CN1313906A - 通过在半导体微芯片上进行电斑点印迹检测法分辩单核苷酸多态性 - Google Patents

通过在半导体微芯片上进行电斑点印迹检测法分辩单核苷酸多态性 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用硅微芯片上的电路快速检测单核苷酸多态性的方法。该方法能在将DNA电协助转运、浓缩和结合到所选电极(测试位点)后,准确地辨别扩增好的DNA样品。所述测试位点构成规则的样品阵列,后者可利用包含野生型序列和错配序列这两种标记报告分子的内部控制来加以分辨。利用该方法分辨了甘露糖结合蛋白的复杂四等位基因SNP。

Description

通过在半导体微芯片上进行电斑点印迹检测法 分辨单核苷酸多态性
发明领域
本发明涉及检测单核苷酸多态性(SNP)。具体来说，发明涉及利用电寻址微芯片检测SNP。
背景
以下给出了与本发明有关的大概信息。这不表示文中提供的任何信息是这里要求保护的发明的现有技术，也不表示任何明确或隐含提及的参考文献对于本发明是现有技术。
单核苷酸多态性(SNP)是构成最常见的一类遗传变异的点突变，在人类基因组中的发生频率为0.5-10/1000碱基对。SNP是能引发人类疾病的稳定突变，并可以作为遗传标记。多基因与环境之间的复杂关系使得有必要探寻一个较大群体中的SNP以便弄清它们对于疾病发生和进展的影响。目前的工作致力于利用高密度阵列、质谱、分子信号、肽核酸以及5’核酸酶检测法通过大规模图谱绘制项目来鉴定人类SNP。但这类技术还未广泛用于研究和临床。
SNP基因分型的常规方法依赖于(1)对PCR扩增的材料进行基于凝胶的测序，比如Komman等描述过的(临床杂志24:72-77(1997))，或者(2)限制酶切片段长度多态性(RFLP)，比如A.J.Jeffreys等描述过的(细胞18:1-10(1979))，或者(3)与等位基因特异性寡核苷酸探针(ASO)进行斑点印迹杂交，比如Malmgren等描述过的(临床遗传学50:202-205(1996))，或者(4)如Schafer等描述的单链构象多态性(SSCP)(自然生物技术15:33-39(1995))。其中测序方法虽然有效，但是非常费时，并且可能遇到由二级结构导致的假结果。RFLP通常只包含一部分SNP多态性。ASO可能需要将热变性步骤延长时间，而SSCP不容易实现自动化。用高密度寡核苷酸阵列作被动杂交已经完成了大规模的SNP基因分型。但是，常规DNA阵列上的位点无法单个地控制，必须在整个阵列上进行相同的处理步骤。
我们提供了一种改善SNP检测技术的方法，该方法结合了微电子学与分子生物学工艺，其中调节微芯片上的电场就能在指定的测试位点对DNA分子进行浓缩、杂交和检测。这个新方法还利用测试位点的极性反转使单碱基对错配的寡核苷酸和大量测试位点构象发生变性，从而能灵活地设计快速高通量地筛选目的基因。
发明概述
本发明提供了许多方面的内容，其中的一个优选实施方案包括利用生物电子微芯片与核酸杂交来检测单个或多个等位基因复合体以及其它含有单核苷酸多态性(SNP)的核酸中的SNP，这包括，但不限于，同一单倍型核酸中是否存在多个多态性位点，甘露糖结合蛋白的复杂四等位SNP,Fc-γ受体，主要组织相容性复合体以及白介素1β的SNP分型。
在另一个实施方案中，本发明包括对含有目的核酸序列的患者样品中的SNP进行多重检测，比如根据临时需要能对大量样品进行快速SNP基因分型以确定基因亚型。
在另一个实施方案中，发明包括同时筛选来自一个患者样品的不同基因的多个SNP。
在此外的一个实施方案中，发明包括利用等位基因特异性探针，在此，无论多态性核苷酸位于等位基因特异性探针的5’、中部、或者3’，都能同样好地分辨多态性。
在另一个实施方案中，所述方法采用将扩增靶核酸的一个链标记，其中在用于扩增反应的扩增引物上引入标记(包括，但不限于，含有生物素的标记)来扩增所述靶核酸。
在另一个实施方案中，所述方法包括使标记的靶扩增产物结合到电寻址微芯片上的指定测试位点。
在另一个实施方案中，所述方法包括实时监测电杂交和电严紧的各个阶段从而保证检测过程中的有效控制。
在另一个实施方案中，所述方法使用了基于每秒平均荧光强度(MFI/s)值的荧光杂交模式评判法，包括以下基准：比较阳性和阴性样品之间信号差异的大小，将任何计为负或正的信号分别清楚地统计为分别在阳性或阴性中观察到的MFI强度之下或之上。也可以执行不同的评分基准，如比较将阴性、阳性报告探针给予单个样品时，由两种探针的相对结合力产生的信号获得的MFI/s。在这种情况下，用至少两个不同的为与样品中的特定靶物质进行杂交而设计的报告探针对样品进行测试。由评判得到的结果还取决于渗透层的特性和功能性成分的密度，比如抗生物素蛋白或其它结合基元，或者渗透层成分(比如琼脂糖或水凝胶)的浓度。
此外，本发明的方法还有寻址微芯片相对被动阵列技术的优势，包括：
a．单个控制测试位点，从而能在即将检测前定制测试阵列的构象的能力；
b．在数秒内对核酸分子进行电寻址(即转运)、浓缩和杂交的能力；
c．控制特定测试位点的电严紧，从而能同时使用同一开放阵列微芯片上的不相干分子的能力；
d．将此处公开的方法用于含有数百个测试位点的阵列的自动加样器的能力；以及
e．将此处公开的方法用于分析有限数量细胞内发生的RNA表达的能力。
附图简述
图1是1个微电子阵列格式图案的显微照片。
图2是电斑点印迹检测法示意图。
图3显示野生型人甘露糖结合蛋白(MBP)的有义链中从1001到1158位核苷酸(标为等位基因A)的DNA序列(SEQ ID NO:1)。图中标出了等位基因B、C和D的SNP碱基和位置。该图还显示了正向(MBLF)和反向(R-1120)扩增引物(箭头)的位置。每个合成的报告探针带有cy3或cy5标记。
图4A、4B、4C和4D是微芯片上的SNP检测结果的显微照片，其中每行的4个捕获位点加入了4种未知的扩增MBP样品(NC47、NC48、NC49或NC50)之一。中间第5行装有非特异性(NS)硫代嘌呤甲基转移酶(TPMT)扩增子。这些图显示标记着cy3或cy5的等位基因特异性报告探针在电严紧之前(图4A和4B)或之后(图4C和4D)的杂交情况。图4A和4C检测cy3荧光而图4B和4D检测cy5荧光。
图5A和5B的图表显示样品NC49发射的荧光，在图4中cy3图像(图5A)和cy5图像(图5B)中的量。样品NC49鉴定为A/A纯合子。
图6A和6B的图表显样品NC50发射的荧光，在图4中cy3图像(图6A)和cy5图像(图6B)中的量。样品NC50鉴定为A/B杂合子。
图7A和7B的图表显示样品NC47发射的荧光，在cy3图像(图7A)和cy5图像(图7B)中的量。样品NC47鉴定为B/B纯合子。
图8A和8B的显微照片显示在微芯片上检测含有A和D MBP等位基因的样品的cy5结果。样品LM18是一个D/D纯合子。样品LM27是一个A/D杂合子。其余展示样品为A/A纯合子。
图9A的曲线图显示通过检测与等位基因C、等位基因T以及错配报告分子组杂交的IL-1βT/T扩增子的cy3标记，相对电严紧安培数增加得到的定量结果。
图9B的显微照片显示图9A中的最终严紧条件下的检测结果。
图10A的曲线图显示通过检测与等位基因C、等位基因T杂交的IL-1βT/T扩增子的cy5标记，相对电严紧安培数增加得到的定量结果。
图10B的显微照片显示图10A中的最终严紧条件下的检测结果。
图11A和B的条形图显示探针分别与淋巴毒素基因A/A和G/G纯合子的阳性和阴性信号。
图12A和B的条形图显示探针与肿瘤坏死因子α基因中的靶标的阳性、阴性和对照信号。
图13A到L展示了一系列微阵列照片，其中说明了发明所述的多重分析。
发明详述
定义
文中使用的“平均荧光强度”(MFI)是在目标区域内，将摄象机集成时间归一为1秒时，像素数值的平均值。数值范围将随渗透层组成而变化。
文中使用的“荧光杂交评分”是确定严紧后的杂交特征，其中评判依据的标准可以随渗透层的特性和功能成分变化。在本发明的一个实施方案中，所述标准规定(1)错配的探针要小于10MFI/秒；(2)所有小于25MFI/秒的等位基因特异性报告分子评为阴性；以及(3)所有大于30MFI/秒的报告分子评为阳性。这个评分标准代表了一个如何借助电斑点印迹方法，利用信号参数来鉴定单核苷酸多态性的例子，而非任何意义上对本发明的限制。根据不同标准，可以将规定为阳性或阴性分值的MFI/s大小设置在适合于不同检测灵敏度的合适水平上。
此外，设计利用多重报告分子杂交(或者内部冗余)来确定每个样品的基因型不需与重复样品或对照样品进行比较。详细的实施方案
本发明众多方面之一提供了这样一种方法，它利用电寻址生物电微芯片对多等位基因复合体和其它含有单核苷酸多态性(SNP)的核酸中的SNP进行高通量检测，包括，但不限于在同一核酸内是否存在多个多态性位点，甘露糖结合蛋白中的复杂四等位基因SNP,Fc-γ受体、主要组织相容性复合体以及白介素1 β的SNP分型。正如文中解释的，微电子学与核酸杂交的结合能快速并准确地在SNP序列之间作出分辨。事实上，就在22个未知MBP四等位基因样品和13个D等位基因增强的未知样品中进行的SNP检测而言，已证明本发明所述双色荧光电斑点印迹法100％准确。这样的准确性来源于一个新用法：错配寡核苷酸能验证电子微环境从而确切地分辨杂合子序列，还有cy3和cy5标记报告分子所揭示的内部冗余，证实了单个样品中的SNP。这种基于随选对大量基因子集样品进行快速SNP基因分型的能力相对已有方法有显著的优势。
此外，利用半导体微电子学来转移和浓缩核酸比被动的阵列技术有几个优点，包括，但不限于，(1)灵活性，其中的开放结构和各个控制测试位点的能力使得能在即将作测试前自定义每个阵列的配置；(2)速度，该方法中的电寻址和电杂交保证在数秒而非数小时内进行DNA分子的转移、浓缩和杂交；(3)多路性，其中控制各个测试位点电严紧度的能力使得可以在相同微芯片上同时使用各不相干的分子；(4)高效性，实时监测电杂交和电严紧度不同阶段的能力提供了检测过程中的更有效控制；(5)是一种“芯片上的实验室技术”，其中电子学的运用提供了一种自动化手段，而消除了费时的预处理步骤，即直接在微芯片上采用介电电泳进行细胞浓缩、破裂和核酸浓缩/扩增；(6)自动化，其中可以利用用于100-pad和400-pad半导体芯片的自动加样器以获得高通量参数；以及(7)基因表达，此处描述的技术可以用于分析少数细胞中的RNA表达情况。
实施例1-MBP等位基因检测
人甘露糖结合蛋白(MBP或MBL2)是先天免疫系统的重要成分，它能使病原微生物易被吞噬细胞吞噬。MBP对于对多种病原还未建立起免疫力的儿童尤其重要。继承了几种常见MBP变异体中的任何一种都会导致免疫缺陷，这种情况在免疫抑制时会加剧。已经鉴定到MBP基因的四种不同等位基因。MBP的潜在临床实用性及其基因复杂性使这个序列成为用本发明所述方法进行分析的良好靶标。
本发明的方法使用Nanogen,Inc.(San Diego,CA)制造的电寻址微芯片。这种微芯片是利用常规加工技术在氧化硅片上制作的。利用无线电频率排射方法将硅片涂上20nm钛和100nm铂金属层。采用常规光刻印刷技术，完成金属层的图案并进行蚀刻从而形成电极阵列。然后通过等离子体强化的化学蒸发沉积法给整个硅片沉积上氧化硅绝缘层。露出的电极直径为80μm，电极中心间的距离是200μm。给硅片涂上光阻物质，切成1cm2芯片。在本实施例中，1cm2芯片含有排列成5×5阵列的25个微电极(图1)。每个电极或测试位点可以独立地带正电、负电或是电中性以便分子移动和浓缩到或离开测试位点。
用含有链霉亲合素的琼脂糖渗透层涂覆包含电极的芯片表面，从而在电极附近将样品中的生物材料与苛刻的电化学环境隔开，并进而使样品中生物素化的核酸结合到芯片表面的电极上。所述渗透层的制备是将乙二醛琼脂糖(FMC Bioproducts,Rockland ME)与链霉亲合素(5mg/ml,Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)混合形成2％琼脂糖和1mg/ml链霉亲合素的混合物。将芯片旋涂上链霉亲合素-琼脂糖溶液并用0.2M的氰氢硼化钠/0.3M硼酸钠(pH9.0)还原schiff碱键60分钟。
所述MBP基因中的多重SNP发生在基因中的一个17碱基对区域。将MBP基因的野生型序列定义为等位基因A，而SNP等位基因型命名为等位基因B、C和D。如图3所示，可以由患者的基因组核酸样品扩增包含这个多态性区域的123碱基片段并用于发明所述方法。图2显示了所述方法检测步骤的一个实施方案。
设计用于扩增MBP基因(Genbank HSMBPIA-X15954)的引物使有义链引物包含核苷酸序列5’-TGATTGCCTGTAGCTCTCCAGGCAT-3’(SEQ ID NO:2)，而反链引物包含核苷酸序列：生物素-5’-GGTAAAGAATTGCAGAGAGACGAACAGC-3’(SEQ ID NO:3)(即反链引物的5’末端是生物素化的)。
经PCR由患者基因组DNA扩增本实施例所述方法中的123碱基片段，其中反应体系100μl中含有2-4μl DNA、1×PCR缓冲液Ⅱ(Perkin-Elmer,Branchburg,NJ)、1.5mM MgCl2、200μM dNTPs、200μM各种引物、2.0U的AmpliTaq Gold(Perkin-Elmer)和280nM Taq StartAntibody(Clontech,Palo Alto,CA)。反应体系循环是在9700热循环仪(Perkin-Elmer)中95℃10分钟(1个循环)，95℃30秒、58℃60秒、72℃120秒作35个循环，然后在72℃温育12分钟。每份DNA样品经Qiagen柱子(Valencia,CA)纯化，重悬于水中并利用DNA分子量梯度对照(GibcoBRL,Gathersburg,MD)经凝胶电泳定量。将DNA样品以2.5-10nM的浓度重悬于100mM的组氨酸(Sigma,St.,Louis,MO)中。
将样品(大约40到400μl体积)于95℃热变性2-10分钟，并在冰上迅速冷却。将35μl样品加到微芯片上，利用正偏压直流电以400nA/测试位点电转移(寻址)到一列带4个正电荷的测试位点120秒。用组氨酸缓冲液清洗以除去未结合的DNA。对每个样品重复该步骤。一个任选步骤是将完全寻址的阵列用0.5×SSC(pH11.5)处理5分钟，然后用水和组氨酸彻底冲洗以便产生更强的杂交信号。完成寻址的扩增子借助与预先包埋在渗透层中的链霉亲合素的相互作用仍然结合在它们各自的测试位点上。
然后使每个测试位点上的核酸与荧光标记的等位基因特异性报告寡核苷酸探针通过电杂交进行杂交。合成的报告探针(见表1)在5’末端连接了cy3或cy5荧光基团(BioServe Biotechnologies,Laurel,MD)。电杂交的进行要保证野生型以及SNP cy3和cy5报告基团各以75到125nM的浓度重悬于100mM组氨酸缓冲液中。将每个等位基因组中两种cy3标记的错配报告分子以37.5nM等量混合使缓冲液中的合并浓度为75nM。将每组报告分子(20-35μl)加样到微芯片上，并与一行被捕获的扩增子在475nA/测试位点的条件下杂交15秒。用100mM组氨酸冲洗以除去过量的报告分子。第二、三和四组的报告分子以相同的行-方式加样。杂交后，在20mM二价碱NaH2PO4、20mM Trisbase(pH9.5)(20/20缓冲液)中洗20分钟进行电严紧。
然后优选通过将各个测试位点的电荷极性倒转并增加安培数(电严紧)使单碱基对错配的报告探针变性。给每个测试位点施加0.5μA/测试位点的脉冲电流，通0.1秒，断0.2秒，作150个循环(或者通0.1秒，断0.1秒，50个循环)。芯片在20/20缓冲液中清洗以除去变性的报告分子并用IPLab软件获取图象。当安培数斜线上升结束时，将图象和荧光定量。具体来说，使用0.6μA/测试位点、0.7μA/测试位点、0.8μA/测试位点、0.9μA/测试位点和1.0μA/测试位点。跨越TPMT密码子460多态性的生物素化扩增子作为非特异性本底对照。将每个图象归一化为MFI/s，提取每个MBP测试位点的非特异性计数以便进行最终定量。相对错配对照，阳性测试位点得到明显的信号。
本实施例的方法使用了这样一种装置，其中与微芯片的电连接是通过设置在显微操作器6000(Micromanipulator Company,Carson City,NV)上的环氧化环形探针卡套(Cerprobe,Phoenix,AZ)实现的。动力(Keithley236,Keithley Instruments,Cleveland,OH)源自一列继电器(National Instruments,Austin,TX)的接线端之间的固定电势差或固定电流。计算机硬件(Macintosh Power PC,Apple Computer,Cupertino,CA)和IPLab Spectrum3.1.1版软件(Signal Analytics Corporation,Vienna,VA)使图形用户能通过菜单控制各个阵列位置。激发激光使用HeNe 633nm激光器(8mW输出功率；Research Electro-Optics,Boulder,CO)和频率倍增二极管驱动的固态激光器(5mW输出功率；Laser Compact,Moscow)532nm。通过一个带有575nm(用于cy3)或670nm(用于cy5)(Chroma Tech,Brattleboro,VT)滤光片的8x物镜观察荧光。用电荷耦合器摄像头(Princeton Instruments,Trenton,NJ)扫描并收集荧光信号。通过IPLabSpectrum软件对扫描得到的图象进行定量。
如表1所示，合成野生型、特定SNP等位基因序列或者野生型和SNP错配的特异性报告探针。用cy3(1,1’-双(ε-羧戊基)-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羧氰-5,5’-二磺酸钾盐二-N-羟基琥珀酸酯)和cy5(1,1’-双(ε-羧戊基)-3,3,3’,3’-四甲基吲哚二羧氰-5,5’-二磺酸钾盐二-N-羟基琥珀酸酯)标记野生型和SNP报告分子。标记cy3的野生型探针与标记cy5的野生型探针要隔离开。同样处理SNP探针。但要将野生型的和SNP标记报告分子合并成两类探针混合物。具体来说，这些混合物或组是(1)野生型-cy3/SNP-cy5和(2)野生型-cy5/SNP-cy3。将差异标记的探针混合在一起就能使它们与各个测试位点上扩增好的患者DNA样品同时进行杂交，每种杂交情况得以重复记录。对于每个SNP等位基因，要另外制备两个含有野生型和SNP错配的报告寡核苷酸探针。这些探针只标记cy3。在本实验中任意选择cy3是为了方便实验。但是，为了分辨等位基因可以结合上任何标记。错配的探针同样以相同的摩尔浓度合并为两组，真实的野生型或SNP探针均用cy5标记((1)野生型-cy5/错配-cy3和(2)SNP-cy5/错配cy3)。这些附加的报告分子对使得在同一样品中存在野生型和SNP序列(杂合子)时，能对它们与配对和错配探针序列之间的相互作用进行比较。
                                            表1
报告探针类型     报告分子种类     报告分子序列
等位基因A或D分辨 等位基因A、cy3或cy5  5’caggcaaagatgggCgtgatg3’(SEQ IDNo:4)
等位基因D、cy3或cy5  5’caggcaaagatgggTgtgatg3’(SEQ IDNo:5)
    错配A、cy3  5’caggcaaagatgggAgtgatg3’(S～ID No:6)
    错配D、cy3  5’caggcaaagatgggGgtgatg3’(SEQ IDNo；7)
等位基因A或B分辨 等位基因A、cy3或cy5  5’tgatgGcaccaaggGagaaaag3’(SEQ IDNo:8)
等位基因B、cy3或cy5  5’tgatgAcaccaaggGagaaaag3’(SEQ IDNo:9)
位点1073A和B错配、cy3  5’tgatgTcaccaaggGagaaaag3’(SEQ IDNo:10)
位点1073A和B错配、cy3  5’tgatgCcaccaaggGagaaaag3’(SEQ IDNo:11)
等位基因A或C分辨  等位基因A、cy3或cy5  5’tgatgGcaccaaggGagaaaag3’(SEQ IDNo:12)
 等位基因C、cy3或cy5  5’tgatgGcaccaaggAagaaaag3’(SEQ IDNo:13)
位点1082A和C错配、cy3  5’tgatgGcaccaaggTagaaaag3’(SEQ IDNo:14)
位点1082A和C错配、cy3  5’tgatgGcaccaaggCagaaaag3’(SEQ IDNo:15)
利用这些检测条件，对预先通过常规测序技术确定的MBP序列已知的基因组DNA样品作盲测。所检测的样品中有一组已经鉴定出是这四个等位基因的纯合或杂合形式，将其作为对照。其余样品(22个样品)的基因型未知。用本发明的方法对这22个样品作盲测。另外，检测第二组13个未知样品中是否存在D等位基因位点。
使每个未知扩增子电寻址到一列4个测试位点上。这样，一个25位点的微芯片阵列可以容纳4个不同的患者样品和一个非特异性对照扩增子。每行样品与四种探针混合物(即报告分子组(1)Acy3/Bcy5,(2)错配-cy3/Acy5,(3)错配-cy3/Bcy5，和(4)Bcy3/Acy5)之一进行杂交。每个报告分子组含有一个cy3标记的和一个cy5标记的SNP等位基因特异性寡核苷酸对，它们仅有一个核苷酸错配不同。图4A-D显示了一个代表性微芯片与四个cy3/cy5标记的报告分子组杂交后的图象，该芯片含有4个未知样品(NC47、NC48、NC49和NC50)，报告分子组对上文提及的MBP的A或B等位基因是特异性的。施加电严紧直至错配对照(错配-cy3)被去除到本底水平(图4C)。
图4A-D展示了代表3种可能的基因型(A/A、A/B、B/B)的不同荧光图案。对样品NC47(第1列)所作的分析显示，在cy3图象(图4C)中与第四个报告分子组(第4行)有明显信号，在cy5图象(图4D)中与第一(第1行)和第三(第3行)个报告分子组有信号。总起来说，这样的信号和与含有B等位基因特异探针(代表真实的配对情况)的报告分子组发生的杂交情况是一致的。电严紧将A等位基因特异探针所产生的信号降至本底水平。
未知样品NC48(图4C，第2列)与第一个报告分子组(第1行)呈现出一个cy3信号，与第二和第四报告分子组(第2和4行)是一个cy5信号。每个信号和与A等位基因特异报告分子发生的杂交情况相符。类似地，含有样品NC49(第4列)的一列在cy3图象中(图4C，第1行)和cy5图象中(图4D，第2和4行)与A等位基因特异报告分子有信号。注意图4C中第2和3行中的每个测试位点发射的荧光已降至本底强度。这些测试位点已用错配cy3标记的报告分子进行了杂交，并且知道它们与A和B等位基因序列均错配。错配信号的消失证明用于分辨SNP的电严紧达到了一个合适的水平，任何其余报告分子信号都构成完全配对。
对每板上的未知样品NC50(第5列)进行评估显示，cy3图象(图4C，第1和4行)和cy5图象(图4D，第1-4行)中均有A和B等位基因特异性结合。在与错配cy3报告分子(图4C，第2-3行)作杂交的测试位点没有信号证明电严紧完善，并且明确了NC50扩增子中含有A和B两种等位基因序列。
进一步分辫以上图象以便对每个样品发射的荧光进行定量。MBP报告分子与非特异性扩增子(NS)的结合是电杂交后的总cy5荧光强度的大约4％，比严紧前cy3标记的报告分子高2到4倍。NC49显示，A等位基因报告分子和错配报告分子之间的平均强度与B等位基因和错配报告分子之间的平均强度的区别在10倍以上(图5A和5B)。因此，就B位点而言，将NC49评为A/A纯合子。类似地，样品NC48定为A/A纯合子(数据未显示)。
对评为A/B的未知样品NC50进行的定量显示，结合到被捕获的扩增子上的A和B等位基因特异性cy3报告分子和cy5标记报告分子均有明显的信号(大约70MFI/s)。因此，就B位点来说，NC50扩增子判为A/B杂合子。
将NC47样品的荧光定量(图7A和7B)，显示错配和A等位基因报告分子被降至本底强度。然而，B等位基因报告分子仍有高于100MFI/s的信号。类似地，分析cy5图象(图7B)表明A等位基因信号下降(即低于25MFI/s)，而B等位基因信号保持强劲(即大于100MFI/s)。因此，NC47判为B/B纯合子。
分析来自判为A/A(就SNP等位基因而言)的患者的不同未知样品(样品总数=18)表明，较之错配cy3报告分子，A-cy3报告分子与A/A样品的结合高100倍，它比B或C等位基因cy3标记的SNP报告分子与A/A样品的结合高26倍(探针：均值±均值的标准误差(SEM)；A-cy3:200±36.2 MFI/s,SNP-cy3:7.6±1.8MFI/s，错配-cy3:1.9±0.3MFI/s)。相反地，分析七个判为杂合子的不同未知样品表明，cy3标记的A等位基因和SNP探针与样品的结合强度几乎相等，而错配探针与样品的结合强度低20倍(探针：均值±SEM；A-cy3:188.3±44.4MFI/s；SNP-cy3:150.1±42.3MFI/s；错配-cy3:7±2.2MFI/s)。对于cy5标记探针，记录的配对与错配碱基的比率相等(数据未显示)。
评判22个未知样品的B和C等位基因位点。将每个位置的核苷酸序列以及A、B和C基因型与标准测序结果进行比较(见表2)。如图所示，B和C位点的所有44个SNP评判(22个A/B和22个A/C)的微芯片检测和测序结果是吻合的。至此还没有描述同一单倍型内B和C等位基因序列的发生率。对于B/B基因型，只有完全配对的B和C等位基因探针在严紧后仍保持结合状态。因此，在判定它们是化合物杂合子之前必须对B和C报告分子均作评判。虽然跨越多个变异位点的探针有可能准确地区分开各种基因型，相同单倍型内的多态性位点可能会对以这种方式进行的分辨造成混淆。在此情况下，给每个多态性位点设置不同探针是有利的。如文中所论证的，无论多态性核苷酸位于等位基因特异性探针的5’、中央或3’，都可以同样良好地加以分辨。
然后再将这22个样品进行盲测并评判是否有D等位基因(表2)。本发明的电子学方法正确地从22个样品中鉴定出唯一的D等位基因样品(NC52-A/D)。因为D等位基因的发生率很低，而任何SNP分辨方法的效率就在于其鉴定低频等位基因的能力，因此用D等位基因报告探针通过电子学方法检测了第二组13个未知样品(将其对D等位基因系统有效性加权，样品LM1、LM10、LM11、LM18、LM20、LM27、LM29、LM30、LM31和LM32)。用电子检测法得到的每组样品的D等位基因评分与测序结果100％吻合。图8A和8B显示了13个未知样品中的10个的微芯片图象。
        表2．用未知样品的常规DNA测序(NIH)验证经电斑点印迹
                            (NGEN)所作的SNP分型
样品 A/B  A/C  A/D  NGEN  NIH 一致 不一致
1．NC7  a/a  a/a  a/a     a/a  A/A     +
2．NCI1  a/b  a/a  a/a     a/b  A/B     +
3．NC20  a/a  a/c  a/a     a/c  A/C     +
4．NC44  a/a  a/a  a/a     a/a  A/A     +
5．NC45  a/a  a/a  a/a     a/a  A/A     +
6．NC36  a/a  a/c  a/a     a/c  A/C     +
7．NC37  a/a  a/a  a/a     a/a  A/A     +
8．NC38  a/a  a/a  a/a     a/a  A/A     +
9．NC40  a/b  a/a  a/a     a/b  A/B     +
10．NC42  a/a  a/a  a/a     a/a  A/A     +
11．NC43  a/a  a/a  a/a     a/a  A/A     +
12．NC46  a/a  a/a  a/a     a/a  A/A     +
13．NC47  b/b  a/a  a/a     b/b  B/B     +
14．NC48  a/a  a/a  a/a     a/a  A/A     +
15．NC49  a/a  a/a  a/a     a/a  A/A     +
16．NC50  a/b  a/a  a/a     a/b  A/B     +
17．NC51  b/b  c/c  a/a     b/c  B/C     +
18．NC52  a/a  a/a  a/d     a/d  A/D     +
19．NC53  a/a  a/a  a/a     a/a  A/A     +
20．NC54  a/b  a/a  a/a     a/b  A/B     +
21．NC55  a/b  a/a  a/a     a/b  A/B     +
22．NC56  a/b  a/a  a/a     a/b  A/B     +100％ 0％
实施例2-白介素1β检测
本发明在检测SNP方面的用途进一步通过检测双等位基因白介素1β(1L-1β)多态性来说明。1L-1β序列提取自Genbank(XO4500)，它的5888位点含有C到T的SNP转换。用于PCR扩增的引物序列包括有义链核苷酸序列，5’-AAATTTTGCCACCTCGCCTCACG-3’(SEQ IDNO:16)和反链核苷酸序列，生物素-5’-AGTCCCGGAGCGTGCAGTTCAGT-3’(SEQ ID NO:17)(即反链是生物素化的)。
在本实施例中，如上所述，设计cy3和cy5标记的报告分子(由Bioserve,Laurel,MD合成)组来鉴定野生型(C)和SNP变异(T)等位基因。(见表3)荧光随着电严紧度的上升而消失表明含有已知纯合子T/T生物素化扩增子的测试位点上的非C/非T错配的报告分子发生变性(图9-10)。类似地，cy3和cy5等位基因报告分子没有表现出与T/T扩增子的严谨杂交。相反，与cy3标记的T等位基因报告分子(图9A)和cy5标记的报告分子(图10A)发生的杂交发射出一个超过100MFI/s的明显信号。因此，由测序技术确定为T/T纯合子的扩增子，通过电子学方法同样判为T/T纯合子。总之，在电严紧过程中cy3和cy5报告分子均可见总信号强度的逐渐下降(数据未显示)。
实施例5中的实验显示，对MBP、1L-1β和TNFα复合样品进行了SNP分辨，其中的微芯片作了电剥离，并重新确定重复样品中第二个基因的基因型。
                                    表3
    报告分子特异性     报告分子序列
    等位基因C  5’tcttcttCgacacatgggataacg3’(SEQ ID NO:18)
    等位基因T  5’tcttcttTgacacatgggataacg3’(SEQ ID NO:19)
    错配-A  5’tcttcttAgacacatgggataacg3’(SEQ ID NO:20)
    错配-G  5’tcttcttGgacacatgggataacg3’(SEQ ID NO:21)
实施例3-淋巴毒素基因检测
另一个体现本发明在检测SNP中的用途的是用淋巴毒素观察到的。所述淋巴毒素序列提取自Genbank(M16441)，它的1069位点含有一个A到G的SNP转换。用于PCR扩增的引物序列包括有义链核苷酸序列，5’-CTTCTCTGTCTCTGACTCTCCATC-3’(SEQ ID NO:22)和反链核苷酸序列，生物素-5’-CAAGGTGAGCAGAGGGAGAC-3’(SEQ ID NO:23)(即反链是生物素化的)。
在本实施例中，设计cy3和cy5报告分子组来鉴定淋巴毒素基因中含有的1069位点A或G单核苷酸多态性的基因变异体(报告分子寡核苷酸由Bioserve,Laurel,MD合成)。(见表4)荧光随着电严紧的上升而消失表明，对于样品NC50，含有已知纯合子A/A之生物素化扩增子的测试位点上的非A/非G错配(mis-cy3)报告分子发生变性；对于NC43，含有已知纯合子G/G之生物素化扩增子的测试位点上的非A/非G错配(mis-cy3)报告分子发生变性(图11A和B)。因此，样品NC50和NC43的扩增子由测序技术分别确定为A/A和G/G纯合子，通过电子学方法同样分别判为A/A和G/G纯合子。
                                      表4
报告分子特异性     报告分子序列
    等位基因A     5’ttctgccatgAttcctctctg3’(SEQ ID NO:24)
    等位基因G     5’ttctgccatgGttcctctctg3’(SEQ ID NO:25)
    错配-T     5’ttctgccatgTttcctctctg3’(SEQ ID NO:26)
    错配-C     5’ttctgccatgCttcctctctg3’(SEQ ID NO:27)
实施例4-肿瘤坏死因子α检测
此外，在肿瘤坏死因子基因的启动子中观察到另一个显示应用本发明检测SNP的例子。所述肿瘤坏死因子基因组DNA序列提取自Genbank(X02910)，它的308位点含有一个G到A的SNP转换。用于PCR扩增的引物序列包括有义链核苷酸序列，5’-GTTAGAAGGAAACAGACCACAGACC-3’(SEQ ID NO:28)和反链核苷酸序列，生物素-5’-TCCTCCCTGCTCCGATTCC-3’(SEQ ID NO:29)(即反链是生物素化的)。
在本实施例中，设计cy3和cy5报告分子组来鉴定肿瘤坏死因子基因的启动子中含有的G或A单核苷酸多态性的基因变异体(报告分子寡核苷酸由Bioserve,Laurel,MD合成)。(见表5)在本发明的一个改进方法中，仅用两个报告分子组来检测G或A等位基因。给含有来自样品NC39和NC40的扩增子以及非特异性扩增子TPMT的测试位点上施加电严紧条件。电严紧显示由DNA测序确定为A/G杂合子的样品NC39是A/G杂合子。并且，鉴定出由DNA测序确定为G/G纯合子的样品NC40是G/G纯合子(图12A)。为了作评判，将其余电杂交报告分子信号归一为最大MFI/sec，并将结果与非特异性对照TPMT的结果进行比较。本实施例显示了本发明在鉴定SNP中的应用，以及可用于筛选那些鉴定特定接合型时需要的报告分子信号数量减少的方法。
                                        表5
    报告分子特异性     报告分子序列
    等位基因G     5’gcatgGggacggggttc(SEQ ID NO:30)
    等位基因A     5’gcatgAggacggggttc(SEQ ID NO:30)
实施例5-多重分析
实验还显示了分辨TNFα、MBP和1L-1β复合样品中的SNP，其中将微芯片作了电剥离，再检测这个三组分样品中下一个基因的基因型。分别将三个扩增子：MBPA/A纯合子(M)、1L-1βT/T纯合子(Ⅰ)和TNTα G/G纯合子(T)加入并以1∶1∶1的三组分混合物(T+M+I)捕获在25pad的溶液处理芯片上(图13A)。芯片与TNFα特异性cy3/cy5标记的报告分子组杂交，作双份(图13B)。通过逐渐增加电严紧得到了等位基因特异性多态性(图13C和D)。获知混合样品中的TNFα的基因型后，通过在更高温度(42℃)下施加电严紧，并随后在0.5×SSC(pH11.5)中冲洗2分钟将芯片上的标记报告分子剥离。然后在组氨酸中彻底清洗剥离芯片，得到基线图象(13E)。然后用MBP等位基因特异性cy3/cy5报告分子组(13F)重新与芯片杂交，并通过施加电严紧条件(13G和H)获取基因型。将确定了基因型的芯片(再次)电剥离，获得基线图象(13I)，并用1L-1β等位基因报告分子组与复合样品杂交(13J)。通过电严紧条件获得其基因型(13K和L)。这些结果表明，只需一次捕获加样就将板上多个基因分型的能力可以增加电斑点印迹的通量参数。
如上所示，有多种方式可以得到复合样品。在一个方案中可以在单个开放阵列微芯片上检测来自一个患者样品的多个靶分子。此外，可以将每个靶分子捕获到微芯片上的不同位置或同一个捕获块。复合还可以指一个微芯片阵列上容纳有多个患者样品。在这种情况中，可以将每个患者的各个靶分子捕获在单独的捕获位点或位点簇或者每个患者一个位点来进行分析。
以上是用于阐述本发明的实施方案，而非对发明任何意义上的限制。虽然描述发明时顾及了特定改进，但其细节不应解释为对发明的限制，因为很显然可以在不脱离发明的精神和范围的情况下采取各种等同、变化和修饰方案，而这类等同方案应理解为包括在本文中。所有出版物和专利申请均同等程度地全文引入本文作为参考文献，并视作每篇出版物和专利申请均是逐一并个别地引入作为参考文献的。

Claims (9)

1．一种利用有多个测试位点的电寻址微芯片来检测单核苷酸多态性的方法，包括：
ⅰ．提供至少一个含有至少一种目标靶核酸的样品，所述靶核酸含有至少一个SNP；
ⅱ．任选将所述靶核酸作扩增反应从而形成扩增产物；
ⅲ．使所述靶核酸或所述扩增产物电寻址到微芯片的特定测试位点；
ⅳ．将所述靶核酸或所述扩增产物捕获到所述测试位点；
ⅴ．提供SNP特异性探针并使该探针与所述靶核酸或所述扩增产物进行电杂交以形成杂交复合物；
ⅵ．对所述杂交复合物实行电严紧条件从而使杂交复合物去稳定，其中杂交复合物含有至少一个在所述靶核酸或扩增产物与探针之间形成的错配；以及
ⅶ．在(ⅵ)的电严紧之后检测保持稳定的杂交复合物。
2．权利要求1的方法，其中所述样品含有的目标靶核酸选自编码下列物质的核酸(1)甘露糖结合蛋白(2)Fc-γ受体(3)主要组织相容性复合体(4)白介素1β(5)淋巴毒素以及(6)肿瘤坏死因子α。
3．权利要求1的方法，其中所述检测单核苷酸多态性是通过对含有目的核酸序列的多个患者样品进行多次SNP检测。
4．权利要求3的方法，其中所述患者样品是连续地提供的。
5．权利要求1的方法，其中所述检测单核苷酸多态性包括同时筛选一个患者样品中不同基因的多种SNP的能力。
6．权利要求1的方法，其中所述电寻址和/或电严紧包括实时监测电杂交和电严紧各阶段的能力，从而保证检测过程中的有效控制。
7．权利要求1的方法，其中所述SNP来自目标靶核酸的多等位基因构成的基因复合物。
8．一种检测来自至少一个患者样品的目标靶核酸中的多种单核苷酸多态性的方法，所述方法对每个患者样品使用具有多测试位点的电寻址微芯片中的单个捕获位点，方法包括：
ⅰ．提供至少一个含有至少一种目标靶核酸的样品，所述靶核酸含有至少一个SNP；
ⅱ．任选将所述靶核酸作扩增反应从而形成扩增产物；
ⅲ．使所述靶核酸或所述扩增产物电寻址到微芯片的特定测试位点；
ⅳ．将所述靶核酸或所述扩增产物捕获到至少一个测试位点；
ⅴ．提供SNP特异性探针并使该探针与所述靶核酸或所述扩增产物进行电杂交以形成杂交复合物；
ⅵ．对所述杂交复合物实行电严紧条件从而使杂交复合物去稳定，其中杂交复合物含有至少一个在所述靶核酸或扩增产物与探针之间形成的错配；以及
ⅶ．在(ⅵ)的电严紧之后检测保持稳定的杂交复合物。
9．一种检测来自多个患者样品的目标靶核酸中的单核苷酸多态性的方法，所述方法对每个患者样品使用具有多测试位点的电寻址微芯片中的至少一个捕获位点，方法包括：
ⅰ．提供含有目标靶核酸的样品，所述靶核酸含有至少一个SNP；
ⅱ．任选将所述靶核酸作扩增反应从而形成扩增产物；
ⅲ．使所述靶核酸或所述扩增产物电寻址到微芯片的特定测试位点；
ⅳ．将所述靶核酸或所述扩增产物捕获到至少一个测试位点；
ⅴ．提供SNP特异性探针并使该探针与所述靶核酸或所述扩增产物进行电杂交以形成杂交复合物；
ⅵ．对所述杂交复合物实行电严紧条件从而使杂交复合物去稳定，其中杂交复合物含有至少一个在所述靶核酸或扩增产物与探针之间形成的错配；以及
ⅶ．在(ⅵ)的电严紧之后检测保持稳定的杂交复合物。
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