CN105087755B - Dna三向节活化的杂交链式反应用于dna甲基化转移酶的高灵敏检测 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于DNA三向节活化的杂交链式反应用于DNA甲基化转移酶的高灵敏检测。本发明以DNA甲基化转移酶M.SssI为模型，开发了酶保护切割识别机制，将酶对底物的作用转化为杂交链式反应的触发过程，从而引起DNA的自组装过程，并实现了通用性DNA纳米器件的构建。该器件能够用于DNA修饰酶(尤其是DNA甲基化转移酶)的高灵敏检测和抑制剂筛选，具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及酶活性检测领域，具体涉及DNA三向节活化的杂交链式反应用于DNA甲基化转移酶的高灵敏检测，尤其涉及DNA甲基化转移酶M.SssI的检测。
背景技术
在过去十几年里，DNA因其具有严格的碱基配对原则而成为一种有趣的组装元素用于可控的、程序化的设计和组装DNA纳米材料。通过合理的序列设计和DNA自组装过程，一系列的动态DNA纳米器件被成功组装，如纳米机器、逻辑门、催化放大器等，它们大多是基于Toehold介导的链置换反应。DNA纳米器件通常是通过pH的调节、核酸杂交以及金属离子与碱基的反应引发的。然而，一般的设计仅仅将一种目标物转化为信号输出，这大大限制了目标物响应的DNA纳米器件的多样化设计。
典型的DNA三向节是由三条单独的DNA互相杂交形成，它作为一种新型的DNA纳米组装构筑单元被应用于DNA动态自组装中。多臂结构为组装目标物响应的DNA纳米器件提供了更多的可能性。对Toehold介导的链置换反应而言，在不同的三向节臂上安置Toehold和链迁移序列是至关重要的，原因为该种设计可使组装更加灵活，反应更易调节。在DNA三向节活化策略中，最初Toehold序列和链迁移序列是不可接近的，当进行识别反应后，通过某种信号转导机制的引入，即可将该识别事件转化为三向节的活化过程。最近，DNA三向节活化策略被成功用于目标物诱导的DNA环路和逻辑门中。然而，在该类设计中仍存在诸多限制，Toehold和链迁移序列通过一段完整的适体链连接或被劈开成两条DNA链，这就只能依赖指定的识别机制构建DNA纳米器件，如适体与蛋白质的绑定、金属与特定碱基对的结合等。因此，构建功能先进且能识别多种目标物的DNA纳米器件仍是个巨大的挑战。
核酸酶，如DNA修饰酶，在调节基因表达和维持基因完整性上起重要作用。DNA修饰酶的异常表达可能干扰基因形式的遗传外重新编程进而影响核染色质结构，引起许多疾病，如癌症、亨廷顿疾病或精神异常等。然而，DNA修饰酶作用的底物为一段DNA序列或特定的碱基位点，利用DNA修饰酶构建DNA纳米器件的最大障碍即为缺少有效的识别机制，如何将该类酶的作用转化为DNA三向节活化过程，是本领域技术人员面临的难题。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，发明人通过引入新的酶识别机制，可以实现将不同种目标物转化为同一种信号输出的一般性纳米器件的构建。以DNA甲基化转移酶M.SssI为模型，开发了在DNA三向节活化中引入酶保护切割识别机制，将DNA修饰酶对底物的作用转化为杂交链式反应的触发过程，从而引起DNA的自组装过程，并实现了通用性DNA纳米器件的构建。该器件能够用于DNA修饰酶(尤其是DNA甲基化酶)的高灵敏检测和抑制剂筛选，证明了该方法具有潜在的应用价值。
本发明涉及以下技术方案：
1、一种杂交链式反应方法，包括由DNA修饰酶参与的DNA三向节活化形成DNA三向节触发链，进而引发发卡结构H1、H2的杂交链式反应，其特征在于，DNA修饰酶识别探针可被限制性内切酶切割无法作为触发链引发杂交链式反应，DNA修饰酶与DNA修饰酶识别探针作用引入限制性酶酶切保护机制，DNA修饰酶的作用使得限制性内切酶识别位点发生变化，使其无法被该限制性内切酶切割，继而作为DNA三向节触发链引发杂交链式反应。
具体的，本发明所述引入限制性酶酶切保护机制，优选的实施例为，DNA修饰酶识别探针由一条携带Toehold部分的DNA链与一条携带链迁移部分的DNA链直接退火形成，Toehold部分和链迁移部分是相互靠近的，其茎部包含可同时被限制性内切酶和DNA修饰酶作用的识别位点，识别探针与DNA修饰酶作用后，探针茎部序列发生变化，限制性内切酶识别位点消除，识别探针不能被限制性内切酶切割，保持探针的原构象，继而引发后续的杂交链式反应，未经DNA修饰酶作用的探针，不能阻止限制性内切酶对其茎部的切割，造成Toehold部分和链迁移部分的分离，破坏引发链的完整性，DNA动态自组装过程不能进行。
本领域技术人员明了，不同类型的DNA修饰酶可以通过不同的方式使得识别序列发生碱基变化，如针对DNA甲基化转移酶M.SssI，识别探针由一条携带Toehold部分的DNA链与一条携带链迁移部分的DNA链直接退火形成，Toehold部分和链迁移部分是相互靠近的，其茎部包含同时可被限制性内切酶HpaII和M.SssI作用的识别位点，识别探针与M.SssI作用后，甲基化的胞嘧啶阻止HpaII的切割，能够保持识别探针的原构象，进而可以引发后续的杂交链式反应，而未甲基化的探针则不能阻止HpaII对其茎部的切割，造成Toehold部分和链迁移部分的分离，破坏了引发链的完整性，因此DNA动态自组装过程不能进行。
2、一种基于DNA三向节活化杂交链式反应的DNA甲基化转移酶检测方法，其特征在于，
(1)制备DNA甲基化转移酶识别探针、H1、H2，其中DNA甲基化转移酶识别探针由一条携带Toehold部分的DNA链与一条携带链迁移部分的DNA链直接退火形成，Toehold部分和链迁移部分是相互靠近的，其茎部包含可同时被限制性内切酶和DNA甲基化转移酶作用的识别位点，识别探针与DNA甲基化转移酶作用后，探针茎部序列发生变化，限制性内切酶识别位点消除，识别探针不能被限制性内切酶切割，保持探针的原构象，继而引发后续的杂交链式反应，未经DNA甲基化转移酶作用的探针，不能阻止限制性内切酶对其茎部的切割，造成Toehold部分和链迁移部分的分离，破坏引发链的完整性，DNA动态自组装过程不能进行；
(2)加入步骤(1)识别探针所对应的DNA甲基化转移酶和限制性内切酶，进行杂交链式反应；
(3)对反应结果进行信号检测。
优选的，上述检测方法在DNA甲基化转移酶与识别探针作用前，进行DNA的退火，包括DNA甲基化转移酶识别探针、杂交链式反应的H1和H2的退火，使H1和H2均形成稳定的非活化状态发夹结构，DNA甲基化转移酶识别探针由分别携带toehold和链置换部分的两条单链退火形成。
优选的，杂交链式反应中形成的双链在每个H2的末端都会形成一个G-四倍体结构，作为信号报告元件，通过加入荧光染料NMM进行信号检测。
优选的，DNA甲基化转移酶为M.SssI，其对应使用的限制性内切酶为HpaII。
优选的，识别探针的序列为CCTT GCA ATT CCGGA TAC TCT ATT，AAT AGA GTA TCCGG TTT AC AA CGAA CACG TTACC；H1的序列为ACAA CGAA CACG TTACC GGGTA GGGCGTTAGGA GGTA ACGT GTTC GTTG TAAT TGCA AGG，H2的序列为TGGGT TCCTAA CGCCC TACCCGGTAA CGTGT TCGTT GT GCAATT ACAA CGAA CACG TTACC GGTA GGCG GG。
3、一种利用上述检测方法进行DNA甲基化转移酶抑制剂/拮抗剂筛选的方法，其特征在于：在步骤(2)中，额外加入不同浓度的候选抑制剂后，进行杂交链式反应。
4、一种基于DNA三向节活化的杂交链式反应的DNA甲基化转移酶检测试剂盒，其特征在于，包括DNA甲基化转移酶识别探针、H1、H2，信号检测试剂，其中DNA甲基化转移酶识别探针由一条携带Toehold部分的DNA链与一条携带链迁移部分的DNA链直接退火形成，Toehold部分和链迁移部分是相互靠近的，其茎部包含可同时被限制性内切酶和DNA甲基化转移酶作用的识别位点，识别探针与DNA甲基化转移酶作用后，探针茎部序列发生变化，限制性内切酶识别位点消除，识别探针不能被限制性内切酶切割，保持探针的原构象，继而引发后续的杂交链式反应，未经DNA甲基化转移酶作用的探针，不能阻止限制性内切酶对其茎部的切割，造成Toehold部分和链迁移部分的分离，破坏引发链的完整性，DNA动态自组装过程不能进行。
优选的，DNA甲基化转移酶为M.SssI，其对应使用的限制性内切酶为HpaII，识别探针的序列为CCTT GCA ATT CCGGA TAC TCT ATT，AAT AGA GTA TCC GG TTT AC AA CGAACACG TTACC；H1的序列为ACAA CGAA CACG TTACC GGGTA GGGCG TTAGGA GGTA ACGT GTTCGTTG TAAT TGCA AGG，H2的序列为TGGGT TCCTAA CGCCC TACCC GGTAA CGTGT TCGTT GTGCAATT ACAA CGAA CACG TTACC GGTA GGCG GG。
本发明取得了以下技术效果：
(1)本发明引入新的酶识别机制，提供了新的DNA三向节活化策略。
(2)本发明所述的DNA三向节活化策略，克服了现有技术中只能依赖指定的识别机制构建DNA纳米器件的限制(如适体与蛋白质的绑定、金属与特定碱基对的结合)。
(3)本发明以DNA甲基化转移酶M.SssI为模型，开发了引入酶保护切割识别机制，将酶对底物的作用转化为杂交链式反应的触发过程，引起DNA的自组装过程，实现了一类通用性DNA纳米器件的构建。
(4)本发明所述方法针对DNA甲基化转移酶实现了高灵敏检测，对于DNA甲基化转移酶的检测，本发明的检测下限达到0.019U/mL，检测下限优于或相当于已报道M.SssI荧光检测方法的检测下限，并且免除了荧光团和淬灭团的标记，经济可行，利于进行临床实践的研究。
(5)本发明所述检测方法经试验验证具有良好的特异性。
附图说明
图1DNA三向节活化为基础的杂交链式反应用于DNA甲基化转移酶M.SssI活性检测的原理。
图2(A)荧光光谱实验验证M.SssI响应的组合Toehold介导的杂交链式反应；(B)凝胶电泳实验验证限制性内切酶保护机制和杂交链式反应。
图3(A)不同浓度的M.SssI下的荧光图谱；(2)荧光净信号与M.SssI浓度之间的线性关系。
图4DNA甲基化转移酶M.SssI响应的DNA三向节活化的杂交链式反应特异性考察。
图5抑制剂5-dC对甲基化转移酶M.SssI的抑制作用。
图6抑制剂5-Aza-dC对甲基化转移酶M.SssI的抑制作用。
具体实施方式
仪器装置
荧光分光光度计(F-7000，日本Hitachi)；电热恒稳培养箱(DNP-9052，上海精宏实验设备有限公司)；恒温循环水槽(HX-105，北京长流科学仪器有限公司)；电子天平(ME型号，梅特勒-托利多仪器有限公司)。K30型干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司，杭州)。DYY-8C型双稳定时电泳仪电源(北京市六一仪器厂，北京)；JY-SCZ9型双垂直电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司，北京)。
材料与试剂
所有的DNA序列均由上海生物工程有限公司合成和纯化(上海，中国)。40％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)和溴化乙锭(EB)均由上海生物工程有限公司购得(中国)。5-氟尿嘧啶购于Med Chem Express(USA)。甲基化转移酶M.SssI、甲基化转移酶HaeIII、甲基化转移酶AluI、限制性内切酶HpaII以及S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)均购于New England Biolabs(Ipswitch，MA)。甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞嘧啶(5-Aza)和5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶(5-Aza-dC)购于Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。所有的试剂均为分析纯，所用水为超纯水(>18.25MΩ)。
实施例一、实验方法
M.SssI与其识别序列的作用
取不同浓度的M.SssI，160μM SAM与甲基化转移酶识别探针与NEBuffer 2(1×)混合，反应2h后，加入甲基化敏感限制性内切酶HpaII与Cutsmart(1×)缓冲液混合，反应2h。进行HpaII失活，失活条件为80℃下保持30min，并使温度缓慢降下来。
杂交链式反应的进行
在以上体系中，加入1×TNaK缓冲液，H1，H2和超纯水，涡旋混匀后反应2h。维持完整的甲基化转移酶识别序列与H1、H2混合进行杂交链式反应。
染料的加入以及荧光测定
上述杂交链式反应完成后，在反应体系中加入NMM，KCl和超纯水，使其体积增加到50μL。涡旋混匀后，避光反应1h。
所有的荧光强度测定都是通过日本Hitachi FL-7000荧光分光光度计上进行，然后建立M.SssI活性浓度与绝对荧光强度的关系曲线。
DNA甲基化转移酶抑制剂的筛选
选取DNA甲基化转移酶M.SssI的两种抑制剂，分别为5-氮杂胞嘧啶和5-氮杂脱氧胞嘧啶。筛选抑制剂与M.SssI活性检测步骤类似，一点不同的是第一步M.SssI与其识别序列相互作用时加入不同浓度的抑制剂，进行后续反应。根据荧光强度与抑制剂的浓度建立关系曲线。
实施例二、基于DNA三向节活化的杂交链式反应用于DNA甲基化转移酶的高灵敏检测
DNA三向节活化为基础的杂交链式反应用于检测M.SssI活性原理
为了实现本方法的通用性，我们基于限制性内切酶的保护机制设计了一种新颖的DNA三向节活化方式用于CpG甲基化转移酶活性的测定。具体原理如图1所示：M.SssI的识别探针(RMP)由一条携带Toehold部分的DNA链与一条携带链迁移部分的DNA链直接退火形成。在RMP中，Toehold部分和链迁移部分是相互靠近的，因而可作为触发DNA组装的引发链。另外，其茎部包含限制性内切酶HpaII和M.SssI的识别序列和位点。当RMP的茎部与M.SssI作用后，甲基化的胞嘧啶阻止HpaII的切割，能够保持RMP的原构象，进而可以引发后续的杂交链式反应。而未甲基化的RMP则不能阻止HpaII对其茎部的切割，造成Toehold部分和链迁移部分的分离，破坏了引发链的完整性，因此DNA动态自组装过程不能进行。因此，通过一种动态DNA组装方式的设计即可实现多种目标物的检测。
DNA三向节活化为基础的杂交链式反应检测M.SssI活性的可行性研究
为了验证该设计的可行性，我们分别进行了荧光光谱实验和凝胶电泳实验。如图2A所示，当体系中加入8U/mL M.SssI时，体系呈现明显的荧光增强信号(curve b)。而体系中不存在M.SssI时，体系呈现微弱的荧光信号(curve a)。可能原因为RMP形成过程中有除设计探针外的二级结构不能有效的被HpaII切割，进而产生一定量的杂交链反应产物。另外，凝胶电泳实验中(图2B)，首先验证了甲基化的RMP是否能有效的阻止HpaII的切割。Lane1为纯的RMP加上20U/mL HpaII，与lane2中纯的RMP相比可看出，RMP在lane 1中条带消失，在下方出现两条分离的条带，为HpaII切割的产物。Lane 3为甲基化的RMP加上20U/mLHpaII，与lane 2相比，其位置和亮度均没有变化。以上结果说明，甲基化的RMP可阻止限制性内切酶HpaII的切割。因此，我们下一步验证了甲基化的RMP是否能进行有效的DNA组装。Lane 7为整个反应的对照条带，即未加入甲基化转移酶。从条带可看出未出现明显的杂交链式反应产物，并且四个亮带与lane 5中的H1、lane 6中的H2以及lane 1的切割产物一致。Lane 8为整个反应的阳性条带，与lane 7相比，在条带上方出现了较宽的杂交链式反应产物条带。以上结果说明，甲基化的RMP能够有效地进行DNA组装。综上所述，基于限制性内切酶保护原理构建的DNA三向节活化方式用于甲基化转移酶活性分析的策略是可行的。
DNA三向节活化为基础的杂交链式反应检测M.SssI活性的性能
灵敏度
通过测定不同浓度的M.SssI与荧光强度的变化关系，对本方法的灵敏度进行了考察。如图3A所示，随着M.SssI浓度的不断增加，荧光强度呈现逐步增加的趋势，说明逐渐增多的甲基化RMP阻止了HpaII的切割。图3B为荧光强度与目标M.SssI的线性关系曲线，从图中可以看出，M.SssI浓度与净荧光强度在0.50U/mL-80U/mL(R＝0.9979)范围内呈线性关系。经估算本方法的检测下限达到0.019U/mL。本方法得到的检测下限优于或相当于已报道M.SssI荧光检测方法的检测下限。但本设计简单，而且免除了荧光团和淬灭团的标记，经济可行，利于进行临床实践的研究。
特异性
我们选择两种胞嘧啶甲基化转移酶AluI和HaeIII验证该方法对M.SssI的特异性。因此，当在体系中加入AluI和HaeIII时，RMP的识别序列不能被甲基化，因此会被HpaII切割，造成无效的DNA组装。如图4所示，8U/mL的AluI和HaeIII加入到体系中，产生的荧光强度与背景信号相当。而8U/mL的M.SssI则产生了明显增强的荧光信号。以上结果表明，RMP识别探针的设计对DNA甲基化转移酶M.SssI具有良好的特异性。
抑制剂筛选
为了考察本方法对M.SssI抑制剂的筛选能力，我们选择5-氮杂胞嘧啶(5-dC)和5-氮杂脱氧胞嘧啶(5-Aza-dC)作为抑制剂模型。如图5所示，选择5-dC的浓度范围为0.1μM到5μM，M.SssI的相对活性呈现逐渐减小的趋势，直至达到平衡。说明随着该抑制剂量的加大，M.SssI的活性受到了有效的抑制。从图上可看出，该抑制剂的IC50为0.4μM。我们进行了类似的实验对5-Aza-dC的抑制作用进行了考察，如图6所示。选择5-Aza-dC的浓度范围为0.1μM到2μM，得到的IC50值为2.9μM。从以上结果可以看出，本文所建立的方法可以进行甲基化转移酶抑制剂的筛选，说明本方法具有潜在的临床应用价值。
本发明提供了一种核酸酶响应的DNA三向节活化方式，以DNA甲基化酶M.SssI为模型，构建了一种通用型的杂交链式反应用于酶活性的高灵敏、特异性检测以及抑制剂筛选。通过引入酶保护切割机制，将酶的识别事件转化为同一个DNA组装的引发链，进而引发相同的杂交链式反应。本发明的一般化设计原理可使其微小的改变识别部分即可实现更多种核酸酶的检测和抑制剂筛选。
Claims (6)
1.一种基于DNA三向节活化的杂交链式反应的DNA甲基化转移酶检测方法，所述方法为非疾病的诊断方法，其特征在于，
（1）制备DNA甲基化转移酶识别探针、H1、H2，其中DNA甲基化转移酶识别探针由一条携带Toehold部分的DNA链与一条携带链迁移部分的DNA链直接退火形成，Toehold部分和链迁移部分是相互靠近的，其茎部包含同时可被限制性内切酶和DNA甲基化转移酶作用的识别位点，识别探针与DNA甲基化转移酶作用后，甲基化的胞嘧啶阻止相应限制性内切酶的切割，保持识别探针的原构象，进而可以引发后续的杂交链式反应，而未甲基化的探针则不能阻止限制性内切酶对其茎部的切割，造成Toehold部分和链迁移部分的分离，破坏了引发链的完整性，DNA动态自组装过程不能进行；
（2）加入步骤（1）识别探针所对应的DNA甲基化转移酶和限制性内切酶，进行杂交链式反应；
（3）对反应结果进行信号检测；
其中，DNA甲基化转移酶为M.SssI，其对应使用的限制性内切酶为HpaII。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在DNA甲基化转移酶与识别探针作用前，进行DNA的退火，包括DNA甲基化转移酶识别探针、杂交链式反应的H1和H2的退火，使H1和H2均形成稳定的非活化状态发夹结构，DNA甲基化转移酶识别探针由分别携带toehold和链置换部分的两条单链退火形成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，杂交链式反应中形成的双链在每个H2的末端都会形成一个G-四倍体结构，作为信号报告元件，通过加入荧光染料NMM进行信号检测。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，识别探针的序列为CCTT GCA ATT CCGGATAC TCT ATT AAT AGA GTA TCC GG TTT AC AA CGAA CACG TTACC；H1的序列为ACAA CGAACACG TTACC GGGTA GGGCG TTAGGA GGTA ACGT GTTC GTTG TAAT TGCA AGG， H2的序列为TGGGT TCCTAA CGCCC TACCC GGTAA CGTGT TCGTT GT GCAATT ACAA CGAA CACG TTACCGGTA GGCG GG。
5.一种利用权利要求1-4任一项所述方法进行DNA甲基化转移酶抑制剂/拮抗剂筛选的方法，其特征在于：在步骤（2）中，额外加入不同浓度的候选抑制剂后，进行杂交链式反应。
6.一种基于DNA三向节活化杂交链式反应的DNA甲基化转移酶M.SssI检测试剂盒，其特征在于，包括DNA甲基化转移酶M.SssI识别探针、H1、H2，限制性内切酶HpaII，信号检测试剂，其中识别探针的序列为CCTT GCA ATT CCGGA TAC TCT ATT AAT AGA GTA TCC GG TTTAC AA CGAA CACG TTACC；H1的序列为ACAA CGAA CACG TTACC GGGTA GGGCG TTAGGA GGTAACGT GTTC GTTG TAAT TGCA AGG， H2的序列为TGGGT TCCTAA CGCCC TACCC GGTAA CGTGTTCGTT GT GCAATT ACAA CGAA CACG TTACC GGTA GGCG GG。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |