BR112016012264B1 - Sonda de ácido nucleico para ligação a um fragmento de ácido nucleico alvo de fita simples, conjunto de sondas e composição - Google Patents

Sonda de ácido nucleico para ligação a um fragmento de ácido nucleico alvo de fita simples, conjunto de sondas e composição Download PDF

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Abstract

SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO PARA LIGAÇÃO A UM FRAGMENTO DE ÁCIDO NUCLEICO ALVO DE FITA SIMPLES, CONJUNTO DE SONDAS E COMPOSIÇÃO, BEM COMO MÉTODO DE TESTE DE UMA AMOSTRA PARA A PRESENÇA DE UM FRAGMENTO DE ÁCIDO NUCLEICO ALVO. É aqui proporcionado, entre outras coisas, um método de processamento de uma amostra de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o método compreende a) a hibridização de uma amostra compreendendo um fragmento alvo a uma sonda de ácido nucleico compreendendo: i. uma sequência de cabeça e uma sequência de cauda, em que as sequências de cabeça e de cauda estão nas extremidades de uma primeira molécula de oligonucleotídeo; e ii. uma sequência splint que compreende, em ordem: uma sequência flanqueadora a montante, que é complementar à sequência de cabeça; uma sequência complementar alvo que é complementar com o fragmento alvo; e uma sequência flanqueadora a jusante que é complementar à sequência de cauda; produzindo assim um produto de hibridização, em que as extremidades do fragmento alvo são ligáveis adjacentes às extremidades das sequências de cabeça e da cauda da primeira molécula de oligonucleotídeo; e b) ligando as extremidades do fragmento alvo para as extremidades das sequências de cabeça e da cauda da (...).

Description

REFERÊNCIA CRUZADA
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido UK N.°: 1321191.7, depositado em 2 de Dezembro, de 2013, cujo pedido é aqui incorporado por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção se refere a sondas para a detecção de sequências de ácidos nucleicos específicas em amostras biológicas, em particular as sondas para utilização em métodos multiplex de detecção de múltiplas sequências específicas em paralelo, e aos métodos em que essas sondas são utilizadas para detectar fragmentos de ácido nucleico. Em particular, a presente divulgação se refere aos fragmentos de DNA de direcionamento de cromossomos específicos para análise a jusante.
ANTECEDENTES
[003] genoma haploide humano contém 3 bilhões de pares de bases empacotados em 23 cromossomos, e o genoma diploide tem 6 bilhões de pares de bases em 23 pares de cromossomos. A rapidez e a comodidade da tecnologia de sequenciamento moderno permitem que muitas perguntas de diagnóstico sejam abordadas o sequenciamento de alto rendimento de todo o genoma de um indivíduo ou a quantidade total de DNA em uma amostra. No entanto, para muitas aplicações de diagnóstico de DNA, é apenas necessário investigar um subconjunto do genoma, focando na região ou regiões que se sabe estarem associadas com os distúrbios particulares sob investigação.
[004] Um número de técnicas tem sido descrito para reduzir a complexidade do genoma, antes da análise. Sempre que é necessária apenas uma única região curta do genoma a ser analisada, isto pode ser feito utilizando PCR simples para amplificar a sequência utilizando iniciadores para as regiões conhecidas em ambos os lados. No entanto, quando se deseja amplificar muitas regiões de uma amostra para a análise genômica, artefatos de amplificação podem surgir como resultado de execução de várias amplificações diferentes juntas na mesma mistura de reação.
[005] WO2003/044216 (Parallele Bioscience, Inc.) e US20090004701A1 (Malek Faham) descreveram um método de amplificação multiplex de ácidos nucleicos alvo, em que os iniciadores oligonucleotídicos comuns foram ligados aos sítios internos para os fragmentos de ácido nucleico de fita simples. Os locais de iniciação de síntese comuns foram acrescentados a cada um de uma pluralidade de diferentes sequências alvo para permitir a sua amplificação estequiométrica.
[006] WO2005/111236 (Olink AB) também descreveu um método para identificação de sequências do genoma humano por amplificação de sequências alvo específicas. O método envolveu fragmentar a amostra genômica em fragmentos com, pelo menos, uma sequência final definida. Construtos seletores, todos compreendendo um motivo par de iniciadores, foram colocados em contato com os fragmentos. Após a ligação, as sequências alvo selecionadas foram amplificadas em paralelo, utilizando um iniciador específico de pares para o motivo iniciador-par comum para os seletores. Os construtos seletores descritos em WO2005/111236 tinham um longo oligonucleotídeo hibridizado com um oligonucleotídeo curto, cada construto seletor possuindo uma ou duas extremidades protuberantes complementares a uma sequência de extremidade definida de um fragmento contendo a sequência alvo. Contatar os seletores com os fragmentos alvo resultou na hibridização do fragmento alvo entre extremidades protuberantes do seletor ou seletores. No caso de um seletor único com duas extremidades protuberantes esta hibridização produziu um construto circularizado. No caso de um par de seletores cada um com uma extremidade protuberante formou um construto linear. A ligação e sequenciamento dos construtos seletores contendo os fragmentos alvos permitiram que a sequência alvo fosse determinada. Uma vez que os construtos seletores hibridizaram apenas para as porções de extremidade do fragmento que contém a sequência alvo (ou a uma porção de extremidade e uma porção interna), o método permitiu a seleção das sequências alvo que diferiam nas porções não hibridizantes, para que cada molécula seletora pudesse hibridizar com uma variedade de diferentes sequências alvo. A identidade exata do alvo foi, em seguida, determinada por amplificação e sequenciamento dos construtos. WO2005/111236 propôs usar os seletores em métodos de análise de variabilidade genética ou para medições no número de cópias de DNA.
[007] GB2492042 descreve uma variação do método seletor, no qual os fragmentos foram contatados com uma sonda parcialmente de fita dupla compreende um oligonucleotídeo seletor e, pelo menos, um vetor de oligonucleotídeo. O oligonucleotídeo seletor continha duas regiões não adjacentes específicas para o fragmento alvo e uma região específica não alvo que compreendia pelo menos dois sítios de ligação para o oligonucleotídeo vetor. O oligonucleotídeo vetor não era complementar à sequência alvo, e incluiu uma sequência de nucleotídeos complementar ao sítio de ligação do vetor no oligonucleotídeo seletor. O oligonucleotídeo vetor também continha elementos para a detecção/enriquecimento. No método, as porções complementares dos oligonucleotídeos sonda foram hibridizadas com o fragmento alvo, seguido por ligação dos oligonucleotídeos vetores e alvo para produzir um fragmento híbrido sonda-alvo, o qual foi, em seguida, detectado.
[008] Um desenvolvimento da tecnologia de seletor foi descrito em WO2011/009941 (Olink Genomics AB), que descreve a ligação de uma extremidade de um fragmento de DNA genômico digerido a uma sonda. Em comparação com as sondas seletores anteriores, que envolvia a ligação às duas regiões do fragmento alvo e em que a sequência a ser isolada foi tipicamente limitada por duas regiões de sequências conhecidas, as sondas em WO2011/009941 foram descritos para utilização em que havia apenas uma região conhecida de sequência. Algumas modalidades das sondas em WO2011/009941 continham elementos de imobilização a uma fase sólida. A ligação do fragmento de ácido nucleico alvo para a sonda resultou em captura estável do fragmento alvo e permitiu a utilização de etapas de lavagem altamente rigorosas, para remover fragmentos não ligados, resultando em uma especificidade alta.
[009] São também conhecidas sondas cadeado. Sondas cadeado são oligonucleotídeos lineares com sequências complementares alvo nas extremidades e uma sequência complementar não alvo entre estas. Quando hibridizadas com a sequência de DNA alvo correta, as duas extremidades da sonda são reunidas inicial à final e podem ser unidas por DNA ligase. A ligação é inibida por pareamentos incorretos na junção de ligação, de modo que a ligação bem-sucedida da sonda cadeado depende de hibridização altamente específica para a sequência alvo, permitindo que a sonda se distinga entre sequências alvo altamente semelhantes e seletivamente feche com cadeado seu alvo exato. Como consequência da natureza helicoidal do DNA de fita dupla, a molécula sonda circularizada é concatenada com a fita de DNA alvo.
[0010] Foi conhecido amplificar as sondas cadeado circularizadas usando replicação em círculo rolante, também conhecido como amplificação de círculo rolante. Replicação por círculo rolante foi descrita em US 5.854.033 (Lizardi). Replicação de círculo rolante é uma amplificação de uma molécula de ácido nucleico circular usando uma DNA polimerase de deslocamento de fita, resultando em grandes moléculas de DNA que contêm repetições em tandem da sequência amplificada. A DNA polimerase catalisa a extensão do iniciador e deslocamento de fita na reação de polimerização de um círculo rolante em processo que procede tanto quanto desejado. Isso resulta em uma amplificação das ordens de grandeza da sequência da sonda circularizada maiores do que um único ciclo de replicação de PCR e outras técnicas de amplificação, em que cada ciclo é limitado a uma duplicação do número de cópias de uma sequência alvo. Amplificação adicional pode ser obtida usando uma cascata de reações de deslocamento de fita.
[0011] Fredriksson et al. (Nucleic Acids Res. 35(7):e47 2007) descreveu "Gene-Collector", um método para a amplificação multiplex de ácidos nucleicos utilizando sondas coletoras que contêm sequências adjacentes complementares às sequências de extremidade do iniciador cognato de produtos de PCR desejados, de modo que a ligação das sondas coletoras para os produtos de PCR une as extremidades dos produtos de PCR em conjunto para formar um círculo de DNA. Amplificação universal é então realizada usando amplificação de círculo rolante para gerar um produto final de concatâmeros de sequências alvo. Este método permite que os amplicons corretos em uma reação de PCR multiplex sejam detectados seletivamente, porque as sequências das extremidades dos amplicons corretos são um par de iniciadores cognato e são circularizadas pela sonda coletora, enquanto que artefatos de PCR combinando um iniciador de um par com um iniciador a partir de outro par não são circularizados.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012] A presente invenção proporciona métodos aperfeiçoados e sondas para a análise de fragmentos de ácido nucleico, tal como DNA genômico fragmentado. Algumas modalidades da invenção referem-se a sondas e a sua utilização em métodos de testar amostras para a presença de fragmentos de ácidos nucleicos alvo de fita simples. Algumas modalidades da invenção referem-se às sondas que compreendem
[0013] um oligonucleotídeo alvo que contém uma sequência complementar alvo, que é o complemento do fragmento alvo e uma sequência flanqueadora adjacente à sequência alvo complementar, e
[0014] uma sequência de oligonucleotídeo tendo uma extremidade livre 5’ ou 3’,
[0015] em que a hibridização entre o fragmento e a sonda molda o fragmento alvo para ligação à extremidade livre 5’ ou 3’ da sequência oligonucleotídica.
[0016] Algumas modalidades da invenção referem-se ainda às sondas que hibridizam ao longo do comprimento de um único fragmento de ácido nucleico de fita simples e ligam a cada extremidade do fragmento. Tais sondas compreendem uma sequência de oligonucleotídeo tendo uma extremidade livre 5’ e uma sequência de oligonucleotídeo tendo uma extremidade livre 3’, para ligação à cada extremidade do fragmento alvo. O produto de ligação é depois detectado, permitindo um direcionamento altamente específico e a detecção dos fragmentos de ácidos nucleicos definidos.
[0017] Um método de acordo com algumas modalidades da invenção pode compreender digerir DNA aos fragmentos com a sequência definida, desnaturação dos fragmentos de DNA resultantes para fragmentos de fita simples (alvos) e a mistura dos alvos com as sondas tal como aqui descrito. A hibridização dos alvos para as sondas produz moldes para ligação para ligar especificamente o alvo com uma sonda correspondente para gerar um círculo ou um produto de ligação linear. Os produtos de ligação podem então ser enriquecidos, por exemplo, por exonucleases ou química de fase sólida, e opcionalmente amplificados por amplificação por círculo rolante, PCR, ou outros métodos de amplificação de DNA.
[0018] Uma das principais vantagens de algumas modalidades da presente invenção encontra-se na análise de uma multiplicidade de fragmentos de DNA em paralelo. Uma multiplicidade de fragmentos de DNA pode ser dirigida especificamente e selecionada para análise a jusante. Isto é particularmente útil para o teste não invasivo pré-natal (NIPT) de DNA fetal livre de células no sangue materno, em que a contagem de milhares de fragmentos de DNA específicos do cromossomo produz uma quantificação muito precisa.
[0019] Em um aspecto, um método para testar uma amostra quanto à presença de um ácido nucleico alvo é fornecido. O método envolve, tipicamente, gerar fragmentos de ácidos nucleicos alvo definidos, o contato da amostra com uma sonda que hibridiza ao longo do comprimento do fragmento alvo e fornece junções ligáveis em ambas as extremidades 3’ e 5' do fragmento, ligando o fragmento alvo à sonda em ambas extremidades 5' e 3’, e, em seguida, a detecção da nova molécula de ácido nucleico formada pelo evento de dupla ligação.
[0020] Um aspecto proporciona um método para testar uma amostra quanto à presença de um ácido nucleico alvo, compreendendo: (i) proporcionar uma amostra de ácido nucleico fragmentado (ii) proporcionar condições de desnaturação em que o fragmento alvo é de fita simples (iii) contatar a amostra com uma sonda de ácido nucleico compreendendo
[0021] um oligonucleotídeo alvo que é mais longo do que o fragmento alvo e que contém uma sequência complementar alvo interna, de modo a que a hibridização entre o oligonucleotídeo alvo e o fragmento alvo forme uma sequência de fita dupla localizada entre as sequências flanqueadoras a montante e a jusante do oligonucleotídeo alvo, e
[0022] sequências inicial e final tendo extremidades livres 5’ e 3’, respectivamente, em que as sequências inicial e da final são complementares às sequências flanqueadoras a montante e a jusante, respectivamente, (iv) proporcionar condições de anelamento sob as quais as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, e o fragmento alvo, se presente, hibridiza com a sequência complementar alvo, posicionando desse modo, as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final (v) proporcionar condições para a ligação de modo a que, se o fragmento alvo está presente, a extremidade 3’ do fragmento alvo está ligada à extremidade 5' da sequência inicial para formar uma primeira junção de ligação, e a extremidade 5’ do fragmento alvo está ligada à extremidade 3’ da sequência final de modo a formar uma segunda junção de ligação, produzindo um produto de dupla ligação que compreende uma fita contínua de ácido nucleico compreendendo as sequências inicial e da final e o fragmento alvo, e (vi) detectar se o produto da dupla ligação está presente,
[0023] em que a detecção do produto da dupla ligação indica a presença do fragmento de alvo na amostra.
[0024] Em contraste com a maioria das outras abordagens de seleção e detecção de DNA, o presente método pode ser particularmente útil quando a totalidade do fragmento de ácido nucleico é pré-definida ou predeterminada - isto é, quando a sequência do fragmento alvo é conhecida de antemão. Em algumas implementações do presente método, o fragmento alvo é o produto de uma fragmentação específica de ácido nucleico, em vez de uma fragmentação aleatória tal como pode ser produzido por meios físicos, tais como corte ou sonicação. A fragmentação específica de ácido nucleico pode ser conseguida utilizando enzimas de restrição, PCR, ou outra definição de extremidade de fragmento direcionada à sequência.
[0025] É desejável que o oligonucleotídeo alvo contate todo o fragmento alvo, para assegurar a ligação específica da sequência alvo precisa. Isto contrasta com as abordagens anteriores, onde as sondas foram concebidas para hibridizar com uma extremidade ou extremidades do fragmento e/ou a uma região interna, mas não se ligam ao longo do comprimento do fragmento alvo. Na verdade, ligação limitada ao fragmento alvo foi um recurso de concepção deliberado em muitas sondas anteriores, uma vez que isto permitiu que fragmentos sejam tidos como alvos e detectados quando a sua sequência foi apenas parcialmente conhecida. Ao especificamente direcionar fragmentos de sequência conhecida - sujeitas à possibilidade de uma pequena variabilidade da sequência resultante de diferentes alelos em uma população, se aplicável - as sondas e métodos do presente método podem permitir uma ligação e detecção precisas do fragmento alvo desejado com um risco muito baixo de resultados falso-positivos.
[0026] A ligação dupla do fragmento de alvo pode ainda contribuir para a elevada especificidade do método. A sonda torna-se ligada à sequência alvo em cada extremidade, isto é, à extremidade 5’ e 3’ do fragmento de fita simples de ácido nucleico. Assim, as extremidades alvo que foram especificamente geradas por fragmentação podem ser especificamente detectadas por ligação específica de sequência com as sequências inicial e da final. A natureza específica da sequência da ligação é conseguida através da exigência para a hibridização de ambos o fragmento alvo e as sequências inicial e final com o oligonucleotídeo alvo, e através da sensibilidade de DNA ligase que é inibida pelos pareamentos incorretos de pares de bases. A hibridização do fragmento alvo ao oligonucleotídeo alvo contribui para a especificidade da ligação, mas, em contraste com as reações de ligação que proporcionam maior seletividade no que diz respeito aos pareamentos incorretos nas extremidades 5' e 3’ do fragmento alvo, a hibridização é desestabilizada no máximo por pareamentos incorretos internos na parte central do alvo.
[0027] oligonucleotídeo alvo atua para ligação de molde do fragmento alvo com as sequências inicial e da final. As sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, que definem um intervalo entre a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final. Os fragmentos alvo hibridizam com a sequência complementar alvo nas lacunas, assim, posicionando as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ das sequências da final. Preferencialmente, a hibridização do fragmento alvo e as sequências inicial e final com a sonda geram duas junções ligáveis perfeitamente emparelhadas. O produto da dupla ligação é, então, uma fita contínua de ácido nucleico compreendendo as sequências inicial e da final e o fragmento alvo.
[0028] Um número de possíveis projetos da sonda é contemplado. Por exemplo, as extremidades 5’ e 3’ para a ligação com o fragmento alvo podem ser fornecidas por sequências inicial e final em dois oligonucleotídeos de estruturas principais separadas, ou por sequências inicial e final nas respectivas extremidades de um único oligonucleotídeo da estrutura principal cujas alças posicionam fragmento alvo entre as extremidades 5’ e 3’.
[0029] No primeiro caso (dois oligonucleotídeos de estrutura principal separados), a ligação do fragmento alvo para os dois oligonucleotídeos de estrutura principal produz uma fita linear de ácido nucleico que compreende o fragmento alvo entre as sequências da inicial e da final.
[0030] No segundo caso (único oligonucleotídeo de estrutura principal em alça), a ligação do fragmento alvo produz um círculo de ácido nucleico compreendendo a sequência alvo entre as sequências da inicial e da final.
[0031] De acordo com outras versões, uma ou ambas as sequências inicial e final podem ser fornecidas no próprio oligonucleotídeo alvo, de modo que o oligonucleotídeo alvo forme uma estrutura em alça, em condições de anelamento. Dependendo da concepção, o produto de dupla ligação, em tais casos, pode ser ou uma molécula de ácido nucleico linear ou uma circular.
[0032] A detecção do produto é dependente do sucesso da ligação do fragmento alvo com as sequências inicial e final de modo a formar uma fita contínua de ácido nucleico. Em geral, o produto da dupla ligação é detectado usando uma abordagem que requer que ambos os eventos de ligação ocorram, de modo a gerar um sinal. Por exemplo, a detecção pode compreender a amplificação através de ambas as junções de ligação (por exemplo, por PCR ou, por modalidades de circularização da sonda, a replicação de círculo rolante), ou capturando a fita de ácido nucleico contínua em uma extremidade e detectando a sua outra extremidade. A fixação covalente do fragmento alvo para a sonda através de ligação forma uma ligação forte, assim a lavagem rigorosa pode ser usada para remover os ácidos nucleicos não ligados, em que as sequências inicial e final não estão ligadas de forma covalente, a sua hibridização mútua ao oligonucleotídeo alvo sendo interrompida pela lavagem.
[0033] Estas características do método e a sonda permitem uma seleção altamente específica de fragmentos alvos. Quando os métodos são aplicados para a detecção multiplex de uma pluralidade de fragmentos alvo, em paralelo, uma detecção muito precisa e quantificação do ácido nucleico alvo são possíveis. Como resultado da sua elevada especificidade, o presente método pode ser especialmente adequado para utilização em diagnóstico em pequenas amostras e/ou para a detecção de pequenas diferenças em quantidades relativas de diferentes ácidos nucleicos alvo, por exemplo, no diagnóstico de aneuploidias em cromossomos fetais a partir de uma amostra de sangue materno ou na detecção da presença de vestígios de DNA do tumor em uma amostra de tecido normal a partir de um paciente ou a detecção de fragmentos de ácidos nucleicos a partir de agentes infecciosos.
[0034] Ter um reconhecimento altamente específico para o fragmento alvo permite a utilização de uma concentração relativamente elevada de sonda sem gerar sinais de falsos positivos, aumentando, desse modo, o rendimento e a eficiência da reação. Isto pode ser de grande importância em aplicações de diagnóstico em que a baixa variabilidade é importante e alvos podem estar presentes em números baixos, por exemplo, em NIPT por análise de DNA isento de células, a detecção de DNA de câncer isento de células e a detecção de DNA de de agentes infecciosos. Algumas modalidades do presente método permitem uma análise altamente específica de fragmentos de DNA curtos, o que é de importância em aplicações para análise de DNA fragmentado, como de DNA isento de células no sangue, ou DNA fixado em formalina embutido em parafina.
[0035] Com referência às Figs. 3 e 4, fornecidas aqui, entre outras coisas, é um método de processamento de uma amostra de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o método pode compreender: a) hibridização de uma amostra (por exemplo, uma amostra que tenha sido digerida com uma enzima de restrição) que compreende um fragmento alvo (um "DNA alvo") a uma sonda de ácido nucleico compreendendo: i. uma sequência inicial e uma sequência final, em que as sequências inicial e final estão nas extremidades de uma primeira molécula de oligonucleotídeo; e ii. uma sequência tala (onde o termo "sequência tala" pretende referir-se a uma sequência de um oligonucleotídeo que, quando hibridizada com dois ou mais outros polinucleotídeos, atua como um "tala" para posicionar os polinucleotídeos próximos um do outro de modo a que eles possam ser ligados uns aos outros, tal como ilustrado nas Figs. 3 e 4). Como mostrado nas Figs. 3 e 4, a sequência tala (que é referida como um "oligonucleotídeo alvo" em alguns casos) utilizada neste método contém uma sequência flanqueadora a montante que é complementar à sequência inicial; uma sequência complementar alvo que é complementar ao fragmento alvo; e uma sequência flanqueadora a jusante que é complementar à sequência final. Esta etapa de hibridização produz um produto de hibridização, em que as extremidades do fragmento alvo são ligavelmente adjacentes às extremidades das sequências inicial e final da primeira molécula de oligonucleotídeo, onde o termo "ligavelmente adjacente" no contexto de duas sequências que são ligavelmente adjacentes uma à outra, quer dizer que não há nucleotídeos intervenientes entre os dois oligonucleotídeos e podem ser ligados uns aos outros usando uma ligase. A próxima etapa do método compreende b) ligar as extremidades do fragmento alvo para as extremidades das sequências inicial e final da primeira molécula de oligonucleotídeo, produzindo assim um produto cíclico que compreende o fragmento alvo e as sequências inicial e final. Esta etapa de ligação é ilustrada na Fig. 1 (embora, tal como ilustrado nas Figs. 3 e 4, o método possa ser implementado em uma variedade de formas diferentes e, como tal, a sonda de ácido nucleico usada na primeira etapa do método pode ser composta por um ou dois oligonucleotídeos).
[0036] Produtos circularizados proporcionam uma vantagem significativa para a detecção, porque eles podem ser amplificados por amplificação em círculo rolante (RCA). RCA produz centenas ou milhares de cópias de um produto circularizado em uma única molécula, desse modo amplificando efetivamente o produto circularizado e fazendo com que seja relativamente fácil de detectar, utilizando, por exemplo, oligonucleotídeos marcados que hibridizam com um motivo no produto.
[0037] Como ilustrado na Fig. 1, o método pode ainda compreender a amplificação do produto cíclico por amplificação de círculo rolante utilizando um iniciador que hibridiza com uma sequência na sonda de ácido nucleico (por exemplo, uma sequência inicial, uma sequência final, ou uma sequência entre as mesmas). Nestas modalidades, o método pode ainda compreender a quantificação do número de produtos de amplificação em círculo rolante produzidos, proporcionando deste modo uma estimativa da quantidade do referido fragmento alvo na amostra. Nestas modalidades, os produtos podem ser amplificados por ampliação de círculo rolante utilizando o iniciador que é complementar a uma sequência em algum lugar no produto cíclico) para produzir uma pluralidade de produtos de RCA, por exemplo, o produto que corresponde a um único fragmento "clonado". O número de produtos de amplificação em círculo rolante pode ser estimado por, por exemplo, distribuição dos produtos RCA na superfície de um suporte (uma lâmina), hibridização dos produtos RCA utilizando oligonucleotídeos marcados (por exemplo, oligonucleotídeos marcados com fluorescência) e, em seguida, a contagem do número de sinais discretos em uma área do apoio por microscopia, por exemplo, microscopia de fluorescência. A marcação pode ser feita antes ou depois de os produtos terem sido distribuídos sobre o suporte e, porque cada produto RCA contém milhares de cópias das mesmas sequências, deve haver milhares de sítios de ligação para os oligonucleotídeos marcados, aumentando assim o sinal. Em modalidades multiplex (por exemplo, em que os produtos RCA correspondentes a dois cromossomos diferentes estão sendo contados), os produtos RCA correspondentes a um cromossomo podem ser marcados com um fluoróforo e os produtos RCA correspondentes a outro cromossomo podem ser marcados com um fluoróforo diferente, assim permitindo que os diferentes produtos RCA sejam contados separadamente.
[0038] A quantificação de sinais a partir de produtos RCA individuais é significativa porque, em muitas aplicações (por exemplo, diagnóstico pré-natal não invasiva através de análise de DNA isento de células), o número de fragmentos correspondentes aos cromossomos específicos (por exemplo, cromossomo 21) precisa ser determinado precisamente e sem tendências. Os métodos de análise típicos usam PCR, que, como é bem conhecido, é um procedimento muito tendencioso em que algumas sequências são amplificadas com eficiências muito mais elevados do que outras. Isso torna as estratégias baseadas em PCR impraticáveis para muitos esforços de diagnóstico.
[0039] Em modalidades alternativas e como ilustrado na Fig. 1, o fragmento alvo pode ser amplificado por PCR e quantificado. Como seria evidente, as sequências flanqueadoras que são adicionadas ao fragmento alvo e/ou os iniciadores de PCR podem ser compatíveis com o uso em, por exemplo, método de terminador reversível da Illumina, método pirosequenciamento da Roche (454), sequenciamento por ligação da Life Technologies (a plataforma sólida) ou plataforma Ion Torrent de Life Technologies. Exemplos de tais métodos estão descritos nas seguintes referências: Margulies et al (Nature 2005 437: 376-80); Ronaghi et al (Analytical Biochemistry 1996 242: 84-9); Shendure (Science 2005 309: 1728); Imelfort et al (Brief Bioinform. 2009 10:609-18); Fox et al (Methods Mol Biol. 2009;553:79-108); Appleby et al (Methods Mol Biol. 2009; 513: 19-39) e Morozova (Genomics. 2008 92: 255-64), que são incorporadas por referência para as descrições gerais dos métodos e as etapas particulares dos métodos, incluindo todos os produtos de partida, reagentes e produtos finais para cada uma das etapas. Nestas modalidades, os produtos cíclicos podem ser amplificados e sequenciados, e a abundância dos fragmentos na amostra pode ser estimada por contagem do número de sequência lida correspondente aos fragmentos.
[0040] Em certas modalidades e tal como ilustrado na Fig. 3, a sequência tala em uma molécula diferente para as sequências inicial e final, isto é, uma "segunda" molécula oligonucleotídica. Como tal, a sonda de ácido nucleico usada no início do método pode ser composta de dois oligonucleotídeos (uma "estrutura principal" de um oligonucleotídeo de "direcionamento", como ilustrado na Fig. 3).
[0041] Em outras modalidades e tal como ilustrado na Fig. 4, a sequência tala pode estar na mesma molécula que as sequências inicial e final, isto é, na "primeira" molécula oligonucleotídica. Como tal, a sonda de ácido nucleico usada no início do método pode ser composta por um único oligonucleotídeo.
[0042] A sequência complementar alvo pode ser de qualquer tamanho, dependendo do comprimento da sequência complementar alvo na sonda de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a sequência complementar alvo é de 10 a 100, por exemplo, 10 a 50 ou 10 a 30 nucleotídeos de comprimento. Tal como observado abaixo, a sequência complementar alvo, contém um ou mais erros de emparelhamento (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais, até 10 ou mais) ao fragmento alvo e, em certos casos, o complemento inverso da sequência complementar alvo pode ser pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% idêntico ao fragmento alvo.
[0043] As sequências flanqueadoras podem ser de qualquer tamanho, dependendo do desenho. Em algumas modalidades, as sequências flanqueadoras são 10 e 40 nucleotídeos, por exemplo, 10 e 30 nucleotídeos, de comprimento.
[0044] Em algumas modalidades, a amostra pode conter fragmentos de DNA genômico, por exemplo, o DNA genômico a partir de virtualmente qualquer organismo, incluindo, mas não limitao a, plantas, animais (por exemplo, répteis, mamíferos, insetos, vermes, peixes, etc.), amostras de tecido, bactérias, fungos (por exemplo, levedura), fagos, vírus, tecido cadavérico, amostras antigas/arqueológicas, etc. Em certas modalidades, o DNA genômico utilizado no método pode ser derivado de um mamífero, em que em certas modalidades o mamífero é um ser humano. Em modalidades exemplares, a amostra genômica pode conter DNA genômico a partir de uma célula de mamífero, tal como, uma célula de humano, camundongo, rato, ou macaco. A amostra pode ser feita a partir de células cultivadas e as células de uma amostra clínica, por exemplo, uma biopsia de tecido, raspagem ou lavagem ou células de uma amostra forense (isto é, as células de uma amostra coletada no local do crime). Em modalidades particulares, a amostra de ácido nucleico pode ser obtida a partir de uma amostra biológica, tais como células, tecidos, fluidos corporais, e fezes. Fluidos corporais de interesse incluem, mas não estão limitados a, sangue, soro, plasma, saliva, muco, muco, fluido espinal cerebral, fluido pleural, lágrimas, fluido duto lactal, linfa, saliva, fluido cerebrospinal, fluido sinovial, urina, fluido amniótico e sêmen. Em modalidades particulares, uma amostra pode ser obtida de um sujeito, por exemplo, um ser humano. Em algumas modalidades, a amostra analisada pode ser uma amostra de DNA isento de células obtida a partir de sangue, por exemplo, a partir do sangue de uma fêmea grávida. Em certas modalidades, o DNA genômico pode ser amplificado, por exemplo, utilizando um método de amplificação do genoma completo, antes da fragmentação.
[0045] Em modalidades, na quais a sequência tala está em uma segunda molécula de oligonucleotídeo (tal como mostrado na Fig. 3), o segundo oligonucleotídeo pode, adicionalmente, compreender uma fração de captura que pode ser utilizada para enriquecer o produto cíclico. Nestas modalidades, o método pode compreender: c) imobilizar o produto cíclico através da ligação da fração de captura a uma fase sólida; e d) lavar a fase sólida para remover o ácido nucleico não ligado e outros componentes da reação; enriquecendo, assim, o produto cíclico. Por exemplo, o segundo oligonucleotídeo pode conter uma porção de biotina, por exemplo, biotina ou um análogo da biotina, como destiobiotina, oxibiotina, 2'-iminobiotina, diaminobiotina, sulfóxido de biotina, biocitina, etc., com ou sem um ligante, por exemplo, -LC- biotina, -LC-LC-Biotina, -SLC-Biotina ou -PEGn-Biotina onde n é 312, e os produtos cíclicos podem ser enriquecidos utilizando um substrato que é acoplado a estreptavidina. A biotina liga-se a estreptavidina com uma afinidade de pelo menos 10 -8M.
[0046] Para modalidades de testes de pré-natal não-invasivos, o fragmento alvo pode ser de cromossomo humano 21, 13 ou 18.
[0047] Em algumas modalidades, o método compreende a hibridização da amostra com um conjunto de pelo menos 50 (por exemplo, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 500, pelo menos 1000, pelo menos 2000, ou pelo menos 5000) das referidas sondas, em que as referidas sondas têm como alvo fragmentos diferentes no mesmo cromossomo (por exemplo, cromossomo humano 21, 13 ou 18), e em que o método resulta em uma pluralidade de produtos cíclicos que compreende os fragmentos alvo. O número de produtos cíclicos produzidos pode ser quantificado por, por exemplo, amplificação dos mesmos usando RCA e contando o número de produtos de RCA, conforme descrito acima.
[0048] Em algumas modalidades, o método compreende a hibridização da amostra com um primeiro conjunto e um segundo conjunto dos referidos conjuntos de sondas de ácidos nucleicos, em que os primeiro e segundo conjuntos de sondas alvo (isto é, hibridizam com fragmentos de e se ligam para produzir produtos cíclicos, como descrito acima) num primeiro cromossomo na amostra e um segundo cromossomo na amostra, respectivamente, amplificando os produtos cíclicos por ampliação de círculo rolante (RCA) e comparando o número de produtos RCA correspondentes ao primeiro cromossomo com o número de produtos RCA correspondentes ao primeiro cromossomo, proporcionando assim uma estimativa das quantidades relativas de DNA a partir dos cromossomos da amostra.
[0049] Em algumas modalidades, o método compreende a hibridização da amostra com um primeiro conjunto e um segundo conjunto dos referidos conjuntos de sondas de ácidos nucleicos, em que os primeiro e segundo conjuntos de sondas alvo (isto é, hibridizam com fragmentos de e ligam para produzir produtos cíclicos, como descrito acima) uma primeira região e uma segunda região de um cromossomo na amostra, respectivamente, amplificando os produtos cíclicos por ampliação de círculo rolante (RCA) e comparando o número de produtos RCA correspondentes à primeira região cromossômica para o número de produtos RCA correspondentes à segunda região cromossômica, proporcionando assim uma estimativa das quantidades relativas de DNA das regiões cromossômicas na amostra. Esta modalidade pode ser usada para identificar, por exemplo, deleções ou duplicações, por exemplo.
[0050] É também aqui proporcionada uma composição compreendendo sonda de ácido nucleico compreendendo: i. uma sequência inicial e uma sequência final, em que as sequências inicial e final estão em extremidades opostas de uma primeira molécula de oligonucleotídeo; e ii. uma sequência tala que compreende, em ordem: uma sequência flanqueadora a montante, que é complementar à sequência inicial, uma sequência complementar alvo que é complementar a um fragmento alvo no genoma humano; e uma sequência flanqueadora a jusante que é complementar à sequência final; em que a sonda é concebida de modo que, quando o primeiro oligonucleotídeo, a sequência tala, e o fragmento alvo são hibridizados um ao outro, as extremidades do fragmento alvo são ligavelmente adjacentes às extremidades das sequências inicial e final na primeira molécula de oligonucleotídeo. Em certas modalidades, a composição pode compreender um primeiro conjunto de pelo menos 50 (por exemplo, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 500, pelo menos 1000, pelo menos 2000, ou pelo menos 5000) das sondas de ácido nucleico, em que as sequências alvo complementares das sondas são complementares aos diferentes fragmentos alvos de um primeiro cromossomo humano (por exemplo, cromossomo é 21, 13 ou 18).
[0051] Em certas modalidades, a composição pode compreender um segundo conjunto de pelo menos 50 (por exemplo, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 500, pelo menos 1000, pelo menos 2000, ou pelo menos 5000) das referidas sondas de ácido nucleico, em que as sequências complementares alvos das sondas no segundo conjunto de sondas são complementares aos diferentes fragmentos alvo de um segundo cromossomo humano. Em algumas modalidades, o primeiro cromossomo humano pode ser cromossomo 21 e o segundo cromossomo humano cromossomo pode ser 13 ou 18. Em alguns casos, o segundo cromossomo humano não é cromossomo 21, 13 ou 18.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0052] O especialista na técnica irá compreender que os desenhos descritos a seguir são apenas para fins ilustrativos. Os desenhos não se destinam a limitar o escopo dos ensinamentos presentes em qualquer forma.
[0053] Fig. 1 ilustra esquematicamente uma modalidade do méto do objeto em que uma molécula de DNA circular é formada e amplificada por PCR ou RCA.
[0054] Fig. 2 ilustra esquematicamente uma modalidade objeto em que um produto de ligação linear é formado e enriquecido com reagentes de fase sólida.
[0055] Fig. 3 mostra uma sonda que compreende um oligonu- cleotídeo de estrutura principal circularizado ligado ao seu fragmento alvo. A sonda é ilustrada em duas versões, A e B.
[0056] Fig. 4 mostra uma sonda oligonucleotídica única circula- rizada com o fragmento alvo ligado.
[0057] Fig. 5 mostra uma sonda em alça dupla circularizada composta de um oligonucleotídeo alvo e um oligonucleotídeo da estrutura principal em alça, com o fragmento alvo ligado.
[0058] Fig. 6 mostra uma sonda linear em alça composta de um oligonucleotídeo alvo e um oligonucleotídeo da estrutura principal linear, com o fragmento alvo ligado.
[0059] Fig. 7 mostra uma sonda linear que compreende dois oligonucleotídeos da estrutura principal, com o fragmento alvo ligado.
[0060] Fig. 8 é uma imagem de um gel que mostra a especificidade do método aqui descrito.
[0061] Fig. 9 é um gráfico que ilustra a precisão do método aqui descrito.
[0062] Fig. 10 painel A mostra uma imagem de produtos RCA marcados sobre a superfície de uma lâmina; o painel B mostra como proporções de fragmentos a partir de cromossomos diferentes podem ser determinadas com precisão pela contagem de produtos RCA individuais.
DESCRIÇÃO DETALHADA O fragmento de ácido nucleico alvo
[0063] O fragmento alvo que é ligado pela sonda é um único fragmento de cadeia de ácido nucleico. Em algumas modalidades, os presentes métodos ligam fragmentos alvos cuja sequência é pré- definida. A sequência do fragmento completo que inclui as extremidades pode ser conhecida. Fragmentos conhecidos de sequência pré-definida podem ser produzidos por fragmentação específica, em vez de aleatória, do ácido nucleico. Métodos de fragmentação específicos incluem digestão com enzimas de restrição, PCR (por exemplo, PCR multiplex), e outros métodos de definição de extremidade com fragmento direcionado à sequência , incluindo outras enzimas, ribozimas, ou uma combinação de tais técnicas.
[0064] Um método de fragmentação é a digestão com uma endonuclease de restrição ou uma combinação de duas ou mais endonucleases de restrição. Assim, a amostra de ácido nucleico fragmentada pode ser um digesto de uma enzima de restrição e o fragmento alvo pode ser um fragmento de restrição.
[0065] Uma variedade de enzimas específicas de clivagem de ácidos nucleicos é conhecida e qualquer enzima adequada pode ser usada na presente invenção, incluindo as enzimas que clivam em uma posição pré-definida dentro de uma sequência específica de ácido nucleico, ou enzimas endonucleolíticas que clivam depois ou antes de uma sequência específica de reconhecimento de ácido nucleico e enzimas de corte. Ácidos nucleicos catalíticos, como ribozimas, podem ser também utilizados para a fragmentação de DNA. As enzimas podem clivar o ácido nucleico de fita dupla para produzir uma extremidade cega ou uma extremidade coesiva, ou podem clivar uma fita simples de ácido nucleico. Vários tipos de enzimas de restrição são conhecidos, incluindo Tipo I, Tipo II, Tipo III, Tipo IV e Tipo V. Enzimas adequadas ou combinações de enzimas podem ser selecionados para utilização no método tal como desejado. Por exemplo, o ácido nucleico em uma amostra (por exemplo, 10 ng de DNA) pode ser digerido com a enzima de restrição (por exemplo, 1 U) em tampão de enzima de restrição compatível correspondente. A reação pode ser incubada sob condições adequadas (por exemplo, 37 °C durante 1 hora), seguida por desativação enzimática (por exemplo, a 80 ° C durante 20 minutos).
[0066] Outro método conveniente de fornecer o ácido nucleico fragmentado é usar iniciadores para amplificação de sequências específicas lineares a partir do ácido nucleico. Multiplex PCR pode ser utilizado, tratando o ácido nucleico com múltiplos pares de iniciadores específicos para amplificar vários fragmentos específicos. Neste caso, as extremidades do fragmento alvo correspondem às sequências do par de iniciadores.
[0067] Para muitas aplicações de diagnóstico e outras, a amostra é uma amostra de cromossomos fragmentados (por exemplo, cromossomos humanos ou cromossomos microbianos). O fragmento alvo pode ser um fragmento do genoma específico para um cromossomo de um genoma de um organismo. Em outras palavras, o fragmento alvo pode ser encontrado somente em um cromossomo do genoma e não em outros cromossomos daquele genoma. Geralmente, o método será utilizado para a análise do genoma humano, em cujo caso o fragmento alvo pode ser um fragmento específico a um cromossomo humano, ou seja, encontrado naquele cromossomo e não em outros cromossomos humanos. Por exemplo, o fragmento pode ser específico ao cromossomo 21.
[0068] O fragmento alvo pode ser específico de um locus de um cromossomo. Por conseguinte, pode ser encontrada naquele locus cromossômico e não em outros loci do mesmo cromossomo ou outros cromossomos do mesmo genoma. Por exemplo, o fragmento pode ser específico de um locus de um cromossomo humano.
[0069] Uma dada espécie de ácido nucleico em uma amostra pode incluir alguma variabilidade, por exemplo, uma amostra pode compreender os cromossomos de diferentes indivíduos, como o ácido nucleico obtido a partir de sangue materno, que contém DNA materno e DNA fetal. Aqui as espécies de interesse podem ser um cromossomo particular, mas é conveniente detectar todas as cópias do cromossomo seja de origem materna ou fetal. Deste modo, uma espécie de interesse pode ser um cromossomo ou local cromossômico, e as sequências alvo são encontradas naquele cromossomo ou local em ambas as cópias fetais e maternas do cromossomo ou local cromossômico.
[0070] As amostras de ácido nucleico podem ser proporcionadas em qualquer forma adequada, como por exemplo, amostras de tecido biológico ou de fluidos a partir de pacientes. As amostras podem ser amostras de sangue, sangue total, plasma ou soro, amostras de tecido, por exemplo, amostras de tecido fixadas em formalina embebidas com parafina, ou podem ser amostras de ácido nucleico extraído a partir de sangue ou de tecido.
[0071] A amostra pode ser qualquer amostra que contenha ácido nucleico. O ácido nucleico contido na amostra pode ser DNA e/ou RNA. A amostra pode ser complexa, por exemplo, DNA genômico inteiro ou cDNA a partir de um organismo inteiro, tecido ou população de células, ou de uma fração dos mesmos. A este respeito, pode, por exemplo, ser um produto direto de um procedimento de isolamento de ácido nucleico, ou de um procedimento de lise celular, ou pode ser ainda fracionado ou purificado de alguma forma, por exemplo, este pode conter ácidos nucleicos que tenham sido parcialmente ou completamente separados, de algum modo, ou tratados de qualquer forma, por exemplo, RNA para produzir cDNA. A amostra pode ser de qualquer fonte procariótica ou eucariótica ou viral, por exemplo, pode ser microbiana (por exemplo, bacteriana ou fúngica), planta, ou animal. Preferencialmente, a amostra é de origem humana, por exemplo, o DNA genômico humano. A amostra pode ser uma amostra de tecido ou de sangue de um animal, em que o ácido nucleico a ser detectado é microbiano, por exemplo, bacteriano, viral ou fúngico. Para os métodos relacionados ao diagnóstico pré-natal não invasivos, a amostra é derivada a partir do sangue de uma mulher grávida e compreende DNA fetal. Em outros exemplos, o ácido nucleico a ser detectado ou quantificado é DNA associado a tumor.
[0072] Geralmente, o método pode ser realizado nas amostras in vitro. Por conseguinte, os métodos geralmente não incluem o diagnóstico realizado in vivo sobre o corpo do humano ou animal ou métodos de tratamento do corpo humana ou animal por cirurgia ou terapia. No entanto, os resultados dos métodos de diagnóstico in vitro podem ser utilizados para informar o tratamento subsequente dos pacientes.
Desnaturação do ácido nucleico alvo
[0073] A sonda reconhece e se liga ao ácido nucleico alvo na forma de fita simples, através de hibridização entre o fragmento de fita simples e a sequência alvo complementar do oligonucleotídeo alvo. Portanto, se o fragmento alvo na amostra já não é de fita simples, devem ser fornecidas condições de desnaturação para separar o fragmento alvo de fita simples a partir da sua fita de ácido nucleico complementar.
[0074] As condições de desnaturação podem ser a uma temperatura suficientemente elevada para separar o fragmento alvo a partir da sua sequência complementar. Condições de desnaturação podem ser a incubação a 95 ° C, durante um tempo adequado, por exemplo 10 minutos. Alternativamente desnaturação química pode ser realizada.
Complementaridade
[0075] Um método de teste de uma amostra para a presença de um fragmento alvo pode compreender o contato da amostra com uma sonda de ácido nucleico, em que a sonda compreende
[0076] um oligonucleotídeo contendo uma sequência de direcionamento alvo complementar, que é o complemento do fragmento alvo, e uma sequência flanqueadora adjacente à sequência alvo complementar e
[0077] uma sequência de oligonucleotídeo tendo uma extremidade livre 5’ ou 3’, em que a sequência oligonucleotídica é complementar à sequência flanqueadora.
[0078] As concentrações adequadas de sondas podem ser determinadas com base na concentração (ou concentração esperada) do fragmento alvo ou fragmentos alvo na amostra. Tal como ilustrado nos exemplos, as sondas podem ser adicionadas à amostra a uma concentração de 10 pM por sonda. Quando uma amostra é posta em contato com várias sondas (por exemplo, um conjunto de sondas), as concentrações das sondas individuais podem ser 10 pM. Preferencialmente, as sondas são utilizadas em excesso da concentração esperada de espécies de ácidos nucleicos de interesse a serem detectadas ou quantificadas. Uso de sonda em excesso deve assegurar que todas as cópias de sequências alvo presentes na amostra são reconhecidas. Isto maximiza a sensibilidade da detecção. Além disso, sempre que os métodos envolvem a quantificação, esta garante que a detecção dos produtos de ligação ou sinal cumulativo a partir de um conjunto de sondas é proporcional à quantidade de sequências alvo na amostra.
[0079] Sob condições de anelamento, o fragmento alvo (se presente) hibridiza com a sequência complementar alvo da fita de direcionamento e a sequência de oligonucleotídeo hibridiza para a sequência flanqueadora, de modo que a extremidade livre 5’ ou 3’ da sequência de oligonucleotídeo está em justaposição com a extremidade 3’ ou 5' do fragmento alvo, respectivamente. Assim, o oligonucleotídeo alvo modela o fragmento alvo para ligação à sequência de oligonucleotídeos. A extremidade 3’ do fragmento alvo pode ser ligada a uma extremidade 5' de uma sequência inicial e a extremidade 5’ do fragmento alvo pode ser ligada a uma extremidade 3’ de uma sequência final em um evento de dupla ligação.
[0080] Em sondas de acordo com a presente invenção, a especificidade máxima para o fragmento alvo é alcançada se a sequência complementar alvo, é o complemento exato do fragmento alvo, de modo que haja hibridização perfeita entre eles. No entanto, isto não é essencial em todos os casos, e um pequeno grau de pareamento incorreto pode ser aceito, por exemplo, para permitir a detecção dos fragmentos que exibem uma variação alélica em que é desejado detectar o fragmento independentemente do alelo exato presente na amostra. Como alternativa, várias sondas podem ser concebidas para sequências variantes. Isto pode permitir ambas a detecção e a discriminação de alelos diferentes ou mutações. Sondas de acordo com a presente invenção são mais vantajosamente utilizadas em métodos multiplex onde um grande número de diferentes sondas está incluído em uma reação. Dentro de uma tal pluralidade de sondas, é previsto que a maioria das sondas terá complementaridade perfeita para os seus fragmentos alvos, mas algumas sondas podem ligar-se aos alvos com menores pareamentos incorretos.
[0081] Preferencialmente, a sequência complementar alvo tem menos do que 5 pares de bases desemparelhados com o fragmento alvo. Pode, opcionalmente, haver um, dois, três ou quatro pares de bases desemparelhados entre o fragmento alvo e a sequência complementar alvo. O pareamento incorreto pode ser um ponto em que uma base correspondente está ausente de uma sequência, de modo que a sequência complementar forma uma alça no ponto desemparelhado, ou pode ocorrer onde um nucleotídeo não complementar está presente em uma sequência e assim não pareia com a base na posição correspondente da outra sequência. Onde há um pareamento de base incorreto, ou seja, um pareamento da ou T com C ou G, ligação de hidrogênio não ocorre entre as bases das duas fitas, embora hibridização ainda ocorra entre o fragmento alvo e a sequência complementar alvo do oligonucleotídeo alvo devido ao pareamento de bases entre os nucleotídeos vizinhos ao pareamento incorreto. Desemparelhamentos podem ser bases oscilantes. Uma base de oscilação seria normalmente corresponde a uma posição na sequência alvo complementar que pareia com uma posição de variação genética conhecida no fragmento alvo. A sonda pode ser sintetizada através da adição de um ou vários didesoxinucleotídeos durante o ciclo de síntese específico para a posição de base oscilante. Este é tipicamente o caso para a síntese de oligonucleotídeos tradicionais. Alternativamente múltiplas sondas separadas podem ser produzidas, uma para cada variante genética. Este é normalmente o caso se as sondas são sintetizadas utilizando síntese baseada em microarranjo. Uma base oscilante pode corresponder às diferenças de nucleotídeo único entre os códons, onde os diferentes códons codificam o mesmo aminoácido.
[0082] Em geral, as sequências complementares alvos mais longas para hibridizar fragmentos alvo mais longos podem tolerar um maior número de pareamentos incorretos em comparação com sequências alvo complementares mais curtas. A sequência complementar alvo pode, por exemplo, ter no máximo 1 em 8, 1 em 9 ou 1 em 10 pareamentos incorretos de pares de bases com o fragmento alvo. Tais incompatibilidades devem ser restritas à região interna da de sequência complementar alvo e fragmento alvo, de modo que eles não inibam a ligação ou fragmentação alvo específica de sequência, por exemplo, digestão com enzimas de restrição. Por conseguinte, preferencialmente, não há complementaridade perfeita entre o fragmento alvo e a sequência complementar alvo nos 6 a 8 nucleotídeos terminais, preferencialmente os 10 nucleotídeos terminais em cada extremidade do fragmento alvo.
[0083] De um modo geral, o fragmento alvo e a sequência complementar alvo são do mesmo comprimento. O comprimento total do fragmento alvo está, assim, ligado pela sua sequência complementar alvo. A hibridização do fragmento alvo ao oligonucleotídeo alvo representa um único evento de ligação entre as duas moléculas de ácidos nucleicos, em contraste com sondas que ligam as duas extremidades de uma molécula alvo ou para duas regiões não adjacentes do alvo.
[0084] A sequência complementar alvo pode ter um comprimento de pelo menos 10 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 15 nucleotídeos. Pode ser de até 20, 25, 30, 35 ou 40 nucleotídeos de comprimento. As faixas preferidas incluem de 10 - 20 nucleotídeos, 10 - 30 nucleotídeos, e 10 - 40 nucleotídeos. Tais sequências alvo complementares relativamente curtas são adequadas para a ligação de fragmentos correspondentemente curtos. A sequência curta contribui para a especificidade da reação de ligação dupla, uma vez que a DNA ligase é sensível às diferenças de pares de bases e, preferencialmente, irá ligar sequências perfeitamente emparelhadas. Onde pareamentos incorretos estão presentes na presença de DNA ligase ligados à sequência de fita dupla, as sequências não podem ser ligadas, o que proporciona uma etapa adicional de revisão assegurando uma elevada especificidade na detecção do fragmento alvo, preferencialmente, fragmentos de sequência diferente, mas semelhante. A DNA ligase tipicamente tem uma pegada de 6 a 8 bases de cada lado do corte. Portanto, se o fragmento é de 20 bases, 12 a 16 das bases serão cobertas por especificidade de ligase.
[0085] A hibridização da sonda irá discriminar contra pareamentos incorretos especialmente na parte central da sequência hibridizada enquanto a ligação irá discriminar contra pareamentos incorretos nas extremidades do fragmento alvo. Em conjunto, isto gera um fragmento de detecção altamente específico.
[0086] O oligonucleotídeo alvo é maior do que o fragmento alvo, uma vez que inclui as sequências flanqueadoras assim como a sequência alvo complementar, e pode ainda incluir uma ou mais sequências customizadas. Uma sequência customizada não é complementar às outras regiões da sonda ou ao fragmento alvo - em outras palavras, não hibridiza com outras regiões da sonda (fora da sequência customizada) ou ao fragmento alvo, sob condições de anelamento. A região flanqueadora a montante está a montante de ou 5’ da sequência complementar alvo no oligonucleotídeo alvo. A região flanqueadora a jusante está a jusante de ou 3’ da sequência complementar alvo no oligonucleotídeo alvo. Por conseguinte, a sequência complementar alvo é interna ao oligonucleotídeo alvo e não inclui uma extremidade do oligonucleotídeo alvo, uma vez que é flanqueada pelas sequências flanqueadoras a montante e a jusante.
[0087] A sequência de fita dupla produzida por hibridização do fragmento alvo e a sequência complementar alvo podem ser consideradas uma sequência de fita dupla híbrida, uma vez que é um híbrido do alvo e a sonda. Tipicamente, a sequência de fita dupla adota uma conformação helicoidal dupla, em que o fragmento alvo é uma fita e o oligonucleotídeo alvo é a outra fita da dupla hélice. A sequência de fita dupla híbrida é flanqueada pelas sequências flanqueadoras a montante e a jusante do oligonucleotídeo alvo, que por sua vez hibridizam com as sequências inicial e final para produzir sequências de fita dupla. Mais uma vez, estes normalmente adotam a conformação de dupla hélice normal do ácido nucleico de fita dupla.
[0088] As sequências flanqueadoras a montante e a jusante são preferencialmente diferentes umas das outras, isto é, preferencialmente, têm sequências diferentes. É preferido que a sequência inicial seja complementar à sequência flanqueadora a montante, mas não a sequência flanqueadora a jusante, e que a sequência final é complementar à sequência flanqueadora a jusante, mas não com a sequência flanqueadora a montante. Isso garante que as sequências inicial e final hibridizem apenas com as sequências flanqueadoras a montante e a jusante respectivamente.
[0089] A sequência inicial terá geralmente o mesmo comprimento que a sequência flanqueadora a montante. A sequência da final terá geralmente o mesmo comprimento que a sequência flanqueadora a jusante.
[0090] Comprimentos normais para as sequências flanqueadoras estão entre 10 e 40 nucleotídeos, por exemplo, 10 - 20 ou 10 - 30 nucleotídeos. As sequências flanqueadoras podem ser do mesmo comprimento que cada outra. Uma ou ambas as sequências flanqueadoras podem ser do mesmo comprimento que a sequência alvo complementar. A sequência flanqueadora a montante e/ou a jusante podem, portanto, ter um comprimento de pelo menos 10 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 15 nucleotídeos. Pode ser de até 20, 25, 30, 35 ou 40 nucleotídeos de comprimento.
[0091] Preferencialmente, a sequência inicial é o complemento da sequência a montante. Preferencialmente, a sequência final é o complemento da sequência a jusante. Um pareamento perfeito das sequências é desejável para a ligação da sonda ideal de modo a que as sequências inicial e final sejam corretamente posicionadas para ligação com o fragmento alvo. Opcionalmente, no entanto, pode haver um, dois, três ou quatro pares de bases entre a sequência inicial e a sequência flanqueadora a montante, e/ou entre a sequência final e a sequência flanqueadora a jusante. Preferencialmente, há menos de 5 pares de bases.
[0092] À exceção da sequência alvo complementar, geralmente a sonda não deve ser complementar ao fragmento alvo ou a outros ácidos nucleicos que possam estar presentes na amostra. Isto é para evitar hibridização indesejada da sonda de ácido nucleico que não o alvo. Assim, se a sonda é para a ligação de um fragmento de DNA genômico humano, a sonda pode ser concebida de modo a que as sequências além da sequência complementar alvo não sejam complementares ao DNA genômico humano, de modo que a sonda hibridize apenas para o fragmento alvo e não para outro ácido nucleico na amostra. Anelamento e ligação
[0093] O fragmento alvo é ligado em uma reação altamente específica em ambas as extremidades. Uma vez que o fragmento alvo é, tipicamente, o produto de uma fragmentação específica de ácido nucleico, estas extremidades geralmente terão uma sequência específica predeterminada. Na etapa de ligação, estas extremidades são especificamente detectadas por ligação dependente da sequência com as sequências inicial e final, respectivamente. Preferencialmente, a ligação do fragmento alvo para a sonda cria duas junções ligáveis perfeitamente pareadas, uma entre a extremidade 3’ do fragmento alvo e a extremidade 5' da sequência inicial e uma entre a extremidade 5’ do fragmento alvo e a extremidade 3’ da sequência final.
[0094] A ligação de uma extremidade 5’ de ácido nucleico a uma extremidade 3’ de ácido nucleico pode ocorrer quando as duas extremidades são de pareadas em base aos nucleotídeos adjacentes de uma sequência complementar. Pareamento de bases dos respectivos nucleotídeos terminais para os nucleotídeos adjacentes forma uma fita de ácido nucleico contendo um corte entre as duas extremidades. A ligação das duas extremidades pode ser catalisada por DNA ligase. Fornecer condições para ligação irá, por conseguinte, normalmente compreender proporcionar uma enzima DNA ligase e condições de reação sob as quais a DNA ligase liga as duas extremidades para formar uma fita de ácido nucleico contínuo, fechando o corte. Um número de enzimas ligase está comercialmente disponível, como Ampligase (Epicentre), cujas condições são adequadas para adicionar 1 U de enzima e incubar a 55 ° C durante 1 hora em tampão de ligase.
[0095] O oligonucleotídeo alvo modela o fragmento alvo para ligação às sequências inicial e final, devido à localização da sequência alvo complementar entre as sequências flanqueadoras. Sob condições de anelamento na presença do fragmento alvo, as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, que definem um intervalo entre extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final. O fragmento alvo hibridiza com a sequência complementar alvo no intervalo. Assim, a hibridização das sequências inicial e final e o fragmento alvo ao oligonucleotídeo alvo posiciona a extremidade 3’ do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5' da sequência inicial, e posiciona a extremidade 5’ do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 3’ da sequência final.
[0096] O posicionamento das duas extremidades em justaposição proporciona um substrato para a DNA ligase para ligar as extremidades juntas. É preferido que a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da extremidade 5 do fragmento alvo hibridizem com nucleotídeos adjacentes do oligonucleotídeo alvo, e a extremidade 3’ da sequência final e a extremidade e 5' do fragmento alvo hibridiza aos nucleotídeos adjacentes do oligonucleotídeo alvo. Por conseguinte, a sequência flanqueadora a montante pode ser imediatamente adjacente à sequência alvo complementar, sem nucleotídeos intervenientes. Do mesmo modo, a sequência flanqueadora a jusante pode ser imediatamente adjacente à sequência alvo complementar sem nucleotídeos intervenientes. Extremidades 3’ e 5’ podem ser diretamente ligadas por DNA ligase vedando o corte entre eles para formar uma fita de ácido nucleico contínua.
[0097] O produto da dupla ligação, isto é, o produto da ligação de ambas as sequências inicial e a sequência final para o fragmento alvo, é uma fita contínua de ácido nucleico. É contínua no sentido de que não contém quaisquer Cortes ou intervalos, de modo que todos os nucleotídeos na fita estejam ligados de forma covalente.
[0098] A sonda pode ser concebida de modo a que a fita contínua de ácido nucleico compreendendo as sequências inicial e final e o fragmento alvo seja um círculo de ácido nucleico. O termo círculo aqui se refere à topologia da fita sendo uma alça fechada, sem a extremidade livre.
[0099] Sob condições de anelamento na presença do fragmento alvo, as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, que definem um intervalo entre extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final. O fragmento alvo hibridiza para a sequência alvo complementar no intervalo, desse modo, posicionando as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ das sequências da final, e completando um círculo de ácido nucleico que compreende o fragmento alvo e as sequências inicial e final.
[00100] As moléculas de ácido nucleico que formam o círculo têm as suas extremidades em justaposição. A ligação das extremidades produz a fita circular contínua de ácido nucleico que compreende pelo menos as sequências inicial e final e o fragmento alvo.
[00101] As sondas que formam um círculo de ácido nucleico incluem sondas em que as sequências inicial e final são fornecidas em uma única molécula de ácido nucleico. Por exemplo, em adição ao oligonucleotídeo alvo a sonda pode compreender um oligonucleotídeo de estrutura principal possuindo as sequências inicial e final nas suas extremidades 3’ e 5’, respectivamente, em que as sequências inicial e final do oligonucleotídeo de estrutura principal ligam em trans às sequências flanqueadoras do oligonucleotídeo alvo nas condições de anelamento. O oligonucleotídeo da estrutura principal pode compreender uma sequência customizada entre as sequências da inicial e da final. A Figura 3 ilustra modalidades de tais sondas. Alternativamente, as sequências inicial e final do oligonucleotídeo da estrutura principal podem ser adjacentes, sem qualquer sequência customizada entre elas.
[00102] Em outro exemplo, as sequências inicial e final podem estar em extremidades do oligonucleotídeo alvo e ligam em cis para as sequências flanqueadoras, nas condições de anelamento. O oligonucleotídeo alvo pode compreender uma sequência customizada entre o oligonucleotídeo alvo e a sequência inicial e/ou final. A Figura 4 ilustra uma modalidade de uma tal sonda.
[00103] As sondas que formam um círculo de ácido nucleico incluem sondas em que as sequências inicial e final são fornecidas em moléculas de ácido nucleico diferentes. Em tais casos, o círculo de ácido nucleico que se forma sob as condições de anelamento irá compreender pelo menos três moléculas de ácido nucleico - o fragmento alvo, a sequência inicial e a sequência final. As extremidades das moléculas de ácido nucleico estarão todas em justaposição, como foi observado anteriormente. Mais de duas reações de ligação são necessárias para formar a fita circular contínua de ácido nucleico em tais casos. Um exemplo é onde a sequência final é a extremidade 3' do oligonucleotídeo alvo e em que a sonda compreende um oligonucleotídeo da estrutura principal tendo a sequência inicial na sua extremidade 5'. Sob as condições de anelamento a sequência final liga em cis para a sequência flanqueadora a jusante do oligonucleotídeo alvo, e a sequência inicial do oligonucleotídeo da estrutura principal liga em trans para a sequência flanqueadora a montante de oligonucleotídeo alvo. Ligação em cis significa que a ligação ocorre na mesma molécula de ácido nucleico, isto é, uma única fita de ácido nucleico que forma uma estrutura tridimensional em que diferentes regiões são reunidas e hibridizam. Ligação em trans significa que a ligação ocorre entre moléculas de ácidos nucleicos diferentes. Opcionalmente, o oligonucleotídeo da estrutura principal compreende um par de sequências de repetição invertidas que formam uma estrutura em gancho em condições de anelamento, posicionando desse modo a extremidade 3’ do oligonucleotídeo de estrutura principal em justaposição com a extremidade 5’ do oligonucleotídeo alvo. Há um corte entre as duas extremidades. Uma sonda deste tipo é ilustrada na Figura 5. Quando são fornecidas as condições para a ligação, a extremidade 5’ do oligonucleotídeo alvo é ligada à extremidade 3’ do oligonucleotídeo da estrutura principal. O produto da dupla ligação é um círculo de ácido nucleico que compreende o oligonucleotídeo alvo, o fragmento alvo e o oligonucleotídeo da estrutura principal. Em alternativa, quando existe um intervalo entre a extremidade 5’ do oligonucleotídeo alvo e a extremidade 3’ do oligonucleotídeo da estrutura principal, a sonda mostrada na Figura 5 não será circularizada por ligação - em vez de fita contínua de ácido nucleico compreendendo as sequências inicial e final e o fragmento alvo é uma fita linear de ácido nucleico.
[00104] A sonda pode, alternativamente, ser disposta em orientação oposta de modo a que a sequência inicial está na extremidade 5’ do oligonucleotídeo alvo e a sonda compreende um oligonucleotídeo da estrutura principal possuindo a sequência final na sua extremidade 3’. Neste caso, sob as condições de anelamento a sequência inicial se liga em cis à sequência flanqueadora a montante do oligonucleotídeo alvo, e a sequência final do oligonucleotídeo da estrutura principal liga em trans para a sequência flanqueadora a jusante do oligonucleotídeo alvo. Mais uma vez, o oligonucleotídeo da estrutura principal pode compreender um par de sequências de repetição invertidas que formam uma estrutura em gancho em condições de anelamento para posicionar a extremidade 5’ do oligonucleotídeo da estrutura principal em justaposição com a extremidade 3’ do oligonucleotídeo alvo. A extremidade 3’ do oligonucleotídeo alvo é então ligada à extremidade 5' do oligonucleotídeo da estrutura principal de modo que o produto da dupla ligação é um círculo de ácido nucleico que compreende o oligonucleotídeo alvo, o fragmento alvo e o oligonucleotídeo da estrutura principal. Alternativamente, como mencionado acima, o anelamento pode posicionar a extremidade 5’ do oligonucleotídeo da estrutura principal perto da extremidade 3’ do oligonucleotídeo alvo, mas separada por um intervalo de um ou mais nucleotídeos. O produto ligado, então, será uma fita linear contínua de ácido nucleico compreendendo as sequências inicial e final e o fragmento alvo.
[00105] O oligonucleotídeo da estrutura principal pode compreender uma sequência customizada entre a sequência de repetição invertida, de modo que, sob as condições de anelamento o oligonucleotídeo da estrutura principal forma uma estrutura em gancho, tal como ilustrado na Figura 5.
[00106] Como observado, as sondas podem ser concebidas de modo que a fita contínua de ácido nucleico compreendendo as sequências inicial e final e o fragmento alvo seja uma fita linear de ácido nucleico. Sob condições de anelamento na presença do fragmento alvo, as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, que definem um intervalo entre extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final. O fragmento alvo hibridiza para a sequência alvo complementar no intervalo, desse modo, posicionando as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ das sequências da final, e completando uma fita de ácido nucleico que compreende o fragmento alvo e as sequências inicial e final. As moléculas de ácido nucleico que formam a fita têm as suas extremidades em justaposição. O termo justaposição foi discutido em outro local. Há um corte entre as extremidades a serem ligadas. A ligação das extremidades produz a fita contínua de ácido nucleico que compreende pelo menos as sequências inicial e final e o fragmento alvo.
[00107] A sonda pode compreender um oligonucleotídeo alvo possuindo a sequência final na sua extremidade 3’ e um oligonucleotídeo de estrutura linear que possui a sequência inicial na sua extremidade 5'. Sob condições de anelamento, a sequência final liga em cis para a sequência flanqueadora a jusante do oligonucleotídeo alvo, e a sequência inicial do oligonucleotídeo da estrutura principal liga em trans para a sequência flanqueadora a montante de oligonucleotídeo alvo. O oligonucleotídeo alvo pode compreender uma sequência customizada entre a sequência flanqueadora a jusante e a sequência da final, de modo que, sob as condições de anelamento, o oligonucleotídeo alvo forma uma estrutura em gancho. A fita linear de ácido nucleico formada em condições de anelamento compreende o oligonucleotídeo da estrutura principal, o fragmento alvo e oligonucleotídeo alvo. A Figura 6 ilustra este arranjo.
[00108] A sonda pode, igualmente, ser disposta na orientação inversa, em que a sequência inicial está na extremidade 5’ do oligonucleotídeo alvo e a sonda compreende um oligonucleotídeo da estrutura principal tendo a sequência final na sua extremidade 3’. Neste caso, a sequência inicial liga em cis para a sequência flanqueadora a montante do oligonucleotídeo alvo e a sequência final de oligonucleotídeo da estrutura principal liga em trans para a sequência flanqueadora a jusante do de direcionamento oligonucleotídeo.
[00109] Outra forma de sonda que forma uma fita de ácido nucleico linear, tal como o produto de ligação é uma sonda que compreende as sequências inicial e final nos oligonucleotídeos da estrutura principal separados. Tal sonda pode compreender um oligonucleotídeo de estrutura principal compreendendo uma sequência inicial que tem uma extremidade 5’ livre, e um oligonucleotídeo de estrutura principal compreendendo uma sequência final tendo uma extremidade 3’ livre, em que, nas condições de anelamento, as sequências inicial e final ligam em trans para as sequências flanqueadoras do oligonucleotídeo alvo. Um ou ambos oligonucleotídeos de estrutura principal podem compreender ainda uma sequência customizada. A Figura 7 ilustra sondas deste tipo.
[00110] Preferencialmente, os oligonucleotídeos da sonda em sua forma não ligada são lineares. Assim, preferencialmente, o oligonucleotídeo alvo é uma molécula de ácido nucleico linear. Para sondas, incluindo um ou mais oligonucleotídeos de estrutura principal, estes são também preferencialmente lineares. Isto permite a diferenciação conveniente entre sondas ligadas e não ligadas, onde um círculo de DNA é formado apenas como um resultado da ligação bem sucedida das modalidades de circularização da sonda. As moléculas de ácido nucleico lineares não são amplificadas por replicação do círculo rolante.
Detecção
[00111] Depois de fornecer as condições sob as quais o fragmento alvo, se presente, é ligada à sonda, uma etapa de detecção é realizada para determinar se ou não tal ligação ocorreu. Isto indica se ou não o fragmento alvo estava presente na amostra. Assim, a detecção do produto de ligação é dependente da ligação bem- sucedida do fragmento alvo com as sequências inicial e final de modo a formar a fita contínua de ácido nucleico. A etapa de detecção, portanto, em geral, envolve a detecção de um sinal que requer a presença de ambas as junções de ligação. Por exemplo, a detecção pode compreender a amplificação através de ambas as junções de ligação (por exemplo, por PCR ou, por modalidades de circularização da sonda, a replicação de círculo rolante), ou capturando a fita de ácido nucleico contínua em uma extremidade e detectando a sua outra extremidade.
[00112] Opcionalmente, um método pode incluir o enriquecimento do produto da dupla ligação antes da detecção. Os produtos podem ser enriquecidos por amplificação e/ou através de química de fase sólida. Produtos de ácido nucleico circular podem ser enriquecidos seletivamente por tratamento da amostra com a exonuclease (por exemplo, exonuclease lambda) para digerir os produtos de ácidos nucleicos lineares. De um modo geral, a degradação da exonuclease pode ser utilizada para enriquecer os produtos de ligação quando os produtos de ligação são protegidos contra a degradação da exonuclease. Exonuclease deve então ser desativada (por exemplo, pelo calor) antes de qualquer etapa subsequente que envolve a polimerização, por exemplo, antes da amplificação por círculo rolante. Como ilustrado no Exemplo 1, 1U de Exonuclease pode ser adicionado para remover sondas e fragmentos que não reagiram. As condições adequadas são incubação a 37 °C durante 1 hora em tampão de exonuclease correspondente, seguido de inativação da enzima a 80 ° C durante 20 minutos. Quando são utilizados os métodos de captura/detecção, produtos de ligação podem ser enriquecidos através da captura dos produtos em uma fase sólida através da fração de captura. Tal como ilustrado no Exemplo 2, uma solução contendo produtos de ligação linear pode ser misturada com 10 ml de grânulos magnéticos revestidas com estreptavidina M-280 (Invitrogen) em Tris-HCl (pH 7,5), 3,5 mM EDTA e 0,07% Tween-20, num volume final de 200 ml, e incubada em temperatura ambiente durante 15 minutos. Após incubação, os grânulos são coletados utilizando um ímã e o sobrenadante é removido. Outras formas de enriquecer produtos de ligação incluem produtos de ligação especificamente selecionados por tamanho.
[00113] Uma forma conveniente de detectar o produto de dupla ligação para proporcionar condições para a amplificação e para testar a presença do produto de amplificação. Várias abordagens de amplificação são possíveis, como NASPA, LAMP, amplificação T7, PCR ou, em que a fita contínua é um círculo, replicação por círculo rolante. A etapa de detectar o produto da dupla ligação pode compreender proporcionar condições para a amplificação através das primeira e segunda junções de ligação da fita contínua de ácido nucleico, e detectar se um produto de amplificação está presente. Os produtos de ligação podem ser amplificados por amplificação clonal. As técnicas de amplificação adequados incluem amplificação por círculo rolante (ver abaixo), ponte de PCR (Adessi C, et al., Nucleic Acids Res. 2000 Oct 15;28(20):E87), PCR em emulsão (PCR digital em emulsões foi descrito por Dressman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 22 de julho; 100 (15): 8817-22. Epub 2003 Jul 11) e PCR digital (Vogelstein & Kinzler, Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 3 de agosto; 96(16):9236-41). Amplificação clonal localizada em géis foi descrita por Mitra & Church, Nucleic Acids Res. 1999 15 de dezembro; 27 (24): E34.
[00114] Sempre que o produto de dupla ligação é um círculo de ácido nucleico, uma forma conveniente de detectar o produto é proporcionar condições para a replicação do círculo rolante e para detectar se um produto de replicação por círculo rolante está presente. O produto de replicação por círculo rolante é dependente de dupla ligação para proporcionar o círculo de ácido nucleico para a amplificação. Replicação por círculo rolante foi descrita em US 5.854.033 (Lizardi) e Fire & Xu, Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 May 9;92(10):4641-5. Replicação de círculo rolante é uma amplificação de uma molécula de ácido nucleico circular usando uma DNA polimerase de deslocamento de fita, resultando em grandes moléculas de DNA que contêm repetições em tandem da sequência amplificada. A DNA polimerase catalisa a extensão do iniciador e deslocamento de fita na reação de polimerização de um círculo rolante em processo que procede tanto quanto desejado. Isso resulta em uma amplificação das ordens de grandeza da sequência da sonda circularizada maiores do que um único ciclo de replicação de PCR e outras técnicas de amplificação, em que cada ciclo é limitado a uma duplicação do número de cópias de uma sequência alvo. Amplificação adicional pode ser obtida usando uma cascata de reações de deslocamento de fita. Replicação por rolante círculo pode ser replicação por círculo rolante hiperrramificada. RCA hiperrramificada foi descrita por Lizardi et al., Nat Genet. Jul 1998; 19(3):225-32. Condições para a replicação por círculo rolante encontram-se ilustradas nos Exemplos, por exemplo, a incubação com 1U de polimerase phi29 (New England Biolabs) pode ser adicionado no correspondente tampão phi29 e nucleotídeos (dNTPs) a 37 ° C durante 1 hora .
[00115] Após a replicação por círculo rolante, as sequências de sondas amplificadas podem ser detectadas e quantificadas utilizando qualquer um dos sistemas convencionais de detecção de ácidos nucleicos, como a detecção de marcadores fluorescentes, sistemas de detecção ligados à enzima, a detecção de marcador mediada por anticorpos, e a detecção de marcadores radioativos. Preferencialmente, um produto de amplificação por círculo rolante é detectado por hibridização de um oligonucleotídeo de detecção marcada com um motivo no produto RCA, por exemplo, um motivo em uma sequência customizada da sonda. Uma vez que o produto amplificado é diretamente proporcional à quantidade de sequência alvo presente em uma amostra, medições quantitativas representam de forma confiável a quantidade de uma sequência alvo em uma amostra. As principais vantagens deste método são que a etapa de ligação pode ser manipulada para obter a discriminação alélica, a etapa de replicação de DNA é isotérmica, e os sinais são estritamente quantitativos, porque a reação de amplificação é linear e é catalisada por uma enzima altamente processiva. Em ensaios multiplex, o oligonucleotídeo iniciador utilizado para a reação de polimerase de DNA pode ser o mesmo para todas as sondas.
[00116] Para sondas, em que as sequências inicial e final estão em moléculas separadas de ácido nucleico, pode ser conveniente usar métodos de captura/detecção. O produto da dupla ligação contém as sequências inicial e final em uma única molécula de ácido nucleico (a fita contínua), enquanto que as sondas não ligadas não. Por conseguinte, o produto da dupla ligação pode ser especificamente detectado através da captura da molécula de ácido nucleico contendo a sequência inicial, lavando para remover o ácido nucleico da sonda não ligado, em seguida, detectando a presença da sequência final na fração capturada. Alternativamente, o produto de dupla ligação pode ser detectado através da captura da molécula de ácido nucleico contendo a sequência final, lavando para remover o ácido nucleico da sonda não ligada, em seguida, detectando a presença da sequência inicial na fração capturada. A detecção é específica para as sondas ligadas, uma vez que as sequências inicial e final das sondas não ligadas estão ligadas apenas por hibridização entre os ácidos nucleicos e são separadas por lavagem, enquanto que as sondas ligadas contêm as sequências inicial e final de uma fita de ácido nucleico contínua, isto é, ligadas de forma covalente.
[00117] Uma sonda pode ser modificada para carrear uma fração de captura. A fração de captura pode permitir a ligação a um substrato sólido, tal como um grânulo. Uma fração de captura adequada é a biotina, que pareia com estreptavidina, permitindo que o ácido nucleico da sonda modificada seja isolado sobre o substrato sólido revestido com estreptavidina. Quando uma sonda compreende um oligonucleotídeo de estrutura principal contendo a sequência inicial ou final, e um ácido nucleico separado (oligonucleotídeo alvo, ou um segundo oligonucleotídeo de estrutura principal) contendo a final ou inicial, respectivamente, qualquer uma destas moléculas de ácido nucleico pode carrear uma fração de captura, por exemplo, pode ser biotinilada. Pode ser conveniente proporcionar a sonda com a fração de captura antes de combinar a sonda com a amostra. Alternativamente, a fração de captura pode ser introduzida após a etapa de ligação.
[00118] Quando uma molécula de ácido nucleico na sonda carreia uma fração de captura, a outra pode ter um marcador. É possível utilizar a própria sequência de ácido nucleico como um marcador, por exemplo, para detectar especificamente a presença da sequência inicial (em que a final é capturada) ou a sequência final (em que a inicial é capturada) ou para detectar uma sequência customizada que é única para a molécula de ácido nucleico a ser detectada. Um oligonucleotídeo complementar pode ser usado para a detecção. Alternativamente, o ácido nucleico pode ter um marcador heterogêneo, tal como um fluoróforo. O marcador heterogêneo não faz parte do próprio ácido nucleico. Outros marcadores que podem ser utilizados incluem, pontos quânticos, bioluminescência, cascatas de enzimas geradoras de sinal, como a amplificação de sinal de tiramida, e porções radioativas. O método pode então compreender a detecção da presença do marcador, por exemplo, a detecção de fluorescência, detecção dos pontos quânticos, detecção de bioluminescência, detecção do sinal gerado pela enzima, ou a detecção de radioatividade, respectivamente.
[00119] Como um exemplo, a etapa de detectar se o produto da dupla ligação está presente pode incluir a captura de um oligonucleotídeo da estrutura principal da sonda sobre um substrato através da fração de captura, lavando o substrato para remover as sondas não ligadas e retendo uma fração capturada compreendendo o substrato e oligonucleotídeo da estrutura principal capturado, e testando para a presença do produto da dupla ligação na fração capturada. Sempre que o produto de dupla ligação carrear um marcador, este pode compreender o teste para a presença do marcador na fração capturada.
[00120] A fração de captura pode ser uma molécula de biotina com afinidade para um substrato de estreptavidina. Outros marcadores de afinidade adequados incluem marcadores de polihistidina com afinidade aos íons metálicos imobilizados, como cobalto, níquel, cobre, que podem ser utilizados para a purificação de sequências que contêm histidina, por exemplo, oligonucleotídeos de estrutura principal. A fração de captura pode, assim, fazer parte da sequência a ser capturada, por exemplo, uma sequência His-tag, ou pode ser uma porção heterogênea, que não faz parte do próprio ácido nucleico.
[00121] Um substrato sólido adequado é um grânulo, por exemplo, grânulos magnéticos para facilitar o enriquecimento dos produtos capturados utilizando um ímã. O substrato pode ser revestido com um elemento de ligação para a fração de captura, por exemplo, esferas magnéticas revestidas com estreptavidina podem ser utilizadas com sondas biotiniladas.
[00122] Uma vantagem de algumas modalidades do presente método é que ele não depende de sequenciamento de ácidos nucleicos, nem de PCR, que geram os resultados tendenciosos porque algumas sequências amplificam mais eficientemente do que outras. Opcionalmente, no entanto, a detecção pode compreender uma etapa de validação da identidade do fragmento ligado por sequenciamento do produto. Uma das vantagens da presente invenção é que, através da incorporação do fragmento alvo real no produto da dupla ligação, o produto pode ser sequenciado para confirmar que as sondas reagiram com o alvo correto. Esta é uma vantagem em comparação com outras abordagens baseadas em dupla ligação como US20130172212 (Ariosa).
Multiplexação
[00123] Vários fragmentos de ácido nucleico alvo diferentes podem ser detectados utilizando uma pluralidade de sondas em paralelo. Por exemplo, uma amostra de cromossomos fragmentada pode ser colocada em contato com um conjunto de sondas para a ligação de fragmentos múltiplos de um cromossomo, em que cada sonda no conjunto é para a ligação de um fragmento alvo específico diferente para aquele cromossomo. As sondas podem partilhar uma sequência customizada comum, que pode ser usada como um código de barras para identificar as sondas que se ligam especificamente àquele cromossomo. Multiplexação pode incluir oligonucleotídeos multiplex de direcionamento e um oligonucleotídeo comum de estrutura principal, mas também vários conjuntos de oligonucleotídeos alvo, onde cada subconjunto hibridiza para separar oligonucleotídeos da estrutura principal.
[00124] Várias sondas podem ser utilizadas para proporcionar um sinal detectável, em que a grandeza do sinal é proporcional ao número de sondas que reconhecem os seus fragmentos alvos. Os sinais individuais a partir da pluralidade de sondas são convertidos em um único sinal detectável cumulativo, amplificando os sinais individuais através de sondagem multiplex. Dez ou mais sondas produzem um sinal de amplificação de dez vezes ou mais. Os sinais gerados dependem de as sondas reagirem corretamente no reconhecimento do alvo, utilizando uma sequência de hibridização específica e ligação para gerar os produtos específicos de ligação dupla a partir da qual é obtido o sinal.
[00125] Cada sonda que reconhece o seu fragmento alvo gera um produto de ligação, e os produtos de ligação produzidos por cada hibridização da sonda podem ser individualmente detectáveis, para que um sinal individual seja obtido a partir de cada. No entanto, uma característica elegante da presente invenção é que estes sinais individuais não precisam ser detectados individualmente, mas preferencialmente são fundidos em um sinal cumulativo e o sinal detectado é cumulativo. O sinal cumulativo é uma combinação dos sinais individuais e podem, portanto, ser usados para detectar e/ou quantificar os produtos de ligação, o que representa a presença ou a quantidade das espécies de ácido nucleico sob investigação. Algumas implementações do presente método permitem uma fusão anterior dos sinais da sonda em comparação com métodos de envolvendo sequenciamento e microarranjos, no qual os sinais individuais são gerados para várias sondas em toda uma região e, em seguida, o sinal é fundido na análise para representar uma região. O sinal pode ser fundido antes da detecção, de modo que os sinais individuais não sejam separadamente mapeados ou interrogados. Isso permite um formato de leitura simples.
[00126] Um sinal individual pode ser obtido a partir de cada produto da dupla ligação que é formado como resultado da hibridização da sonda a cada fragmento alvo. Assim, por exemplo, quando um conjunto de sondas compreende 10 sondas diferentes que reconhecem 10 fragmentos alvos de uma espécie de interesse em uma amostra, haverá 10 produtos de ligação incluindo junções de ligação, e um sinal cumulativo pode ser detectado, que é a combinação de sinais individuais a partir dos 10 produtos de ligação. Claro que, no presente exemplo, o número real das sondas de moléculas, fragmentos alvo e produtos de ligação pode ser maior do que 10, porque normalmente haverá múltiplas cópias de cada fragmento alvo em uma amostra e a amostra será contatada com múltiplas cópias de cada sonda.
[00127] Método de amplificação de sinal por multiplexação pode ser utilizado para detectar espécies de ácido nucleico de interesse em uma amostra, por exemplo, quando uma espécie de ácido nucleico é um componente menor ou traço em uma amostra de ácido nucleico complexa. A amplificação por multiplexação permite uma detecção confiável. Isto pode ser utilizado, por exemplo, para a detecção do ácido nucleico microbiano em amostras, como amostras de pacientes, para fins de diagnóstico. As amostras podem ser sondadas com sondas específicas para os ácidos nucleicos microbianos de várias espécies, para detectar e identificar aqueles presentes. Isto é útil para a detecção de agentes de doenças infecciosas, como bactérias, vírus e fungos. Transcrições de ácido nucleico específicas podem ser detectadas. A amplificação por multiplexação também pode ser utilizada para quantificar as espécies de ácido nucleico. Ao sondar duas ou mais espécies de ácido nucleico - uma ou mais espécies de interesse e uma ou mais espécies de ácido nucleico de referência - o método permite a quantificação das quantidades relativas das duas espécies na amostra. O método é especialmente útil quando aplicado para a detecção ou quantificação de cromossomos ou loci cromossômico, por exemplo para a detecção do número de cópias cromossômicas. Uma aplicação de um valor particular é a utilização de tais métodos para a identificação de defeitos cromossômicos, incluindo para o diagnóstico de canceres e aneuploidias congênitas. Uso para diagnóstico pré-natal não invasivo (NIPT) é descrito especificamente.
[00128] Uma espécie de ácido nucleico em uma amostra pode ser detectada através de contato da amostra com um conjunto de sondas de acordo com a presente invenção, em que cada sonda reconhece especificamente uma sequência alvo distinta nas espécies de ácido nucleico a serem detectadas. As sequências alvo correspondem aos fragmentos alvos das espécies de ácido nucleico. Reconhecimento de cada sequência alvo por cada sonda gera um produto de dupla ligação, tal como aqui descrito. Um sinal cumulativo pode então ser detectado, sendo esta uma combinação de sinais provenientes dos produtos. A detecção do sinal indica a presença da espécie de ácido nucleico na amostra. As espécies de ácido nucleico podem ser quantificadas através da quantificação do sinal cumulativo para determinar um nível de sinal, em que o nível do sinal é proporcional à quantidade das espécies de ácido nucleico na amostra, e desse modo determinando a quantidade das espécies de ácido nucleico na amostra. Uma primeira espécie de ácido nucleico pode ser quantificada em relação a uma segunda ou espécie de referência de ácido nucleico por contato da amostra com um primeiro conjunto de sondas e um segundo conjunto de sondas, em que as sondas do primeiro conjunto, cada uma, reconhece especificamente uma sequência alvo distinta dentro das primeiras espécies de ácido nucleico e em que as sondas do segundo conjunto, cada uma, reconhece especificamente uma sequência alvo distinta dentro da segunda ou espécie de referência ácido nucleico. Primeiro e segundo sinais cumulativos são detectados, o primeiro sinal cumulativo sendo uma combinação de sinais individuais de produtos gerados por sondas do primeiro conjunto que reconhecem as suas sequências alvo, e o segundo sinal cumulativo sendo uma combinação de sinais individuais de produtos gerados por sondas do segundo conjunto reconhecendo as suas sequências alvos. O primeiro e segundo sinais são quantificados para determinar o primeiro e segundo níveis de sinal, respectivamente, sendo estes proporcionais às quantidades da primeira e da segunda espécie de ácido nucleico na amostra. As quantidades relativas da primeira e da segunda espécie de ácido nucleico na amostra podem assim ser determinadas através da comparação do primeiro e segundo níveis de sinal.
[00129] Por exemplo, o sinal cumulativo pode ser a enumeração resumida de produtos amplificado por clonagem e/ou marcados das sondas que reconhecem as suas sequências alvo, por exemplo, produtos de amplificação por círculo rolante, ou um sinal fluorescente emitido a partir de todos os produtos em que cada produto emite sinal fluorescente. Para quantificar as quantidades relativas de várias espécies de ácidos nucleicos, sinais diferentes são usados para cada espécie, por exemplo, produtos de um conjunto de sondas pode emitir um comprimento de onda diferente ou espectro de fluorescência em comparação com produtos de outro conjunto de sondas.
[00130] Uma espécie de ácido nucleico em uma amostra pode ser detectada por um método, que compreende
[00131] contatar a amostra com um conjunto de sondas, em que cada sonda reconhece especificamente uma sequência alvo distinta dentro das espécies de ácido nucleico sendo detectadas,
[00132] fornecer condições desnaturantes em que as sequências alvo nas espécies de ácido nucleico são de fita simples,
[00133] fornecer condições para hibridização e ligação, as condições sob as quais as sondas hibridizam com as suas sequências alvo e geram produtos de ligação, e
[00134] detectar um sinal cumulativo que é uma combinação de sinais individuais de todos os produtos de ligação,
[00135] em que a detecção do sinal indica a presença da espécie de ácido nucleico na amostra.
[00136] Detalhes da amostra, o ácido nucleico alvo, etapas do método (por exemplo, desnaturação, pareamento, ligação) e sondas são aqui descritas em outro local. O método pode compreender: (i) proporcionar uma amostra na qual as espécies de ácido nucleico são fragmentadas em fragmentos alvo, (ii) proporcionar condições de desnaturação em que os fragmentos alvo são de fita simples (iii) contatar a amostra com um conjunto de sondas, em que cada sonda reconhece especificamente uma sequência alvo distinta dentro das espécies de ácido nucleico sendo detectadas, em que as sequências alvo são as sequências de fragmentos alvo, e em que cada sonda compreende
[00137] um oligonucleotídeo alvo que é mais longo do que o fragmento alvo e que contém uma sequência alvo complementar interna, de modo a que a hibridização entre o oligonucleotídeo alvo e o fragmento alvo constitui uma sequência de fita dupla localizada entre as sequências flanqueadoras a montante e a jusante do oligonucleotídeo alvo, e
[00138] sequências inicial e final tendo extremidades livres 5’ e 3', respectivamente, em que as sequências inicial e final são complementares às sequências flanqueadoras a montante e a jusante, respectivamente, (iv) proporcionar condições de anelamento sob as quais as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, e fragmentos alvo, se presente, hibridizam com a sequência complementar alvo das sondas, desse modo, posicionando as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final (v) proporcionar condições para a ligação de modo que, se um fragmento alvo está presente, a extremidade 3’ do fragmento alvo está ligada à extremidade 5' da sequência inicial para formar uma primeira junção de ligação, e a extremidade 5’ do fragmento alvo está ligada à extremidade 3’ da sequência final de modo a formar uma segunda junção de ligação, a produção de um produto de dupla ligação que compreende uma fita contínua de ácido nucleico compreendendo as sequências inicial e final e o fragmento alvo, e (vi) detectar um sinal cumulativo que é uma combinação de sinais individuais de todos os produtos,
[00139] em que a detecção do sinal indica a presença da espécie de ácido nucleico na amostra.
[00140] As espécies de ácido nucleico podem ser quantificadas por um método que compreende (i) proporcionar uma amostra na qual as espécies de ácido nucleico são fragmentadas em fragmentos alvo (ii) proporcionar condições de desnaturação em que os fragmentos alvo são de fita simples (iii) contatar a amostra com um conjunto de sondas, em que cada sonda reconhece especificamente um fragmento alvo distinto das espécies de ácido nucleico sendo quantificadas, em que cada sonda compreende
[00141] um oligonucleotídeo alvo que é mais longo do que o fragmento alvo e que contém uma sequência alvo complementar interna, de modo a que a hibridização entre o oligonucleotídeo alvo e o fragmento alvo constitui uma sequência de fita dupla localizada entre as sequências flanqueadoras a montante e a jusante do oligonucleotídeo alvo, e
[00142] sequências inicial e final tendo extremidades livres 5’ e 3', respectivamente, em que as sequências inicial e final são complementares às sequências flanqueadoras a montante e a jusante, respectivamente, (iv) proporcionar condições de anelamento sob as quais as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, e fragmentos alvo, se presente, hibridizam com a sequência complementar alvo das sondas, desse modo, posicionando as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final (v) proporcionar condições para a ligação de modo que, se um fragmento alvo está presente, a extremidade 3’ do fragmento alvo está ligada à extremidade 5' da sequência inicial para formar uma primeira junção de ligação, e a extremidade 5’ do fragmento alvo está ligada à extremidade 3’ da sequência final de modo a formar uma segunda junção de ligação, produzindo um produto de dupla ligação que compreende uma fita contínua de ácido nucleico compreendendo as sequências inicial e final e o fragmento alvo, (vi) detectar um sinal cumulativo que é uma combinação de sinais individuais de todos os produtos de ligação, e (vii) quantificar o sinal cumulativo para determinar um nível de sinal, em que o nível do sinal é proporcional à quantidade das espécies de ácido nucleico na amostra, e
[00143] determinando, assim, a quantidade de espécies de ácido nucleico na amostra.
[00144] método pode ser usado para quantificar uma primeira espécie de ácido nucleico em relação a uma segunda espécie de ácido nucleico em uma amostra. O método pode compreender: (i) proporcionar uma amostra em que a primeira e a segunda espécie de ácido nucleico são fragmentadas em fragmentos alvo (ii) proporcionar condições de desnaturação em que os fragmentos alvo são de fita simples (iii) contatar a amostra com um primeiro conjunto de sondas e um segundo conjunto de sondas, em que as sondas do primeiro conjunto reconhecem especificamente fragmentos alvo distintos da primeira espécie de ácido nucleico e em que as sondas do segundo conjunto especificamente reconhecem fragmentos alvo distintos da segunda espécie de ácido nucleico, em que cada sonda compreende
[00145] um oligonucleotídeo alvo que é mais longo do que o fragmento alvo e que contém uma sequência alvo complementar interna, de modo a que a hibridização entre o oligonucleotídeo alvo e o fragmento alvo constitui uma sequência de fita dupla localizada entre as sequências flanqueadoras a montante e a jusante do oligonucleotídeo alvo, e
[00146] sequências inicial e final tendo extremidades livres 5’ e 3', respectivamente, em que as sequências inicial e final são complementares às sequências flanqueadoras a montante e a jusante, respectivamente, (iv) proporcionar condições de anelamento sob as quais as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, e fragmentos alvo, se presente, hibridizam com a sequência complementar alvo das sondas, desse modo, posicionando as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final (v) proporcionar condições para a ligação de modo que, se um fragmento alvo está presente, a extremidade 3’ do fragmento alvo está ligada à extremidade 5' da sequência inicial para formar uma primeira junção de ligação, e a extremidade 5’ do fragmento alvo está ligada à extremidade 3’ da sequência final de modo a formar uma segunda junção de ligação, produzindo um produto de dupla ligação que compreende uma fita contínua de ácido nucleico compreendendo as sequências inicial e final e o fragmento alvo, (vi) detectar um primeiro sinal cumulativo que é uma combinação de sinais individuais dos produtos de ligação gerados por sondas do primeiro conjunto, e sua quantificação para determinar um primeiro nível de sinal, em que o primeiro nível de sinal é proporcional à quantidade da primeira espécie de ácido nucleico na amostra, (vii) detectar um segundo sinal cumulativo que é uma combinação de sinais individuais dos produtos de ligação gerados por sondas do segundo conjunto, e sua quantificação para determinar um segundo nível de sinal, em que o segundo nível de sinal é proporcional à quantidade da segunda espécie de ácido nucleico na amostra, e (viii) comparar o primeiro e segundo níveis de sinal, determinando, assim, as quantidades relativas da primeira e da segunda espécies de ácido nucleico na amostra.
[00147] Geralmente, o número de sondas será de, pelo menos, dez para cada uma das espécies de ácido nucleico a ser detectada ou quantificada. O número de curso se refere ao número de sondas diferentes, em vez do número absoluto de moléculas da sonda. Consequentemente, o ácido nucleico conterá, pelo menos, dez sequências alvo específicas diferentes, e o sinal cumulativo é uma combinação de sinais individuais de pelo menos dez sondas originais, este sinal cumulativo representando uma espécie de ácido nucleico. Altos níveis de multiplex podem ser utilizados para obter correspondentemente elevados níveis de amplificação do sinal. Por exemplo, pelo menos 100, pelo menos 1000, pelo menos, 10.000 ou mesmo um maior número de sondas pode ser utilizado para cada uma das espécies de ácido nucleico a ser detectada ou quantificada.
[00148] O método pode compreender o contato de uma amostra de cromossomos fragmentados com vários conjuntos de sondas para a ligação de múltiplos fragmentos de dois ou mais cromossomos, que compreende:
[00149] um primeiro conjunto de sondas para a ligação de uma pluralidade de fragmentos específicos alvos para um primeiro cromossomo, e
[00150] um segundo conjunto de sondas para a ligação de uma pluralidade de fragmentos alvo específicos para um segundo cromossomo, e opcionalmente
[00151] um ou mais conjuntos de sondas para a ligação de uma pluralidade de fragmentos alvo específicos para um ou mais cromossomos.
[00152] Sondas dentro de um conjunto podem compartilhar uma sequência customizada que é comum a esse conjunto e difere das sequências customizadas de sondas em outros conjuntos, permitindo que as sondas de cada conjunto sejam convenientemente identificadas. Cada conjunto de sondas pode conter, pelo menos, 500, 600, 700, 800, 900 ou pelo menos 1.000 sondas diferentes para a ligação de uma pluralidade de fragmentos alvo específicos para o cromossomo. Por exemplo, um método pode utilizar 1.000 diferentes oligonucleotídeos alvo para cada um dos cromossomos 21, 13 e 18, respectivamente, e três oligonucleotídeos da estrutura principal diferentes, um para cada subconjunto de cromossomo.
[00153] É possível determinar as quantidades relativas dos dois ou mais cromossomos de uma amostra por meio da detecção dos produtos de dupla ligação para cada conjunto de sondas e a detecção das quantidades relativas das sequências customizadas nos referidos produtos.
[00154] Utilizando sondas de oligonucleotídeos em que os oligonucleidos de direcionamento a montante e a jusante formam um círculo, motivos que codificam alelos específicos ou loci podem ser incorporados na sequência customizada em multiplex elevado.
Cariotipagem Digital e Diagnóstico pré-natal não invasivo
[00155] Algumas modalidades do presente método podem oferecer vantagens particulares em campos onde a quantificação precisa de DNA alvo é buscada. Isto inclui um número de técnicas de diagnóstico à base de ácido nucleico. Uma dessas áreas é a análise de DNA do câncer em uma amostra biológica (por exemplo, sangue) a partir de um paciente. Outra área é a de diagnóstico pré-natal não invasivo por análise do DNA livre de células (NIPT).
[00156] Um desafio com NIPT é que um grande número de fragmentos de genoma específicos deve ser contado a fim de alcançar a confiança estatística necessária para diagnosticar uma aneuploidia cromossômica anormal (diferenças do número de cópias do cromossomo). Uma vez que o DNA fetal é misturado com o DNA materno, tornando-se 4-30% do material genético na corrente sanguínea de uma mulher grávida, observar uma aneuploidia cromossômica no DNA fetal requer uma medição muito precisa.
[00157] As sondas aqui descritas podem ser utilizadas para a análise de DNA fetal circularizante livre em amostras de sangue materno. Ao usar uma pluralidade de sondas dirigidas para diferentes fragmentos de um cromossomo e uma pluralidade de sondas dirigidas para diferentes fragmentos de um segundo cromossomo, as sondas permitem um desequilíbrio no número relativo dos dois cromossomos na amostra a ser determinado com alta confiança. Isso permite que aneuploidias cromossômicas, como a trissomia sejam diagnosticadas a partir do DNA fetal mesmo contra o elevando background do DNA materno.
[00158] As sondas aqui descritas podem ser utilizadas para testar amostras de sangue materno de mulheres grávidas, para detectar o ácido nucleico fetal para o diagnóstico de anomalias cromossômicas como Trissomia, testando amostras de pacientes para o DNA do tumor para o diagnóstico ou monitoramento da presença de um tumor no paciente. Outros usos incluem amostras de ensaio de material para a presença de ácido nucleico microbiano, em que a detecção do ácido nucleico indica infecção microbiana do material pelo micróbio, que pode ser um agente infeccioso, tal como uma bactéria, vírus ou fungo. A amostra pode ser uma amostra de tecido ou de sangue de um paciente.
[00159] Mais geralmente, usando centenas ou milhares de sondas diferentes, o presente método pode conseguir alta precisão por detecção de centenas ou milhares de fragmentos de ácido nucleico específicos, fornecendo vantagens em uma variedade de aplicações de diagnóstico. Detecção de uma multiplicidade de fragmentos de DNA do cromossomo ou loci cromossômicos associados a uma doença particular, permite que a quantidade daquele cromossomo ou locus seja medida em relação a um cromossomo de controle ou um locus, de modo que mesmo pequenas diferenças de uma amostra podem ser detectadas com segurança.
[00160] Ao analisar fragmentos alvos curtos uma grande proporção do DNA isento de células altamente fragmentado no sangue materno pode ser analisada com alta eficiência. Isto é importante uma vez que quantidades muito pequenas de DNA isento de células estão disponíveis no sangue materno.
[00161] Um método de quantificação de um primeiro cromossomo ou locus cromossômico em relação a um segundo cromossomo ou locus cromossômico em uma amostra de ácido nucleico obtida de uma indivíduo pode compreender (i) proporcionar uma amostra na qual o primeiro e o segundo cromossomos ou loci cromossômicos são fragmentados em fragmentos alvo (ii) proporcionar condições de desnaturação em que os fragmentos alvo são de fita simples (iii) contatar a amostra com um primeiro conjunto de sondas e um segundo conjunto de sondas, em que as sondas do primeiro conjunto reconhecem especificamente fragmentos alvo distintos do primeiro cromossomo e em que as sondas do segundo conjunto especificamente reconhecem fragmentos alvo distintos do segundo cromossomo, em que cada sonda compreende
[00162] um oligonucleotídeo alvo que é mais longo do que o fragmento alvo e que contém uma sequência alvo complementar interna, de modo a que a hibridização entre o oligonucleotídeo alvo e o fragmento alvo constitui uma sequência de fita dupla localizada entre as sequências flanqueadoras a montante e a jusante do oligonucleotídeo alvo, e
[00163] sequências inicial e final tendo extremidades livres 5’ e 3', respectivamente, em que as sequências inicial e final são complementares às sequências flanqueadoras a montante e a jusante, respectivamente, (iv) proporcionar condições de anelamento sob as quais as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, e fragmentos alvo, se presente, hibridizam com a sequência complementar alvo das sondas, desse modo, posicionando as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final (v) proporcionar condições para a ligação de modo que, se um fragmento alvo está presente, a extremidade 3’ do fragmento alvo está ligada à extremidade 5' da sequência inicial para formar uma primeira junção de ligação, e a extremidade 5’ do fragmento alvo está ligada à extremidade 3’ da sequência final de modo a formar uma segunda junção de ligação, produzindo um produto de dupla ligação que compreende uma fita contínua de ácido nucleico compreendendo as sequências inicial e final e o fragmento alvo, (vi) detectar um primeiro sinal cumulativo que é uma combinação de sinais individuais dos produtos de ligação gerados por sondas do primeiro conjunto, e sua quantificação para determinar um primeiro nível de sinal, em que o primeiro nível de sinal é proporcional à quantidade do primeiro cromossomo ou o locus cromossômico na amostra, (vii) detectar um segundo sinal cumulativo que é uma combinação de sinais individuais dos produtos de ligação gerados por sondas do segundo conjunto, e sua quantificação para determinar um segundo nível de sinal, em que o segundo nível de sinal é proporcional à quantidade do segundo cromossomo ou locus cromossômico na amostra, e (viii) comparar o primeiro e segundo níveis de sinal, determinando-se assim as quantidades relativas do primeiro e segundo cromossomos ou loci cromossômico na amostra.
[00164] método pode ser utilizado para o diagnóstico de aneuploidia (por exemplo, trissomia) em um feto, em que a amostra de ácido nucleico é uma amostra obtida a partir de sangue materno e contém DNA fetal isento de células misturado com DNA materno, e em que uma proporção desigual do primeiro e segundo níveis de sinal é indicativo de aneuploidia (por exemplo, trissomia).
Sondas
[00165] Outros aspectos incluem sondas adequadas para utilização no presente método. Exemplos de sondas e as suas características já foram descritos acima. Algumas características adicionais e exemplos são aqui descritos.
[00166] A sonda de ácido nucleico é preferencialmente DNA. No entanto, pode ser um outro ácido nucleico, de ocorrência natural ou não. As bases padrão de DNA são A, T, C e G, mas a sonda de ácido nucleico pode, opcionalmente, incluir nucleotídeos não padrões.
[00167] De um modo geral, uma sonda, de acordo com a presente invenção compreende um oligonucleotídeo alvo e sequências inicial e final. As sequências inicial e final podem fazer parte do oligonucleotídeo alvo, ou um ou ambos podem estar em uma molécula de ácido nucleico diferente. Opcionalmente, a sonda compreende o oligonucleotídeo alvo, um oligonucleotídeo de estrutura principal compreendendo a sequência inicial e um oligonucleotídeo de estrutura principal compreendendo a sequência da final. Uma sonda pode, portanto, compreender uma, duas ou três moléculas de ácido nucleico na sua forma não ligada.
[00168] O oligonucleotídeo alvo é maior do que o fragmento alvo e contém uma sequência complementar alvo interna, de modo a que a hibridização entre o oligonucleotídeo alvo e o fragmento alvo forma uma sequência de fita dupla localizada entre as sequências flanqueadoras a montante e a jusante do oligonucleotídeo alvo. As sequências inicial e final têm extremidades livres 5’ e 3’, respectivamente, e são complementares às sequências flanqueadoras a montante e a jusante, respectivamente. Sob condições de anelamento na presença do fragmento alvo, as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, que define um intervalo entre extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final, em que o fragmento alvo hibridiza para a sequência complementar alvo no intervalo, assim, posicionando as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ das sequências da final.
[00169] As sondas podem ser concebidas de modo a que a hibridização do fragmento alvo no intervalo complete um círculo de ácido nucleico, o círculo compreendendo o fragmento alvo e as sequências inicial e final.
[00170] A sequência inicial e/ou a final da sonda é preferencialmente unida a uma sequência customizada, que não é complementar com outras regiões da sonda ou do fragmento alvo.
[00171] Em algumas modalidades da sonda, uma única molécula de ácido nucleico compreende sequências inicial e final.
[00172] As sequências inicial e final podem ser separadas a partir do oligonucleotídeo alvo de forma que eles se ligam em trans com as sequências flanqueadoras. Por exemplo, as sequências inicial e final pode estar nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente, de um oligonucleotídeo de estrutura principal. Uma sequência customizada pode ser incluída entre as sequências inicial e final de oligonucleotídeo de estrutura principal. Um exemplo de uma tal sonda é mostrado na Figura 1 e na Figura 3. Alternativamente, as sequências inicial e final de oligonucleotídeo de estrutura principal podem ser adjacentes, sem qualquer sequência de nucleotídeos intervenientes. Em tal caso, as sequências flanqueadoras do oligonucleotídeo alvo hibridizam ao longo de todo o comprimento do oligonucleotídeo de estrutura principal e podem circularizar o mesmo.
[00173] As sondas podem ser concebidas de modo a que a sequência inicial é uma extremidade 5’ do oligonucleotídeo alvo e/ou a sequência final é uma extremidade 3’ do oligonucleotídeo alvo, de modo a que a hibridização do fragmento alvo no intervalo completa uma fita de nucleico ácido compreendendo o fragmento alvo, as sequências inicial e final, a sequência complementar alvo e as sequências flanqueadoras. As sequências inicial e final podem estar nas extremidades do oligonucleotídeo alvo e ligam em cis com as sequências flanqueadoras. Um exemplo de uma tal sonda é mostrado na Figura 4. Nesta versão da sonda, as sequências inicial e final e a sequência complementar alvo todos se tornam circularizadas com o fragmento alvo. Sequências customizadas podem ser posicionadas nas alças do oligonucleotídeo. A sonda de ácido nucleico que é relativamente longa, mas tem a vantagem de se unir à estrutura de oligonucleotídeo em uma molécula que é pré-montada e não necessita de hibridização de moléculas de ácido nucleico de sondas diferentes.
[00174] As sondas também podem ser concebidas com um oligonucleotídeo de estrutura principal, que é uma molécula de ácido nucleico separada a partir do oligonucleotídeo alvo. A sequência da final pode ser uma extremidade 3' do oligonucleotídeo alvo e a sequência inicial uma extremidade 5' de um oligonucleotídeo de estrutura principal. Alternativamente, a sequência pode ser uma inicial extremidade 5' do oligonucleotídeo alvo e a sequência final uma extremidade 3’ de um oligonucleotídeo de estrutura principal. Uma sequência customizada pode ser introduzida no oligonucleotídeo alvo, por exemplo, para proporcionar um laço entre a sequência inicial ou a final e a sequência flanqueadora. Uma vantagem com o uso desta abordagem é que a sonda de uma sequência de detecção pode ser introduzida no circuito e está associada com a sequência complementar alvo, o que pode ser vantajoso para os métodos de multiplex, multiplexes especialmente elevados com esquemas de detecção de alta-plex. O oligonucleotídeo da estrutura principal pode compreender ainda uma sequência customizada. Ao fornecer a sonda em dois oligonucleotídeos, as moléculas de ácido nucleico sonda são mais curtas do que a versão de apenas oligonucleotídeo, mas mantêm a mesma função.
[00175] Um outro projeto da sonda proporciona as sequências inicial e final em dois oligonucleotídeos da estrutura principal. Assim, a sonda compreende
[00176] um oligonucleotídeo alvo que é mais longo do que o fragmento alvo e que contém uma sequência complementar alvo interna, de modo a que a hibridização entre o oligonucleotídeo alvo e o fragmento alvo constitui uma sequência de fita dupla localizada entre as sequências flanqueadoras a montante e a jusante do oligonucleotídeo alvo,
[00177] um oligonucleotídeo de estrutura principal compreendendo uma sequência inicial que tem uma extremidade 5’ livre, e
[00178] um oligonucleotídeo de estrutura principal compreendendo uma sequência final tendo uma extremidade 3’ livre,
[00179] em que as sequências de oligonucleotídeos inicial e final são complementares às sequências flanqueadoras a montante e a jusante, respectivamente.
[00180] Um oligonucleotídeo de estrutura principal pode carrear uma fração de captura, em cujo caso o outro oligonucleotídeo da estrutura principal é utilizado para detecção e pode transportar um marcador heterogêneo. Um ou ambos oligonucleotídeos de estrutura principal podem compreender ainda uma sequência customizada. Alternativamente ou adicionalmente, o oligonucleotídeo alvo pode incluir uma sequência customizada.
[00181] Sob condições de anelamento na presença do fragmento alvo, as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, que define um intervalo entre extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final, em que o fragmento alvo hibridiza para a sequência complementar alvo no intervalo, assim, posicionando as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ das sequências da final. A hibridização do fragmento alvo no intervalo completa uma fita de ácido nucleico que compreende o fragmento alvo e as sequências inicial e final. A fita carreia a fração de captura e o marcador, permitindo a detecção utilizando métodos de captura/detecção descritos neste documento.
Kits e conjuntos de sondas
[00182] Um aspecto adicional da presente divulgação é um conjunto de sondas para a ligação de fragmentos de ácido nucleico alvo de fita simples, que compreende uma pluralidade de sondas, as sondas que têm uma pluralidade de diferentes sequências alvo complementares para a ligação de múltiplos fragmentos alvos diferentes.
[00183] O conjunto de sondas pode ser para ligação de múltiplos fragmentos num cromossomo humano, em que cada sonda no conjunto é para a ligação de um fragmento alvo diferente específico para aquele cromossomo. Tais sondas podem todas incluir uma sequência customizada comum, como parte do oligonucleotídeo alvo ou como parte de um oligonucleotídeo da estrutura principal.
[00184] Vários conjuntos de sondas podem ser fornecidos para a ligação de fragmentos diferentes de dois ou mais cromossomos humanos, compreendendo:
[00185] um primeiro conjunto de sondas para a ligação de uma pluralidade de fragmentos específicos alvos para um primeiro cromossomo, e
[00186] um segundo conjunto de sondas para a ligação de uma pluralidade de fragmentos alvo específicos para um segundo cromossomo, e opcionalmente
[00187] um ou mais conjuntos de sondas para a ligação de uma pluralidade de fragmentos alvo específicos para um ou mais cromossomos. As sondas dentro de um conjunto podem compartilhar uma sequência customizada que é comum a esse conjunto e difere das sequências customizadas de sondas em outros conjuntos.
[00188] Os kits também podem ser fornecidos, compreendendo conjuntos de sondas em solução em um ou mais recipientes.
Usos
[00189] As sondas, conjuntos de sondas e kits aqui descritos podem ser utilizados para testar amostras para a presença de fragmentos de ácido nucleico alvos. Eles podem ser usados para identificar a presença de um fragmento alvo definido em uma amostra de ácido nucleico fragmentado in vitro.
[00190] Um aspecto inclui a utilização de uma sonda para testar uma amostra quanto à presença de um fragmento de ácido nucleico de fita simples alvo,
[00191] em que a sonda compreende um oligonucleotídeo alvo contendo uma sequência que é o complemento exato do fragmento alvo, e sequências de oligonucleotídeos inicial e final que hibridizam adjacentes ao fragmento alvo no oligonucleotídeo alvo,
[00192] em que a hibridização entre o fragmento alvo e a sonda moldam o fragmento alvo para ligação às sequências inicial e da final.
[00193] Exemplos de tais sondas e da sua utilização em métodos de amostras de teste são descritos em mais detalhes em outra parte deste documento. Os usos incluem testar amostras de sangue materno de mulheres grávidas, para detectar o ácido nucleico fetal para o diagnóstico de anomalias cromossômicas como Trissomia, e testar amostras de doentes para DNA de tumor para o diagnóstico ou monitoramento da presença de um tumor no paciente. Outros usos incluem amostras de ensaio de material para a presença de ácido nucleico microbiano, em que a detecção do ácido nucleico indica infecção microbiana do material pelo micróbio, que pode ser um agente infeccioso, tal como uma bactéria, vírus ou fungo. A amostra pode ser uma amostra de tecido ou de sangue de um paciente.
EXEMPLOS
[00194] O exemplo seguinte é fornecido para demonstrar e ilustrar mais certas modalidades e aspectos da presente invenção e não devem ser interpretados como limitativos do seu escopo. EXEMPLO 1
[00195] Um protocolo adequado para realizar o método ilustrado na Figura 1 é como segue: 1) 10 ng de DNA são digeridos com 1 unidade de enzima de restrição em tampão de enzima de restrição compatível correspondente. A reação é incubada em 37C durante 1 h, seguida por desativação enzimática a 80C durante 20 min. 2) Os fragmentos de DNA são desnaturados aos fragmentos de fita simples a 95C durante 10 min e misturados com sondas e ligase para formar círculos. O pool de sonda é adicionado na concentração individual de 10 pM, juntamente com 1U de Ampligase (Epicentre) e incubado a 55C durante 1 hora em tampão de ligase. 3) 1U de exonuclease é adicionada para remover sondas e fragmentos que não reagiram. 1 U de lambda exonuclease (Epicentre) é adicionada a 37C durante 1 hora em tampão de exonuclease correspondente seguido de inativação da enzima a 80C durante 20 min. 4) Os círculos restantes são amplificados por RCA. 1U de polimerase phi29 (New England Biolabs) é adicionada em tampão phi29 correspondente e nucleotídeos (dNTPs) a 37C durante 1 h. EXEMPLO 2
[00196] Um protocolo adequado para realizar o método ilustrado na Figura 2 é como segue: 1) 10 ng de DNA são digeridos com 1 unidade de enzima de restrição em tampão de enzima de restrição compatível correspondente. A reação é incubada em 37C durante 1 h, seguida por desativação enzimática a 80C durante 20 min. 2) Os fragmentos de DNA são desnaturados aos fragmentos de fita simples a 95C durante 10 min e misturados com sondas e ligase para formar produtos de ligação lineares. O pool de sonda é adicionado na concentração individual de 10 pM, juntamente com 1U de Ampligase (Epicentre) e incubado a 55C durante 1 hora em tampão de ligase. 3) O produto de ligação é capturado em grânulos de estreptavidina magnéticos. Para remover sondas e fragmentos que não reagiram, a solução é misturada com 10 ml de grânulos magnéticos revestidos com estreptavidina M-280 (invitrogen) em Tris-HCl (pH 7,5), 3,5 mM EDTA e 0,07% Tween-20, em um volume final de 200 ml, e incubada em temperatura ambiente durante 15 min. Após incubação, os grânulos são coletados utilizando um ímã e sobrenadante removido. EXEMPLO 3 Materiais e métodos
[00197] Preparação da amostra: 10ml de sangue foram coletados de cada sujeito em um tubo de DNA livre de células (Streck, Omaha, NE). O plasma foi isolado a partir do sangue por um protocolo de dupla centrifugação (1600 g durante 10 min, seguido de 16 000 g durante 10 minutos, depois um tubo de transferência após a primeira rotação). cfDNA foi isolado por kit de ácido nucleico ccf da Qiagen (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA resultante foi eluído em 50 ul de tampão (parte do kit de Qiagen).
[00198] Concepção da sonda e estrutura principal: A tecnologia de sondas multiplexadas aqui descrita permite a amplificação específica e simultânea de milhares de fragmentos cromossômicos. As sondas foram projetadas para capturar 2500-5000 fragmentos (alvos) de cada um dos cromossomos 21, 18 e 13. Os alvos foram selecionados para terem sequência única no genoma, composição uniforme AT/CG, não incluem polimorfismo conhecido nem CNVs na sequência alvo, e um tamanho entre 18-35bp. Sondas direcionadas a 2500 fragmentos de cada cromossomo 13 e 18 foram reunidos com 5000 sondas direcionadas a fragmentos do cromossomo 21 para criar um único conjunto de sondas de oligo.
[00199] Sequência exemplo de sondas, "N" representa sequência complementar alvo: ATGTGACCCTTCCGTCTGTTGAGTTAGGCCN- NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCGTGCCTTGTCATT CGGGAGCACTAACTGCTG (SEQ ID NO:1)
[00200] As estruturas principais, com sequências inicial e final complementares para as extremidades da sonda foram concebidas para incluir motivos de sequências, para ambos o sequenciamento e contagem digital. Duas estruturas principais foram utilizadas nos experimentos descritos na secção de resultados; um complementar às sondas direcionadas ao cromossomo 13 e 18: (/5Phos/CGCACACGATTAAGGTCCAGTCACAGGCAGAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCT CGGTGGTCGCCGTATCATTTCATGCTGCTAACGGTCGAGTCGGAC AGGTGGCTCCACTAAATAGACGCA); SEQ ID NO:2, e uma estrutura principal de direcionamento ao cromossomo 21: (/5Phos/GGCCTAACTCAACAGACGGAAGGGTCACATAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCT CGGTGGTCGCCGTATCATTTCATGCTGCTAACGGTCGAGCAGTTA GTGCTCCCGAATGACAAGGCACGA; SEQ ID NO:3).
[00201] Protocolo de sonda bioquímica: 50ul de cfDNA purificado foram digeridos com 5U de MseI (New England Biolabs) em tampão 1x NEB4 (New England Biolabs) e 1x BSA em um volume total de 55ul a 37C em 30 min seguido por inativação pelo calor a 65C em 20 minutos. O DNA digerido foi depois misturado com mistura de ligação juntamente com sondas e estruturas principais. Os 55ul de DNA digerido foram misturados com sondas (1pM/sonda), estruturas principais (60 nM cada), 1x tampão de ligação (Epicentre), 100 U de Ampligase (Epicentre), 1 mM de NAD, e 5 mM de Mg 2+ para um volume total de 70ul. Os fragmentos digeridos foram primeiramente desnaturados para DNA de fita simples a 95C em 5 min, seguido por hibridização e ligação a 55C em 16h. A mistura de ligação foi então tratada com exonucleases para remover quaisquer moléculas de DNA lineares restantes. A reação de ligação foi misturada com 20U de ExoI (NEB) e 5U de ExoIII (NEB) e 1x BSA tot volume total de 75ul a 37C durante 60 min, seguido por inativação pelo calor a 65C durante 10 min.
[00202] Análise: Para a análise de sequenciamento, os círculos tratados com exo foram amplificados com os iniciadores de sequenciamento complementares ao instrumento de sequenciamento Ilumina e subsequentemente carregados no instrumento Ilumina Miseq de acordo com protocolo do fabricante.
[00203] Para a análise digital, as reações tratadas com exo foram submetidas a uma reação de amplificação por círculo rolante (RCA) para gerar DNA objetos discretos de cópias concateméricas do círculo. 37,5ul de círculos tratados com exo foram misturados com 4 mM de DTT, 3U de phi29 polimerase (NEB), 0,1uM iniciador, 1 mM de dNTP mix (NEB) e 1x de BSA em um volume total de 50 uL e incubados a 37C durante 1 h seguido por inativação pelo calor a 65C durante 10 min. A reação de RCA foi então marcada com oligonucleotídeos marcados por fluorescência complementares para a sequência de estrutura principal. 50 ul de produtos RCA foram misturados com 0,1% de Tween 20 (Sigma), 5 nM oligonucleotídeos marcados, e 2x SSC (Sigma) em um volume total de 100 ul. Os produtos marcados com RCA foram finalmente depositados sobre uma lâmina de microscópio revestida com poli-lisina (Sigma) e contados em um microscópio fluorescente.
Resultados
[00204] O método de sonda aqui descrito foi demonstrado em sequenciamento Ilumina e um sistema de contagem digital. Para demonstrar o desempenho do método da sonda, uma amostra de DNA com trissomia 21, foi misturada com DNA extraído de amostras de plasma normal (3-5ml de plasma) em diferentes concentrações. As amostras foram então carreadas através do método da sonda e avaliadas por sequenciamento.
[00205] Para os resultados apresentados na Fig. 8, 100 ng de DNA da linhagem celular foram submetidos ao protocolo descrito acima. 10.000 sondas foram misturadas em um pool para circularizar especificamente 10.000 fragmentos cromossômicos correspondentes dos cromossomos 13, 18, e 21. Os 10.000 círculos resultantes foram então amplificados com iniciadores de PCR correspondentes de Ilumina e analisados em gel antes do sequenciamento. A pista 1 corresponde a escada de DNA, a pista 2 a amostra de DNA após a digestão, e a pista 3 o produto de PCR com 10.000 fragmentos amplificados.
[00206] Para os resultados apresentados na Fig. 9, 12 amostras de plasma normal foram analisadas em paralelo com amostras carreando DNA com trissomia 21 em diferentes concentrações. DNA foi extraído e processado através do protocolo sonda 10K-Plex e, finalmente, sequenciado em sequenciador Illumina. Utilizando um intervalo de confiança de 99% proporcionando especificidade, as amostras positivas são detectadas com uma sensibilidade de 90% com base nas distribuições normais estimadas.
[00207] Para demonstrar o princípio da conversão de fragmentos orientadas para objetos de DNA marcados, 10% do DNA com trissomia 21 foi adicionado a 20 ng de DNA linhagem celular normal e conduzido através do método da sonda. Os produtos RCA marcados resultantes foram depositados aleatoriamente em uma lâmina de microscópio e contados. Sondas de direcionamento aos fragmentos derivados do cromossomo 21 foram marcadas com uma cor e fragmentos derivados de Chr. 13 e 18 com uma cor de referência. Estes resultados são mostrados na Fig. 10. Painel (A) da Fig. 10 mostra uma imagem de um microscópio, mostrando produtos RCA marcados e detectados. Ao marcar todos os fragmentos do cromossomo 13 com um fluoróforo e fragmentos a partir de um cromossomo de referência com um segundo fluoróforo, uma razão de medição pode ser alcançada. Painel (B ): 20 ng de DNA processada por meio do protocolo sonda 10K-Plex e convertido para produtos RCA marcados. Os produtos RCA foram analisados em paralelo com amostras contendo uma adição de 10% de DNA de trissomia 21. 12 amostras de DNA normal (amostra # 1-12) foram analisadas em paralelo com três amostras positivas (amostra # 13-15).
DESCRIÇÃO MAIS DETALHADA
[00208] As seguintes cláusulas são parte da descrição.
[00209] 1. Método de teste de uma amostra para a presença de um fragmento de ácido nucleico alvo, que compreende (i) proporcionar uma amostra de ácido nucleico fragmentado (ii) proporcionar condições de desnaturação em que o fragmento alvo é de fita simples (iii) contatar a amostra com uma sonda de ácido nucleico compreendendo
[00210] um oligonucleotídeo alvo que é mais longo do que o fragmento alvo e que contém uma sequência alvo complementar interna, de modo a que a hibridização entre o oligonucleotídeo alvo e o fragmento alvo constitui uma sequência de fita dupla localizada entre as sequências flanqueadoras a montante e a jusante do oligonucleotídeo alvo, e
[00211] sequências inicial e final tendo extremidades 5’ e 3’ livres, respectivamente, em que as sequências inicial e da final são complementares às sequências flanqueadoras a montante e a jusante, respectivamente, (iv) proporcionar condições de anelamento sob as quais as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, e o fragmento alvo, se presente, hibridiza com a sequência alvo complementar, posicionando desse modo, as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final (v) proporcionar condições para a ligação de modo a que, se o fragmento alvo está presente, a extremidade 3’ do fragmento alvo está ligada à extremidade 5' da sequência inicial para formar uma primeira junção de ligação, e a extremidade 5’ do fragmento alvo está ligada à extremidade 3’ da sequência final de modo a formar uma segunda junção de ligação, produzindo um produto de dupla ligação que compreende uma fita contínua de ácido nucleico compreendendo as sequências inicial e da final e o fragmento alvo, e (vi) detectar se o produto da dupla ligação está presente,
[00212] em que a detecção do produto da dupla ligação indica a presença do fragmento de alvo na amostra.
[00213] 2. Método, de acordo com a cláusula 1, em que a amostra de ácido nucleico fragmentado é uma digestão pela enzima de restrição e o fragmento alvo é um fragmento de restrição.
[00214] 3. Método, de acordo com a cláusula 1 ou cláusula 2, em que a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ do fragmento alvo hibridizam com nucleotídeos adjacentes do oligonucleotídeo alvo, e a extremidade 3’ da sequência final e a extremidade 5' do fragmento alvo hibridizam com nucleotídeos adjacentes ao oligonucleotídeo alvo.
[00215] 4. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a etapa de detectar o produto da dupla ligação compreende proporcionar condições para a amplificação através da primeira e segunda junções de ligação da fita contínua de ácido nucleico, e detectar se um produto de amplificação está presente.
[00216] 5. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a fita contínua de ácido nucleico compreendendo as sequências inicial e final e o fragmento alvo é um círculo de ácido nucleico.
[00217] 6. Método, de acordo com a cláusula 5, em que a etapa de detectar o produto da dupla ligação compreende proporcionar condições para a replicação por círculo rolante e detectar se um produto de replicação por círculo rolante está presente.
[00218] 7. Método, de acordo com a cláusula 6, em que a replicação por círculo rolante é replicação por círculo rolante hiperramificada.
[00219] 8. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 5 a 7, em que a sonda compreende as sequências inicial e final de uma molécula de ácido nucleico.
[00220] 9. Método, de acordo com a cláusula 8, em que a sonda compreende um oligonucleotídeo de estrutura principal possuindo as sequências inicial e final nas suas extremidades 5’ e 3’, respectivamente, em que as sequências inicial e final do oligonucleotídeo de estrutura principal liga em trans para as sequências flanqueadoras do oligonucleotídeo alvo, nas condições de anelamento.
[00221] 10. Método, de acordo com a cláusula 9, em que o oligonucleotídeo da estrutura principal compreende uma sequência customizada entre as sequências inicial e final, em que a sequência customizada não é complementar para outras regiões da sonda ou do fragmento alvo.
[00222] 11. Método, de acordo com a cláusula 9, em que as sequências inicial e final de oligonucleotídeo da estrutura principal são adjacentes.
[00223] 12. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 5 a 8, em que as sequências inicial e final estão em extremidades do oligonucleotídeo alvo e ligam em cis para as sequências flanqueadoras, nas condições de anelamento.
[00224] 13. Método, de acordo com a cláusula 12, em que o oligonucleotídeo alvo compreende uma sequência customizada entre o oligonucleotídeo alvo e a sequência inicial e/ou final, em que a sequência customizada não é complementar para outras regiões da sonda ou do fragmento alvo.
[00225] 14. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 7, em que a sequência final está na extremidade 3’ do oligonucleotídeo alvo e a sonda compreende um oligonucleotídeo da estrutura principal tendo a sequência inicial na sua extremidade 5',
[00226] em que, nas condições de anelamento a sequência final se liga em cis para a sequência flanqueadora a jusante do oligonucleotídeo alvo e a sequência inicial do oligonucleotídeo da estrutura principal liga in trans a montante da sequência flanqueadora do oligonucleotídeo alvo.
[00227] 15. Método, de acordo com a cláusula 14, em que o oligonucleotídeo da estrutura principal compreende um par de sequências de repetição invertida, em que
[00228] sob as condições de anelamento as sequências de repetição invertidas formam uma estrutura em gancho, assim, o posicionando a extremidade 3’ do oligonucleotídeo da estrutura principal em justaposição com a extremidade 5’ do oligonucleotídeo alvo, e em que
[00229] sob as condições para ligação, a extremidade 5’ do oligonucleotídeo alvo é ligada à extremidade 3’ do oligonucleotídeo da estrutura principal, de modo que o produto da dupla ligação é um círculo de ácido nucleico que compreende o oligonucleotídeo alvo, o fragmento alvo e o oligonucleotídeo da estrutura principal.
[00230] 16. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 7, em que a sequência inicial está na extremidade 5’ do oligonucleotídeo alvo e a sonda compreende um oligonucleotídeo da estrutura principal tendo a sequência final na sua extremidade 3’,
[00231] em que, nas condições de anelamento a sequência inicial se liga em cis para a sequência flanqueadora a montante do oligonucleotídeo alvo e a sequência final do oligonucleotídeo da estrutura principal se liga em trans a jusante da sequência flanqueadora do oligonucleotídeo alvo.
[00232] 17. Método, de acordo com a cláusula 16, em que o oligonucleotídeo da estrutura principal compreende um par de sequências de repetição invertida, em que
[00233] sob as condições de anelamento as sequências de repetição invertida formam uma estrutura em gancho, assim, posicionando a extremidade 5’ do oligonucleotídeo da estrutura principal em justaposição com a extremidade 3’ do oligonucleotídeo alvo, e em que
[00234] sob as condições de ligação, a extremidade 3’ do oligonucleotídeo alvo é ligada à extremidade 5' do oligonucleotídeo da estrutura principal, de modo que o produto da dupla ligação é um círculo de ácido nucleico que compreende o oligonucleotídeo alvo, o fragmento alvo e o oligonucleotídeo da estrutura principal.
[00235] 18. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 14 a 17, em que o oligonucleotídeo da estrutura principal compreende uma sequência customizada entre a sequência de repetição invertida, de modo que, sob as condições de anelamento o oligonucleotídeo da estrutura principal forma uma alça em gancho.
[00236] 19. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 4, em que a fita contínua de ácido nucleico compreendendo as sequências inicial e final e o fragmento alvo é uma fita linear de ácido nucleico.
[00237] 20. Método, de acordo com a cláusula 19, em que a sequência final está na extremidade 3’ do oligonucleotídeo alvo e em que a sonda compreende um oligonucleotídeo da estrutura principal tendo a sequência inicial na sua extremidade 5',
[00238] em que, nas condições de anelamento a sequência final se liga in cis para a sequência flanqueadora a jusante do oligonucleotídeo alvo e a sequência inicial do oligonucleotídeo da estrutura principal liga in trans a montante da sequência flanqueadora do oligonucleotídeo alvo.
[00239] 21. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 14, 15 ou 20, em que o oligonucleotídeo alvo compreende uma sequência customizada entre a sequência flanqueadora a jusante e a sequência da final, de modo que, sob as condições de anelamento o oligonucleotídeo alvo forma uma alça em gancho.
[00240] 22. Método, de acordo com cláusula 19, em que a sequência inicial está na extremidade 5’ do oligonucleotídeo alvo e em que a sonda compreende um oligonucleotídeo da estrutura principal tendo a sequência final na sua extremidade 3’,
[00241] em que, nas condições de anelamento a sequência inicial se liga in cis para a sequência flanqueadora a montante do oligonucleotídeo alvo e a sequência final do oligonucleotídeo da estrutura principal se liga in trans a jusante da sequência flanqueadora do oligonucleotídeo alvo.
[00242] 23. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 16, 17 ou 22, em que o oligonucleotídeo alvo compreende uma sequência customizada entre a sequência inicial e a sequência flanqueadora a montante, de modo que, sob as condições de anelamento o oligonucleotídeo alvo forma uma alça em gancho.
[00243] 24. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 14 a 18 ou 20 a 23, caracterizada pelo fato de que o oligonucleotídeo da estrutura principal transporta uma fração de captura.
[00244] 25. Método, de acordo com a cláusula 19, em que a sonda compreende um oligonucleotídeo de estrutura principal compreendendo uma sequência inicial que tem uma extremidade 5’ livre, e um oligonucleotídeo de estrutura principal compreendendo uma sequência final tendo uma extremidade 3’ livre, em que, sob as condições de anelamento, as sequências inicial e final ligam em trans para as sequências flanqueadoras do oligonucleotídeo alvo.
[00245] 26. Método, de acordo com a cláusula 25, em que um ou ambos os oligonucleotídeos de estrutura compreendem ainda uma sequência customizada, em que a sequência customizada não é complementar para outras regiões da sonda ou do fragmento alvo.
[00246] 27. Método, de acordo com a cláusula 25, ou a cláusula 26, em que um dos oligonucleotídeos de estrutura principal transporta uma fração de captura.
[00247] 28. Método, de acordo com a cláusula 27, em que o outro oligonucleotídeo da estrutura principal transporta um marcador heterogêneo.
[00248] 29. Método, de acordo com a cláusula 28, em que o marcador é um fluoróforo.
[00249] 30. Método, de acordo com a cláusula 24, ou qualquer uma das cláusulas 27 a 29, em que a etapa de detectar se o produto da dupla ligação está presente compreende capturar o oligonucleotídeo da estrutura principal sobre um substrato através da fração de captura, lavando o substrato para remover as sondas não ligadas e retendo uma fração capturada compreendendo o substrato e oligonucleotídeo da estrutura principal capturado, e testar para a presença do produto da dupla ligação na fração capturada.
[00250] 31. Método, de acordo com a cláusula 28, ou a cláusula 29, em que a etapa de detectar se o produto da dupla ligação está presente compreende capturar o oligonucleotídeo da estrutura principal sobre um substrato através da fração de captura, lavando o substrato para remover as sondas não ligadas e retendo uma fração capturada compreendendo o substrato e oligonucleotídeo da estrutura principal capturado, e testando para a presença do marcador na fração capturada.
[00251] 32. Método, de acordo com a cláusula 24, ou qualquer uma das cláusulas 27 a 31, em que a fração de captura é biotina.
[00252] 33. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a sequência complementar alvo, tem um comprimento de 10 a 30 nucleotídeos.
[00253] 34. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a sequência complementar alvo tem menos do que 5 pares de bases de pareamento incorreto com o fragmento alvo.
[00254] 35. Método, de acordo com a cláusula 34, em que a sequência complementar alvo é o complemento exato do fragmento alvo.
[00255] 36. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que cada uma das sequências flanqueadoras tem um comprimento de 10 a 30 nucleotídeos.
[00256] 37. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que as sequências flanqueadoras a montante e a jusante são diferentes umas das outras.
[00257] 38. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a sequência inicial tem menos do que 5 pares de bases de pareamento incorreto com a sequência flanqueadora a montante e a sequência final tem menos do que 5 pares de bases de pareamento incorreto com a sequência flanqueadora a jusante.
[00258] 39. Método, de acordo com a cláusula 38, em que a sequência inicial é o complemento exato da sequência flanqueadora a montante e a sequência final é o complemento exato da sequência flanqueadora a jusante.
[00259] 40. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o oligonucleotídeo alvo é linear.
[00260] 41. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a amostra é uma amostra de cromossomos humanos fragmentados e o fragmento alvo é um fragmento de genoma humano específico para um cromossomo.
[00261] 42. Método, de acordo com a cláusula 41, em que o fragmento alvo é específico para um locus do genoma humano.
[00262] 43. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a sonda de ácido nucleico é DNA.
[00263] 44. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o método compreende ensaio multiplex para múltiplos fragmentos de ácido nucleico alvo diferentes, utilizando uma pluralidade de sondas em paralelo.
[00264] 45. Método, de acordo com a cláusula 44, em que o método compreende contatar uma amostra de cromossomos fragmentados com um conjunto de sondas para a ligação de fragmentos múltiplos de um cromossomo, em que cada sonda no conjunto é para a ligação de um fragmento alvo específica diferente para aquele cromossomo.
[00265] 46. Método, de acordo com a cláusula 45, em que as sondas compartilham uma sequência customizada comum.
[00266] 47. Método, de acordo com a cláusula 44, em que o método compreende contatar uma amostra de cromossomos fragmentados com conjuntos de sondas para a ligação de fragmentos múltiplos de dois ou mais cromossomos, em que os conjuntos de sondas compreendem:
[00267] um primeiro conjunto de sondas para a ligação de uma pluralidade de fragmentos específicos alvos para um primeiro cromossomo, e
[00268] um segundo conjunto de sondas para a ligação de uma pluralidade de fragmentos alvo específicos para um segundo cromossomo, e opcionalmente
[00269] um ou mais conjuntos de sondas para a ligação de uma pluralidade de fragmentos alvo específicos para um ou mais cromossomos.
[00270] 48. Método, de acordo com a cláusula 47, em que cada conjunto de sondas compreende pelo menos 500 sondas diferentes para a ligação de uma pluralidade de fragmentos alvo específicos para o cromossomo.
[00271] 49. Método, de acordo com a cláusula 47 ou cláusula 48, em que as sondas dentro de um conjunto compartilham uma sequência customizada que é comum a esse subconjunto e difere das sequências customizadas de sondas em outros conjuntos.
[00272] 50. Método, de acordo com a cláusula 49, que compreende a determinação das quantidades relativas dos dois ou mais cromossomos na amostra ao detectar os produtos de dupla ligação para cada conjunto de sondas e detectar as quantidades relativas das sequências customizadas nos referidos produtos.
[00273] 51. Método, de acordo com qualquer uma das cláusulas 45 a 50, em que o cromossomo ou cromossomos são humanos.
[00274] 52. Sonda de ácido nucleico para ligação a um fragmento de ácido nucleico alvo de fita simples, em que a sonda compreende
[00275] um oligonucleotídeo alvo que é mais longo do que o fragmento alvo e que contém uma sequência alvo complementar interna, de modo a que a hibridização entre o oligonucleotídeo alvo e o fragmento alvo constitui uma sequência de fita dupla localizada entre as sequências flanqueadoras a montante e a jusante do oligonucleotídeo alvo, e
[00276] sequências inicial e final tendo extremidades 5’ e 3’ livres, respectivamente, em que as sequências inicial e da final são complementares às sequências flanqueadoras a montante e a jusante, respectivamente,
[00277] de modo que sob condições de anelamento na presença do fragmento alvo, as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, que define um intervalo entre a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final, em que o fragmento alvo hibridiza com a sequência alvo complementar, no intervalo, assim, posicionando as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ das sequências da final, e em que
[00278] hibridização do fragmento de alvo no intervalo completa um círculo de ácido nucleico, o círculo compreendendo o fragmento alvo e as sequências inicial e da final.
[00279] 53. Sonda de ácido nucleico, de acordo com a cláusula 52, em que a sequência inicial e/ou final é unida a uma sequência customizada, em que a sequência customizada não é complementar para outras regiões da sonda ou do fragmento alvo.
[00280] 54. Sonda de ácido nucleico, de acordo com a cláusula 52 ou a cláusula 53, em que uma única molécula de ácido nucleico compreende sequências inicial e final.
[00281] 55. Sonda, de acordo com a cláusula 52 ou cláusula 53, em que as sequências inicial e final são separadas do oligonucleotídeo alvo e ligam em trans para as sequências flanqueadoras.
[00282] 56. Sonda, de acordo com a cláusula 55, em que as sequências inicial e final estão nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente, de um oligonucleotídeo de estrutura principal.
[00283] 57. Sonda, de acordo com a cláusula 56, em que o oligonucleotídeo da estrutura principal compreende uma sequência customizada entre as sequências inicial e final, em que a sequência customizada não é complementar para outras regiões da sonda ou do fragmento alvo.
[00284] 58. Sonda, de acordo com a cláusula 56, em que as sequências inicial e final de oligonucleotídeo da estrutura principal são adjacentes.
[00285] 59. Sonda de ácido nucleico para ligação a um fragmento de ácido nucleico alvo de fita simples, em que a sonda compreende
[00286] um oligonucleotídeo alvo que é mais longo do que o fragmento alvo e que contém uma sequência alvo complementar interna, de modo a que a hibridização entre o oligonucleotídeo alvo e o fragmento alvo constitui uma sequência de fita dupla localizada entre as sequências flanqueadoras a montante e a jusante do oligonucleotídeo alvo, e
[00287] sequências inicial e final têm extremidades 5’ e 3’ livres, respectivamente, em que as sequências inicial e final de oligonucleotídeo são complementares às sequências flanqueadoras a montante e a jusante, respectivamente,
[00288] de modo que sob condições de anelamento na presença do fragmento alvo, as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, que define um intervalo entre a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final, em que o fragmento alvo hibridiza com a sequência alvo complementar, no intervalo, assim, posicionando as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ das sequências da final, e em que
[00289] a sequência inicial é uma extremidade 5’ do oligonucleotídeo alvo e/ou a sequência final é uma extremidade 3’ do oligonucleotídeo alvo, de modo a que a hibridização do fragmento alvo no intervalo completa uma fita de ácido nucleico que compreende o fragmento alvo, a sequências inicial e final, a sequência complementar alvo e as sequências laterais.
[00290] 60. Sonda, de acordo com a cláusula 52 ou cláusula 59, em que as sequências inicial e final estão nas extremidades do oligonucleotídeo alvo e ligam em cis para as sequências flanqueadoras.
[00291] 61. Sonda, de acordo com a cláusula 52 ou a cláusula 59, em que a sequência final é uma extremidade 3’ do oligonucleotídeo alvo e a sequência inicial é uma extremidade 5' de um oligonucleotídeo de estrutura principal separado do oligonucleotídeo alvo.
[00292] 62. Sonda, de acordo com a cláusula 52 ou a cláusula 59, em que a sequência inicial é uma extremidade 5’ do oligonucleotídeo alvo e a sequência final é uma extremidade 3’ de um oligonucleotídeo de estrutura principal separado do oligonucleotídeo alvo.
[00293] 63. Sonda, de acordo com a cláusula 61 ou a cláusula 62, em que o oligonucleotídeo de estrutura principal compreende ainda uma sequência customizada, em que a sequência customizada não é complementar para outras regiões da sonda ou do fragmento alvo.
[00294] 64. Sonda de ácido nucleico para ligação a um fragmento de ácido nucleico alvo de fita simples, em que a sonda compreende
[00295] um oligonucleotídeo alvo que é mais longo do que o fragmento alvo e que contém uma sequência complementar alvo interna, de modo a que a hibridização entre o oligonucleotídeo alvo e o fragmento alvo constitui uma sequência de fita dupla localizada entre as sequências flanqueadoras a montante e a jusante do oligonucleotídeo alvo,
[00296] um oligonucleotídeo de estrutura principal compreendendo uma sequência inicial que tem uma extremidade 5’ livre, e
[00297] um oligonucleotídeo de estrutura principal compreendendo uma sequência final tendo uma extremidade 3’ livre,
[00298] em que as sequências de oligonucleotídeos inicial e final são complementares às sequências flanqueadoras a montante e a jusante, respectivamente, e em que
[00299] um oligonucleotídeo de estrutura principal transporta uma fração de captura e o outro oligonucleotídeo da estrutura principal transporta um marcador heterogêneo,
[00300] de modo que sob condições de anelamento na presença do fragmento alvo, as sequências inicial e final hibridizam com as sequências flanqueadoras, que define um intervalo entre a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ da sequência final, em que o fragmento alvo hibridiza com a sequência alvo complementar, no intervalo, assim, posicionando as extremidades do fragmento alvo em justaposição com a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ das sequências da final, e em que
[00301] hibridização do fragmento alvo no intervalo completa uma fita de ácido nucleico que compreende o fragmento alvo e as sequências inicial e final, em que a fita transporta a fração de captura e o marcador.
[00302] 65. Sonda, de acordo com a cláusula 64, em que a fração de captura é biotina.
[00303] 66. Sonda, de acordo com a cláusula 64 ou a cláusula 65, em que o marcador é um fluoróforo.
[00304] 67. Sonda, de acordo com qualquer uma das cláusulas 64 a 66, em que um ou ambos os oligonucleotídeos de estrutura principal compreendem ainda uma sequência customizada, em que a sequência customizada não é complementar para outras regiões da sonda ou do fragmento alvo.
[00305] 68. Sonda, de acordo com qualquer uma das cláusulas 52 a 67, em que o oligonucleotídeo alvo compreende ainda uma sequência customizada que não é complementar com outras regiões da sonda ou do fragmento alvo.
[00306] 69. Sonda, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a sequência complementar alvo, tem um comprimento de 10 a 30 nucleotídeos.
[00307] 70. Sonda, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a sequência complementar alvo tem menos do que 5 pares de bases de pareamento incorreto com o fragmento alvo.
[00308] 71. Sonda, de acordo com a cláusula 70, em que a sequência complementar alvo é o complemento exato do fragmento alvo.
[00309] 72. Sonda, de acordo com qualquer uma das cláusulas 52 a 71, em que cada uma das sequências flanqueadoras tem um comprimento de 10 a 30 nucleotídeos.
[00310] 73. Sonda, de acordo com qualquer uma das cláusulas 52 a 72, em que as sequências flanqueadoras a montante e a jusante do oligonucleotídeo alvo são diferentes umas das outras.
[00311] 74. Sonda, de acordo com qualquer uma das cláusulas 52 a 73, em que a sequência inicial tem menos do que 5 pares de bases de pareamento incorreto com a sequência flanqueadora a montante e a sequência final tem menos do que 5 pares de bases de pareamento incorreto com a sequência flanqueadora a jusante.
[00312] 75. Sonda, de acordo com a cláusula 74, em que as sequências inicial e final são o complemento exato das sequências flanqueadoras.
[00313] 76. Sonda, de acordo com qualquer uma das cláusulas 52 a 75, em que o oligonucleotídeo alvo é linear.
[00314] 77. Sonda, de acordo com qualquer uma das cláusulas 52 a 76, em que o fragmento alvo é um fragmento de endonuclease de restrição.
[00315] 78. Sonda, de acordo com qualquer uma das cláusulas 52 a 77, em que o fragmento alvo é um fragmento de genoma humano.
[00316] 79. Sonda, de acordo com a cláusula 78, em que o fragmento alvo é um fragmento de genoma humano específico para um cromossomo.
[00317] 80. Sonda, de acordo com a cláusula 79, em que o fragmento alvo é específico para um locus do genoma humano.
[00318] 81. Sonda, de acordo com qualquer uma das cláusulas 52 a 80, em que o ácido nucleico sonda é DNA.
[00319] 82. Um conjunto de sondas para a ligação aos fragmentos de ácido nucleico alvo de fita simples, que compreende uma pluralidade de sondas de acordo com qualquer uma das cláusulas 52 a 81, as sondas que têm uma pluralidade de diferentes sequências alvo complementares para a ligação aos múltiplos fragmentos alvos diferentes.
[00320] 83. Conjunto de sondas, de acordo com a cláusula 82, que é para ligação aos múltiplos fragmentos de um cromossomo humano, em que cada sonda no conjunto é para a ligação de um fragmento alvo específico diferente para aquele cromossomo.
[00321] 84. Conjunto de sondas, de acordo com a cláusula 83, em que as sondas compartilham uma sequência customizada comum.
[00322] 85. Conjuntos de sondas para a ligação de diferentes fragmentos de dois ou mais cromossomos humanos, compreendendo:
[00323] um primeiro conjunto de sondas para a ligação de uma pluralidade de fragmentos específicos alvos para um primeiro cromossomo, e
[00324] um segundo conjunto de sondas para a ligação de uma pluralidade de fragmentos alvo específicos para um segundo cromossomo, e opcionalmente
[00325] um ou mais conjuntos de sondas para a ligação de uma pluralidade de fragmentos alvo específicos para um ou mais cromossomos.
[00326] 86. Conjuntos de sondas, de acordo com a cláusula 85, em que as sondas dentro de um conjunto compartilham uma sequência customizada que é comum a esse conjunto e difere das sequências customizadas de sondas em outros conjuntos.
[00327] 87. Kit que compreende um conjunto ou conjuntos de sondas, de acordo com qualquer uma das cláusulas 82 a 86, em solução em um ou mais recipientes.
[00328] 88. Uso de uma sonda, de acordo com as cláusulas 52 a 81, conjunto de sondas, de acordo com qualquer uma das cláusulas 82 a 86, ou um kit, de acordo com a cláusula 87, para testar uma amostra quanto à presença de um fragmento de ácido nucleico alvo.
[00329] 89. Uso de uma sonda para testar uma amostra quanto à presença de um fragmento de ácido nucleico de fita simples alvo,
[00330] em que a sonda compreende um oligonucleotídeo alvo contendo uma sequência que é o complemento exato do fragmento alvo, e sequências de oligonucleotídeos inicial e final que hibridizam adjacentes ao fragmento alvo no oligonucleotídeo alvo,
[00331] em que a hibridização entre o fragmento alvo e a sonda moldam o fragmento alvo para ligação às sequências inicial e da final. 90. Uso, de acordo com a cláusula 89, em que a sonda é tal como definida em qualquer uma das cláusulas 52 a 81.
[00332] Uma modalidade proporciona um método de processamento de uma amostra de ácido nucleico, compreendendo: a) hibridizar uma amostra compreendendo um fragmento alvo a uma sonda de ácido nucleico compreendendo: i. uma sequência inicial e uma sequência final, em que as sequências inicial e final estão nas extremidades de uma primeira molécula de oligonucleotídeo; e ii. uma sequência splint que compreende, em ordem: uma sequência flanqueadora a montante, que é complementar à sequência inicial; uma sequência complementar alvo que é complementar com o fragmento alvo; e uma sequência flanqueadora a jusante que é complementar à sequência final; produzindo assim um produto de hibridização, em que as extremidades do fragmento alvo são ligáveis adjacentes às extremidades das sequências inicial e da final da primeira molécula de oligonucleotídeo; e b) ligando as extremidades do fragmento alvo para as extremidades das sequências inicial e da final da primeira molécula de oligonucleotídeo, produzindo assim um produto cíclico que compreende o fragmento alvo e as sequências inicial e da final.
[00333] Em qualquer modalidade, o método pode ainda compreender a amplificação do produto cíclico por amplificação de círculo rolante utilizando um iniciador que hibridiza com a primeira molécula de oligonucleotídeo ou a sequência tala. Nestas modalidades, o método pode ainda compreender quantificar o número de produtos de amplificação por círculo rolante produzidos, proporcionando deste modo uma estimativa da quantidade do referido fragmento alvo na amostra.
[00334] Em algumas modalidades, a sequência tala pode estar na primeira molécula de oligonucleotídeo.
[00335] Em algumas modalidades, a sequência tala pode estar em uma segunda molécula de oligonucleotídeo.
[00336] Em qualquer modalidade, a sequência complementar alvo pode ser de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento.
[00337] Em qualquer modalidade, a sequência complementar alvo pode conter um ou mais erros de pareamento com o fragmento alvo.
[00338] Em qualquer modalidade, as sequências flanqueadoras podem ser de 10 e 40 nucleotídeos de comprimento.
[00339] Em qualquer modalidade, a amostra pode ser digerida com uma enzima de restrição.
[00340] Em qualquer modalidade, a amostra pode compreender DNA genômico, por exemplo, o DNA genômico humano. Nestas modalidades, a amostra pode compreender DNA isento de células isoladas a partir de sangue. Por exemplo, em qualquer modalidade, a amostra pode compreender DNA isento de células isolado a partir da corrente sanguínea de uma mulher grávida.
[00341] Em algumas modalidades, a sequência tala pode estar em uma segunda molécula de oligonucleotídeo que compreende uma fração de captura, por exemplo, uma porção de biotina. Nestas modalidades, o método pode compreender: c) imobilizar o produto cíclico através da ligação da fração de captura a uma fase sólida; e
[00342] d) lavar a fase sólida para remover o ácido nucleico não ligado e outros componentes da reação, enriquecendo assim, o produto cíclico.
[00343] Em qualquer modalidade, o fragmento alvo pode ser a partir de cromossomo 21, 13 ou 18.
[00344] Em algumas modalidades, o método pode compreender a hibridização da amostra com um conjunto de pelo menos 50 das referidas sondas, em que as referidas sondas têm como alvo diferentes fragmentos no mesmo cromossomo, e em que o método resulta em uma pluralidade de produtos cíclicos que compreendem os fragmentos alvo.
[00345] Nestas modalidades, o método pode compreender a hibridização da amostra com um primeiro conjunto e um segundo conjunto dos referidos conjuntos de sondas, em que o primeiro e segundo conjuntos têm como alvo um primeiro cromossomo e um segundo cromossomo, respectivamente, amplificando os produtos cíclicos por ampliação por círculo rolante (RCA) e comparando o número de produtos RCA correspondentes ao primeiro cromossomo com o número de produtos RCA correspondentes ao primeiro cromossomo.
[00346] Nestas modalidades, o método pode compreender a hibridização da amostra com um primeiro conjunto e um segundo conjunto dos referidos conjuntos de sondas, em que o primeiro e segundo conjuntos têm como alvo uma primeira e segunda regiões em um cromossomo, respectivamente, amplificando os produtos cíclicos por amplificação por círculo rolante (RCA) e comparando o número de produtos RCA correspondentes à primeira região para o número de produtos RCA correspondentes à segunda região.
[00347] É também aqui proporcionada uma composição que compreende uma sonda de ácido nucleico, tal como descrito acima. Em algumas modalidades, a sonda de ácido nucleico pode compreender: i. uma sequência inicial e uma sequência final, em que as sequências inicial e final estão em extremidades opostas de uma primeira molécula de oligonucleotídeo; e ii. uma sequência tala que compreende, em ordem: uma sequência flanqueadora a montante que é complementar à sequência inicial; uma sequência complementar alvo que é complementar a um fragmento alvo no genoma humano; e uma sequência flanqueadora a jusante que é complementar à sequência final; em que a sonda é concebida de modo que, quando o primeiro oligonucleotídeo, a sequência tala, e o fragmento alvo são hibridizados um ao outro, as extremidades do fragmento alvo são ligavelmente adjacentes às extremidades das sequências inicial e final na primeira molécula de oligonucleotídeo.
[00348] Em qualquer modalidade de composição, a composição pode compreender um primeiro conjunto de pelo menos 50 das sondas de ácidos nucleicos, em que as sequências complementares alvo das referidas sondas são complementares aos diferentes fragmentos alvo de um primeiro cromossomo humano, por exemplo, cromossomo humano é de 21, 13 ou 18. Nestas modalidades, a composição pode compreender, opcionalmente, um segundo conjunto de pelo menos 50 das referidas sondas de ácido nucleico, em que as sequências complementares alvo das referidas sondas do segundo conjunto são complementares aos diferentes fragmentos alvo de um segundo cromossomo humano, por exemplo, os cromossomos 13 ou 18 (se o primeiro cromossomo é cromossomo 21).

Claims (17)

1. Sonda de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um oligonucleotídeo direcionador compreendendo: (i) uma sequência alvo complementar interna que está na faixa de 10 a 100 nucleotídeos de comprimento e que é complementar a um fragmento de ácido nucleico alvo de fita simples que é uma sequência no DNA genômico humano, (ii) uma sequência flanqueadora a montante com pelo menos 10 nucleotídeos que não é complementar a uma sequência no DNA genômico humano, e (iii) uma sequência flanqueadora a jusante com pelo menos 10 nucleotídeos que não é complementar a uma sequência no DNA genômico humano, e (b) um segundo oligonucleotídeo compreendendo uma sequência inicial e uma sequência final tendo extremidades 5’ e 3’ livres, respectivamente, em que a sequência inicial e a sequência final são complementares às sequências flanqueadoras a montante e a jusante, respectivamente, em que na ausência do fragmento de ácido nucleico alvo, a hibridização do oligonucleotídeo direcionador e o segundo oligonucleotídeo produz um ácido nucleico circular, no qual a sequência alvo complementar interna é de fita simples.
2. Sonda, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência complementar ao alvo é uma sequência do cromossomo 21 humano.
3. Sonda, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma sequência inicial ou sequência final se une a uma sequência customizada, em que a sequência customizada não é complementar a outras regiões da sonda ou do fragmento alvo.
4. Sonda, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência complementar ao alvo tem um comprimento na faixa de 10 a 40 nucleotídeos.
5. Sonda, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as sequências flanqueadoras tem independentemente cada, um comprimento de 10 a 40 nucleotídeos.
6. Sonda, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ do fragmento alvo hibridizam a nucleotídeos adjacentes do oligonucleotídeo direcionador, e a extremidade 3’ da sequência final e a extremidade 5’ do fragmento alvo hibridizam a nucleotídeos adjacentes do oligonucleotídeo direcionador.
7. Sonda, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um de: a extremidade 5’ da sequência inicial e a extremidade 3’ do fragmento alvo não hibridizam a nucleotídeos adjacentes do oligonucleotídeo direcionador; ou a extremidade 3’ da sequência final e a extremidade 5’ do fragmento alvo não hibridizam a nucleotídeos adjacentes do oligonucleotídeo direcionador.
8. Sonda, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um de: a sequência flanqueadora a montante é imediatamente adjacente à sequência complementar ao alvo, sem nucleotídeos intervenientes; ou, a sequência flanqueadora a jusante é imediatamente adjacente à sequência complementar ao alvo, sem nucleotídeos intervenientes.
9. Sonda, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um de: a sequência flanqueadora a montante não é imediatamente adjacente à sequência complementar ao alvo; ou, a sequência flanqueadora a jusante não é imediatamente adjacente à sequência complementar ao alvo.
10. Sonda de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência alvo complementar interna do oligonucleotídeo direcionador é complementar a uma sequência que contém uma mutação.
11. Conjunto de sondas, caracterizado pelo fato de que compreende uma pluralidade de sondas como definidas na reivindicação 1, as sondas tendo diferentes sequências complementares ao alvo que hibridizam com fragmentos alvos diferentes.
12. Conjunto de sondas de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as diferentes sequências complementares ao alvo hibridizam com sequências alvos respectivamente diferentes no cromossomo 21 humano.
13. Conjunto de sondas de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 500 das referidas sondas.
14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: a) sonda de ácido nucleico como definida na reivindicação 1; e b) uma amostra de ácido nucleico desnaturado compreendendo o fragmento alvo.
15. Composição de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a amostra é DNA desnaturado livre de células que foi digerido com uma endonuclease de restrição.
16. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o DNA livre de célula é da corrente sanguínea de uma mulher grávida.
17. Composição de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma DNA ligase.
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