KR20220097676A

KR20220097676A - 녹용의 원산지 판별용 지표물질 바이오마커 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220097676A
Application number: KR1020200188073A
Authority: KR
Inventors: 김용안; 황인호
Original assignee: 한국양토양록축산업협동조합
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-07-08
Also published as: KR102565432B1

Abstract

본 발명은 녹용으로부터 수득한 다양한 지표물질 대사체를 포함하는 녹용의 원산지 판별용 바이오마커 및 이를 이용한 녹용의 원산지 판별 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 판별방법에 의하면, 녹용에 포함된 다양한 지표물질 대사체의 함량과 향기성분 마커 등을 분석하여 녹용의 원산지(한국산, 러시아산 또는 뉴질랜드산 등)을 신속하고 특이적으로 판별할 수 있다.

Description

녹용의 원산지 판별용 지표물질 바이오마커 조성물 및 이의 용도 {Composition of biomarker indicator material for identification of origin of antler and use thereof}

본 발명은 녹용으로부터 수득한 다양한 지표물질과 향기성분을 포함하는 녹용의 원산지 판별용 바이오마커 및 이를 이용한 녹용의 원산지 판별 방법에 관한 것이다.

녹용은 수사슴의 어린 뿔로서, 아직 골질화가 되지 않았거나 약간의 골질화가 된 연한 사슴의 뿔을 잘라 말린 것을 지칭한다. 상기 녹용의 기질은 부드럽고 연약하며, 녹용의 표면은 부드러운 털로 뒤덮여 있고, 녹용은 낙각후 매년 다시자라며, 연골, 섬유질 조직, 피부, 신경 및 혈관으로 구성된 단일 구조로 내면은 사슴의 피로 채워져 있다. 동의보감과 본초강목에 따르면, 녹용은 몸의 기력을 북돋고, 뇌 기능을 강화하며, 뼈와 근육을 튼튼하게 하는 것으로 알려져 있다.

최근, 건강을 위해 녹용을 찾는 수요가 늘어나고 있지만, 녹용의 원산지별 가격차이가 있으며, 함유된 녹용의 부위와 등급에 따라 효능의 차이가 현저하므로 이에 대한 각별한 주의가 요구된다. 현재, 국내에 유통되는 녹용으로는 국내산 녹용, 러시아산 녹용, 뉴질랜드산 녹용 등이 있다. 국내산 녹용은 대록 (엘크, Cervus canadensis)과 매화록(梅花鹿, Cervus nippon) 등이 있으며 국내 유통거래 대부분은 엘크종에 속한다. 우리나라의 뚜렸한 사계절은 계절번식 동물인 사슴의 성장에 도움을 줄수있으며, 옛부터 신토불이의 영향으로 소비자들이 국내산을 선호한다. 러시아산 녹용과 뉴질랜드산 녹용의 사슴은 마록 (Cervus elaphus) 또는 교잡종에 속한다. 러시아산 녹용은 추운지방에서 성장한 사슴의 뿔로서, 열탕침적식 건조방법을 주로 사용하며 건조되며, 건녹용 절편의 외관이 좋은것이 특징이다. 뉴질랜드산 녹용은 적록(red deer) 또는 교잡종에 속하며, 러시아산이나 중국산 녹용보다 크기가 작은게 특징이다.

유통시장의 녹용가격은 국내산 녹용, 러시아산 녹용, 뉴질랜드산 순으로 국내산 녹용의 가격이 가장 높다. 그러나 일부에서는 값싼 뉴질랜드산이나 중국산 녹용을 국내산으로 둔갑시켜 유통되다가 적발된적이 있으며, 일부에서는 러시아산 녹용과 혼용되어 사회적 문제를 일으킨 바가 있다.

녹용 원산지에 따른 효능 및 품질의 차이에도 불구하고, 녹용은 대부분 절편된 상태로 유통되기 때문에 이를 육안으로 구분하여 녹용의 원산지를 판별하는 것은 거의 불가능한 실정이다.

이러한 기술적 배경 하에서, 녹용의 원산지를 판별하는 기술에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다. 이러한 기술 중 하나로서, 국내공개특허 10-2009-0015587에서는 러시아 사슴(Cervus elaphus sibiricus), 중국 사슴 (Cervus elaphus bartrianus), 뉴질랜드 사슴 및 캐나다 사슴(C. elaphus canadensis, ELK) 유전자의 가변서열을 분석하여 선별된 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드를 이용하는 녹용 품종 판별방법을 개시하고 있으나, 이러한 기술은 비특이적 어닐링이 야기될 우려가 있고, 낮은 민감도로 인해 녹용 원산지의 판별에 대한 실효성이 매우 낮다는 한계가 있다. 특히 가공과정 중에서 유전자가 파괴된 녹용에 대한 원산지 판별 기술은 전무하다.

원산지별 녹용은 먹이, 품종에 따라 각각의 지표물질이 다르게 조성되며, 휘발성 물질과 생리활성 대사체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체를 포함하는, 녹용(velvet antler)의 원산지 판별용 바이오마커 조성물을 제공한다.

일 양상은 에스테르(Ester), 알코올(Alcohol), 알데하이드(Aldehyde), 케톤(ketone), 탄화수소(hydrocarbon) 및 생리활성 물질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체를 포함하는, 녹용(velvet antler)의 원산지 판별용 바이오마커 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기 바이오마커 조성물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 녹용의 원산지 판별용 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은 상기 판별용 조성물을 포함하는, 녹용 원산지 판별용 키트를 제공한다.

또 다른 양상은 녹용으로부터 대사체를 수득하여 지표물질을 확인하는 단계; 및 상기 수득한 대사체 중 에스테르, 알코올, 알데하이드, 케톤, 탄화수소 및 생리활성 물질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 함량을 분석하는 단계를 포함하는, 녹용 원산지를 판별하는 방법을 제공한다.

일 양상은 에스테르(Ester), 알코올(Alcohol), 알데하이드(Aldehyde), 케톤(ketone), 탄화수소(hydrocarbon) 및 생리활성 물질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체를 포함하는, 녹용(velvet antler)의 원산지 판별용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 녹용의 원산지 판별용 바이오마커는 원산지별 녹용의 대사체의 지표물질 함유 여부 또는 함량 수준 차이를 이용하여 녹용의 원산지를 판별할 수 있는 것을 특징으로 한다. 상기 대사체의 지표물질 함유 여부 또는 함량 수준은, 구체적으로, 한국산, 러시아산 및 뉴질랜드산 중에서 가장 많이 고발현 또는 저발현되는 것으로 이해되어야 한다.

상기 대사체 또는 이에 포함된 바이오마커 조성물은 녹용에서 수득된 것일 수 있으며, 구체적으로 녹용 추출물 또는 녹용 농축물에서 수득된 것일 수 있다.

본 명세서에서의 용어 "녹용(velvet antler)"은 숫사슴의 굳어지지 않은 어린 뿔을 채취하여 가공한 약재를 말하며, 한방에서는 늦봄에 숫사슴의 뿔이 떨어진 자리에 새롭게 자라기 시작한 뿔로서 털이 밀생되고 아직 골질화되지 않았거나 일부 골질화된 어린 뿔을 자른 다음 말린 것을 녹용이라 하고 가을이 되어 각질화된 뿔은 녹각이라고 한다. 녹용에는 다양한 활성 성분들이 함유되어 있는데, 특히 강장보신의 효능이 있어 여러 가지 허약증을 치료하는 대표적인 보약으로 알려져 왔다. 녹용은 간질, 궤양, 빈혈, 류머티즘, 중풍 등의 질환 치료 및 예방, 불면, 피로, 두통, 경련 등의 증상의 개선, 위장운동 촉진, 식욕증진, 신경쇠약 치료 및 개선, 병후회복, 노화방지, 기억력 증진, 성기능 회복 촉진, 그리고 상처 치유 촉진효능 등이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로 녹용은 우리나라에서 가장 많이 소모되는 동물성 생약이다.

본 명세서에서의 용어 "원산지"는, 그 물품이 성장했거나, 생산, 제조 가공된 지역을 말하여 수출입 물품의 경우 국적을 의미한다. 우리나라의 원산지 표시제도는 1991년 7월 1일부터 시행되고 있으며, 대외무역법령에 「원산지 판정 기준」, 「원산지 표시 대상 물품」, 「위반시의 벌칙」등 에 관한 규정을 두고 있다. 관세법령에는 통관 시의 원산지 및 그 표시의 확인 및 시중 유통 과정에서의 단속 등에 관한 규정을 두어 운영하고 있다.

본 명세서에서의 용어 "판별"은, 녹용의 원산지가 어느 곳인지 결정하여 구별하는 마커를 의미한다.

본 명세서에서의 용어 "수준 차이"는, 녹용에서의 특정 대사체를 비교하고자 하는 그룹 간에서의 대사체 함량 수준이 높거나 혹은 낮은 것을 의미한다.

본 명세서에서의 용어 "녹용 원산지 판별용 바이오마커" 는 원산지로부터의 녹용 내에 에스테르, 알코올, 알데하이드, 케톤, 탄화수소 및 생리활성 물질을 포함하는 대사체들이 발현되거나 함유되어 상기 대사체들의 함량 수준을 이용하여 원산지를 판별할 수 있는 바이오마커로 사용할 수 있다는 것을 의미한다. 상기 바이오마커는 원산지별 지표물질을 포함하는 것일 수 있다.

상기 녹용의 원산지는 대한민국, 러시아 및 뉴질랜드 중 하나인 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 바이오마커 조성물은 한국산, 러시아산 또는 뉴질랜드산 중 하나로 판별하는 것일 수 있다.

상기 에스테르는 메틸 아세테이트(Methyl acetate), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), 메틸 프로피오네이트(Methyl propionate), 에틸 부탄오에이트(Ethyl butanoate), 1-메톡시-2-프로필 아세테이트(1-Methoxy-2-propyl acetate), 메틸 헥사노에이트(Methyl hexanoate), 2-이소부톡시에틸 프로피오네이트(2-Isobutoxyethyl propionate), 크리산테닐 프로피오네이트(Chrysanthenyl propionate), 이소부틸 펜틸 카보네이트(Isobutyl pentyl carbonate), 메틸 옥타노에이트(Methyl octanoate), 에틸 옥타노에이트(Ethyl octanoate) 및 헵틸 헵타노에이트(Heptyl heptanoate)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

상기 알코올은 2-푸란메탄올(2-Furanmethanol), 유칼립톨(Eucalyptol), 및 2,4-디-터트-부틸페놀(2,4-Di-tert-butylphenol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

상기 알데하이드는 3-메틸-부탄알(3-methyl-butanal)인 것일 수 있다.

상기 케톤은 2-헵타논(2-Heptanone), 2,4-디메틸-3-헥사논(2,4-dimethyl-3-hexanone), 2,5-디메틸-3-헥사논(2,5-dimethyl-3-hexanone), 3-옥타논(3-Octanone), 2,4-디메틸-3-헥사논(2,4-dimethyl-3-Hexanone) 및 2-운데칸온(2-Undecanone)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

상기 탄화수소는 2,2,6-트리메틸-옥테인(2,2,6-trimethyl-octane), 데케인(Decane), 2-메틸-운데케인(2-methyl-undecane), 3,7-디메틸-노네인(3,7-dimethyl-nonane), 3,6-디메틸-운데케인(3,6-dimethyl-undecane), 2,5-디메틸-도데케인(2,5-dimethyl-dodecane), 1-(헥실옥시)-5-메틸-헥세인(1-(hexyloxy)-5-methyl-hexane), 헥실옥시옥테인(Hexyloxyoctane), 트리데케인(Tridecane) 및 테트라데케인(Tetradecane)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

상기 생리활성 물질은 인지질, 스테로이드, 알칼로이드, 에스테르, 아미노산, 펩타이드, 성장호르몬 및 강글리오사이드 등의 대사체를 의미하는 것으로서, 구체적으로 호베니둘시오사이드 A2(hovenidulcioside A2), 진세노사이드 F3(Ginsenoside F3), 우랄사포닌 B(Uralsaponin B), 노토진세노사이드 I(Notoginsenoside I), 아큐티시민 A(Acutissimin A), 가노데르산 H(Ganoderic acid H), 에이지리놀(Aegelinol), 탈라소스피라미드 A(thalassospiramide A) 및 파풀라칸딘 A (Papulacandin A)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

상기 바이오마커 조성물은 녹용의 한국산 판별용 바이오마커 조성물일 수 있으며, 구체적으로 녹용으로부터 수득한 호베니둘시오사이드 A2, 진세노사이드 F3, 및 우랄사포닌 B로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 대사체를 포함하는 것일 수 있다.

상기 바이오마커 조성물은 녹용의 한국산 판별용 바이오마커 조성물일 수 있으며, 구체적으로 녹용으로부터 메틸 아세테이트, 메틸 프로피오네이트, 에틸 부탄오에이트, 메틸 헥사노에이트, 2-이소부톡시에틸 프로피오네이트, 크리산테닐 프로피오네이트, 이소부틸 펜틸 카보네이트, 메틸 옥타노에이트, 유칼립톨, 2-헵타논, 2-메틸-운데케인, 3,7-디메틸-노네인, 2,5-디메틸-도데케인, 1-(헥실옥시)-5-메틸-헥세인, 헥실옥시옥테인, 트리데케인 및 테트라데케인으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 대사체를 포함하는 것일 수 있다.

상기 바이오마커 조성물은 녹용의 러시아산 판별용 바이오마커 조성물일 수 있으며, 구체적으로 녹용으로부터 수득한 노토진세노사이드 I, 아큐티시민 A, 및 가노데르산 H로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 대사체를 포함하는 것일 수 있다.

상기 바이오마커 조성물은 녹용의 러시아산 판별용 바이오마커 조성물일 수 있으며, 구체적으로 녹용으로부터 수득한 3-메틸-부탄알; 및 2-푸란메탄올, 데케인 및 3,6-디메틸-운데케인 중 하나 이상의 대사체를 포함하는 것일 수 있다.

상기 바이오마커 조성물은 녹용의 뉴질랜드산 판별용 바이오마커 조성물일 수 있으며, 구체적으로 녹용으로부터 수득한 에이지리놀, 탈라소스피라미드 A 및 파풀라칸딘 A로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 대사체를 포함하는 것일 수 있다.

상기 바이오마커 조성물은 녹용의 뉴질랜드산 판별용 바이오마커 조성물일 수 있으며, 구체적으로 녹용으로부터 수득한 3-메틸-부탄알 및 2,5-디메틸-3-헥사논의 대사체를 포함하는 것일 수 있다.

다른 양상은 상기 바이오마커 조성물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 녹용의 원산지 판별용 조성물을 제공하는 것이다. 상기 전술한 내용과 중복되는 내용은 상기 판별용 조성물에도 공히 적용된다.

상기 바이오마커 조성물을 검출할 수 있는 제제는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합, 증폭하거나, 반응하는 제제를 모두 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 제제는 상기 바이오마커에 특이적인 항체, 압타머, 펩타이드, 화합물 또는 핵산 등을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 제제는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 양상은 상기 녹용의 원산지 판별용 바이오마커 조성물 또는 상기 판별용 조성물을 포함하는, 녹용 원산지 판별용 키트를 제공하는 것이다. 상기 전술한 내용과 중복되는 내용은 상기 판별용 키트에도 공히 적용된다.

상기 판별용 키트는 바이오마커 등의 대사체를 검출하기 위한 직접적인 수단뿐만 아니라 분석 방법에 사용되는 다른 구성 성분, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 그 예로써 테스트 튜브, 컨테이너, 반응 완충액, 분석용 효소, 멸균수 등을 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 판별용 키트는 판별 대상이 되는 시료를 담지할 수 있는 통상의 웰 형태의 마이크로타이터 플레이트의 형태일 수 있다. 상기 웰 내에는 시료 및 하나 이상의 바이오마커 검출 제제를 흡수할 수 있는 다공성 지지체를 포함할 수 있다. 상기 지지체는 녹용으로부터 수득한 대사체의 첨가를 대비하여 바이오마커 검출 제제를 미리 결정된 농도로 포함하고 있으며, 아울러 각 시료를 고정할 수 있다. 또한, 지지체의 다공성은 시료 분석 시 첨가되는 추출 용매에 최대한 노출되게 할 수 있다.

또한, 상기 판별용 키트는 또한, 통상적으로 분석장치와 조합하여 대사체를 검출하거나 함량 범위를 정량 표적 분석하기 위하여 여러 가지 대사체를 준비할 수 있는 기구에 포함된 시약, 용매, 소프트웨어 시스템 등을 더 포함할 수 있다.

또 다른 양상은 녹용으로부터 대사체를 수득하는 단계; 및 상기 수득한 대사체 중 에스테르, 알코올, 알데하이드, 케톤, 탄화수소 및 생리활성 물질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 함량을 분석하는 단계를 포함하는, 녹용 원산지를 판별하는 방법을 제공하는 것이다. 상기 전술한 내용과 중복되는 내용은 상기 판별하는 방법에도 공히 적용된다.

상기 녹용으로부터 대사체를 수득하는 단계는 농축 또는 추출 과정 등을 토대로 녹용에서 대사체를 얻는 것을 의미하는 것으로서, 구체적으로 상기 단계는 녹용을 추출하거나 또는 농축하여 대사체를 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 대사체의 추출방법은 용매추출법을 이용할 수 있다. 상기 용매는 녹용의 대사체를 용해할 수 있는 것일 수 있으며, 구체적으로, 상기 용매는, 물; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급 알코올; 아세톤; 트리플루오로에탄올; 테트라하이드로퓨란; 디클로로메탄; 포스페이트; 및 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다.

상기 수득한 대사체의 함량을 분석하는 단계는 질량분석기(Mass Spectrometer), 크로마토그래피(Chromatography) 기기, 크로마토그래피가 결합된 질량분석기(Chromatography- mass spectrometer), 핵자기공명분광분석기(Nuclear Magnetic Resonance spectrometer), 라만 분광기(Raman spectroscopy), 광흡수분석(light absorption analysis)기, 유동주입분석(flow injection analysis)기 등의 기기장치를 이용한 분석법; 상기 대사체에 특이적인 항체, 엡타머, 펩타이드, 핵산 또는 고분자와 대사체 간의 특이적인 결합을 이용한 대사체의 정량분석법; ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 웨스턴 블랏, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter) 또는 마이크로어레이(microarray) 분석법 등의 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명에서 이용되는 크로마토그래피(Chromatography)는 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography), 액체-고체 크로마토그래피 (Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피 (Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함할 수 있다.

상기 수득한 대사체의 함량을 분석하는 단계는 구체적으로 기체 크로마토 그래피/질량분광법(GC/MS) 또는 초고성능 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분광법 (UPLC-QTOF-MS/MS) 으로 분석하는 것일 수 있다.

상기 녹용의 원산지 판별 방법은 상기 함량을 분석한 대사체들 간의 함량 수준 차이로 녹용의 원산지를 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 하기 실시예에 기재된 [표 3]의 원산지별 대사체 함량 분석 결과를 토대로 각 대사체들의 함량을 비교하여(각 원산지별 표준물질과 비교하는 등) 녹용의 원산지를 한국산, 러시아산 또는 뉴질랜드 산으로 판별하는 것일 수 있다.

상기 녹용의 원산지 판별 방법은 상기 수득한 대사체에서 생리활성 물질 중 호베니둘시오사이드 A2, 진세노사이드 F3 및 우랄사포닌 B으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 한국산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 녹용의 원산지 판별 방법은 상기 수득한 대사체에서 생리활성 물질 중 노토진세노사이드 I, 아큐티시민 A, 및 가노데르산 H 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 러시아산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 녹용의 원산지 판별 방법은 상기 수득한 대사체에서 생리활성 물질 중 에이지리놀, 탈라소스피라미드 A 및 파풀라칸딘 A로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 뉴질랜드산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 녹용의 원산지 판별 방법은 상기 수득한 대사체에서 에스테르 중 메틸 아세테이트, 메틸 프로피오네이트, 에틸 부탄오에이트, 메틸 헥사노에이트, 2-이소부톡시에틸 프로피오네이트, 크리산테닐 프로피오네이트, 이소부틸 펜틸 카보네이트, 및 메틸 옥타노에이트로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 한국산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 녹용의 원산지 판별 방법은 상기 수득한 대사체에서 알코올 중 유칼립톨이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 한국산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 녹용의 원산지 판별 방법은 상기 수득한 대사체에서 케톤 중 2-헵타논이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 한국산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 녹용의 원산지 판별 방법은 상기 수득한 대사체에서 탄화수소 중 2-메틸-운데케인, 3,7-디메틸-노네인, 2,5-디메틸-도데케인, 1-(헥실옥시)-5-메틸-헥세인, 헥실옥시옥테인, 트리데케인 및 테트라데케인으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 한국산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 녹용의 원산지 판별 방법은 상기 수득한 대사체에서 3-메틸-부탄알이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 러시아산 또는 뉴질랜드산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 3-메틸-부탄알이 검출되면서, 2-푸란메탄올, 데케인 및 3,6-디메틸-운데케인 중 하나 이상이 검출되는 경우 상기 녹용의 원산지를 러시아산으로 판별할 수 있다. 또한, 3-메틸-부탄알이 검출되면서, 2,5-디메틸-3-헥사논이 검출되는 경우 상기 녹용의 원산지를 뉴질랜드산으로 판별할 수 있다.

본 발명의 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 판별방법에 의하면, 녹용에 포함된 다양한 대사체의 함량 등을 분석하여 녹용의 원산지(한국산, 러시아산 또는 뉴질랜드산)을 신속하고 특이적으로 판별할 수 있다.

도 1은 한국산, 러시아산 및 뉴질랜드산 녹용 절편을 나타낸 도면이다.
도 2는 원산지 별 녹용의 호기성 박테리아(APC) 및 곰팡이(mold) 농도를 나타낸 도면이다.
도 3은 원산지 별 녹용의 항산화 활성을 나타낸 도면이다.
도 4는 원산지 별 녹용의 판별 지표 및 마커를 나타낸 도면이다.
도 5는 원산지 별 녹용의 질량 크로마토그램 [ES+]-UV(265nm) 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6 원산지 별 녹용의 질량 크로마토그램 [ES-]-UV(265nm) 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 원산지 별 녹용 판별 마커물질의 PCA-X 결과를 나타낸 도면이다(검정색: 한국산, 적색: 뉴질랜드산, 녹색: 러시아산).

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 다양한 원산지의 녹용 확보

각 원산지별 녹용을 확보하기 위해, 원산지별로 대표적으로 하기의 녹용을 확보하였다: 한국산 녹용(KVA, 엘크, Cervus canadensis), 러시아산 녹용(RVA, 마록, Cervus elaphus) 및 뉴질랜드산 녹용(NZVA, 레드디어, Cervus elaphus). 각 원산지별 녹용은 대한민국 녹용유통시장에서 원산지별로 24점씩 (5,400g) 구매했다. 녹용 부위는 분골 및 상대이고, 건조 절편 형태로 구매하였으며, 녹용의 형태 및 정보는 도 1에 기재하였다. 상기 건조 녹용 절편의 수분 함량은 KVA, RVA 및 NZVA에 대해 각각 7.0, 7.5 및 8.02 %였다.

실시예 2: 녹용의 원산지별 미생물학적 분석(Microbiological analysis)

원산지별 녹용의 미생물학적 분석을 수행하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 녹용의 미생물 분석을 위해 녹용을(각 유형 당 n = 24)를 샘플링했습니다. 구체적으로, 각 샘플(10g)을 취하여 멸균 플라스틱 파우치에 90mL의 식염수 용액을 첨가하고, 스토마커 (Characteristic, B & F Korea)를 사용하여 1 분 동안 균질화시켰다. 그 후, 균질화된 샘플을 식염수로 연속 희석하여 총 호기성 플레이트 수(APC) 및 곰팡이(mold) 측정에 사용했다. 열거를 위해, 희석된 샘플 1mL를 APC Petrifilm and Mold and Yeast Petrifilm (3M Healthcare., Paul, MN, USA)에 펴고 37℃에서 48시간동안 배양했다. 플레이트에 나타난 콜로니를 열거하고 샘플 그램당 log10 콜로니 형성 단위(CFU/g)로 계산하였다. 각 샘플은 3반복으로 측정되었다.

상기 실험 결과, 적당한 온도에서 호기성 조건에서 성장할 수 있는 총 박테리아를 의미하는 호기성 플레이트 수 (APC)는 KVA, RVA 및 NZVA에서 각각 4.91, 4.54 및 4.36 log10 CFU/g 로서, 녹용 원산지간의 통계적 차이는 발견되지 않았다(p> 0.05). 또한, 곰팡이(mold)의 경우 또한 모든 녹용 샘플에서 비교적 낮은 수 (1.69-2.58 log10 CFU/g)가 발견되었으며, 통계적 차이는 발견되지 않았다(도 2).

상기 결과를 토대로, 미생물학적으로 녹용의 원산지에 따른 차이는 발견되지 않음을 알 수 있다. 또한, 날 식품의 APC 최대 한계는 10⁸ CFU/g 미만이어야 하는 바, 이를 바탕으로 상기 실험에 사용된 모든 종류의 녹용은 미생물 품질 측면에서 보장되었다고 할 수 있다.

실시예 3: 녹용 분말(VAP) 및 녹용 추출물(VAE) 제조

하기의 다양한 성분 분석 실험을 수행하기 위해, 실시예 1에서 확보한 다양한 원산지의 녹용을 분말화 하거나 추출물을 제조하였다.

구체적으로, 녹용건조분말(VAP)을 제조하기 위해 한약 제조 분쇄기(화진바이오텍, 한국)를 이용하여 녹용을 80 mesh 크기로 분쇄하였다. 상기 녹용건조분말은 미네랄 분석에 사용했다.

다음으로, 녹용 추출물은 다음과 같은 동일한 조건에서 준비되었다. 구체적으로, 각 원산지별 녹용에 대해 6개의 추출 배치(각각 750g)를 전기추출기 (경서기계(주), 서울, 대한민국)에서 95℃에서 20시간 가열한 다음 추출하였다. 추출 과정이 완료되면 한약추출용 천 여과기를 통해 여과하였다. 각 원산지별 녹용추출물(VAE)의 고형분 함량은 디지털 측정 장치 (ATAGO PAL-2, 서울, 대한민국)를 사용하여 측정되었다. 건녹용 750g에 대한 녹용 추출물(고형분 12.5%)의 평균 추출량은 KVAE, RVAE 및 NZVAE에 대해 각각 2114, 2182 및 2182 kg 였다. 마지막으로, 12.5%의 고형분을 포함하는 세 가지 녹용 추출물 모두 원래 추출물로 간주되었다.

항산화 분석을 위해서는 상기에서 제조한 녹용 추출물을 동결 건조기에서 건조 분말 형태로 농축한 다음 항산화 물질을 분석했습니다. 아로마 및 생리 활성 화합물의 분석을 위해, 각 추출 배치에서 약 10 mL의 원래 추출물을 추가 처리 없이 취해 분석에 사용하였다 (화합물 손실 방지).

실시예 4: 녹용의 원산지별 항산화 활성 분석

원산지별 녹용의 항산화 활성 분석을 수행하기 위해, 하기의 DPPH 어세이 및 ABTS 어세이 실험을 수행하였다.

먼저, DPPH 어세이를 수행하기 위해, 상기 실시예 3에서 제조한 각 원산지별 녹용 추출물을 증류수로 다양한 농도로 희석했다. 다음으로, 0.5 mM DPPH가 포함된 95% 에탄올 1.9 Ml과 각 추출물 0.1 mL (다른 농도에서)를 혼합했다. 상기 혼합물을 격렬하게 흔들고 실온에서 30분 동안 암실에서 배양 했다. 흡광도는 분광 광도계를 사용하여 517 nm 파장에서 측정되다. Trolox를 사용하여 표준 곡선 방정식과 양성 대조군을 준비했다. 녹용 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 계산하여 VAE 그램 당 μmol Trolox 당량 (TE) (μmol TE / g VAE)으로 표현했다.

ABTS 어세이를 수행하기 위해, 물에서 2mM ABTS와 2.45mM과 황산칼륨 (1:1 비율) 사이의 반응에 의해 ABTS·+ 양이온 라디칼을 생성하였다. 반응 혼합물을 사용하기 전에 12-16 시간 동안 실온에서 어두운 곳에 두었다. ABTS· 라디칼 용액을 95% 에탄올로 희석하고 분광 광도계를 사용하여 734 nm에서 0.730 단위의 흡광도를 얻었다. 그런 다음 서로 다른 농도의 0.1 mL의 녹용 추출물을 1.9 mL의 ABTS· 라디칼 용액과 혼합했다. 암실에서 10 분간 상온에서 배양한 후 분광 광도계를 이용하여 734nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 다양한 농도로 준비된 Trolox를 양성 대조군으로 사용했다. 추출물의 ABTS 자유 라디칼 소거 활성을 계산하고 VAE 그램 당 μmol Trolox 당량 (TE) (μmol TE / g VAE)으로 표현했다.

상기 DPPH 어세이 수행 결과, 자유 라디칼 소거 활성은 KVA>NZVA>RVA 순서로서 각각 평균값은 7.37, 1.65 및 1.02 μmol TE/g이었으며, KVA는 수입된 NZVA 및 RVA에 비해 항산화 능력이 현저하게 (p <0.05) 높음을 확인하였다. 또한, ABTS 어세이 수행 결과, 자유 라디칼 소거 활성은 KVA>NZVA>RVA 순서로서, 각각 50.26, 41.21 및 10.39 μmol TE/g였으며, 상기 DPPH 결과와 동일하게 KVA는 수입된 NZVA 및 RVA에 비해 항산화 능력이 현저하게 (p <0.05) 높음을 확인하였다(도 3).

실시예 5: 녹용의 원산지별 미네랄, 조지방 및 단백질 함량 분석

원산지별 녹용의 미네랄, 조지방 및 단백질 함량 분석을 수행하기 위해, 하기의 실험을 수행하였다.

구체적으로, 미네랄 함량을 분석하기 위해, 테플론 용기에 7mL 질산을 함유한 녹용추출물(각각 1g)을 실온에서 12시간 동안 보관했다. 샘플 용액을 180℃에서 50분 동안 가열한 다음 실온에서 냉각시켰다. 원자 방출 분광 광도계 ICP-OES (모델: iCAP 7400 Duo, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 미네랄 함량을 분석했다. 검출을 위해 각 광물에 대해 588.9 nm의 Na, 248.3 nm의 Fe, 279.5 nm의 Mn, 213.9 nm의 Zn 등과 같이 다른 파장을 설정했다. 검증을 위해 서로 다른 농도의 미네랄 표준을 사용하고 동일한 조건에서 실행했으며 녹용 추출물에 있는 각 미네랄의 최종 농도는 표준 보정 곡선을 사용하여 계산되었다. 또한, 조지방 및 단백질 함량 분석은 기존에 알려진 분석 방법을 이용하였으며, 결과는 mg / 100g VAE로 표시하였다.

상기 실험 결과, 미네랄, 조지방 및 단백질 함량 분석 결과는 하기 표 1에 자세히 기재하였다.

* 다른 위첨자 (a, b, c)가 있는 동일한 행 내의 평균은 (p <0.05)에서 크게 다름.

구체적으로, 검출된 미네랄 중 Fe의 농도가 RVA 추출물에 비해 KVA 추출물에서 유의하게 더 높음다(p <0.05). 반면, Mn, Zn, Ca 함량은 KVA 또는 NZVA 추출물에 비해 RVA 추출물에서 더 높았다 (p <0.05). 또한, 원산지별 Cu 및 Mg 함량에는 차이가 없었다 (p> 0.05).

또한, 녹용 추출물 중 단백질 및 지방 농도는 각각 9.21 ~ 13.90g / 100g 및 0.22 ~ 0.80g / 100g 범위였으며, KVA 샘플은 나머지 다른 원산지에 비해 지방 및 단백질 함량이 더 높았다 (p <0.05). 따라서 미네랄, 지방 및 단백질 함량은 원산지 별로 차이가 있음을 알 수 있다.

실시예 6: 녹용의 원산지별 아미노산 함량 분석

원산지별 녹용의 아미노산 함량 분석을 수행하기 위해, 하기의 실험을 수행하였다.

구체적으로, 각 샘플 (분말 형태의 2.5g)을 5mL 증류수로 균질화하고, 0.45 μm 필터 멤브레인 (Merk Millipore Ltd., Carrigtwohill, Cork, Ireland)을 통해 여과한 후, 상기 여과액을 아미노산 분석에 사용했다. 아미노산 분석은 Intrada 아미노산 컬럼에 연결된 초 고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC, Waters, Milford, USA)를 사용하여 수행하였다: 2 x50 mm, 3μm (Imtaka, Uphur St, Suite A, Portland). 크로마토그래피 분리는 용매 A (ACN : 100mM 포름산 암모늄, 20:80 v/v) 및 B (ACN : 테트라히드로푸란 : 포름산 암모늄 : 포름산, 9 : 75 : 16 : 0.3 v/v)을 사용하여 수행되었다. 분리 조건 설정은 3분 동안 100%B, 3.5분 동안 83%B, 3.5분 동안 100%A로 7분 동안 100%B를 유지하고 다음 샘플 주입 전에 다시 평형화되었다. 아미노산은 표준 아미노산 혼합물의 머무름 시간을 기준으로 식별되었으며 개별 유리 아미노산 값은 μmol/g 샘플로 표시되었다.

상기 실험 결과, 아미노산 함량 분석 결과는 하기 표 2에 자세히 기재하였다.

구체적으로, 3가지 원산지의 녹용 추출물 모두에서 총 20개의 아미노산이 모두 검출되었으나, 이들 중 단 6개의 아미노산 (글리신, 알라닌, 프롤린, 라이신, 메티오닌 및 티로신)만이 원산지별로 차이가 있었다. 특히 글리신, 알라닌, 메티오닌 및 티로신의 농도는 RVA 또는 NZVA에 비해 KVA에서 유의하게 높았다(p<0.05). 반면 라이신과 프롤린의 농도는 RVA에 비해 NZVA에서 더 높았다 (p<0.05). 또한, 글리신, 알라닌, 류신 및 발린의 경우 3가지 원산지 모두에서 가장 우세한 아미노산 중 하나임을 확인하였다.

실시예 7: 녹용의 원산지별 휘발성 향미 화합물 함량 분석

원산지별 녹용의 휘발성 향미 화합물 함량 분석을 수행하기 위해, 하기의 실험을 수행하였다.

녹용 추출물에서 향미 화합물의 추출은 SPME (Solid Phase Micro-Extraction) 기술을 사용하여 수행하였다. 그 후, 휘발성 물질은 기체 크로마토 그래피/질량분광법 (GC/MS) 시스템을 사용하여 결정하였다.

구체적으로, 1.0 mL의 녹용 추출물을 20 mL 헤드 스페이스 바이알에 넣고 1.0 μL의 내부 표준 (2-메틸-3-헵타논, 메탄올 중 816 mg/mL)을 추가했다. 그 후 추출을 위해 바이알을 PTFE-면 실리콘 격막으로 단단히 덮었다. 향미 화합물의 추출, 흡수 및 탈착은 질량 분광광도계 (Mass Spectrophotometry)를 사용하여 가스 크로마토그래피 (모델: 7890B GC)에 연결된 카르복센-폴리디메틸 실록산 (75μm) 섬유 (Supelco, USA)가 장착된 SPME 샘플 준비 기기를 사용하여 수행되다 (모델: 5977B MSD, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). 추출은 60℃에서 60분 동안 수행되었고 휘발성 물질을 포함하는 섬유는 10mL /min의 분할 흐름으로 5 분 동안 주입 포트에서 250℃에서 탈착되었다. 휘발성 물질의 분리는 1 mL/min의 일정한 유속으로 모세관 컬럼 (30 m x 0.25 mm i.d. x 0.25 μm 필름 두께)에서 수행되다. 오븐 온도는 40℃에서 5분 동안 유지한 다음 8℃/min의 속도로 250℃로 증가하고, 상기 온도에서 5분 동안 유지했다. 향미 화합물은 실험을 통해 얻은 질량 스펙트럼 결과를 이미 질량 스펙트럼 라이브러리 (Agilent Technologies)에 있는 것과 비교하거나 머무름 시간을 외부 표준과 비교하여 식별했다. 확인된 화합물은 내부 표준의 피크 면적과 피크 면적을 비교하여 정량화되었다.

상기 실험 결과, 휘발성 화합물 분석 결과는 하기 표 3에 자세히 기재하였다.

* ND: 검출 안됨

* 1) 화합물은 라이브러리의 질량 스펙트럼 (MS) 또는 정품 표준 (STD)으로 식별되었다.

* 다른 위첨자 (a, b)가 있는 동일한 행 내의 평균은 (p <0.05)에서 크게 다름.

구체적으로, SPME / GC-MS 기술을 사용하여 에스테르 (12), 알코올 (3), 알데하이드 (1), 케톤 (6) 및 탄화수소 (10)을 포함한 총 32개의 휘발성 화합물이 검출되었으며, 피라진 (5), 황 함유 화합물 (7) 및 퓨란 (2) 화합물이 확인되었다.

상기 화합물 중 에스테르는 12개로 가장 우세하게 검출되었으며, 특히 12개의 에스테르는 모두 KVA에서 발견된 반면, RVA 또는 NZVA는 4개의 에스테르 화합물 만이 포함된 것으로 확인되었다. 또한, 1-메톡시-2-프로필 아세테이트 및 에틸 옥타노에이트의 경우 3가지 원산지에서 모두 발견되었으며, RVA 및 NZVA에 비해 KVA에서 양이 유의미하게 더 많은 것을 확인하였다 (p <0.05).

알코올 화합물은 KVA에서는 3가지가 모두 검출되었으나, RVA 및 NZVA의 경우에는 1종 또는 2종의 알코올 화합물만이 검출되는 것을 확인하였다. 한편, 2,4-디-터트-부틸페놀 (2,4-Di-tert-butylphenol)은 RVA와 NZVA에서도 발견되었지만, 원산지 별 유의한 차이가 발견되지 않았다(p>0.05).

알데하이드 화합물은 3-메틸부탄알(3-methylbutanal)이 RVA (0.001 μg/mL) 및 NZVA (0.001 μg/mL)에서만 발견된 것을 확인하였다.

케톤 화합물의 경우 2-헵타논(2-Heptanone)은 KVA에서만 발견되었고, 2,5-디메틸-3-헥사논(2,5-dimethyl-3-hexanone)은 RVA에서만 발견되지 않았다. 또한, 2,4-디메틸-3-헥사논(2,4-dimethyl-3-hexanone)의 경우 RVA 및 NZVA에 비해 KVA가 유의미하게 더 많은 양(0.15 ㎍/mL)을 함유하는 것으로 확인되었다 보였다 (p <0.05).

탄화수소의 경우 2,2,6-트리메틸-옥탄(2,2,6-trimethyl-octane)만이 3가지 원산지의 녹용에서 모두 발견되었으며, KVA만이 10종의 탄화수소가 모두 발견되었다.

상기 결과를 토대로, 에스테르, 알코올, 알데하이드, 케톤 및 탄화수소의 검출 수준을 통해 녹용의 원산지를 확인할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 8: 녹용의 원산지별 생리 활성 화합물 분석

원산지별 녹용의 생리 활성 화합물의 함량 등의 분석을 수행하기 위해, 하기의 실험을 수행하였다.

구체적으로, 녹용 추출물(각각 1g)을 증류수에 녹인 다음 0.45 μm 필터 멤브레인 (Merck Millipore)을 통해 여과했다. 초 고성능 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분광법 (UPLC-Q-TOF-MS/MS, Xevo TQ-5, Waters, Milford, USA)을 사용하여 녹용 추출물에서 생물 활성 화합물의 분리 및 검출을 수행하였다. 크로마토그래피를 이용한 화합물 분리는 ACQUITY UPLC HSS T3 컬럼 (100mm Х 2.1mm, 1.8μm, Waters)에서 40℃의 온도와 0.5ml/min의 유속에서 각 녹용 추출물을 주입한 후 수행되었다. 이동상은 용매 A (증류수+0.1% 포름산)와 용매 B (ACN+0.1% 포름산)로 구성되며, 대사산물의 분석 용출 조건은 0~5분 동안 97% A 상 ; 5~16 분 동안 3-100 % 라이너 그라데이션 단계 B ; 16-17 분 동안 100 % 상 B ; 17~19 분 동안 100-3 % 리버스 라이너 그라데이션 위상 B ; 19-25 분 동안 97 % 위상 A이다. 컬럼에서 용출된 화합물은 양이온 및 음이온 모드에서 고해상도 직렬 질량 분석기 SYNAPT G2 Si HDMS QTOF (Waters)로 검출하였다. 양이온 모드의 경우 모세관 전압과 콘 전압은 각각 2kV 및 40V로 설정되었다. 음이온 모델은 각각 1kV 및 40V로 설정되었다. Centroid MS 모드는 질량 분석 데이터를 수집하는 데 사용되었다. 1 차 스캔 범위는 50 ~ 1200Da이고 스캔 시간은 0.2 초였다. 모든 부모 이온은 20-40 eV를 사용하여 조각화되었다. 모든 조각의 정보가 수집되었고 스캔 시간은 0.2초였다. 데이터 수집 과정에서 LE 신호는 실시간 품질 보정을 위해 3초마다 획득되었다. 정확한 질량 획득을 위해 10 μL/min의 유속에서 류신 엔케팔린(encephalin)을 잠금 스프레이 인터페이스에 의해 잠금 질량으로 사용하여 양성 ([M+H]+ = 556.2771) 및 음성 ([M-H]- = 554.2615)을 모니터링하였다. 데이터 수집 및 분석은 UNIFI V1.71 소프트웨어 (Waters)에 의해 제어되었으며, 그런 다음 UNIFI V1.71 (Waters)의 적절한 과학 라이브러리에 대해 스크리닝하여 피크를 식별했다.

상기 UPLC-QTOF-MS/MS 분석 결과, 녹용의 각 원산지별(국가별) 공통적인 기능성 표준물질은 412종류이며, 각 원산지별(나라별) 녹용을 구분할 수 있는 차별화된 마커물질은 300종으로, 한국산(국내산)을 구분하는 녹용 마커물질은 109종, 러시아산 녹용을 구분하는 마커물질은 84종, 뉴질랜드산을 구분하는 녹용 마커물질은 107종이었다. 아울러 한국산-러시아산 녹용에서만 공통적인 마커 물질은 13종, 한국-뉴질랜드산 녹용에서 공통적인 마커물질은 13종, 뉴질랜드-러시아산의 공통 마커 물질은 11종이었다(도 4).

다음으로, 질량 크로마토그램(mass chromatogram) 분석 결과, 양이온 모드[ES+]와 음이온 모드[ES-]에서 나타난 바와 같이, 원산지별(국가별) 수준에 차이가 있었으며, 피크의 상대적 강도(피크 면적 백분율)의 높은 변동을 보여준다. 확인된 화합물중에는 인지질, 스테로이드, 알칼로이드, 에스테르, 아미노산, 펩타이드, 성장호르몬 및 강글리오사이드 등이 검출되었다. 상기 질량 크로마토그램 결과는 도 5[ES+] 및 도 6[ES-]에 표시하였으며, 러시아산 녹용은 파란색, 뉴질랜드산 녹용은 노란색, 한국산(국내산)녹용은 초록색으로 표시하였다.

상기 분석 결과, KVA의 경우 호베니둘시오사이드 A2(hovenidulcioside A2) (허용 ID: HMDB41029), 진세노사이드 F3(Ginsenoside F3)(허용 ID: HMDB39556) 및 우랄사포닌 B(Uralsaponin B)(허용 ID: HMDB39310)이 마커 물질로 선정되었고, RVA의 경우 노토진세노사이드 I(Notoginsenoside I)(허용 ID: HMDB31371), 아큐티시민 A(Acutissimin A)(허용 ID: HMDB39207), 및 가노데르산 H(Ganoderic acid H)(허용 ID: HMDB35987)가 마커 물질로 선정되었으며, NZVA의 경우 에이지리놀(Aegelinol) (허용 ID: HMDB33914), 탈라소스피라미드 A(thalassospiramide A) (허용 ID: CSID17214520) 및 파풀라칸딘 A (Papulacandin A) (허용 ID: CHEBI72611)가 마커물질로 선정되었다.

다음으로, 상기에서 선별한 마커물질의 신뢰도 등을 검증하기 위해 주성분 분석(principal component analysis, PCA-X)을 수행하여 상기에서 선정된 마커물질을 도식화하였다. 그 결과, 녹용의 각 원산지별(국가별) 모델의 4개의 점수 구성 요소를 고려하여, 상기에서 선별한 마커물질들이 녹용의 원산지별로 구별되게 분포하고 있어 원산지를 명확하게 판별할 수 있음을 검증하였으며(도 7), 이를 토대로 상기 마커물질을 이용하면 녹용의 원산지를 효율적으로 판별할 수 있음을 알 수 있다.

상기 실시예들에서 확인한 다양한 녹용 원산지 판별용 지표물질 바이오마커로 사용되는 대사체는 각 나라의 고유의 식물, 나무껍질, 이끼, 먹이 등에서 유래되는 천연 지표물질인 것으로 보이며, 이러한 원산지별 녹용의 대사체 함량의 차이는 사슴의 품종 영향보다는 국가별 사슴의 사료, 사양관리 및, 성장환경 등이 영향을 미치는 것으로 예상할 수 있다.

실시예 9: 통계 분석

원산지별 녹용의 대사체에 대한 이온 모드 데이터 수집 및 분석은 UNIFI V1.71 소프트웨어 (Waters)에 의해 제어와 통계분석에 의하여 통제되었으며, 그런 다음 UNIFI V1.71 (Waters)의 적절한 과학 라이브러리에 대해 스크리닝하여 각각의 피크를 식별되었다. 원산지별 마커에 대한 신뢰도는 PCA 분석을 통하여 확인하였습니다. 상기 실시예의 데이터는 통계 분석 시스템 (SAS Institute, Cary, NC, USA, 2007)의 일원 분산 분석 절차를 사용하여 분석되었다. 변수에 대한 평균 및 표준 오차가 계산되었으며, 녹용의 원산지는 모델의 주요 효과로 간주되었다. 평균은 Duncan의 다중 범위 테스트를 사용하여 비교되었으며, 유의성은 p <0.05에서 정의되었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌것으로 이해해야만 한다.

본 특허는 농협중앙회와 한국양토양록농협의 연구사업 지원 및 대한민국 IPET의 제품 안전 유통 및 소비 기술 개발 프로그램 (프로젝트 번호 320111-1)의 보조금으로 지원되었다.

Claims

에스테르(Ester), 알코올(Alcohol), 알데하이드(Aldehyde), 케톤(ketone), 탄화수소(hydrocarbon) 및 생리활성 물질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체를 포함하는, 녹용(velvet antler)의 원산지 판별용 바이오마커 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 원산지는 대한민국, 러시아 또는 뉴질랜드인 것인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 에스테르는 메틸 아세테이트(Methyl acetate), 에틸 아세테이트(Ethyl Acetate), 메틸 프로피오네이트(Methyl propionate), 에틸 부탄오에이트(Ethyl butanoate), 1-메톡시-2-프로필 아세테이트(1-Methoxy-2-propyl acetate), 메틸 헥사노에이트(Methyl hexanoate), 2-이소부톡시에틸 프로피오네이트(2-Isobutoxyethyl propionate), 크리산테닐 프로피오네이트(Chrysanthenyl propionate), 이소부틸 펜틸 카보네이트(Isobutyl pentyl carbonate), 메틸 옥타노에이트(Methyl octanoate), 에틸 옥타노에이트(Ethyl octanoate) 및 헵틸 헵타노에이트(Heptyl heptanoate)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 알코올은 2-푸란메탄올(2-Furanmethanol), 유칼립톨(Eucalyptol), 및 2,4-디-터트-부틸페놀(2,4-Di-tert-butylphenol)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 알데하이드는 3-메틸-부탄알(3-methyl-butanal)인 것인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 케톤은 2-헵타논(2-Heptanone), 2,4-디메틸-3-헥사논(2,4-dimethyl-3-hexanone), 2,5-디메틸-3-헥사논(2,5-dimethyl-3-hexanone), 3-옥타논(3-Octanone), 2,4-디메틸-3-헥사논(2,4-dimethyl-3-Hexanone) 및 2-운데칸온(2-Undecanone)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 탄화수소는 2,2,6-트리메틸-옥테인(2,2,6-trimethyl-octane), 데케인(Decane), 2-메틸-운데케인(2-methyl-undecane), 3,7-디메틸-노네인(3,7-dimethyl-nonane), 3,6-디메틸-운데케인(3,6-dimethyl-undecane), 2,5-디메틸-도데케인(2,5-dimethyl-dodecane), 1-(헥실옥시)-5-메틸-헥세인(1-(hexyloxy)-5-methyl-hexane), 헥실옥시옥테인(Hexyloxyoctane), 트리데케인(Tridecane) 및 테트라데케인(Tetradecane)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 생리활성 물질은 호베니둘시오사이드 A2(hovenidulcioside A2), 진세노사이드 F3(Ginsenoside F3), 우랄사포닌 B(Uralsaponin B), 노토진세노사이드 I(Notoginsenoside I), 아큐티시민 A(Acutissimin A), 가노데르산 H(Ganoderic acid H), 에이지리놀(Aegelinol), 탈라소스피라미드 A(thalassospiramide A) 및 파풀라칸딘 A (Papulacandin A)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 조성물.
청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 바이오마커 조성물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 녹용의 원산지 판별용 조성물.
청구항 9의 판별용 조성물을 포함하는, 녹용의 원산지 판별용 키트.
녹용으로부터 대사체를 수득하는 단계; 및
상기 수득한 대사체 중 에스테르, 알코올, 알데하이드, 케톤, 탄화수소 및 생리활성 물질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 함량을 분석하는 단계를 포함하는, 녹용 원산지를 판별하는 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 함량을 분석하는 단계는 기체 크로마토 그래피/질량분광법(GC/MS) 또는 초고성능 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분광법 (UPLC-QTOF-MS/MS) 으로 분석하는 것인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 방법은 상기 함량을 분석한 대사체들 간의 함량 수준 차이로 녹용의 원산지를 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 방법은 상기 수득한 대사체에서 생리활성 물질 중 호베니둘시오사이드 A2, 진세노사이드 F3 및 우랄사포닌 B으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 한국산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 방법은 상기 수득한 대사체에서 생리활성 물질 중 노토진세노사이드 I, 아큐티시민 A, 및 가노데르산 H 으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 러시아산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 방법은 상기 수득한 대사체에서 생리활성 물질 중 에이지리놀, 탈라소스피라미드 A 및 파풀라칸딘 A로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 뉴질랜드산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 방법은 상기 수득한 대사체에서 에스테르 중 메틸 아세테이트, 메틸 프로피오네이트, 에틸 부탄오에이트, 메틸 헥사노에이트, 2-이소부톡시에틸 프로피오네이트, 크리산테닐 프로피오네이트, 이소부틸 펜틸 카보네이트, 및 메틸 옥타노에이트로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 한국산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 방법은 상기 수득한 대사체에서 알코올 중 유칼립톨이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 한국산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 방법은 상기 수득한 대사체에서 케톤 중 2-헵타논이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 한국산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 방법은 상기 수득한 대사체에서 탄화수소 중 2-메틸-운데케인, 3,7-디메틸-노네인, 2,5-디메틸-도데케인, 1-(헥실옥시)-5-메틸-헥세인, 헥실옥시옥테인, 트리데케인 및 테트라데케인으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 한국산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 방법은 상기 수득한 대사체에서 3-메틸-부탄알이 검출되고, 2-푸란메탄올, 데케인 및 3,6-디메틸-운데케인 중 하나 이상이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 러시아산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 방법은 상기 수득한 대사체에서 3-메틸-부탄알 및 2,5-디메틸-3-헥사논이 검출되는 경우, 상기 녹용의 원산지를 뉴질랜드산으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.