CN107760672A - 一种基于二代测序技术的工业化基因合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于二代测序技术的工业化基因合成方法，该方法包括如下步骤：将待合成的序列拆分成多段小片段，然后用首尾合成引物合成拆分的多段小片段；采用5’端含有20个随机碱基的扩增用上下游引物对合成的小片段进行扩增；将扩增后的所有小片段混合，然后采用二代测序技术进行测序，将测序结果进行对比分析，找到与预期完全一致的序列，从而确定该序列两端的随机序列为所需序列，然后根据所需序列设计调取引物；采用调取引物对扩增后的小片段进行第一轮调取扩增，然后首尾合成引物进行第二轮调取扩增，然后将第二轮调取扩增后的片段进行组装即得序列产物。本发明在不损失时间成本的情况下，合成步骤简化、通量提高、成本降低。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于二代测序技术的工业化基因合成方法。
背景技术
现有的工业化基因合成技术与平台中必不可少的测序验证步骤都是基于一代测序的平台，即AB公司的3730测序仪平台，其原理是基于Sanger测序法基础之上，由于一代测序平台是对每一个单克隆进行验证测序，所以确定性极高。但是该测序平台的通量较低，即每次测96个样本，总体运行时间大于24小时，成本较高，即每个测序样本的市场价是15-18人民币，并且需要对送测序的每一个克隆进行质粒抽提后测序或者直接用菌液进行扩增测序，步骤繁琐，因此二代测序技术被开发使用。
现有的工业化基因合成方法大致有7个模块化步骤，分别为PCR扩增、连接转化、挑取单克隆摇菌、菌液PCR鉴定、质粒抽提、Sanger测序、PCR扩增正确克隆，最终得到的是与预期一致的约700-1500bp的PCR产物片段。该方法步骤繁多、通量低，整体流程的运行时间超过72小时，成本高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种步骤简单、通量高，成本低的基于二代测序技术的工业化基因合成方法。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种基于二代测序技术的工业化基因合成方法，该方法包括如下步骤：
步骤（1）、将待合成的序列拆分成多段小片段，然后用首尾合成引物合成拆分的多段小片段；
步骤（2）、采用5’端含有20个随机碱基的扩增用上下游引物对步骤（1）合成的小片段进行扩增，以便为小片段加上随机标签序列；
步骤（3）、将步骤（2）扩增后的所有小片段混合，然后采用二代测序技术进行测序，将测序结果进行对比分析，找到与预期完全一致的序列，从而确定该序列两端的随机序列为所需序列，然后根据所需序列设计调取引物；
步骤（4）、采用步骤（3）设计的调取引物对步骤（2）扩增后的小片段进行第一轮调取扩增，然后用步骤（1）中的首尾合成引物进行第二轮调取扩增，然后将第二轮调取扩增后的片段进行组装即得序列产物。
优选地，步骤（1）中待合成的序列超过100Kb。
优选地，步骤（1）中每段小片段不超过250bp。
优选地，步骤（1）中合成的小片段直接进行步骤（2），无需进行凝胶电泳检测后的切胶回收。
优选地，步骤（2）对小片段进行扩增后，进行凝胶电泳检测后的切胶回收，然后进行步骤（3）。
优选地，步骤（3）中，二代测序技术采用Illumina公司二代测序平台Miniseq仪器。
优选地，步骤（3）中，进行混合的小片段中每个片段的量为0.8~1.2ng。
优选地，步骤（3）中，进行测序时的数据量为5Gb以上，测序时间为22小时。
优选地，步骤（4）中，采用PCR进行组装或采用多段重复酶进行组装。
由于上述技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明采用了Illumina公司Miniseq二代测序平台的并行测序技术，优化了工业化基因合成中需要克隆、筛选、质粒制备后测序的步骤，代之以PCR产物测序后调取扩增随后组装的流程，使得其在不损失时间成本的情况下，工业化基因合成步骤由原来的7步简化至4步、通量由原来的96孔增加至103以上、成本由原来的15-18人民币降低至10元以下，并且还有优化空间。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明中若无特别说明，原料均可市购获得。本发明中序列的合成、引物的设计均采用本领域的常规方法进行。
文中的“序列”代表着聚合物中单体的排列顺序，比如核苷酸在多核甘酸序列中的排列顺序，此处所说的“核苷酸序列”“核酸”或者“多核苷酸”指的是单链或者双链中的脱氧核糖核苷酸，核苷酸序列是由自然的核苷酸A,T,C,G,U或者其他合成的自然碱基的类似物组成，本发明中，腺嘌呤缩写为A,鸟嘌呤缩写为G,胞嘧啶缩写为C,胸腺嘧啶缩写为T,尿嘧啶缩写为U。多核酸序列可以是单链或者双链，若无特别说明，核苷酸也包括了较长的核苷酸或较短的核苷酸，比如寡核苷酸。
文中采用传统的标记方法来描述多核苷酸序列，单链和左端为5’端，双链的左端为正链5’端。
实施例1：
（1）、序列分析与全序列拆分：将要合成的基因进行全序列分析，并按照每段250bp进行拆分，编号为G1/G2/G3…/G20（如SEQ ID NO.1至20），所需合成的基因序列为上述G1至G20按顺序连接的序列；
（2）、工业化基因合成拆分后的小片段：按照现有的工业化基因合成流程对G1/G2/G3…/G20中每段进行合成，如果扩增成功，无需进行凝胶电泳检测后的切胶回收；
（3）、给片段加随机标签序列：用5’端含有20个随机碱基的扩增用上下游引物对步骤2中的片段进行扩增，引物序列结构如下：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-Gn段5’20bp（n代表需要扩增的小片段序列的编号，其中，引物序列结构表示该引物由两部分组成，分别是20bp随机N和要扩增的序列的5’端的20bp，随机20bpN是标签序列，后20bp是与模板配对区域），以便加上随机标签序列，然后进行凝胶电泳检测后的切胶回收，编号分别为GB-1/GB-2/GB-3…/GB-20；
（4）、用Illumina公司二代测序平台Miniseq仪器测序：将步骤3中PCR扩增得到的所有小片段混合，每个片段量约为1ng即可，一共20个片段，然后用Illumina公司二代测序平台Miniseq仪器测序，要求数据量为5Gb以上，该步骤运行时间大约为24小时；
（5）、测序结果分析：将步骤4中返回的测序结果进行比对分析，找到与步骤1中预期需要合成的完全一致的250bp序列两端的20bp随机序列的确定序列，并设计调取扩增引物，引物结构如下：5’-20bp标签序列-Gn段5’20bp（n代表需要扩增的小片段序列的编号，其中20bp标签序列是确定的，是根据步骤4中测序结果分析得到的序列），该步骤中必须使用高灵敏度酶进行调取扩增；
（6）、拆分片段调取与组装：根据步骤5中设计的引物对步骤3中的每个对应的PCR产物进行第一轮调取PCR扩增，然后不回收凝胶电泳后的产物，直接用第二步合成小片段的首尾合成引物进行第二轮调取扩增，然后将这些扩增出的250bp片段按照正常工业化基因合成流程进行PCR组装或者多段重复酶组装。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，且本发明不限于上述的实施例，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于二代测序技术的工业化基因合成方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
步骤（1）、将待合成的序列拆分成多段小片段，然后用首尾合成引物合成拆分的多段小片段；
步骤（2）、采用5’端含有20个随机碱基的扩增用上下游引物对步骤（1）合成的小片段进行扩增，以便为小片段加上随机标签序列；
步骤（3）、将步骤（2）扩增后的所有小片段混合，然后采用二代测序技术进行测序，将测序结果进行对比分析，找到与预期完全一致的序列，从而确定该序列两端的随机序列为所需序列，然后根据所需序列设计调取引物；
步骤（4）、采用步骤（3）设计的调取引物对步骤（2）扩增后的小片段进行第一轮调取扩增，然后用步骤（1）中的首尾合成引物进行第二轮调取扩增，然后将第二轮调取扩增后的片段进行组装即得序列产物。
2.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的工业化基因合成方法，其特征在于：步骤（1）中待合成的序列超过100Kb。
3.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的工业化基因合成方法，其特征在于：步骤（1）中每段小片段不超过250bp。
4.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的工业化基因合成方法，其特征在于：步骤（1）中合成的小片段直接进行步骤（2），无需进行凝胶电泳检测后的切胶回收。
5.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的工业化基因合成方法，其特征在于：步骤（2）对小片段进行扩增后，进行凝胶电泳检测后的切胶回收，然后进行步骤（3）。
6.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的工业化基因合成方法，其特征在于：步骤（3）中，二代测序技术采用Illumina公司二代测序平台Miniseq仪器。
7.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的工业化基因合成方法，其特征在于：步骤（3）中，进行混合的小片段中每个片段的量为0.8~1.2ng。
8.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的工业化基因合成方法，其特征在于：步骤（3）中，进行测序时的数据量为5Gb以上，测序时间为22小时。
9.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的工业化基因合成方法，其特征在于：步骤（4）中，采用PCR进行组装或采用多段重复酶进行组装。
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Cited By (5)
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|---|---|---|---|---|
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| CN106282269B (zh) * | 2016-08-16 | 2022-10-18 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | 一种重复性dna的合成与组装方法及其应用 |
| CN109411011A (zh) * | 2018-11-06 | 2019-03-01 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | 一种引物组的设计方法及其应用 |
| CN109411011B (zh) * | 2018-11-06 | 2022-05-17 | 苏州泓迅生物科技股份有限公司 | 一种引物组的设计方法及其应用 |
| WO2020228298A1 (zh) * | 2019-05-13 | 2020-11-19 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种测序文库的构建方法及其应用 |
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