CN117327771A - 一种用于增强dna电路构建和多功能转导的空间控制邻近分裂镊子开关 - Google Patents
一种用于增强dna电路构建和多功能转导的空间控制邻近分裂镊子开关 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117327771A CN117327771A CN202311134435.0A CN202311134435A CN117327771A CN 117327771 A CN117327771 A CN 117327771A CN 202311134435 A CN202311134435 A CN 202311134435A CN 117327771 A CN117327771 A CN 117327771A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tweezer
- split
- dna
- switch
- fluorescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000010361 transduction Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000026683 transduction Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 claims description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 3
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 claims description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 2
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 claims description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 14
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 6
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 abstract description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 25
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 25
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 16
- 230000004044 response Effects 0.000 description 15
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 9
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 9
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 4
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000011449 brick Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012938 design process Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000008846 dynamic interplay Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000008866 synergistic binding Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种通用的空间控制邻近分裂镊子开关，以实现从生物分子到所需寡核苷酸的多功能转导。该发明利用镊子双链刚性与发夹锁阻碍效应相协同，有效地降低了电路泄漏。此外，该纳米开关构象可通过核酸、小分子和蛋白质进行调控，适用于广泛的靶标检测，并在不同类型的靶标间建立逻辑操作，实现了多功能传导。最后，该策略可直接与DNA催化电路耦合，提高传导性能。本发明设计简单、泄漏低、灵活性强、复杂性可扩展、系统兼容性高，为基于核酸转导网络的开发开辟了新的道路，将广泛应用于生物医学研究、信息计算和合成生物学领域的各种动态DNA纳米技术中。
Description
技术领域
本发明属于动态核酸纳米技术领域，特别涉及一种基于空间控制的邻近分裂镊子开关。
背景技术
动态DNA纳米技术提供了一种非常多功能的工具包，可用于构建DNA电路、纳米器件和纳米结构。借助于Watson-Crick碱基配对规则的可预测性，可以设计正交相互作用，触发后续的杂交事件。而基于DNA的系统中实现动态相互作用的关键机制是toehold介导的链置换。这种方法可以扩展DNA电路的结构，简化设计过程，并可有效的实现对目标物质的检测。此外，对生物分子表面的协同结合将双链寡核苷酸带到邻近位置，可增强其杂交特异性。基于这些机制，已开发出多种核酸电路和纳米器件，这些进展在细胞特异性识别、成像以及蛋白质/核酸分析方面得到了广泛应用。然而，目标结合位点、toehold和分支迁移区域都以单链形式暴露，容易形成二级结构，并导致显著的背景泄漏。当构建复杂级联和分层DNA网络时，这个问题显得尤为关键。
现有的方法旨在调节邻近诱导链置换反应的动力学并减少泄漏主要涉及调整关联区域中双链茎和间隔的长度和序列。然而，这些方法的效果仍然不令人满意，因为缩短辅助结构区域的长度或用A:T键替换G:C非共价键将减少DNA三项结的稳定性，极大地降低所需反应速率。而引入一个与暴露区域杂交的阻断链，可以有效地最小化泄漏。然而，这种设计会增加所需反应的能垒，使反应过程变得复杂，并阻碍双链长度超过10-12个核苷酸的总体反应。或者通过分裂结构域之间的互域桥接，以消除非toehold环的独立泄漏，并增强三项结中的链置换反应动力学。然而，这些方法只能在特定条件中减少泄漏，无法系统性的消除泄露。因此，仍然需要开发一种强大、简单和通用的方法，以最小化泄漏反应，并将其应用于DNA逻辑电路和复杂网络的构建。
为了解决这个问题，DNA纳米器件已成为一个有前途的解决路径。通过"自下而上"的DNA自组装，可以构建各种不同大小和复杂度的二维和三维物体。通过操纵物质的空间和时间分布，表现出比简单DNA结构更高的稳健性和识别性能，如DNA折纸、DNA马达、3D砖块、DNA纳米镊子等。在这些不同的DNA纳米机器中，纳米镊子是可以设计为具有各种连接长度或结构的灵活支架，两个臂之间的空间距离可以在外部刺激(如光、pH、离子和核酸)存在的情况下得到很好的调节，以便快速切换配置。受此启发,本发明通过使用纳米开关的构象变换，将生物分子信号传导为独立寡核苷酸的释放。值得注意的是，该发明只需要简单的序列设计，并通过邻近诱导的链置换反应就可实现核酸、小分子和蛋白质的检测。更重要的是，可以高效地建立不同类型目标物质的逻辑计算和扩增操作，构建多功能的传导系统。此外，该方法在复杂的生物环境中进行生物分子的分析方面是强大且灵敏的。我们预见，该发明将提供一种在DNA纳米技术中探索创新概念和策略的新工具。
发明内容
本发明针对构建复杂级联和分层DNA网络中通常产生难以忽视的信号泄露的问题，通过分析邻近诱导链置换的内在泄漏途径，提供了一种空间控制的邻近分裂镊子开关，用于增强DNA电路构建和多功能转导。
本发明是一种空间控制的邻近分裂镊子开关，包括：
(1)DNA样品的制备：所有的DNA寡核苷酸在10μM的浓度下悬浮于TE缓冲液中(10mMTris·HCl，1mM EDTA，pH＝8.0)，并在使用前储存在-20℃；所有的DNA复合物在TM缓冲液中组装(10mM Tris·HCl，1mM EDTA，12.5mM MgCl2，pH＝8.0)；本研究中涉及的各个杂交链反应发夹和复合物在T100 Thermal Cycler PCR(Bio-Rad)中退火；样品最初在95℃下加热5分钟，然后以0.1℃/s的恒定速率缓慢冷却至20℃；为确保复合物完全形成，组分(除报告基团外)的比例为1:1:1进行退火；所有报告双链退火时，荧光链和猝灭链的比例为1:1.5，以确保链置换信号能够清晰地报告；一旦退火完成，所有预制的组分在4℃下储存以备使用；
(2)邻近诱导信号的荧光测量：荧光信号由Rotor-Gene 6000仪器记录；所有荧光信号在绿色通道(470nm/510nm)下监测，激发和发射带宽均设置为5nm，对于所有实验，每10秒记录一次荧光数据；反应体积在PCR管中设置为20μL，增益设置为默认值，添加靶标后开始荧光动力学测量；空白荧光测量按照相同的步骤进行，需将添加靶标的步骤替换为TM缓冲液。
所述步骤(1)中报告探针的退火后终浓度是200nM。
所述步骤(1)中杂交链反应发夹的退火后终浓度是500nM。
所述步骤(1)中DNA复合物退火后终浓度是200nM
所述步骤(2)中反应时间为30min。
所述步骤(2)中报告探针toehold长度为8nt。
所述步骤(2)中反应温度为37℃。
所述步骤(2)中进行杂交链式反应时同时加入等比例的发夹1和发夹2。
本发明依赖于一种灵活可编程的DNA纳米镊子，它可以在生物分子的邻近效应作用下实现从打开状态切换到关闭状态的构象变化。这种构象变化允许调节趾toehold和链置换区域之间的物理空间距离，并释放输出链。为了进一步防止电路泄漏并确保精确控制，我们在关联区域引入了两个附加的发夹锁结构。在没有目标物质(核酸/小分子/蛋白质)的情况下，DNT将toehold和链置换区域彼此分开，并同时在初始的“打开”状态下分开两个目标结合位点。相反，通过目标物质同时结合夹子两侧而产生的近距效应，发夹锁会打开，有效地延长了关联区域，形成了更稳定的双链茎。toehold和链置换区域会紧密连接，导致“关闭”状态，并允许高效的链置换反应发生。
PAGE分析首先用于验证纳米开关的结构组装和操作可行性(附图1)。1-3条带包含三条单链DNA结合位点1、结合位点2和连接链。在第4条带中出现了一个迁移较慢的带，表明纳米开关的稳定结构已按预期组装。与第6和7条带不同，第8条带中加入了F链和Q链的混合物，并且由于报告基团的形成，出现了一个明亮的新带。与靶标杂交后，在第11条带中出现了相应的复合转导条带，而第4和5条带中未形成。这些结果表明，通过靶标的添加，纳米开关可以有效地从打开构象邻近诱导到关闭构象。在将靶标引入带有报告基团系统的PST开关后，与第10和11条带相比，观察到一个明显的迁移较慢且分子量较高的带，对应于产物，表明了与报告系统与纳米开关成功发生链置换反应。
为了进一步分析纳米开关的响应信号，我们使用FAM荧光基团和BHQ猝灭基团标记核酸报告系统，并进行了实时荧光测定(附图2)。空白对照系统在没有目标的情况下只表现出轻微的荧光强度增加，证实了纳米开关可将toehold与链置换区域分开。相比之下，在存在目标的情况下观察到荧光强度的迅速增加，表明邻近诱导的链置换反应的发生。因此，上述结果确认了纳米开关的成功组装和反应可行性。
为了确定发夹锁是否可以保护扩展区域在没有目标的情况下不暴露自身至关重要。我们尝试协调夹子结构域，扩展域和关联区域，以获得最佳的发夹锁(附图3)。随着关联区域(224vs 225)和扩展区域(335vs 345)的延长，荧光强度逐渐增加，表明双链茎的稳定性显著增强，但也逐渐增加了背景泄漏。当夹子结构域减少到一个碱基对，扩展区域减少到两个碱基对时，无法稳定形成发夹锁，导致电路泄漏增加(123vs 223)。通过比较六种发夹锁设计的信噪比，可以观察到224的信噪比最高。因此，选择224作为优化的发夹锁设计。
在调节过程中，通过改变间隔区域的长度(从0到5个核苷酸)可以将纳米开关从紧张状态调整到松弛状态，从而精确地控制toehold和链置换区域之间的距离(附图4)。对于间隔区域长度为0个核苷酸，由于镊子的双链刚性，获得了最低的反应效率和背景信号。对于间隔区域长度大于0个核苷酸，荧光强度随间隔区域长度的增加而增加。当间隔区域长度为1个核苷酸时，获得了最高的信噪比，而当间隔区域长度为5个核苷酸时，获得了最低的信噪比。
接下来我们评估了该方法响应目标BCR-ABL基因浓度变化的灵敏度(附图5)。发现链置换的性能与靶DNA浓度的变化呈正相关。即使在目标DNA浓度降低至5nM的情况下，与没有靶DNA相比，荧光强度的定量分析显示出明显且可区分的信号差异。检测限确定为4.06nM。
为了进一步探索所提出系统的适用性，我们还设计了另外两个基于DNA适配体的非核酸分子转导纳米开关：肿瘤进展相关的腺苷-5′-三磷酸(ATP)和动脉血栓形成相关的凝血酶(THR)分别作为研究最多的小分子和蛋白质的代表标志物。对于基于ATP的PST开关，当设计仅依靠ATP分裂适配体而不改变缔合区和SDR结构域的序列时，荧光强度随着ATP浓度的增加而逐渐提高(附图6)，表明荧光强度高度依赖于ATP浓度，且ATP的LOD为11.05μM。这些数据表明，该设计基于PST开关诱导SDR的构象变化，实现了从小分子到输出信号的高效和灵敏的转导。
我们进一步测试了该发明是否可以检测到大分子THR。类似地，通过改变目标结合域与THR分裂适配体的序列。链置换速率也由THR以浓度依赖性方式控制。我们观察到荧光强度随着THR浓度从2μM降低到0nM而衰减(附图7)，表明THR和输出寡核苷酸之间存在正依赖性。结果表明，PST开关在低至50nM的浓度下可以检测到THR，THR的检测限为30.76nM，并揭示了在我们的设计中，即使是蛋白质仍然可以有效地转导。这些发现证明了PST开关的多功能性，仅通过简单设计靶标互补序列，可以很容易地适应各种靶标，而无需优化。
另外，由于自由设计的输出链与目标结合序列无关，这为构建不同类型分子之间的逻辑操作提供了极大的灵活性。因此，我们选择BCR-ABL和ATP作为原理验证目标，并构建了三个具有代表性的逻辑门：“AND”、“OR”和“INH”门(附图8)。这些目标的存在被定义为输入1，而它们的不存在被定义为输入0。“1”状态对应于荧光信号的增加，“0”状态表示信号没有明显的增加。
在AND门中，我们引入了“组合链”的概念，BCR-ABLDNA互补结合位点1与ATP适配体结合位点2连接，镊子通过互补序列与BCR-ABL DNA互补结合位点2和ATP适配体结合位点1连接，形成AND-纳米开关。在没有BCR-ABL或ATP的情况下，结合区不能形成双链短茎，toehold也不会与链置换结构域相连，因为目标和结合序列之间的杂交事件只发生在镊子的一侧。因此，这种情况不会启动有效的SDR，即明显的荧光响应(附图9)。只有在BCR-ABL和ATP同时存在的情况下，组合链才能与镊子两侧的靶结合位点连接形成稳定的结构，导致镊子的闭合状态和缔合域的邻近结合，触发有效的链置换反应产生增强的荧光信号。
在OR门中，设计了两个纳米开关，分别用于识别BCR-ABL和ATP。值得注意的是，SDR域在BCR-ABL和ATP响应PST交换机中共享相同的序列。因此，BCR-ABL或ATP能够激活SDR并被报告系统检测到(附图10)。在没有ATP和BCR-ABL的情况下，没有观察到明显的荧光增加。在ATP或BCR-ABL或ATP和BCR-ABL存在的情况下，一个或两个镊子将被关闭，导致邻近诱导的链置换反应并通过荧光响应报告。
为了构建INH关系，BCR-ABL系统保持为常规纳米开关，而由ATP响应镊子连接的发夹环和链置换区域被设计为针对BCR-ABL转导系统的toehold和链置换区域的互补序列。在该设计中，ATP充当BCR-ABL转导系统的抑制剂。在没有ATP的情况下，由于镊子的双链刚性和发夹锁的抑制作用，发夹环和链置换区域保持分离，难以与BCR-ABL转导系统的toehold和链置换区域稳定杂交。ATP的加入将使它们通过短双工茎邻近连接，并加强对BCR-ABL转导系统的碱基对，导致报告过程受到抑制(附图11)。在没有BCR-ABL和ATP的情况下，两个镊子都保持开放状态，没有观察到明显的荧光。随着BCR-ABL的加入，BCR-ABL响应镊子关闭以缩短两臂之间的距离，并执行了邻近诱导的链置换反应。因此，观察到显着的荧光响应。当加入ATP时，ATP的闭态镊子会与BCR-ABL响应镊子的SDR结构域结合，BCR-ABL的SDR效率显著降低，且未发出明显的荧光信号。总体而言，通过直接操纵纳米开关的靶标结合位点，可以建立不同靶标之间的逻辑关系，该纳米开关具有很大的设计灵活性。
最后，与酶依赖性测定相比，杂交链反应被认为是复杂生物样品中核酸扩增的理想选择。因此，我们将该策略集成到该纳米开关中，以检查该平台与其他核酸电路的连接性和兼容性(附图12)。一旦靶标存在，靶标结合位点就会识别并与其结合，从而产生闭合的纳米镊子和关联结构域的邻近结合。随后的杂交链式反应诱导催化回路将被启动并产生增强的荧光信号。我们随后使用该系统检测BCR-ABL(附图13)，荧光响应随着靶标浓度的增加而逐渐增强，荧光强度与靶标浓度之间表现出良好的线性关系。BCR-ABL的检测限低至0.127nM。
综上所述，本专利提出了的空间控制纳米开关的通用策略，以可实现从生物分子到所需寡核苷酸的多功能转导。在核酸和非核酸分子之间架起了一座宽阔的桥梁，具有超低泄漏、设计灵活、可扩展复杂性和系统兼容性等优点。该方法将广泛应用于生物医学研究、信息计算和合成生物学领域的各种动态DNA纳米技术中。
附图说明
图1是反应的PAGE凝胶分析图
图2是纳米开关的实时荧光响应曲线
图3是不同发夹锁设计的荧光响应和信噪比比较
图4是不同间隔区域长度的荧光响应和信噪比比较
图5是不同浓度的BCR-ABL输入下的荧光响应分析
图6是不同浓度的ATP输入下的荧光响应分析
图7是不同浓度的THR输入下的荧光响应分析
图8是构建逻辑门的原理示意图
图9是AND门的实时荧光响应曲线
图10是OR门的实时荧光响应曲线
图11是INH门的实时荧光响应曲线
图12纳米开关与杂交链式反应DNA耦合的原理示意图。
图13不同浓度BCR-ABL输入下的实时荧光曲线
具体实施方式
本发明是一种空间控制的邻近分裂镊子开关，按以下步骤操作：
(1)DNA样品的制备：在10μM的浓度下悬浮DNA寡核苷酸于TE缓冲液中(10mMTris·HCl，1mM EDTA，pH＝8.0)，并在使用前储存在-20℃。所有的DNA复合物在TM缓冲液中组装(10mM Tris·HCl，1mM EDTA，12.5mM MgCl2，pH＝8.0)。样品最初在95℃下加热5分钟，然后以0.1℃/s的恒定速率缓慢冷却至20℃。一旦退火完成，所有预制的组分在4℃下储存以备使用。
(2)邻近诱导信号的荧光测量：荧光信号由Rotor-Gene 6000仪器记录。所有荧光信号在绿色通道(470nm/510nm)下监测，激发和发射带宽均设置为5nm。荧光动力学测量是在添加靶标后开始的。空白荧光测量按照相同的步骤进行，只是将添加靶标的步骤替换为TM缓冲液。
Claims (9)
1.本发明是一种用于增强DNA电路构建和多功能转导的空间控制邻近分裂镊子开关，其特征在于包括如下步骤：
(1)DNA样品的制备：所有的DNA寡核苷酸在10μM的浓度下悬浮于TE缓冲液中(10mMTris·HCl，1mM EDTA，pH＝8.0)，并在使用前储存在-20℃；所有的DNA复合物在TM缓冲液中组装(10mM Tris·HCl，1mM EDTA，12.5mM MgCl2，pH＝8.0)；本研究中涉及的各个杂交链反应发夹和复合物在T100 Thermal Cycler PCR(Bio-Rad)中退火；样品最初在95℃下加热5分钟，然后以0.1℃/s的恒定速率缓慢冷却至20℃；为确保复合物完全形成，组分(除报告基团外)的比例为1:1:1进行退火；所有报告双链退火时，荧光链和猝灭链的比例为1:1.5，以确保链置换信号能够清晰地报告；一旦退火完成，所有预制的组分在4℃下储存以备使用；
(2)邻近诱导信号的荧光测量：荧光信号由Rotor-Gene 6000仪器记录；所有荧光信号在绿色通道(470nm/510nm)下监测，激发和发射带宽均设置为5nm，对于所有实验，每10秒记录一次荧光数据；反应体积在PCR管中设置为20μL，增益设置为默认值，添加靶标后开始荧光动力学测量；空白荧光测量按照相同的步骤进行，需将添加靶标的步骤替换为TM缓冲液。
2.如权利要求1所述的纳米开关进行特异性识别。
3.如权利要求1所述的一种空间控制邻近分裂镊子开关，其制备方法步骤(1)中报告探针的退火后终浓度是200nM。
4.如权利要求1所述的一种空间控制邻近分裂镊子开关，其制备方法步骤(1)中杂交链反应发夹的退火后终浓度是500nM。
5.如权利要求1所述的一种空间控制邻近分裂镊子开关，其制备方法步骤(1)中DNA复合物退火后终浓度是200nM。
6.如权利要求1所述的一种空间控制邻近分裂镊子开关，其制备方法步骤(2)中反应时间为30min。
7.如权利要求1所述的一种空间控制邻近分裂镊子开关，其制备方法步骤(2)中报告探针toehold长度为8nt。
8.如权利要求1所述的一种空间控制邻近分裂镊子开关，其制备方法步骤(2)中温度为37℃可得到最佳反应效果。
9.如权利要求1所述的一种空间控制邻近分裂镊子开关，其制备方法步骤(2)中进行杂交链式反应时需同时加入等比例的发夹1和发夹2。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311134435.0A CN117327771A (zh) | 2023-09-04 | 2023-09-04 | 一种用于增强dna电路构建和多功能转导的空间控制邻近分裂镊子开关 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311134435.0A CN117327771A (zh) | 2023-09-04 | 2023-09-04 | 一种用于增强dna电路构建和多功能转导的空间控制邻近分裂镊子开关 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117327771A true CN117327771A (zh) | 2024-01-02 |
Family
ID=89289309
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311134435.0A Pending CN117327771A (zh) | 2023-09-04 | 2023-09-04 | 一种用于增强dna电路构建和多功能转导的空间控制邻近分裂镊子开关 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117327771A (zh) |
-
2023
- 2023-09-04 CN CN202311134435.0A patent/CN117327771A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7632641B2 (en) | Hybridization chain reaction | |
| ES2807614T3 (es) | Detección múltiple de ácidos nucleicos | |
| Sefah et al. | Nucleic acid aptamers for biosensors and bio-analytical applications | |
| JP3843215B2 (ja) | 高い特異性を有するプライマー、増幅法およびキット | |
| ES2899693T3 (es) | Método para la detección de fragmentos genómicos | |
| JP6363984B2 (ja) | 修飾した核酸を用いる情報伝播のシステムおよび方法 | |
| US9176123B2 (en) | Binding-induced hairpin detection system | |
| US8815507B2 (en) | Method and materials for the cooperative hybridization of oligonucleotides | |
| Wang et al. | Sensitive detection of cancer gene based on a nicking-mediated RCA of circular DNA nanomachine | |
| Feng et al. | Label-free optical bifunctional oligonucleotide probe for homogeneous amplification detection of disease markers | |
| Zhang et al. | Target-catalyzed assembly formation of metal-ion dependent DNAzymes for non-enzymatic and label-free amplified ATP detection | |
| Bagheri et al. | PAM‐Engineered Toehold Switches as Input‐Responsive Activators of CRISPR‐Cas12a for Sensing Applications | |
| JPWO2003100095A1 (ja) | 標的核酸の検出法 | |
| Bai et al. | A Spatially Controlled Proximity Split Tweezer Switch for Enhanced DNA Circuit Construction and Multifunctional Transduction | |
| Xue et al. | Inverted mirror image molecular beacon-based three concatenated logic gates to detect p53 tumor suppressor gene | |
| CN105209640A (zh) | 使用发卡寡核苷酸扩增核酸的方法 | |
| CN117327771A (zh) | 一种用于增强dna电路构建和多功能转导的空间控制邻近分裂镊子开关 | |
| US20180135112A1 (en) | Labeled circular dna molecules for analysis of dna topology, and topoisomerases and for drug screening | |
| JP2013523097A (ja) | オリゴヌクレオチド機能性を制御する方法 | |
| CN105087755B (zh) | Dna三向节活化的杂交链式反应用于dna甲基化转移酶的高灵敏检测 | |
| Xu et al. | Stepwise nanoassembly of a single hairpin probe and its biosensing | |
| Friedrichs et al. | Controlling DNA polymerization with a switchable aptamer | |
| JP5652850B2 (ja) | 核酸結合蛋白質アッセイ法およびキット | |
| KR20190092883A (ko) | 삼중접합구조 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 표적핵산 검출 방법 | |
| Gilhooly et al. | Specific anchoring of large topologically closed DNA for single-molecule protein: DNA interactions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |