cabeza y/o cola de la sonda se une preferentemente a una secuencia personalizada que no es complementaria a otras regiones de la sonda o al fragmento diana.
En algunas realizaciones de la sonda, una única molécula de ácido nucleico comprende las secuencias de cabeza y cola.
Las secuencias de cabeza y cola pueden estar separadas del oligonucleótido de direccionamiento para que se unan en trans a las secuencias flanqueantes. Por ejemplo, las secuencias de cabeza y cola pueden estar en los extremos 5' y 3' respectivamente de un oligonucleótido de la cadena principal. Puede incluirse una secuencia personalizada entre las secuencias de cabeza y cola del oligonucleótido de la cadena principal. Un ejemplo de una sonda de este tipo se muestra en la Figura 1 y la Figura 3. Alternativamente, las secuencias de cabeza y cola del oligonucleótido de la cadena principal pueden ser adyacentes, sin ninguna secuencia de nucleótidos intermedias. En tal caso, las secuencias flanqueantes del oligonucleótido de direccionamiento se hibridan a lo largo de la longitud completa del oligonucleótido de la cadena principal y pueden circularizarlo.
Las sondas pueden diseñarse de modo que la secuencia de cabeza sea un extremo 5' del oligonucleótido de direccionamiento y/o la secuencia de cola sea un extremo 3' del oligonucleótido de direccionamiento, de modo que la hibridación del fragmento diana en el espacio complete una cadena de ácido nucleico que comprende el fragmento diana, las secuencias de cabeza y cola, la secuencia complementaria a la diana y las secuencias flanqueantes. Las secuencias de cabeza y cola pueden estar en los extremos del oligonucleótido de direccionamiento y unirse en cis a las secuencias flanqueantes. Un ejemplo de dicha sonda se muestra en la Figura 4. En esta versión de la sonda, las secuencias de cabeza y cola y la secuencia complementaria a la diana se circularizan con el fragmento diana. Las secuencias personalizadas pueden colocarse en los bucles del oligonucleótido. El ácido nucleico de la sonda es relativamente largo, pero tiene la ventaja de unir la estructura de oligonucleótidos en una molécula que está ensamblada previamente y no requiere la hibridación de diferentes moléculas de ácido nucleico de la sonda.
Las sondas también pueden diseñarse con un oligonucleótido de la cadena principal, que es una molécula de ácido nucleico separada del oligonucleótido de direccionamiento. La secuencia de cola puede ser un extremo 3' del oligonucleótido de direccionamiento y la secuencia de cabeza un extremo 5' de un oligonucleótido de la cadena principal. Alternativamente, la secuencia de cabeza puede ser un extremo 5' del oligonucleótido de direccionamiento y la secuencia de cola un extremo 3' de un oligonucleótido de la cadena principal. Puede introducirse una secuencia personalizada en el oligonucleótido de direccionamiento, por ejemplo para proporcionar un bucle entre la secuencia de cabeza o cola y la secuencia flanqueante. Una ventaja de usar este enfoque de la sonda es que puede introducirse una secuencia de detección en el bucle y se asocia con la secuencia complementaria a la diana, lo que puede ser ventajoso para los métodos multiplex, especialmente los multiplex superiores con esquemas de detección de alto plex. El oligonucleótido de la cadena principal puede comprender además una secuencia personalizada. Al proporcionar la sonda en dos oligonucleótidos, las moléculas de ácido nucleico de la sonda son más cortas que la versión del oligonucleótido único, pero mantienen la misma función.
Otro diseño de la sonda proporciona las secuencias de cabeza y cola en dos oligonucleótidos de la cadena principal. Por tanto, la sonda comprende
un oligonucleótido de direccionamiento que es más largo que el fragmento diana y contiene una secuencia interna complementaria a la diana, de modo que la hibridación entre el oligonucleótido de direccionamiento y el fragmento diana forma una secuencia bicatenaria ubicada entre las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento,
un oligonucleótido de la cadena principal que comprende una secuencia de cabeza que tiene un extremo 5' libre, y
un oligonucleótido de la cadena principal que comprende una secuencia de cola que tiene un extremo 3' libre,
en donde las secuencias de oligonucleótidos de cabeza y cola son complementarias a las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo, respectivamente.
Un oligonucleótido de la cadena principal puede llevar un resto de captura, en cuyo caso se usa el otro oligonucleótido de la cadena principal para la detección y puede llevar un marcador heterogéneo. Uno o ambos oligonucleótidos de la cadena principal pueden comprender además una secuencia personalizada. Alternativa o adicionalmente, el oligonucleótido de direccionamiento puede incluir una secuencia personalizada.
En condiciones de fusión en presencia del fragmento diana, las secuencias de cabeza y cola se hibridan con las secuencias flanqueantes, lo que define un espacio entre el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola, en donde el fragmento diana hibrida con la secuencia complementaria a la diana en el espacio, lo que coloca de esta manera los extremos del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola. La hibridación del fragmento diana en el espacio completa una cadena de ácido nucleico que comprende el fragmento diana y las secuencias de cabeza y cola. La cadena lleva el resto de captura y el marcador, lo que permite la detección mediante el uso de los métodos de captura/detección que se describe en otra parte en la presente descripción.
Kits y conjuntos de sondas
Un aspecto adicional de esta descripción es un conjunto de sondas para unir los fragmentos de ácido nucleico diana monocatenarios, que comprenden una pluralidad de sondas, las sondas tienen una pluralidad de diferentes secuencias complementarias a la diana para la unión de múltiples fragmentos diana diferentes.
El conjunto de sondas puede ser para unir múltiples fragmentos de un cromosoma humano, en donde cada sonda del conjunto es para unir un fragmento diana diferente específico de ese cromosoma. Todas estas sondas pueden incluir una secuencia personalizada común, como parte del oligonucleótido de direccionamiento o como parte de un oligonucleótido de la cadena principal.
Pueden proporcionarse múltiples conjuntos de sondas para unir diferentes fragmentos de dos o más cromosomas humanos, que comprenden:
un primer conjunto de sondas para unir una pluralidad de fragmentos diana específicos de un primer cromosoma, y
un segundo conjunto de sondas para unir una pluralidad de fragmentos diana específicos de un segundo cromosoma, y opcionalmente
uno o más conjuntos adicionales de sondas para unir una pluralidad de fragmentos diana específicos a uno o más cromosomas adicionales. Las sondas dentro de un conjunto pueden compartir una secuencia personalizada que es común a ese conjunto y difiere de las secuencias personalizadas de las sondas en otros conjuntos.
También pueden proporcionarse los kits que comprenden los conjuntos de sondas en solución en uno o más recipientes.
Usos
Las sondas, los conjuntos de sondas y los kits que se describen en la presente descripción pueden usarse para analizar las muestras para detectar la presencia de los fragmentos de ácido nucleico diana. Pueden usarse para identificar la presencia de un fragmento diana definido en una muestra de ácido nucleico fragmentado in vitro.
Un aspecto incluye el uso de una sonda para analizar una muestra para detectar la presencia de un fragmento de ácido nucleico monocatenario diana,
en donde la sonda comprende un oligonucleótido de direccionamiento que contiene una secuencia que es el complemento exacto del fragmento diana, y las secuencias de oligonucleótidos de cabeza y cola que se hibridan adyacentes al fragmento diana en el oligonucleótido de direccionamiento,
en donde la hibridación entre el fragmento diana y la sonda moldea el fragmento diana para la ligación a las secuencias de cabeza y cola.
Los ejemplos de tales sondas y de su uso en los métodos de ensayo de las muestras se describen con más detalle en otra parte en la presente descripción. Los usos incluyen analizar las muestras de la sangre materna de mujeres embarazadas para detectar el ácido nucleico fetal para el diagnóstico de anomalías cromosómicas como la trisomía, y analizar las muestras de pacientes en busca de ADN tumoral para el diagnóstico o el seguimiento de la presencia de un tumor en el paciente. Otros usos incluyen analizar las muestras de material para detectar la presencia de ácido nucleico microbiano, donde la detección del ácido nucleico microbiano indica la infección del material por el microbio, que puede ser un agente infeccioso tal como una bacteria, un virus o un hongo. La muestra puede ser una muestra de tejido o la sangre de un paciente.
Ejemplos
El siguiente ejemplo se proporciona con el fin de demostrar e ilustrar además determinadas realizaciones y aspectos de la presente invención y no debe interpretarse como una limitación del alcance de esta.
Ejemplo 1
Un protocolo adecuado para realizar el método ilustrado en la Figura 1 es el siguiente: 1) Se digieren 10 ng de ADN con 1 unidad de la enzima de restricción en el amortiguador compatible correspondiente de la enzima de restricción. La reacción se incuba a 37 °C durante 1 h, seguido de la desactivación enzimática a 80 °C durante 20 min. 2) Los fragmentos de ADN se desnaturalizan en fragmentos monocatenarios a 95 °C durante 10 min y se mezclan con las sondas y la ligasa para formar círculos. El conjunto de las sondas se añaden en una concentración individual de 10 pM junto con 1 U de la ampligasa (Epicentre) y se incuban a 55 °C durante 1 h en el amortiguador de la ligasa. 3) Se añade 1 U de la exonucleasa para eliminar las sondas y los fragmentos que no reaccionaron. Se añade 1 U de la exonucleasa Lambda (Epicentre) a 37 °C durante 1 h en el amortiguador correspondiente de la exonucleasa seguido de la inactivación de la enzima a 80 °C durante 20 min. 4) Los círculos restantes se amplifican por la RCA. Se añade 1 U de la polimerasa phi29 (New England Biolabs) en el amortiguador correspondiente de phi29 y los nucleótidos (dNTP) a 37 °C durante 1 h.
Ejemplo 2
Un protocolo adecuado para realizar el método ilustrado en la Figura 2 es el siguiente: 1) Se digieren 10 ng de ADN con 1 unidad de la enzima de restricción en el amortiguador compatible correspondiente de la enzima de restricción. La reacción se incuba a 37 °C durante 1 h, seguido de la desactivación enzimática a 80 °C durante 20 min. 2) Los fragmentos de ADN se desnaturalizan a los fragmentos monocatenarios a 95 °C durante 10 min y se mezclan con las sondas y la ligasa para formar los productos de la ligación lineales. El conjunto de las sondas se añaden en una concentración individual de 10 pM junto con 1 U de la ampligasa (Epicentre) y se incuban a 55 °C durante 1 h en el amortiguador de la ligasa. 3) El producto de la ligación se captura en las perlas magnéticas con estreptavidina. Para eliminar las sondas y los fragmentos que no reaccionaron, la solución se mezcla con 10 ml de las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina M-280 (Invitrogen) en Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 3,5 mM y Tween-20 al 0,07 % en un volumen final de 200 ml, y se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. Después de la incubación, las perlas se recogen mediante el uso de un imán de anillo y se elimina el sobrenadante.
Ejemplo 3
Materiales y métodos
Preparación de las muestras: Se recogieron 10 ml de la sangre de cada sujeto en un tubo de ADN libre de células (Streck, Omaha, NE). El plasma se aisló de la sangre mediante un protocolo de doble centrifugación (1600 g durante 10 min, seguido de 16 000 g durante 10 min, después de una transferencia al tubo después de la primera centrifugación). El ADNcf se aisló mediante el kit de ácido nucleico ccf de Qiagen (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN resultante se eluyó en 50 ul de amortiguador (parte del kit Qiagen).
Diseño de la cadena principal y la sonda: La tecnología de la sonda multiplexada que se describe en la presente descripción permite la amplificación específica y simultánea de miles de fragmentos cromosómicos. Las sondas se diseñaron para capturar 2500-5000 fragmentos (dianas) de cada uno de los cromosomas 21, 18 y 13. Las dianas se seleccionaron para tener una secuencia única en el genoma, una composición AT/GC uniformada, que no incluyeran polimorfismos conocidos, ni CNV en la secuencia diana, y un tamaño entre 18-35 pb. Las sondas dirigidas a 2500 fragmentos de cada cromosoma 13 y 18 se combinaron con 5000 sondas dirigidas a los fragmentos del cromosoma 21 para generar un único conjunto de sondas de oligo.
Secuencia de ejemplo de las sondas, "N" representa la secuencia complementaria a la diana:
ATGTGACCCTTCCGTCTGTTGAGTTAGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
TCGTGCCTTGTCATTCGGGAGCACTAACTGCTG (SEQ ID NO:1)
Las cadenas principales, con las secuencias de cabeza y cola complementarias a los extremos de la sonda, se diseñaron para incluir los motivos de secuencia tanto para la secuenciación como para el recuento digital. Se usaron dos cadenas principales en los experimentos que se describen en la sección de resultados; una complementaria a las sondas dirigida a los cromosomas 13 y 18:
(/5Fos/CGCACACGATTAAGGTCCAGTCACAGGCAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGG AAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATTTCATGCTGCTAAC
GGTCGAGTCGGACAGGTGGCTCCACTAAATAGACGCA); SEQ ID NO: 2, y una cadena principal dirigida al cromosoma 21:
(/5Phos/GGCCT AACTCAACAGACGGAAGGGT CACAT AGAT CGGAAGAGCGT CGT GTAGGG
AAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATTTCATGCTGCTAAC
GGTCGAGCAGTTAGTGCTCCCGAATGACAAGGCACGA; SEQ ID NO:3).
Protocolo bioquímico de la sonda: Se digirieron 50 ul de ADNcf purificado con 5 U de Msel (New England Biolabs) en amortiguador NEB4 1x (New England Biolabs) y BSA 1x en un volumen total de 55 ul a 37 °C en 30 min, seguido de la inactivación por calor a 65 °C en 20 min. A continuación, el ADN digerido se mezcló con una mezcla de ligación junto con las sondas y las cadenas principales. Los 55 ul del ADN digerido se mezclaron con las sondas (1 pM/sonda), las cadenas principales (60 nM cada una), el amortiguador de ligación 1x (Epicentre), 100 U de la ampligasa (Epicentre), NAD 1 mM y Mg2+ 5 mM a un volumen total de 70 ul. Los fragmentos digeridos se desnaturalizaron primero a ADN monocatenario a 95 °C en 5 min seguido de la hibridación a 55 °C y la ligación en 16 h. La mezcla de ligación se trató luego con exonucleasas para eliminar cualquier molécula de ADN lineal restante. La reacción de la ligación se mezcló con 20 U de Exol (NEB) y 5 U de ExoIII (Ne B) y BSA 1x con un volumen total de 75 ul a 37 °C durante 60 min, seguido de la inactivación por calor a 65 °C durante 10 min.
Análisis: Para el análisis de secuenciación, los círculos tratados con exo se amplificaron con cebadores de secuenciación complementarios al instrumento de secuenciación Illumina y posteriormente se cargaron en el instrumento Illumina Miseq de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para el análisis digital, las reacciones tratadas con exo se sometieron a una reacción de amplificación en círculo rodante (RCA) para generar objetos de ADN discretos de copias concateméricas del círculo. Se mezclaron 37,5 ul de los círculos tratados con exo con DTT 4 mM, 3U de la polimerasa phi29 (NEB), el cebador 0,1 uM, una mezcla de dNTP 1 mM (NEB) y BSA 1x en un volumen total en 50 ul, y se incubaron a 37 °C durante 1 hora seguido por la inactivación por calor a 65 °C durante 10 min. A continuación, la reacción de la RCA se marcó con oligonucleótidos marcados con fluorescencia complementarios a la secuencia de la cadena principal. Se mezclaron 50 ul de los productos de la RCA con Tween 20 al 0,1 % (Sigma), los oligonucleótidos marcados 5 nM y SSC 2x (Sigma) en un volumen total de 100 ul. Los productos de la RCA marcados se depositaron finalmente en un portaobjetos de microscopio recubierto con polilisina (Sigma) y se contaron en un microscopio fluorescente.
Resultados
El método de la sonda que se describe en la presente descripción se demostró en la secuenciación de Illumina y un sistema de recuento digital. Para demostrar el rendimiento del método de la sonda, se mezcló una muestra de ADN con trisomía 21 con ADN extraído de las muestras de plasma normal (3-5 ml de plasma) en diferentes concentraciones. A continuación, las muestras se evaluaron a través del método de la sonda y se evaluaron mediante la secuenciación.
Para los resultados mostrados en la Figura 8, se sometieron 100 ng de ADN de la línea celular al protocolo que se describió anteriormente. Se mezclaron 10 000 sondas en un conjunto para circularizar específicamente 10 000 fragmentos cromosómicos correspondientes de los cromosomas 13, 18 y 21. A continuación, los 10 000 círculos resultantes se amplificaron con los cebadores de PCR correspondientes a Illumina y se analizaron en el gel antes de la secuenciación. El carril 1 corresponde a la escala de ADN, el carril 2 a la muestra de ADN después de la digestión y el carril 3 al producto de la PCR con 10000 fragmentos amplificados.
Para los resultados mostrados en la Figura 9, se analizaron 12 muestras de plasma normal en paralelo con las muestras portadoras de ADN con trisomía 21 en diferentes concentraciones. El ADN se extrajo y se procesó mediante el protocolo de sonda 10K-plex y finalmente se secuenció en el secuenciador Illumina. Mediante el uso de un intervalo de confianza que proporciona una especificidad del 99 %, las muestras positivas se detectan con una sensibilidad del 90 % en función de las distribuciones normales estimadas.
Para demostrar el principio de la conversión de los fragmentos dirigidos a objetos de ADN marcados, se añadió el 10 % de ADN con trisomía 21 a 20 ng de ADN de línea celular normal y se evaluó mediante el método de la sonda. Los productos de la RCA marcados resultantes se depositaron aleatoriamente en un portaobjetos de microscopio y se contaron. Las sondas dirigidas a los fragmentos derivados del cromosoma 21 se marcaron con un color y los fragmentos derivados de los cromosomas 13 y 18 con un color de referencia. Los resultados se muestran en la Figura 10. El Panel (A) de la Figura 10 muestra una imagen de un microscopio, que muestra los productos de la RCA marcados y detectados. Al marcar todos los fragmentos del cromosoma 13 con un fluoróforo y los fragmentos de un cromosoma de referencia con un segundo fluoróforo, puede lograrse una medición de la relación. Panel (B): 20 ng de ADN procesado a través del protocolo de sonda 10K-plex y convertidos en los productos de la RCA marcados. Los productos de la RCA se analizaron en paralelo con las muestras que llevaban un 10 % de adición de ADN con trisomía 21. Se analizaron 12 muestras de ADN normal (muestra # 1-12) en paralelo con tres muestras positivas (muestra # 13-15).
Una realización proporciona un método para procesar una muestra de ácido nucleico, que comprende: a) hibridar una muestra que comprende un fragmento diana con una sonda de ácido nucleico que comprende: i. una secuencia de cabeza y una secuencia de cola, en donde las secuencias de cabeza y cola están en los extremos de una primera molécula de oligonucleótido; y ii. una secuencia de tablilla que comprende, en orden: una secuencia flanqueante corriente arriba que es complementaria a la secuencia de cabeza; una secuencia complementaria a la diana que es complementaria al fragmento diana; y una secuencia flanqueante corriente abajo que es complementaria a la secuencia de cola; lo que produce de esta manera un producto de hibridación en el que los extremos del fragmento diana son adyacentes de manera ligable a los extremos de las secuencias de cabeza y cola en la primera molécula de oligonucleótido; y b) ligar los extremos del fragmento diana a los extremos de las secuencias de cabeza y cola de la primera molécula de oligonucleótido, lo que produce de esta manera un producto cíclico que comprende el fragmento diana y las secuencias de cabeza y cola.
En cualquier realización, el método puede comprender además amplificar el producto cíclico mediante la amplificación en círculo rodante mediante el uso de un cebador que hibrida con la primera molécula de oligonucleótido o la secuencia de tablilla. En estas realizaciones, el método puede comprender además cuantificar el número de productos de la amplificación en círculo rodante producidos, lo que produce de esta manera una estimación de la cantidad de dicho fragmento diana en la muestra.
En algunas realizaciones, la secuencia de tablilla puede estar en la primera molécula de oligonucleótido.
En algunas realizaciones, la secuencia de tablilla puede estar en una segunda molécula de oligonucleótido.
En cualquier realización, la secuencia complementaria a la diana puede tener una longitud de 10 a 30 nucleótidos.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para analizar una muestra para detectar la presencia de un fragmento de ácido nucleico diana, que comprende
(i) proporcionar una muestra de ácido nucleico fragmentado;
(ii) proporcionar condiciones desnaturalizantes en las que el fragmento diana es monocatenario;
(iii) poner en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico que comprende
un oligonucleótido de direccionamiento que es más largo que el fragmento diana y contiene una secuencia interna complementaria a la diana, de modo que la hibridación entre el oligonucleótido de direccionamiento y el fragmento diana forma una secuencia bicatenaria ubicada entre una secuencia flanqueante corriente arriba y una secuencia flanqueante corriente abajo del oligonucleótido de direccionamiento, y,
una secuencia de cabeza y una secuencia de cola que tienen extremos libres 5' y 3' respectivamente, en donde la secuencia de cabeza y la secuencia de cola son complementarias a las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo respectivamente;
(iv) proporcionar condiciones de fusión en las que las secuencias de cabeza y cola se hibridan con las secuencias flanqueantes corriente arriba y corriente abajo, y el fragmento diana, si está presente, hibrida con la secuencia complementaria de la diana, colocando así los extremos del fragmento diana en yuxtaposición con el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' de la secuencia de cola;
(v) proporcionar condiciones para la ligación de modo que, si el fragmento diana está presente, el extremo 3' del fragmento diana se liga al extremo 5' de la secuencia de cabeza para formar una primera unión de ligación, y el extremo 5' del fragmento diana se liga al extremo 3' de la secuencia de cola para formar una segunda unión de ligación, produciendo un producto de ligación que comprende una cadena circular de ácido nucleico que comprende las secuencias de cabeza y cola y el fragmento diana; y,
(vi) detectar si el producto de ligación está presente,
en donde la presencia del producto de ligación indica la presencia del fragmento diana en la muestra.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra de ácido nucleico fragmentado es un digerido de enzima de restricción y el fragmento diana es un fragmento de restricción.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el extremo 5' de la secuencia de cabeza y el extremo 3' del fragmento diana se hibridan con los nucleótidos adyacentes del oligonucleótido de direccionamiento, y el extremo 3' de la secuencia de cola y el extremo 5' del fragmento diana se hibridan con nucleótidos adyacentes del oligonucleótido de direccionamiento.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa de detectar si el producto de ligación está presente comprende además proporcionar condiciones para la amplificación a través de la primera unión de ligación y la segunda unión de ligación de la cadena circular de ácido nucleico, y detectar si está presente un producto de amplificación.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa de detectar si el producto de ligación está presente comprende además proporcionar condiciones para la amplificación del círculo rodante y detectar si está presente un producto de amplificación del círculo rodante.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la sonda comprende un oligonucleótido de la cadena principal que tiene las secuencias de cabeza y cola en sus extremos 5' extremos 3' respectivamente, en donde las secuencias de cabeza y cola del oligonucleótido de cadena principal se unen en trans a las secuencias flanqueantes del oligonucleótido de direccionamiento bajo las condiciones de fusión.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el oligonucleótido de la cadena principal comprende una secuencia personalizada entre las secuencias de cabeza y cola, en donde la secuencia personalizada no es complementaria de otras regiones de la sonda o del fragmento diana.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las secuencias flanqueantes tienen cada una una longitud de 10 a 30 nucleótidos.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra es una muestra de cromosomas humanos fragmentados y el fragmento diana es un fragmento del genoma humano específico de un cromosoma.
10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende además pruebas multiplex para múltiples fragmentos de ácido nucleico diana diferentes usando una pluralidad de sondas en paralelo.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el método comprende además poner en contacto una muestra de cromosomas fragmentados con un conjunto de sondas para unir múltiples fragmentos de un cromosoma, en donde cada sonda en el conjunto es para unir un fragmento diana diferente específico de ese cromosoma.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el método comprende además poner en contacto una muestra de cromosomas fragmentados con dos o más conjuntos de sondas para unir múltiples fragmentos de dos o más cromosomas, en donde los dos o más conjuntos de sondas comprenden:
un primer conjunto de sondas para unir una pluralidad de fragmentos diana específicos de un primer cromosoma, y un segundo conjunto de sondas para unir una pluralidad de fragmentos diana específicos de un segundo cromosoma, y opcionalmente
uno o más conjuntos adicionales de sondas para unir una pluralidad de fragmentos diana específicos para uno o más cromosomas adicionales.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde cada conjunto de sondas comprende al menos 500 sondas diferentes para unir una pluralidad de fragmentos diana específicos del cromosoma.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, comprendiendo además el método determinar las cantidades relativas de los dos o más cromosomas en la muestra detectando los productos de ligación para cada conjunto de sondas y detectando las cantidades relativas de las secuencias personalizadas en dichos productos.
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