WO2023282164A1 - プローブ、プローブセット、及び哺乳動物の核酸検出キット - Google Patents
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- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
Definitions
- the present invention relates to probes, probe sets, and mammalian nucleic acid detection kits. This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2021-113260 filed in Japan on July 8, 2021, the content of which is incorporated herein.
- Fluorescence In Situ Hybridization which is one of the methods of transcriptome analysis, can detect the expression distribution and expression level of specific nucleic acids in tissues and cells by fluorescence.
- the seqFISH (Sequential Fluorescence In Situ Hybridization) method is a technique that can directly identify many RNA transcripts within a single cell while maintaining spatial localization.
- transcripts are first labeled with fluorescent probes by successive rounds of hybridization to read the sequential barcode of each transcript, and then the sequential barcodes are decoded to identify the transcripts present in a single cell. to uniquely identify the RNA transcript (see, for example, Patent Document 1, etc.).
- the limit of optical resolution and the density of transcripts in a single cell are problems.
- the seqFISH+ method which can image the mRNA of 10,000 genes in a single cell with high precision and sub-diffraction limit resolution using a standard confocal microscope. have been developed (see, for example, Non-Patent Document 1).
- Non-Patent Document 1 When detecting mammalian nucleic acids by the FISH method described in Patent Document 1, Non-Patent Document 1, etc., it is necessary to develop a probe consisting of a sequence that does not exist in the mammalian genome. Designing such probes is extremely difficult, and only about several dozen types of probes have been released to the public at present. Therefore, the number of simultaneously detectable genes is limited to about 20-30.
- the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a probe consisting of a nucleotide sequence that does not exist in mammalian genomes.
- the present invention includes the following aspects. (1) consisting of a nucleotide sequence that does not hybridize to mammalian nucleic acids under stringent conditions; A probe consisting of a sequence containing the base sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1-673. (2) The probe according to (1), wherein the mammal is one or more animals selected from the group consisting of humans and mice. (3) the mammal is one or more animals selected from the group consisting of humans, mice, zebrafish, Xenopus laevis, and rats, SEQ.
- one or more detection probes comprising the probe according to (4); one or more capture probes having a sequence A complementary to at least a portion of said detection probe and a sequence B complementary to at least a portion of a mammalian target nucleic acid; with When two or more of the detection probes are provided, the two or more detection probes do not hybridize to each other under stringent conditions, and A mammalian nucleic acid detection kit, wherein when two or more of the capture probes are provided, the two or more of the capture probes do not hybridize to each other under stringent conditions.
- the probe of the above aspect it is possible to provide a probe consisting of a nucleotide sequence that does not exist in mammalian genomes.
- FIG. 10 is a fluorescent image of mRNA in mouse ES cells visualized by smFISH using three types of probes in Example 2.
- FIG. 10 is a fluorescent image of mRNA in mouse ES cells visualized by smFISH using three types of probes in Example 2.
- the probe of this embodiment consists of a nucleotide sequence that does not hybridize to mammalian nucleic acids under stringent conditions, and comprises a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 1-673.
- the inventors screened probes consisting of base sequences that do not exist in the entire genome sequences of mammals (especially humans and mice) from a probe library designed by an original algorithm to obtain the present invention. was completed.
- the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 673 consist of 15 bases each, and are nucleotide sequences that do not exist in the whole genome sequences of human and mouse, and have been discovered by the inventor for the first time.
- Probe means a molecule or molecular complex used to detect nucleic acids. Since the probe of the present embodiment comprises a base sequence that does not hybridize with mammalian nucleic acids under stringent conditions, it binds to the capture probe when detecting mammalian nucleic acids, as described later, and It is suitably used as a detection probe for detecting animal nucleic acids. That is, a probe consisting of a sequence containing the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 673 is preferably used as a detection probe for detecting human or mouse nucleic acids.
- Under stringent conditions refers to conditions under which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
- stringent conditions more specifically, for example, 5 ⁇ SSC (composition of 20 ⁇ SSC: 3M sodium chloride, 0.3M citric acid solution, pH 7.0), 0.1% by weight N-lauroylsarcosine , 0.02% by weight SDS, 2% by weight blocking reagent for nucleic acid hybridization, and 50% formamide in a hybridization buffer at 55°C or higher and 70°C or lower for several hours to overnight. and hybridizing conditions.
- the washing buffer used for washing after incubation is preferably 0.1% by weight SDS-containing 1 ⁇ SSC solution, more preferably 0.1% by weight SDS-containing 0.1 ⁇ SSC solution.
- the nucleic acid that constitutes the probe of the present embodiment can have a length of, for example, 10 to 50 bases, preferably 10 to 30 bases.
- the nucleic acid that constitutes the probe of this embodiment may further contain other sequences in addition to the base sequences represented by any of SEQ ID NOS: 1-673, and is represented by any of SEQ ID NOS: 1-673. It is preferable to consist only of the base sequence of
- Nucleic acid means a polymeric organic compound in which nitrogen-containing bases derived from purines or pyrimidines, sugars and phosphoric acids are regularly bound, and includes nucleic acid analogs and the like.
- the nucleic acid that constitutes the probe of this embodiment may be DNA or RNA.
- the probe of the present embodiment is not limited to those made of natural nucleic acids, and artificial nucleic acids such as BNA, ethylene-crosslinked nucleic acid (ENA), peptide nucleic acid (PNA), glycol nucleic acid (GNA), and threose nucleic acid (TNA). It may also contain nucleic acids.
- the probe of this embodiment may further have a labeling substance. That is, the probe of this embodiment consists of a nucleotide sequence that does not hybridize to mammalian nucleic acids under stringent conditions, and comprises a sequence that includes the nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 673; and a labeling substance.
- Labeling substance means a substance that directly or indirectly generates a detectable signal by chemical or physical means.
- labeling substances include enzyme labels such as peroxidase (eg, horseradish peroxidase) and alkaline phosphatase; carboxyfluorescein (FAM), 6-carboxy-4',5'-dichloro2',7'-dimethoxyfluorescein (JOE ), fluorescein isothiocyanate (FITC), tetrachlorofluorescein (TET), 5′-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite (HEX), fluorescent labels such as Cy3, Cy5, Alexa488, Alexa555, Alexa568, Alexa647; electrochemiluminescent labels such as ruthenium complexes; metal nanoparticles and the like, but are not limited thereto.
- Preferred labeling substances include fluorescent labels (fluorochromes).
- the labeling substance is bound directly or indirectly via a linker or the like to the 5'-end or 3'-end of the nucleic acid in the probe.
- linker is meant a linking moiety that links two substances or a molecule that is used to link two substances.
- the probe set of this embodiment comprises two or more of the probes described above, and the two or more of said probes do not hybridize to each other under stringent conditions.
- two or more of the probes do not hybridize to each other under stringent conditions, so that multiple target nucleic acids can be detected simultaneously with high accuracy.
- the probe set of this embodiment comprises 2 or more, preferably 10 or more, more preferably 50 or more, still more preferably 100 or more, particularly preferably 200 or more, and most preferably 240 or more of the probes described above.
- the probe set of the present embodiment includes more types of probes than the above lower limit, more mammalian nucleic acids can be detected at the same time.
- 240 or more probes as described above are provided, simultaneous detection of total mRNA of a specific mammal (particularly human or mouse) by smFISH becomes possible.
- the probes when the probes have labeling substances, it is preferable that two or more of the probes have labeling substances different from each other.
- the mammalian nucleic acid detection kit of the present embodiment (hereinafter sometimes simply referred to as the "nucleic acid detection kit of the present embodiment") comprises one or more detection probes and one or more capture probes.
- a detection probe consists of a probe with a labeling substance as described above. That is, the detection probe comprises a nucleotide sequence that does not hybridize to mammalian nucleic acids under stringent conditions, and comprises a nucleic acid comprising a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 673, and a labeling substance.
- labeling substances include those exemplified in the above "probe", and among them, fluorescent labeling (fluorochrome) is preferable.
- the two or more types of detection probes when two or more types of detection probes are provided, the two or more types of detection probes preferably have different labeling substances.
- the capture probe has a sequence A complementary to at least a portion of said detection probe and a sequence B complementary to at least a portion of a mammalian target nucleic acid.
- the two or more types of the detection probes do not hybridize to each other under stringent conditions
- the two or more types of the capture probes are provided, the two or more types of the capture probes are The probes do not hybridize to each other under stringent conditions. Thereby, a plurality of target nucleic acids can be detected simultaneously with high accuracy.
- the target nucleic acid is not particularly limited as long as it is derived from mammals, and may be DNA or RNA.
- Mammals include, but are not limited to, humans, chimpanzees and other primates; dogs, cats, rabbits, horses, sheep, goats, cows, pigs, rats (including nude rats), mice (nude mice and skid mice), livestock animals such as hamsters and guinea pigs, pet animals and laboratory animals, etc., but are not limited thereto.
- a human or a mouse is preferable as a mammal from which the target nucleic acid is derived.
- sequence A consists of a sequence complementary to at least part of the detection probe.
- the capture probe, having sequence A, can hybridize with the detection probe under stringent conditions to detect the target nucleic acid.
- the sequence A preferably consists of a sequence complementary to a sequence having a length of about 10 to 50 consecutive bases among the nucleic acids constituting the detection probe.
- the nucleic acids constituting it is particularly preferable that it consists of a sequence complementary to the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 673.
- the length of sequence A can be, for example, 10 to 50 bases, preferably 10 to 30 bases.
- sequence B is a sequence complementary to at least part of the mammalian target nucleic acid. Having the sequence B, the capture probe can hybridize with the target nucleic acid under stringent conditions to capture the target nucleic acid.
- the length of sequence B can be, for example, 10 bases or more and 2000 bases or less, and can be 50 bases or more and 1500 bases or less.
- the nucleic acid that constitutes the capture probe may be DNA or RNA.
- capture probes are not limited to natural nucleic acids, and include artificial nucleic acids such as BNA, ethylene-bridged nucleic acid (ENA), peptide nucleic acid (PNA), glycol nucleic acid (GNA), and threose nucleic acid (TNA). It's okay.
- the nucleic acid detection kit of this embodiment may contain other elements in addition to the detection probe and the capture probe.
- Other components include, for example, detection reagents for labeled substances, sample preparation reagents, diluents, buffers (washing buffers, etc.), instructions for use, and the like.
- the nucleic acid detection kit of this embodiment can be used in a method for simultaneously detecting multiple nucleic acids in mammals. Specifically, it can be used for transcriptome analysis by various ISH methods such as seqFISH, and detection of structural changes in the genome.
- a method for simultaneously detecting a plurality of mammalian nucleic acids is a method using the nucleic acid detection kit, contacting two or more of said capture probes with a mammalian cell or tissue; After removing the unhybridized capture probes by washing, contacting two or more of the detection probes with mammalian cells or tissues; After removing the unhybridized detection probe by washing, detecting the detection probe; including.
- the capture probes and detection probes are diluted in various known buffers and added to mammalian cells or tissues.
- the mammalian cell or tissue may be any cell or tissue derived from the mammals described above, and in the case of mammals including humans, it can be performed in vitro. can be performed in vivo. That is, target cells or tissues may be immobilized, cultured, or functioning in vivo.
- Contact between the capture probes and mammalian cells or tissues is carried out by incubating at 30° C. or higher and 45° C. or lower (preferably about 37° C.) for 24 hours or longer and 60 hours or shorter (preferably 36 hours or longer and 48 hours or shorter). can be done.
- Contact between the detection probe and mammalian cells or tissues can be carried out by incubating at 30°C or higher and 45°C or lower (preferably about 42°C) for 10 hours or more and 24 hours or less (preferably about 16 hours).
- the capture probe and detection probe are washed once or more using a known washing buffer.
- a detection method for the detection probe can be appropriately selected according to the type of labeling substance contained in the detection probe. Specifically, for example, when the labeling substance is a fluorescent substance, a method of detection using a confocal microscope may be used. Therefore, according to the method of simultaneously detecting a plurality of mammalian nucleic acids of the present embodiment, a large number of various mammalian nucleic acids can be detected simultaneously.
- Example 1 (Preparation of probe) The inventor prepared a probe library consisting of random base sequences designed by an original algorithm. Next, for the base sequence of each probe in the prepared probe library, the sequence identity with the whole genome sequence of human and mouse is determined by Web version BLAST (human, mouse) using Genomic + transcript databases, and Refseq transcript data is used as an index. Bowtie2 (human, mouse, zebrafish, Xenopus laevis, and rat) was used to screen probes consisting of nucleotide sequences not present in the entire genome sequences of human, mouse, zebrafish, Xenopus, and rat.
- SEQ ID NOs: 673 types of probes consisting of base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 673 were obtained as probes consisting of base sequences that do not exist in the entire human and mouse genome sequences.
- Example 2 (Visualization test of mRNA in mouse ES cells by smFISH method using three types of probes)
- a visualization test of mRNA in mouse ES cells was performed. As fluorescent substances, Alexa647 was bound to ReadOut-12, Cy3B was bound to ReadOut-85, and Alexa488 was bound to ReadOut-170.
- the procedure of the smFISH method was performed by a known method. Specifically, first, mouse ES cells were previously cultured on a slide glass, and the cells were fixed with 4 v/v% paraformaldehyde at room temperature for 10 minutes. The samples were then added with 70% ethanol and incubated for 1 hour. After that, probes shown in Tables 2-1 to 4-2 below targeting Dnmt3b mRNA, Adgrg6 mRNA, and Vgf mRNA were added to the sample as capture probes, and incubated at 37°C for 36 hours or more and 48 hours or less. and hybridized.
- the probe of this embodiment consists of a base sequence that does not exist in the genome of mammals, and can be used to simultaneously detect a large number of various mammalian nucleic acids.
Abstract
プローブは、哺乳動物の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない塩基配列からなり、配列番号１～６７３のいずれかに表される塩基配列を含む配列からなる。プローブセットは、２種以上の、前記プローブを備え、２種以上の前記プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない。
Description
本発明は、プローブ、プローブセット、及び哺乳動物の核酸検出キットに関する。
本願は、２０２１年７月８日に、日本に出願された特願２０２１－１１３２６０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０２１年７月８日に、日本に出願された特願２０２１－１１３２６０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
近年、遺伝子変異の発現変化と、癌、糖尿病及び心臓疾患等の複雑な疾患との関連性を理解するために、トランスクリプトーム解析の重要性が増している。トランスクリプトーム解析の手法の一つである、蛍光Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ（ＦＩＳＨ）法では、組織や細胞において、特定の核酸の発現分布や発現量を蛍光によって検出することができる。
ＦＩＳＨ法の中でも、ｓｅｑＦＩＳＨ（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法は、空間的な局在位置を保持しながら、単一細胞内で直接多くのＲＮＡ転写産物を同定できる技術である。ｓｅｑＦＩＳＨ法では、まず、各転写産物の逐次バーコードを読み取るために、ハイブリダイゼーションの連続ラウンドにより、転写産物を蛍光プローブで標識し、次いで、逐次バーコードをデコードして、単一細胞内に存在するＲＮＡ転写産物を一意的に識別する（例えば、特許文献１等参照）。しかしながら、ｓｅｑＦＩＳＨ法において、光学分解能の限界と単一細胞内での転写産物の密度が課題となっている。これらの課題を解決し得る方法として、標準的な共焦点顕微鏡を使用して、単一細胞内の１万個の遺伝子のｍＲＮＡを高精度で回折限界以下の分解能で画像化できる、ｓｅｑＦＩＳＨ＋法が開発されている（例えば、非特許文献１等参照）。
特許文献１や非特許文献１等に記載のＦＩＳＨ法により、哺乳動物の核酸を検出する際には、哺乳動物のゲノムに存在しない配列からなるプローブを開発する必要がある。このようなプローブの設計は極めて困難であり、現在公開されているプローブも数十種類程度のみである。そのため、同時検出可能な遺伝子数は２０～３０程度に限定されている。
Eng C-H L., et al., "Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH+.", Nature, Vol. 568, Issue 7751, pp. 235-239, 2019.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、哺乳動物のゲノムに存在しない塩基配列からなるプローブを提供する。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） 哺乳動物の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない塩基配列からなり、
配列番号１～６７３のいずれかに表される塩基配列を含む配列からなる、プローブ。
（２） 前記哺乳動物がヒト及びマウスからなる群より選ばれる１種以上の動物である、（１）に記載のプローブ。
（３） 前記哺乳動物が、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、及びラットからなる群より選ばれる１種以上の動物であって、
配列番号６、２２、３１、４２、４３、５４、６１、７１、８６～８８、９１、１０９、１１４、１１８、１２５、１２８、１３４、１４０、１４１、１４６、１４９、１５１、１５７、１６７、２０１、２１３、２１４、２１８、２２０、２２１、２２８、２３０、２３４、２４１、２４２、２４８、２５３、２８３、２８９、２９４、２９８、３０３、３０５、３１０、３２７、３４９、３６３、３６５、３７５、３７８、３８５、３９４、４００、４０６、４１２、４１６、４１８、４２０、４２１、４３０、４３１、４３９、４７５、５０１、５２３、５３２、５４８、５５７、５６３、５８５、５８９、５９３、６０８、６２０、６３１、６４２、６４６のいずれかに表される塩基配列を含む配列からなる、（１）又は（２）に記載のプローブ。
（４） 標識物質を更に有する、（１）～（３）のいずれか一つに記載のプローブ。
（５） ２種以上の、（１）～（４）のいずれか一つに記載のプローブを備え、
２種以上の前記プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない、プローブセット。
（６） （４）に記載のプローブからなる検出プローブを１種以上と、
前記検出プローブの少なくとも一部と相補的な配列Ａと、哺乳動物の標的核酸の少なくとも一部と相補的な配列Ｂと、を有する捕捉プローブを１種以上と、
を備え、
前記検出プローブを２種以上備える場合に、２種以上の前記検出プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズせず、且つ、
前記捕捉プローブを２種以上備える場合に、２種以上の前記捕捉プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない、哺乳動物の核酸検出キット。
（７） （６）に記載の哺乳動物の核酸検出キットを用いる、哺乳動物の複数の核酸を同時に検出する方法であって、
２種以上の前記捕捉プローブを哺乳動物の細胞又は組織と接触させることと、
洗浄によりハイブリダイズしていない前記捕捉プローブを除去した後、２種以上の前記検出プローブを哺乳動物の細胞又は組織と接触させることと、
洗浄によりハイブリダイズしていない前記検出プローブを除去した後、前記検出プローブを検出することと、
を含む、方法。
（１） 哺乳動物の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない塩基配列からなり、
配列番号１～６７３のいずれかに表される塩基配列を含む配列からなる、プローブ。
（２） 前記哺乳動物がヒト及びマウスからなる群より選ばれる１種以上の動物である、（１）に記載のプローブ。
（３） 前記哺乳動物が、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、及びラットからなる群より選ばれる１種以上の動物であって、
配列番号６、２２、３１、４２、４３、５４、６１、７１、８６～８８、９１、１０９、１１４、１１８、１２５、１２８、１３４、１４０、１４１、１４６、１４９、１５１、１５７、１６７、２０１、２１３、２１４、２１８、２２０、２２１、２２８、２３０、２３４、２４１、２４２、２４８、２５３、２８３、２８９、２９４、２９８、３０３、３０５、３１０、３２７、３４９、３６３、３６５、３７５、３７８、３８５、３９４、４００、４０６、４１２、４１６、４１８、４２０、４２１、４３０、４３１、４３９、４７５、５０１、５２３、５３２、５４８、５５７、５６３、５８５、５８９、５９３、６０８、６２０、６３１、６４２、６４６のいずれかに表される塩基配列を含む配列からなる、（１）又は（２）に記載のプローブ。
（４） 標識物質を更に有する、（１）～（３）のいずれか一つに記載のプローブ。
（５） ２種以上の、（１）～（４）のいずれか一つに記載のプローブを備え、
２種以上の前記プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない、プローブセット。
（６） （４）に記載のプローブからなる検出プローブを１種以上と、
前記検出プローブの少なくとも一部と相補的な配列Ａと、哺乳動物の標的核酸の少なくとも一部と相補的な配列Ｂと、を有する捕捉プローブを１種以上と、
を備え、
前記検出プローブを２種以上備える場合に、２種以上の前記検出プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズせず、且つ、
前記捕捉プローブを２種以上備える場合に、２種以上の前記捕捉プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない、哺乳動物の核酸検出キット。
（７） （６）に記載の哺乳動物の核酸検出キットを用いる、哺乳動物の複数の核酸を同時に検出する方法であって、
２種以上の前記捕捉プローブを哺乳動物の細胞又は組織と接触させることと、
洗浄によりハイブリダイズしていない前記捕捉プローブを除去した後、２種以上の前記検出プローブを哺乳動物の細胞又は組織と接触させることと、
洗浄によりハイブリダイズしていない前記検出プローブを除去した後、前記検出プローブを検出することと、
を含む、方法。
上記態様のプローブによれば、哺乳動物のゲノムに存在しない塩基配列からなるプローブを提供することができる。
＜プローブ＞
本実施形態のプローブは、哺乳動物の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない塩基配列からなり、配列番号１～６７３のいずれかに表される塩基配列を含む配列からなる。
本実施形態のプローブは、哺乳動物の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない塩基配列からなり、配列番号１～６７３のいずれかに表される塩基配列を含む配列からなる。
発明者は、後述する実施例に示すように、独自のアルゴリズムにより設計したプローブライブラリから、哺乳動物（特に、ヒト及びマウス）の全ゲノム配列に存在しない塩基配列からなるプローブをスクリーニングして本発明を完成するに至った。配列番号１～６７３に表される塩基配列は、それぞれ１５塩基からなり、いずれもヒト及びマウスの全ゲノム配列に存在しない塩基配列であり、発明者が今回初めて見出したものである。
また、後述する実施例に示すように、上記６７３種類のプローブのうち、配列番号６、２２、３１、４２、４３、５４、６１、７１、８６～８８、９１、１０９、１１４、１１８、１２５、１２８、１３４、１４０、１４１、１４６、１４９、１５１、１５７、１６７、２０１、２１３、２１４、２１８、２２０、２２１、２２８、２３０、２３４、２４１、２４２、２４８、２５３、２８３、２８９、２９４、２９８、３０３、３０５、３１０、３２７、３４９、３６３、３６５、３７５、３７８、３８５、３９４、４００、４０６、４１２、４１６、４１８、４２０、４２１、４３０、４３１、４３９、４７５、５０１、５２３、５３２、５４８、５５７、５６３、５８５、５８９、５９３、６０８、６２０、６３１、６４２、６４６に表される塩基配列は、それぞれ１５塩基からなり、いずれもヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、及びラットの全ゲノム配列に存在しない塩基配列であり、発明者が今回初めて見出したものである。
「プローブ」とは、核酸を検出するために用いられる分子又は分子複合体を意味する。本実施形態のプローブは、哺乳動物の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない塩基配列からなることから、後述するように、哺乳動物の核酸を検出する際に、捕捉プローブに結合し、哺乳動物の核酸を検出するための検出プローブとして好適に用いられる。すなわち、配列番号１～６７３のいずれかに表される塩基配列を含む配列からなるプローブは、ヒト又はマウスの核酸を検出するための検出プローブとして好適に用いられる。また、配列番号６、２２、３１、４２、４３、５４、６１、７１、８６～８８、９１、１０９、１１４、１１８、１２５、１２８、１３４、１４０、１４１、１４６、１４９、１５１、１５７、１６７、２０１、２１３、２１４、２１８、２２０、２２１、２２８、２３０、２３４、２４１、２４２、２４８、２５３、２８３、２８９、２９４、２９８、３０３、３０５、３１０、３２７、３４９、３６３、３６５、３７５、３７８、３８５、３９４、４００、４０６、４１２、４１６、４１８、４２０、４２１、４３０、４３１、４３９、４７５、５０１、５２３、５３２、５４８、５５７、５６３、５８５、５８９、５９３、６０８、６２０、６３１、６４２、６４６のいずれかに表される塩基配列を含む配列からなるプローブは、ヒト及びマウスからなる群より選ばれる１種以上の哺乳動物の核酸を検出するための検出プローブとして好適に用いられる。
「ストリンジェントな条件下」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件下として、より具体的には、例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム，０．３Ｍ クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５℃以上７０℃以下で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件が挙げられる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
本実施形態のプローブを構成する核酸は、例えば、１０塩基以上５０塩基以下の長さとすることができ、１０塩基以上３０塩基以下の長さであることが好ましい。
本実施形態のプローブを構成する核酸は、配列番号１～６７３のいずれかに表される塩基配列に加えて、その他の配列を更に含んでもよいが、配列番号１～６７３のいずれかに表される塩基配列のみからなることが好ましい。
「核酸」とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味し、核酸アナログ等も含まれる。
本実施形態のプローブを構成する核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。また、本実施形態のプローブは、天然核酸からなるものに限定されず、ＢＮＡ、エチレン－架橋化核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）等の人工核酸を含んでもよい。
本実施形態のプローブを構成する核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。また、本実施形態のプローブは、天然核酸からなるものに限定されず、ＢＮＡ、エチレン－架橋化核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）等の人工核酸を含んでもよい。
本実施形態のプローブは、標識物質を更に有してもよい。すなわち、本実施形態のプローブは、哺乳動物の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない塩基配列からなり、配列番号１～６７３のいずれかに表される塩基配列を含む配列からなる核酸と、標識物質と、から構成されている。
「標識物質」とは、化学的手段又は物理的手段により検出可能なシグナルを直接的又は間接的に生成する物質を意味する。標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ等の酵素標識；カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６－カルボキシ－４’,５’－ジクロロ２’,７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、５'－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト（ＨＥＸ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等の蛍光標識；ヨウ素１２５等の放射性同位体標識；ルテニウム錯体等の電気化学発光標識；金属ナノ粒子等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい標識物質としては、蛍光標識（蛍光色素）が挙げられる。
本実施形態のプローブにおいて、標識物質は、当該プローブ中の核酸の５’末端又は３’末端に直接的に、又は、リンカー等を介して間接的に結合している。
「リンカー」とは、２つの物質を連結する連結部分、又は２つの物質を連結するために用いられる分子を意味する。
「リンカー」とは、２つの物質を連結する連結部分、又は２つの物質を連結するために用いられる分子を意味する。
＜プローブセット＞
本実施形態のプローブセットは、２種以上の、上述したプローブを備え、２種以上の前記プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない。
本実施形態のプローブセットは、２種以上の、上述したプローブを備え、２種以上の前記プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない。
本実施形態のプローブセットにおいて、２種以上の前記プローブが互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないことで、目的とする複数の核酸を高精度に同時に検出することができる。
本実施形態のプローブセットは、上述したプローブを２種以上、好ましくは１０種以上、より好ましくは５０種以上、さらに好ましくは１００種以上、特に好ましくは２００種以上、最も好ましくは２４０種以上備える。本実施形態のプローブセットが、上述したプローブを上記下限値以上の種類備えることで、より多くの哺乳動物の核酸を同時に検出することができる。特に２４０種以上の上述したプローブを備える場合には、特定の哺乳動物（特に、ヒト又はマウス）の全ｍＲＮＡのｓｍＦＩＳＨによる同時検出が可能となる。
本実施形態のプローブセットにおいて、前記プローブが標識物質を有する場合に、２種以上の前記プローブは、互いに異なる標識物質を有することが好ましい。
＜哺乳動物の核酸検出キット＞
本実施形態の哺乳動物の核酸検出キット（以下、単に「本実施形態の核酸検出キット」と称する場合がある）は、検出プローブを１種以上と、捕捉プローブを１種以上と、を備える。
本実施形態の哺乳動物の核酸検出キット（以下、単に「本実施形態の核酸検出キット」と称する場合がある）は、検出プローブを１種以上と、捕捉プローブを１種以上と、を備える。
検出プローブは、上述した標識物質を有するプローブからなる。すなわち、検出プローブは、哺乳動物の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない塩基配列からなり、配列番号１～６７３のいずれかに表される塩基配列を含む配列からなる核酸と、標識物質と、から構成されている。
標識物質としては、上記「プローブ」において例示されたものが挙げられるが、中でも、蛍光標識（蛍光色素）が好ましい。
標識物質としては、上記「プローブ」において例示されたものが挙げられるが、中でも、蛍光標識（蛍光色素）が好ましい。
また、本実施形態の核酸検出キットにおいて、検出プローブを２種以上備える場合に、２種以上の検出プローブは、互いに異なる標識物質を有することが好ましい。
捕捉プローブは、前記検出プローブの少なくとも一部と相補的な配列Ａと、哺乳動物の標的核酸の少なくとも一部と相補的な配列Ｂと、を有する。
前記検出プローブを２種以上備える場合に、２種以上の前記検出プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズせず、且つ、前記捕捉プローブを２種以上備える場合に、２種以上の前記捕捉プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない。これにより、目的とする複数の核酸を高精度に同時に検出することができる。
本実施形態の核酸検出キットにおいて、標的となる核酸は、哺乳動物に由来するものであれば特に限定されず、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。
哺乳動物としては、以下に限定されないが、例えば、ヒト、チンパンジー及びその他の霊長類；イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ラット（ヌードラットも包含する）、マウス（ヌードマウス及びスキッドマウスも包含する）、ハムスター、モルモット等の家畜動物、愛玩動物及び実験用動物等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、標的核酸の由来となる哺乳動物としては、ヒト又はマウスが好ましい。
［捕捉プローブ］
捕捉プローブにおいて、配列Ａは、検出プローブの少なくとも一部と相補的な配列からなる。捕捉プローブは、配列Ａを有することで検出プローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズして、標的核酸を検出することができる。
捕捉プローブにおいて、配列Ａは、検出プローブの少なくとも一部と相補的な配列からなる。捕捉プローブは、配列Ａを有することで検出プローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズして、標的核酸を検出することができる。
配列Ａは、検出プローブに対する結合安定性の観点から、検出プローブを構成する核酸のうち、連続する１０塩基以上５０塩基以下程度の長さの配列と相補的な配列からなることが好ましく、検出プローブを構成する核酸のうち、配列番号１～６７３のいずれかに表される塩基配列と相補的な配列からなることが特に好ましい。
配列Ａの長さは、例えば、１０塩基以上５０塩基以下とすることができ、１０塩基以上３０塩基以下であることが好ましい。
捕捉プローブにおいて、配列Ｂは、哺乳動物の標的核酸の少なくとも一部と相補的な配列である。捕捉プローブは、配列Ｂを有することで、標的核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズして、標的核酸を捕捉することができる。
配列Ｂの長さは、例えば、１０塩基以上２０００塩基以下とすることができ、５０塩基以上１５００塩基以下とすることができる。
捕捉プローブを構成する核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。また、捕捉プローブは、天然核酸からなるものに限定されず、ＢＮＡ、エチレン－架橋化核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）等の人工核酸を含んでもよい。
［その他の要素］
本実施形態の核酸検出キットは、上記検出プローブ及び上記捕捉プローブに加えて、他の要素を含んでいてもよい。他の要素としては、例えば、標識物質の検出試薬、試料調製試薬、希釈液、バッファー類（洗浄バッファー等）、使用説明書等が挙げられる。
本実施形態の核酸検出キットは、上記検出プローブ及び上記捕捉プローブに加えて、他の要素を含んでいてもよい。他の要素としては、例えば、標識物質の検出試薬、試料調製試薬、希釈液、バッファー類（洗浄バッファー等）、使用説明書等が挙げられる。
本実施形態の核酸検出キットは、哺乳動物の複数の核酸を同時に検出する方法に利用することができる。具体的には、ｓｅｑＦＩＳＨ等の各種ＩＳＨ法によるトランスクリプトーム解析や、ゲノムの構造変化の検出に用いることができる。
哺乳動物の複数の核酸を同時に検出する方法は、上記核酸検出キットを用い方法であって、
２種以上の前記捕捉プローブを哺乳動物の細胞又は組織と接触させることと、
洗浄によりハイブリダイズしていない前記捕捉プローブを除去した後、２種以上の前記検出プローブを哺乳動物の細胞又は組織と接触させることと、
洗浄によりハイブリダイズしていない前記検出プローブを除去した後、前記検出プローブを検出することと、
を含む。
２種以上の前記捕捉プローブを哺乳動物の細胞又は組織と接触させることと、
洗浄によりハイブリダイズしていない前記捕捉プローブを除去した後、２種以上の前記検出プローブを哺乳動物の細胞又は組織と接触させることと、
洗浄によりハイブリダイズしていない前記検出プローブを除去した後、前記検出プローブを検出することと、
を含む。
捕捉プローブ及び検出プローブは、公知の各種緩衝液に希釈して、哺乳動物の細胞又は組織に添加する。哺乳動物の細胞又は組織は、上述した哺乳動物に由来する細胞又は組織であればよく、ヒトを含む哺乳動物の場合にはｉｎ ｖｉｔｒｏにて行うことができ、ヒトを含まない哺乳動物の場合にはｉｎ ｖｉｖｏにて行うことができる。すなわち、対象となる細胞又は組織は、固定化されたものであってもよく、培養された状態のものであってもよく、生体内で機能している状態のものであってもよい。
捕捉プローブと哺乳動物の細胞又は組織の接触は、３０℃以上４５℃以下（好ましくは３７℃程度）で、２４時間以上６０時間以下（好ましくは３６時間以上４８時間以下）インキュベートすることで行うことができる。
検出プローブと哺乳動物の細胞又は組織の接触は、３０℃以上４５℃以下（好ましくは４２℃程度）で１０時間以上２４時間以下（好ましくは１６時間程度）インキュベートすることで行うことができる。
捕捉プローブ及び検出プローブの洗浄は、公知の洗浄バッファーを用いて１回以上行う。
検出プローブの検出方法は、検出プローブが有する標識物質の種類に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、標識物質が蛍光物質である場合には、共焦点顕微鏡を用いて検出する方法等が挙げられる。
よって、本実施形態の哺乳動物の複数の核酸を同時に検出する方法によれば、哺乳動物の各種核酸を同時に多数検出することができる。
よって、本実施形態の哺乳動物の複数の核酸を同時に検出する方法によれば、哺乳動物の各種核酸を同時に多数検出することができる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（プローブの作製）
発明者は、独自のアルゴリズムで設計したランダムな塩基配列からなるプローブライブラリを作製した。次いで、作製したプローブライブラリの各プローブの塩基配列について、ヒト及びマウスの全ゲノム配列との配列同一性をＧｅｎｏｍｉｃ＋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｄａｔａｂａｓｅｓを用いたＷｅｂ版ＢＬＡＳＴ（ヒト、マウス）、及び、Ｒｅｆｓｅｑ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｄａｔａをｉｎｄｅｘに用いたＢｏｗｔｉｅ２（ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、及びラット）により解析し、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、及びラットの全ゲノム配列に存在しない塩基配列からなるプローブをスクリーニングした。
（プローブの作製）
発明者は、独自のアルゴリズムで設計したランダムな塩基配列からなるプローブライブラリを作製した。次いで、作製したプローブライブラリの各プローブの塩基配列について、ヒト及びマウスの全ゲノム配列との配列同一性をＧｅｎｏｍｉｃ＋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｄａｔａｂａｓｅｓを用いたＷｅｂ版ＢＬＡＳＴ（ヒト、マウス）、及び、Ｒｅｆｓｅｑ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｄａｔａをｉｎｄｅｘに用いたＢｏｗｔｉｅ２（ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、及びラット）により解析し、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、及びラットの全ゲノム配列に存在しない塩基配列からなるプローブをスクリーニングした。
その結果、ヒト及びマウスの全ゲノム配列に存在しない塩基配列からなるプローブとして、配列番号１～６７３に表される塩基配列からなる、６７３種類のプローブを得た。
これらプローブのうち、配列番号６、２２、３１、４２、４３、５４、６１、７１、８６～８８、９１、１０９、１１４、１１８、１２５、１２８、１３４、１４０、１４１、１４６、１４９、１５１、１５７、１６７、２０１、２１３、２１４、２１８、２２０、２２１、２２８、２３０、２３４、２４１、２４２、２４８、２５３、２８３、２８９、２９４、２９８、３０３、３０５、３１０、３２７、３４９、３６３、３６５、３７５、３７８、３８５、３９４、４００、４０６、４１２、４１６、４１８、４２０、４２１、４３０、４３１、４３９、４７５、５０１、５２３、５３２、５４８、５５７、５６３、５８５、５８９、５９３、６０８、６２０、６３１、６４２、及び６４６に表される塩基配列からなる、７８種類のプローブはヒト及びマウスに加えて、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、及びラットの全ゲノム配列にも存在しないプローブであった。
これらプローブのうち、配列番号６、２２、３１、４２、４３、５４、６１、７１、８６～８８、９１、１０９、１１４、１１８、１２５、１２８、１３４、１４０、１４１、１４６、１４９、１５１、１５７、１６７、２０１、２１３、２１４、２１８、２２０、２２１、２２８、２３０、２３４、２４１、２４２、２４８、２５３、２８３、２８９、２９４、２９８、３０３、３０５、３１０、３２７、３４９、３６３、３６５、３７５、３７８、３８５、３９４、４００、４０６、４１２、４１６、４１８、４２０、４２１、４３０、４３１、４３９、４７５、５０１、５２３、５３２、５４８、５５７、５６３、５８５、５８９、５９３、６０８、６２０、６３１、６４２、及び６４６に表される塩基配列からなる、７８種類のプローブはヒト及びマウスに加えて、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、及びラットの全ゲノム配列にも存在しないプローブであった。
［実施例２］
（３種のプローブを用いたｓｍＦＩＳＨ法によるマウスＥＳ細胞内のｍＲＮＡの可視化試験）
次いで、上記実施例１で得られたプローブの内、以下の表１に示す３種類のプローブを検出プローブとして用いて、マウスＥＳ細胞内のｍＲＮＡの可視化試験を行った。蛍光物質として、ＲｅａｄＯｕｔ－１２にはＡｌｅｘａ６４７を、ＲｅａｄＯｕｔ－８５にはＣｙ３Ｂを、ＲｅａｄＯｕｔ－１７０にはＡｌｅｘａ４８８を、それぞれ結合させたものを準備した。
（３種のプローブを用いたｓｍＦＩＳＨ法によるマウスＥＳ細胞内のｍＲＮＡの可視化試験）
次いで、上記実施例１で得られたプローブの内、以下の表１に示す３種類のプローブを検出プローブとして用いて、マウスＥＳ細胞内のｍＲＮＡの可視化試験を行った。蛍光物質として、ＲｅａｄＯｕｔ－１２にはＡｌｅｘａ６４７を、ＲｅａｄＯｕｔ－８５にはＣｙ３Ｂを、ＲｅａｄＯｕｔ－１７０にはＡｌｅｘａ４８８を、それぞれ結合させたものを準備した。
ｓｍＦＩＳＨ法の手順としては公知の手法により行った。具体的には、まず、マウスＥＳ細胞を予めスライドグラス上で培養し、４ｖ／ｖ％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間細胞を固定した。次いで、サンプルに、７０％エタノールを添加し１時間インキュベートした。その後、サンプルに、Ｄｎｍｔ３ｂ ｍＲＮＡ、Ａｄｇｒｇ６ ｍＲＮＡ、及びＶｇｆ ｍＲＮＡを標的とする、以下の表２－１～表４－２に示すプローブを捕捉プローブとして添加し、３７℃で３６時間以上４８時間以下インキュベートしてハイブリダイズさせた。
次いで、洗浄によりハイブリダイズしていない捕捉プローブを洗い流した後、上記表１に示す３種類のプローブを検出プローブとして添加し、４２℃で１６時間インキュベートしてハイブリッドダイズさせた。次いで、洗浄によりハイブリダイズしていない検出プローブを洗い流した後、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ８）を用いて観察した。結果を図１（対物レンズ（ＨＣ ＰＬ ＡＰＯ １００× ＮＡ １．４７）を用いて撮影）に示す。
図１に示すように、上記３種の検出プローブを用いることで、マウスＥＳ細胞内のｍＲＮＡを可視化できることが確認された。
本実施形態のプローブは、哺乳動物のゲノムに存在しない塩基配列からなり、哺乳動物の各種核酸を同時に多数検出するために利用することができる。
Claims (7)
- 哺乳動物の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない塩基配列からなり、
配列番号１～６７３のいずれかに表される塩基配列を含む配列からなる、プローブ。 - 前記哺乳動物がヒト及びマウスからなる群より選ばれる１種以上の動物である、請求項１に記載のプローブ。
- 前記哺乳動物が、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、及びラットからなる群より選ばれる１種以上の動物であって、
配列番号６、２２、３１、４２、４３、５４、６１、７１、８６～８８、９１、１０９、１１４、１１８、１２５、１２８、１３４、１４０、１４１、１４６、１４９、１５１、１５７、１６７、２０１、２１３、２１４、２１８、２２０、２２１、２２８、２３０、２３４、２４１、２４２、２４８、２５３、２８３、２８９、２９４、２９８、３０３、３０５、３１０、３２７、３４９、３６３、３６５、３７５、３７８、３８５、３９４、４００、４０６、４１２、４１６、４１８、４２０、４２１、４３０、４３１、４３９、４７５、５０１、５２３、５３２、５４８、５５７、５６３、５８５、５８９、５９３、６０８、６２０、６３１、６４２、６４６のいずれかに表される塩基配列を含む配列からなる、請求項１又は２に記載のプローブ。 - 標識物質を更に有する、請求項１又は２に記載のプローブ。
- ２種以上の、請求項１又は２に記載のプローブを備え、
２種以上の前記プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない、プローブセット。 - 請求項４に記載のプローブからなる検出プローブを１種以上と、
前記検出プローブの少なくとも一部と相補的な配列Ａと、哺乳動物の標的核酸の少なくとも一部と相補的な配列Ｂと、を有する捕捉プローブを１種以上と、
を備え、
前記検出プローブを２種以上備える場合に、２種以上の前記検出プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズせず、且つ、
前記捕捉プローブを２種以上備える場合に、２種以上の前記捕捉プローブは互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない、哺乳動物の核酸検出キット。 - 請求項６に記載の哺乳動物の核酸検出キットを用いる、哺乳動物の複数の核酸を同時に検出する方法であって、
２種以上の前記捕捉プローブを哺乳動物の細胞又は組織と接触させることと、
洗浄によりハイブリダイズしていない前記捕捉プローブを除去した後、２種以上の前記検出プローブを哺乳動物の細胞又は組織と接触させることと、
洗浄によりハイブリダイズしていない前記検出プローブを除去した後、前記検出プローブを検出することと、
を含む、方法。
Priority Applications (2)
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-
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ENG C-H L. ET AL.: "Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH+", NATURE, vol. 568, 2019, pages 235 - 239, XP036755257, DOI: 10.1038/s41586-019-1049-y |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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