CN101164918A - 一种浓集污水或污水处理厂尾水中病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种浓集污水或污水处理厂尾水中病毒的方法。该病毒浓集的方法，包括以下步骤：1)调节水样条件：取污水或污水处理厂尾水水样，加入Al3+，使Al3+终浓度为0.5－1mol/L，将pH值调节至3.0－3.5；2)吸附：在步骤1)的水样中，加入硅胶颗粒，搅拌吸附；3)洗脱：收集步骤2)吸附后的硅胶，用pH 3.0－3.5H2SO4溶液冲洗后，放入pH值为9.0－9.5的尿素－赖氨酸缓冲液中振荡涡漩，离心收集上清液得到洗脱液；4)洗脱液浓缩：将步骤3)得到的洗脱液超滤浓缩。本发明的方法不仅具有回收率相对较高、处理水量大、效果稳定、操作简单、成本低廉等优点，还可以将浓集后的样品直接用于分子生物学操作，为快速准确检测水环境中的病毒提供了强有力的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种浓集污水或污水处理厂尾水中病毒的方法。
背景技术
通过水传播的病原微生物是危害人类健康和生态安全的重大隐患，全世界约有1/4的疾病是由水中病原微生物直接或间接引起的(Gerba，C.P.，Pathogens in theenvironment.In：Pepper，I.L.，Gerba，C.P.，Brusseau，M.L.(Eds.)，PollutionScience.Academic Press，New York，1996.p.279-299)。水环境中的病原微生物主要分为致病细菌、病毒和原生动物三类，其中病毒在水环境中含量低，但是致病性强且种类繁多。水环境中的病毒主要来自人和动物的排泄物，这些病毒进入水环境中后，在相当长的时间里仍保持较高的传染性和致病性，常规的水处理和消毒工艺不能完全将其去除和灭活(Hambidge，A.，Reviewing efficacy of alternativewater treatment techniques.Health Estate 2001.55(6)，23-25)，已有众多研究者在污水(Baggi，F.，Peduzzi，R.，2000.Genotyping of rotaviruses inenvironmental water and stool samples in Southern Switzerland by nucleotidesequence analysis of 189 base pairs at the 5_end of the VP7 gene.J.Clin.Microbiol.38，3681-3685)、地表水(Eiji Haramoto，Hiroyuki Katayama，KumikoOguma.and Shinichiro Ohgaki Application of Cation-Coated Filter Method toDetection of Noroviruses，Enteroviruses，Adenoviruses，and Torque TenoViruses in the Tamagawa River in Japan.Applied and EnvironmentalMicrobiology，May 2005，p.2403-2411)、地下水以及饮用水(Gratacap-Cavallier，B.，Genoulaz，0.，Brengel-Pesce，K.，Soule，H.，Innocenti-Francillard，P.，Bost，M.，Gofti，L.，Zmirou，D.，Seigneurin，J.M.，2000.Detection of humanand animal rotavirus sequences in drinking water.Appl.Environ.Microbiol.66，2690-2692)中检测出轮状病毒、诺瓦克病毒、甲型肝炎病毒、肠道病毒、腺病毒等。Sobey等人的报告中指出，城市生活污水造成的地下水污染已经使污水中的病原微生物成为公众健康的威胁。在1989-1990年间，美国爆发的26起通过饮用水传播的流行疾病就有13起由此而引起(J.E.Scandura，M.D.Sobey.Viral andbacterial contamination of groundwater from on-site sewage treatment systems.Water Science and Technology，1997，35(11-12)：141-146.)。也有研究也表明，经用于灌溉或直接排入地表水系统的再生水也存在病毒污染的风险(Ganoulis，Anastasia Papalopoulou.Risk analysis of wastewater reclamation and reuse.Wat.Sci.Tech.1996(33)，297-302.)。因此，快速及时地检测水环境中病毒污染状况，及时发现水处理工艺中的失误，分析病毒传播途径，并制定高效的预防控制手段，这对于降低轮状病毒感染风险、预防控制轮状病毒疾病爆发流行、保障水质安全具有十分重要的意义。
病毒检测系统由浓集水样和检测浓缩后水样中的病毒两个部分组成。由于水中病毒的浓度非常低，不能直接检出，而且环境中存在大量干扰细胞感染及分子生物学检测的杂质，因此病毒检测的主要难点之一就是从大体积水样中高效地浓集出目标病毒并去除浓缩病毒的同时也被浓缩的干扰物质。
目前，研究较多、应用较广泛的病毒浓集方法有以下几种：
1.吸附-洗脱法
吸附-洗脱法是让病毒吸附在滤材表面，然后用洗脱液将病毒从滤材上洗脱下来。常用的滤材有带负电和带正电的两种，常用的吸附介质一般是滤膜或固体颗粒。常用的洗脱液根据作用方式不同有两类：一类是改变吸附特性的物质，如甘氨酸、三氯乙酸及EDTA等；另一类是和病毒竞争吸附位点的蛋白类物质，如牛肉提取液(Beef Extract)等。
2.絮凝沉淀法
絮凝沉淀法，即向水中加入化学物质，形成絮凝沉淀，病毒通过与沉淀结合而浓缩。常用的无机絮凝剂有氢氧化铝、氯化铝、磷酸铝、磷酸钙；有机絮凝剂有聚乙二醇和鱼精蛋白的硫酸盐等。絮凝法浓集大体积水样中的病毒效率不高，一般用于小体积的水样浓缩，如吸附法的洗脱液中病毒的再浓缩。
3.免疫捕获法
免疫捕获法是基于抗体和抗原特异性结合的原理。将高特异性的纯化抗体交联于层析材料上，装填成柱，或具有超顺磁性的氧化铁粒子连接上抗体，抗体与样品液中对应的致病微生物发生特异性结合，在外加磁场的作用下，载有致病微生物的免疫磁性粒子向磁极方向聚集，收集磁粒子，最后用洗脱液洗脱层析材料或磁粒即可得到浓集后的病毒(Casas N，Sunen E..Detection of enteroviruses，hepatitisA virus and rotaviruses in sewage by means of an immunomagnetic capturereverse transcription PCR assay[J].Microbiol Res，2002，157(3)：169-175.)。这种结合过程是特异的，能有效去除各种干扰物质，灵敏度极高，操作相对简单。而且具有良好的兼容性，可以很容易与各种检测方法相结合。有研究者把免疫磁珠分离技术(immunomagnetic bead-based separation，IMS)与PCR技术结合在一起，发展了IMS-PCR技术，提高了PCR检测的效率和准确性。吸附免疫捕获技术的难点是制备高性能的固相载体和病原微生物的特异性抗体，如制备均一球形超顺磁性且易于结合蛋白的磁珠，在国外多为专利产品且价格昂贵，国内对免疫磁珠技术的研究刚刚起步。
4.电阻拦法
当含微生物的液体流经垂直电场内的填充层时，被极化的填充料阻拦了微生物以及其它可形成溶液的物质(如核酸、蛋白质、甚至分子量比较低的有机物)。填充料对很小的颗粒来说不是真正的过滤层，即使最好的微生物吸附剂，它的吸附容量不大，只因为放到了电场中，才转变成高效率的过滤器，吸附容量增大几十个数量级。填充料上阻留的微生物等在切断电场后，很容易用水流冲洗下来(丁昌慧，邵荣标.水中脊髓灰质炎病毒浓集方法研究的新进展.中国卫生检验杂志，2000，10(4)：509-510.)。
水中理想的浓集方法应该具备：(1)效果稳定，回收率高，能检测大体积水样中微量的病毒；(2)操作简单，成本较低，能用于常规水质监测。尽管目前可用的浓集方法有很多种，且各有所长，但实际水体中复杂的水质条件，使病毒浓集效果受到影响，为了能更好地应用于水质安全管理，仍然需要进一步探索。
相较饮用水而言，城市生活污水和污水厂尾水水质条件复杂，有机物含量高，利用滤膜法容易堵塞。
发明内容
本发明的目的是提供一种浓集污水或污水处理厂尾水中病毒的方法。
本发明所提供的浓集污水或污水处理厂尾水中病毒的方法，包括以下步骤：
1)调节水样条件：取污水或污水处理厂尾水水样，加入Al3+，使Al3+终浓度为0.5-1mmol/L，将pH值调节至3.0-3.5；
2)吸附：在步骤1)的水样中，加入硅胶颗粒，搅拌吸附；
3)洗脱：收集步骤2)吸附后的硅胶，用pH3.0-3.5的H2SO4溶液冲洗后，放入pH值为9.0-9.5的尿素-赖氨酸缓冲液中振荡涡漩，离心收集上清液得到洗脱液；
4)洗脱液浓缩：将步骤3)得到的洗脱液超滤浓缩。
所述方法中，所述步骤1)中，Al3+终浓度优选为1mol/L，所述Al3+优选为是通过AlCl3加入的。
所述方法中，所述步骤1)中，将pH值调节至3.0-3.5。
所述方法中，所述步骤2)中，所述硅胶颗粒的粒径为200目，所述硅胶颗粒的添加量可为1-4g/L污水或污水处理厂尾水，优选为1g/L污水或污水处理厂尾水。
所述方法中，所述步骤2)中，所述搅拌吸附的时间为10-20分钟。
所述方法中，所述步骤3)中，收集步骤2)吸附后的硅胶是用滤纸过滤收集，所述滤纸优选为定性滤纸；所述尿素-赖氨酸缓冲液为的pH值优选为9.0；所述冲洗用H2SO4溶液pH值优选为3.0，所述H2SO4溶液的用量为10-20ml/g硅胶颗粒。
所述方法中，所述步骤3)中，尿素-赖氨酸缓冲液的用量为20-30ml/g硅胶颗粒；所述振荡涡漩的时间为20-30分钟。
所述方法中，所述步骤4)中还包括在洗脱液超滤前先每50ml尿素-赖氨酸缓冲液加入1ml 50×TE缓冲液，并调水样pH为7.0。
所述方法中，所述步骤4)中，所述超滤后每1L污水或污水处理厂尾水水样浓缩至0.1-1.5ml。
上述污水处理厂尾水，包括污水处理后的各种出水(如二级处理出水、三级处理出水(一般也称为再生水)等)也可为其他污水如地表水、景观娱乐用水等。
本发明的方法针对浊度较高、杂质较多的生活污水和污水处理厂尾水，通过向水环境样品中投加多价阳离子和固体颗粒荷电材料吸附水中病毒，收集固体颗粒后利用尿素-赖氨酸溶液洗脱其吸附的病毒，建立了固体颗粒(硅胶)吸附-尿素-赖氨酸溶液洗脱的浓集方法，可在1-2小时内得到浓集病毒的水样，即省时间又减少了长时间操作造成的病毒死亡，生活污水回收率平均为21％，污水厂尾水回收率平均为27％，与目前同类的研究相比具有较好的回收效率。该方法不仅可以处理大体积高浊度水环境样品，还避免使用牛肉提取液(含有较多干扰分子生物学操作的杂质)洗脱吸附病毒，利用该方法浓集后的样品，不仅可以直接利用传统的细胞培养法检测，还可以直接利用分子生物学方法检测。
本发明的方法具有回收率相对较高、处理水量大、效果稳定、操作简单、成本低廉、应用广泛等优点，在污水及污水处理尾水、再生水、景观娱乐用水等水环境病毒检测中有广阔的应用前景。
附图说明
图1为浓集病毒用过滤器结构示意图
图2为Al3+离子浓度对病毒回收率的影响曲线图
图3为不同滤料对轮状病毒的吸附效率比较
图4为Q污水处理厂3月水样浓缩后RT-PCR直接测定结果
图5为污水处理厂4月水样浓缩后RT-PCR直接测定结果
图6为污水处理厂5月水样浓缩后RT-PCR直接测定结果
图7为高碑店污水处理厂5月水样浓缩后RT-PCR直接测定结果
图8为小红门污水处理厂5月水样和实验室生活污水浓缩后RT-PCR直接测定结果
图9为昆运河颐和园处和昆运河紫竹院处5月水样浓缩后RT-PCR直接测定结果
图10为Q污水处理厂3月水样浓缩后感染的细胞RT-PCR测定结果
图11为Q污水处理厂3月水样浓缩后利用RT-PCR测定结果
图12为利用本发明的方法浓集水样病毒及病毒检测流程图
具体实施方式
下述实施例中的方法中，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、污水或污水处理尾水中病毒浓集方法的建立
本发明利用固体颗粒吸附-洗脱法，建立适用于大体积的、水质条件复杂的生活污水和污水厂尾水中病毒的浓集方法。利用固体颗粒吸附洗脱法进行污水病毒浓集，基本包括预过滤、固体颗粒吸附、洗脱、浓缩等步骤。
本实施例以生活污水和二级出水为实验对象，进行污水或污水处理尾水中病毒浓集方法的各个条件的优化。
测定生活污水和二级出水(生活污水二级处理后出水)的浊度和COD值，测得本研究所用污水浊度为10-50NTU，COD为200-250mg/L；二级出水浊度为0.5-3NTU，COD为50-60mg/L。
由于在采用的生活污水和二级出水中没有检测出轮状病毒，因此分别取1L生活污水和二级出水作实验水样，分别投入100μl纯培养轮状病毒(其中病毒的准确含量用real-time RT-PCR确定)作为样品进行病毒浓集，浓集后的样品进行检测病毒拷贝数，病毒回收率＝(检测出轮状病毒的拷贝数/投加到水样中轮状病毒的拷贝数)×100％。
一、检测浓集后水样中轮状病毒拷贝数的方法
下述实施例中，如无特别说明，检测浓集后水样中轮状病毒拷贝数的方法为下述real-time RT-PCR法，主要包括RNA提取和real-time RT-PCR定量检测两个步骤：
1.水样RNA提取
取浓集至1ml的水样，按QIAampR UltraSensTM Virus Kit(Catalog no.53706，QIAGEN)的说明书提取RNA。具体步骤为：
(1)将1ml样品平衡到室温(15-25℃)后转移到2ml的离心管中。
(2)在样品上面加入0.8ml buffer AC，小心加入，避免溅到盖子上，吸5.6μl载体RNA加入到离心管盖子上。
(3)盖紧盖子，颠倒离心管3次，然后漩涡10s。
(4)在室温(15-25℃)下孵育10min。
(5)1200×g离心3min。
(6)完全去除上清液。
(7)加入300μl已经孵育到60℃ buffer AR和20μl蛋白酶K。
(8)充分旋涡直到沉淀完全溶解。
(9)将混合物放在已预热到40℃的heating block上摇动10min，设置为最大转速。
(10)用掌上离心机简单地离心，让黏附在盖子上的液体下来。
(11)加入300μl Buffer AB，漩涡以充分混匀，然后简单地离心，让黏附在盖子上的液体下来。
(12)小心地将700μl裂解产物加入到QIAamp spin column(放在2ml的收集管上)中，不要粘到边缘。盖上盖子，离心，250×g，1min。
(13)把QIAamp spin column放在一个新的2ml收集管上，丢弃盛有滤出液的收集管。小心打开QIAamp spin column盖子，加入500μl Buffer AW1。6000×g，离心1min。
(14)把QIAamp spin column放在一个新的2ml收集管上，丢弃盛有滤出液的收集管。小心打开QIAamp spin column盖子，加入500μl Buffer AW2。20,000×g，14000rpm，离心3min。
(15)把QIAamp spin column放在一个1.5ml离心管上，丢弃盛有滤出液的收集管。小心打开QIAamp spin column盖子，为洗提核酸，加入30μl Buffer AVE到QIAamp spin column中，4℃ 6000×g(8000rpm)离心1min。
(16)重复洗提过程，加入30μl Buffer AVE，6000×g(8000rpm)离心1min。
分别取1μl做琼脂糖凝胶电泳，检测RNA质量，并以微量核酸定量仪测定RNA浓度。立即做逆转录或者保存于-80℃。
2.轮状病毒real-time RT-PCR检测方法
(1)逆转录
按照ExScriptTM RT reagent Kit(Code：DRR035A，大连宝生物有限公司)说明书提供的参考进行逆转录反应，反应体系(10μl)如表1所示：
表1.逆转录反应体系
| 试剂 | 加样量(μL) |
| RNA | 5 |
| 5×ExScriptTM buffer | 2 |
| dNTPmix(各10mM) | 0.5 |
| 0ligo(dT)(100) | 0.5 |
| ExScriptTM RTase(200U/μl) | 0.25 |
| RNase Inhibitor(40U/μl) | 0.25 |
| RNase free dH20 | 1.5 |
| 反应总体积 | 10 |
反应条件为：42℃，15min；95℃，2min。逆转录得到的cDNA立即做real-timePCR或保存于-20℃。
(2)轮状病毒特异性引物及标准品
本研究所用的引物(在轮状病毒的VP7基因上设计)序列如表2所示：
表2.荧光定量PCR所用引物序列
| 引物名称 | 序列(5′-3′) |
| SA-11-Sense | CCTCACTTATACACTTTGCC |
| SA-11-Antisense | TTCGCTTCGTCAGTTTGCT |
扩增片段为318bp，引物由三博基因公司合成。所用的标准品质粒的制备方法为：
A.取1ml轮状病毒(滴度为104.5TCID50/ml)，按QIAampR UltraSensTM Virus Kit(Catalog no.53706，QIAGEN)的说明书提取RNA，具体步骤如前所述，获得30μlRNA。
B.按照ExScriptTM RT reagent Kit(Code：DRR035A，大连宝生物有限公司)说明书提供的参考进行逆转录反应，反应体系(10μl)，具体如前所述。
C.取逆转录的cDNA进行PCR反应，PCR反应引物为：上游引物：
CCTCACTTATACACTTTGCC，下游引物为TTCGCTTCGTCAGTTTGCT；反应体系为：总共50ul，包括cDNA 5μL(0.5ug)，dNTPmix 1μL，20μM上游引物1μL，20μM下游游引物1μL，10×PCR buffer 5μL，25mM Mg2+ 4μL，Taq酶0.5μL，ddH2O 32.5μL；
反应程序为：先95℃，预变性5min；然后94℃变性1min，59℃退火45s，72℃延伸1min，进行40个循环；最后72℃延伸10min。做2管PCR反应，获得100μL PCR反应产物。
D.取90μ LPCR产物行2％琼脂糖回收胶，利用胶回收试剂盒(Cat.：DV805A，大连宝生物有限公司)进行目的片段的回收纯化。回收纯化后取2μL进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果表明回收纯化的效果较好，PCR产物为318bp的片段，可用于T-A和其他双酶切克隆。
E.将回收纯化的目的片段和pGEM-T-easy载体连接(pGEM-T-easy载体连接试剂盒购自Invitrogen公司)，将连接产物转入大肠杆菌DH5α，挑取克隆，提取质粒进行EcoRI酶切鉴定，含有酶切得到318bp的片段的质粒的克隆即为阳性克隆，将酶切证明为阳性克隆的菌液送测序，测序结果blast比对结果证明为阳性重组体，且该重组体和GenBank中下载猴轮状病毒株SA-11的所有VP7的序列具有99％以上的同源性，即得到构建成功的标准品质粒。
F.质粒标准品的制备：进行标准品质粒的大量提取和纯化，重取纯化的质粒标准品1ul到200ul的TE缓冲液中，利用紫外分光光度测量260nm处的OD值，确定质粒标准品的纯度较好。利用DNA质量浓度＝A260×核酸稀释倍数×50/1000的公式计算质粒标准品的浓度为3.22ug/ul。质粒标准品的拷贝数为：DNA的拷贝数＝(DNA的质量/DNA的摩尔质量)×6.02×1023其中1bp＝649Da计算获得为9×1011/μL。
将质粒标准品依次稀释，使其每μl拷贝数分别为：9×109、9×108、9×107、9×106、9×105、9×104、9×103、9×102、9×101、9×100、9×10-1。分别取1μl做real-time PCR，测定结果，建立标准曲线的相关系数。
(3)轮状病毒real-time PCR
依照SYBRR Premix Ex TaqTM(Code：DRR041S，大连宝生物有限公司)说明书，荧光定量PCR的反应体系(25μl)如表3所示：
表3.荧光定量PCR的反应体系
| 试剂 | 加样量(μL) |
| cDNA | 1 |
| 2×SYBRR Premix Ex TaqTM | 12.5 |
| 20μM上游引物 | 0.25 |
| 20μM下游游引物 | 0.25 |
| dH2O | 11 |
| 反应总体积 | 25 |
反应程序如表4所示：
表4.荧光定量PCR的反应程序
| 温度/℃ | 时间 | 内容 | |
| 95 | 5min | 预变性 | |
| 95 | 5s | 变性 | 40个循环 |
| 59 | 20s | 退火 | |
| 72 | 15s | 延伸 | |
| 4 | ∞ | 保存 |
在延伸步骤采集荧光信号，根据步骤(2)建立的标准曲线计算病毒拷贝数。以RNaseH2O作为阴性对照。
二、污水或污水处理尾水中病毒浓集方法的条件优化
1、预过滤的病毒损失分析
对于生活污水，因其悬浮颗粒多，浊度高，用普通定性滤纸先预过滤。将1L生活污水滤纸截下的沉淀用酸碱洗脱法洗脱，具体方法为：用pH为3.0的H2SO4溶液(约5ml)洗去过滤得到的固体颗粒表面的阳离子，然后放入30-50ml pH为10.5的NaOH中涡旋30min。洗脱液和固体颗粒的混合物用离心分离，取上清液离心超滤至1ml，按照步骤一的方法提取RNA利用real-time RT-PCR方法检测到回收效率＜1％的病毒，考虑到酸碱洗脱法的洗脱效率低，实际浓集过程中因预过滤而损失的病毒应在14％左右。
2、添加阳离子及其浓度的优化
将(按照步骤1的方法预过滤处理后)生活污水和二级出水(生活污水二级处理后出水)各分成4组，每组1L，分别加入不同浓度(0，1，5，10mmol／L)的Al3+(加入AlCl3)，搅拌5-10min使絮体充分生成。调节pH于3.0。将约5g硅胶(100目)铺于滤纸上，放在抽滤器(装置图如图1所示，漏斗面为孔径为80微米的沙滤面，直径为10厘米，与锥形瓶的接口为磨沙接口，在实际应用中在沙滤面上平铺定性滤纸。图1中1为玻璃漏斗，2为沙滤面，3为锥形瓶，4为磨沙接口，5为真空泵接口)的布氏漏斗里，让水样通过。过滤后，收集硅胶，按照步骤1所述的酸碱洗脱法洗脱。将硅胶和洗脱液的混合物4000rpm，5min，4℃离心分离，取上清液，调节PH值为7左右，加入1ml 10×TE缓冲液。超滤至1ml，按照步骤一的方法提取RNA，利用real-time RT-PCR方法检测其回收率，结果如表5和图2所示。
从实验结果可以看出，在水样中投加Al3+能有效提高病毒的回收效率。投加1mMAl3+，调节pH为3时，回收效率最高，分别为8％和11.2％。当Al3+浓度继续增加时，二级出水中的病毒回收率反而下降，1mM为其峰值所在处，这可能是因为Al3+过多时，洗脱不易，而且形成的含有机杂质的絮体有可能干扰后续分子生物学操作；而污水中的病毒回收率增长平缓，可能是因为污水的水质条件更复杂，杂质更多。
表5.水样中阳离子浓度对病毒回收率的影响
| Al3+浓度(mM) | 污水 | 生活污水二级处理后出水 | ||||
| 1 | 2 | 平均值 | 1 | 2 | 平均值 | |
| 0 | N/A | N/A | N/A | 2.23％ | N/A | 2.23％ |
| 1 | 6.60％ | 6.60％ | 6.60％ | 3.42％ | 19.01％ | 11.22％ |
| 5 | 12.44％ | 2.57％ | 7.51％ | 2.52％ | 5.51％ | 4.01％ |
| 10 | 2.40％ | 15.69％ | 9.04％ | 4.98％ | 2.95％ | 3.96％ |
3、固体吸附颗粒材料的选择
设计实验比较三种不同的固体吸附颗粒材料(分别为200目硅胶(G200)，100目硅胶(G200)和二氧化硅颗粒(SiO2))的回收效果。它们的颗粒大小是依次增大的，而且硅胶和二氧化硅颗粒表面的光滑程度是不同的。
分别取200目硅胶(G200)，100目硅胶(G200)或二氧化硅颗粒(SiO2)各2-3g设对生活污水或二级出水进行吸附，将滤纸铺在步骤2所述的抽滤器的漏斗里(图1)，对污水进行抽率吸附过滤。
分别取按照步骤1的方法预过滤后的1L生活污水或二级出水中，分别加入1mMAl3+(加入1mM AlCl3)，调节pH为3.0，分别用上述漏斗里装有5g 200目硅胶(G200)，100目硅胶(G200)或二氧化硅颗粒(SiO2)的抽滤器，进行抽率，设两个重复(如表6所示)，抽率后，收集固体吸附颗粒材料，分别按照步骤1所述的酸碱洗脱法洗脱，洗脱后得到的液体用超滤法再浓缩至1ml，用步骤一的方法检测浓集后水样中轮状病毒拷贝数，计算其回收率。
结果如表6中所示，结果表明，回收率比较高的滤料是200目的硅胶。这可能是因为这种硅胶颗粒更精细，表面较光滑，易于洗脱。但是回收率普遍偏低(＜10％)，尤其是生活污水的回收率(＜5％)很低。可能是因为生活污水水质条件复杂，病毒可能吸附在悬浮物或胶体上，依靠改变pH值的酸碱洗脱法很难将其洗脱下来。另外，固体悬浮物及Al(OH)3絮体的混合物和硅胶难以分离，大大增加了操作难度。而且这些杂质对后续操作过程如超滤、提取RNA甚至荧光定量PCR检测有严重干扰作用。
表6.水样经不同滤料过滤后洗脱液中的病毒检出量
| 滤料种类 | 污水 | 二沉池出水 | ||||
| 重复1 | 2 | 平均值 | 1 | 2 | 平均值 | |
| G100 | 0.82％ | 0.35％ | 0.58％ | 8.95％ | 7.85％ | 8.40％ |
| G200 | 4.44％ | 3.60％ | 4.02％ | 5.56％ | 1.97％ | 3.76％ |
| SiO2 | 2.84％ | 1.72％ | 2.28％ | 5.27％ | 5.15％ | 5.21％ |
将上述固体颗粒吸附过滤后的水样调节pH为7，加入1ml 10×TE缓冲液，超滤至1ml，提取RNA后测定其中轮状病毒的含量计算其占所加入病毒总量的比率，结果如表7所示，则固体颗粒吸附率为100％-上述固体颗粒吸附过滤后的水样中的病毒占所投入病毒总量的比率，结果如图3所示，结果表明，这3种固体颗粒的吸附效率均很高，达到99.8％以上。
表7.经不同滤料过滤后的水样中病毒的含量占投入病毒量的比例
| 滤料种类 | 污水 | 二级出水 | ||||
| 1 | 2 | 平均值 | 1 | 2 | 平均值 | |
| G100 | 0.10％ | 0.02％ | 0.06％ | 0.04％ | 0.04％ | 0.04％ |
| G200 | 0.05％ | 0.03％ | 0.04％ | 0.04％ | 0.03％ | 0.04％ |
| SiO2 | 0.02％ | 0.05％ | 0.03％ | 0.04％ | 0.03％ | 0.03％ |
4、固体吸附颗粒材料的吸附方式优化
用200目硅胶作为固体吸附颗粒材料，水样条件调节为Al3+浓度为1mM，pH为3.0。分别用两种不同方式进行吸附过滤：吸附方式一是将约5g 200目硅胶铺于滤纸上，放在步骤2所述的抽滤器的漏斗里(图1)，让水样通过，效果类似于装柱；吸附方式二是将1-4g 200目硅胶投入水样中，搅拌5-10min，使病毒和固体颗粒充分接触后，用漏斗里铺有滤纸的抽滤器(图1)过滤收集。相比而言第二种操作更简单。对于同一种固体吸附颗粒来说，采用不同吸附过滤方式显然只可能对吸附效率有影响。因此，检测了水样用不同方式吸附过滤后过滤液中的病毒含量占投入病毒的量的比率，即将不同方式吸附过滤后过滤液用超滤法再浓缩至1ml，用步骤一的方法检测浓集后水样中轮状病毒拷贝数，计算其占投入病毒的比率从而计算得到不同吸附方式的吸附率。
结果如表8所示，结果表明吸附方式二吸附率略低，但相差不大，吸附效率依然很高(＞99.5％)。因为硅胶用量少，易于洗脱，操作简单，故决定采用第二种过滤方式，即采用将硅胶投入水中，搅拌5-10min，使病毒和固体颗粒充分接触，用滤纸过滤收集硅胶。从以上对不同固体吸附颗粒和吸附方式选择中可以看出，吸附效率都很高，即吸附步骤对回收效率影响不大。
表8.水样经不同吸附颗粒吸附方式的吸附率检测结果
| 吸附方式 | 污水 | 二级处理出水 | ||||||
| 1 | 2 | 平均值 | 吸附率 | 1 | 2 | 平均值 | 吸附率 | |
| 吸附方式一 | 0.05％ | 0.03％ | 0.04％ | 99.96％ | 0.04％ | 0.03％ | 0.04％ | 99.96％ |
| 吸附方式二 | 0.56％ | 0.33％ | 0.44％ | 99.56％ | 0.21％ | 0.21％ | 0.21％ | 99.79％ |
5、洗脱方法的优化
比较了四种洗脱法的洗脱效率：
(1)酸碱洗脱法：用pH为3.0的H2SO4溶液(约5m1)洗去固体颗粒表面的阳离子，然后放入30-50ml pH为10.5的NaOH中涡旋30min。洗脱液和固体颗粒的混合物用离心分离，取上清液留作超滤用。
(2)牛肉提取液洗脱法：将收集的固体颗粒放入30-50ml pH值为9.5的3％的牛肉提取液(Beef Extract)，涡旋30min。
(3)尿素-赖氨酸洗脱法：尿素-赖氨酸溶液(Urea-arginine phosphate buffer，UAPB)由以下成分组成：1.5M尿素：0.02M赖氨酸：0.008M NaH2PO4。pH值为9.0。具体方法为将收集的固体颗粒放入50ml UAPB，涡旋30min。
(4)甘氨酸-苏氨酸洗脱法：甘氨酸和苏氨酸浓度分别为0.5mM，调节pH值为10。将收集的固体颗粒放入50ml溶液中，涡旋30min。
将分别取1L生活污水水样调节至Al3+含量为1mM，选硅胶(100目)为滤料，按照步骤4所述吸附方式二所述方法进行吸附过滤，将吸附的硅胶颗粒分别用四种洗脱方法洗脱。将洗脱液进行浓缩，除了第二种洗脱方法得到的洗脱液用有机絮凝法(将洗脱液pH调节为3.5，缓慢搅拌20min，至有沉淀出现，离心，收集沉淀，溶解于加入Na2HPO4溶液，超滤至1ml)，其它均用将洗脱液直接超滤至1ml后，提取RNA，利用real-time RT-PCR方法测其回收率。设置两个重复。
结果如表9所示，从实验结果表9中可以看出，利用尿素-赖氨酸洗脱法的回收率最高，而且重复性较好，平均值为27％；其次是甘氨酸-苏氨酸洗脱法，在10~15％之间；牛肉提取液的回收效率是最低的，仅为5.21％。而且，牛肉提取液中含有的丰富有机物使得洗脱液变得混浊，使超滤再浓缩过程非常困难，而且其中的杂质对后续分子生物学操作有很大的抑制作用。实验结果表明传统的牛肉提取液洗脱法和Katayama提出的酸碱洗脱法，并不适用于浊度高、杂质多的二级出水和城市生活污水。
表9.水样经不同滤料过滤后洗脱液中的病毒检出量
| 重复1 | 重复2 | 平均值 | |
| 酸碱洗脱法 | 5.27％ | 5.15％ | 5.21％ |
| 牛肉提取液洗脱法 | 1.12％ | 0.41％ | 0.76％ |
| 尿素-赖氨酸洗脱法 | 30.65％ | 23.78％ | 27.21％ |
| 甘氨酸-苏氨酸洗脱法 | 17.54％ | 9.57％ | 13.56％ |
6、洗脱液再浓缩方法的选择
实验中采用超滤法浓缩洗脱液，即在超滤管中加入待超滤的洗脱液，离心，收集浓缩后的溶液。在步骤5中所述采用牛肉提取液洗脱时，洗脱液中的胶体太多，超滤十分不易，故采用有机絮凝法。方法如下：将洗脱液pH调节为3.5，缓慢搅拌20min，至有沉淀出现，离心，收集沉淀，溶解于加入Na2HPO4溶液，超滤后待用。
这种方法在步骤3中，已经证实超滤再浓集的回收效率几乎达100％。从表9中可以看出，利用有机絮凝法再浓集其中的病毒，最后的病毒回收率十分低(＜2％)。这可能是由于洗脱效率过低引起的，可能是在洗脱液再浓缩时损失了很多病毒，也有可能是牛肉提取液浓缩后含有的大量有机物质对后续分析产生了干扰，而引起偏差。显然，与超滤法相比，这种方法的可行性不高。
三、污水和污水处理厂尾水中病毒浓集方法的建立
综上所述，每1L污水的浓集方法的主要步骤为：
(1)取生活污水(对于生活污水，因其悬浮颗粒多，浊度高，用普通定性滤纸先预过滤，取滤液进行处理)或污水处理厂尾水1L，水样中加入Al3+至最终浓度为1mM，搅拌5-10min。
(2)加入1-2g 200目的硅胶颗粒，搅拌5-10min。
(3)用定性滤纸过滤水样，用约5ml的pH＝3.0的H2SO4溶液冲洗硅胶，然后收集硅胶颗粒。
(4)将硅胶颗粒放入约50ml pH＝9.0的尿素-赖氨酸缓冲液(1.5M尿素：0.02M赖氨酸：0.008M NaH2PO4，PH值为9.0)中，振荡涡漩20-30min。
(5)离心分离固体颗粒和洗脱液的混合物，收集上清液，加入1ml 50×TE缓冲液，调pH为7.0，然后超滤至1ml得到浓集了污水中病毒的溶液。
用该方法对1L上述投入纯培养轮状病毒的生活污水或生活污水二级出水作为样品进行病毒浓集，浓集后的样品进行检测病毒拷贝数，病毒回收率＝(检测出轮状病毒的拷贝数/投加到水样中轮状病毒的拷贝数)×100％。设置3个重复，结果表明本发明的方法的浓集生活污水中轮状病毒的效率为21％，误差范围为7％；本发明的方法的浓集生活污水二级出水中轮状病毒的效率为27％，误差范围为4.5％。
实施例2、污水或污水处理厂尾水中病毒浓集方法的效果鉴定
1.水样采集方法
采样用塑料样品瓶，取水时尽量减少与空气接触时间，用手握住样品瓶底部，将瓶迅速浸入水面下，然后将瓶口转向水流方向，待水样充满至瓶体积2/3时，在水中塞上瓶盖，取出水面。将取回的水样保存于4℃冰箱中，尽快完成实验操作。
2.实际水样采集地点及取样体积
实际水样的监测地点包括：北京市Q污水处理厂(进水、二级出水和再生水)、G污水处理厂(进水、二级出水和再生水)、X污水处理厂(进水和二级出水)和昆运河某两处水样。
其中，进水(初沉池后面)取样体积为10L，二级出水、再生水和地表水各取20L。
3.常规水质指标检测方法检测如下指标：
(1)化学需氧量：COD
(2)总氮含量：TN
(3)总磷含量：TP
(4)氨氮含量：NH3-N
(5)正磷含量：OP
以上指标根据标准方法测定，结果见表12。
表12实际水样水质参数列表
| 来源 | 时间 | 水样编号 | 水样种类 | 水质参数(mg/L) | ||||
| COD | TN | NH3-N | TP | OP | ||||
| Q污水处理厂 | 3月 | 1 | 进水 | 268.19 | 63.32 | 38.76 | 5.57 | 3.37 |
| 2 | 二级出水 | 55.45 | 27.43 | 17.36 | 0.42 | 0.21 | ||
| 3 | 再生水 | 40.09 | 19.39 | 0.05 | 1.19 | 0.57 | ||
| Q污水处理厂 | 4月 | 4 | 进水 | 314.94 | 42.47 | 36.30 | 6.64 | 0.82 |
| 5 | 二级出水 | 62.16 | 14.04 | 0.13 | 0.15 | 0.03 | ||
| 6 | 再生水 | 37.30 | 15.79 | 0.15 | 0.29 | 0.03 | ||
| Q污水处理厂 | 5月 | 7 | 进水 | 223.07 | 50.04 | 50.88 | 5.01 | 4.55 |
| 8 | 二级出水 | 46.15 | 16.61 | 2.16 | 1.27 | 1.07 | ||
| 9 | 再生水 | 38.46 | 19.51 | 0.07 | 1.38 | 1.14 | ||
| G污水处理厂 | 5月 | 10 | 进水 | 207.68 | 58.57 | 55.38 | 5.87 | 5.61 |
| 11 | 二级出水 | 42.31 | 38.07 | 4.31 | 4.47 | 5.20 | ||
| 12 | 再生水 | 46.15 | 36.68 | 1.13 | 2.56 | 2.27 | ||
| X污水处理厂 | 5月 | 13 | 进水 | 276.91 | 60.73 | 55.55 | 6.50 | 2 97 |
| 14 | 二级出水 | 42.31 | 16.49 | 2.35 | 2.94 | 2.86 | ||
| 实验室生活污水 | 5月 | 15 | 生活污水 | 239.41 | 62.03 | 53.36 | 7.00 | 3.22 |
| 昆运河颐和园处 | 5月 | 16 | 地表水 | 13.09 | 1.18 | 0.12 | 0.00 | 0.00 |
| 昆运河紫竹院处 | 5月 | 17 | 地表水 | 7.48 | 2.53 | 0.60 | 0.03 | 0.01 |
4.水样浓集方法
分别取表12所示的污水，其中生活污水10L，污水厂二级出水20L和再生水20L，地表水20L，将这些水样进行如下处理：
(1)加入AlCl3至最终浓度为1mM，搅拌5-10min，将pH值调节至3.0。
(2)分别加入1g/L污水(生活污水10g，二级出水、再生水或地表水20g)200目的硅胶颗粒，搅拌10-20min。
(3)用定性滤纸过滤水样，每1g硅胶用10ml的pH＝3.0的H2SO4溶液冲洗硅胶，然后收集硅胶颗粒。
(4)将硅胶颗粒放入pH＝9.0的尿素-赖氨酸缓冲液(1.5M尿素：0.02M赖氨酸：0.008M NaH2PO4，PH值为9.0)中，每1g硅胶颗粒用10ml尿素-赖氨酸缓冲液，振荡涡漩20-30min。
(5)离心分离固体颗粒和洗脱液液的混合物，收集上清液，加入1ml 50×TE缓冲液/50ml尿素-赖氨酸缓冲液，调pH为7.0，然后超滤至2ml。
(6)取其中1ml浓缩液感染细胞MA-104后，提取细胞RNA。
(7)另外1ml直接提取病毒RNA，进行real-time RT-PCR扩增(见实施例1)。
5.RT-PCR方法直接测定水样中的病毒
(1)逆转录
按照ExScriptTM RT reagent Kit(Code：DRR035A)说明书提供的参考进行逆转录反应，反应体系(10μl)为：
表13逆转录反应体系
| 试剂 | 加样量(μL) |
| RNA | 5 |
| 5×ExScriptTM buffer | 2 |
| dNTPmix(各10mM) | 0.5 |
| Oligo(dT)(100) | 0.5 |
| ExScriptTM RTase(200U/μl) | 0.25 |
| RNase Inhibitor(40U/μl) | 0.25 |
| RNase free dH2O | 1.5 |
| 反应总体积 | 10 |
可根据需要相应放大反应体系。反应条件为：42℃，15min；95℃，2min。逆转录得到的cDNA立即做real-time PCR反应或保存于-20℃。
(2)几种水中常见病毒特异性引物
针对典型病毒设计的引物如表14所示：
表14实际水样检测中PCR扩增所用引物
| 编号 | 病毒 | 引物名称 | 序列5’-3’ | 产物 |
| 长度(bp) | ||||
| A | RV-SA-11 | RV vp7s | GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG | 318 |
| RV vp7anti | GATCCTGTTGGCCATCC | |||
| B | RV-Wa | RV Vp4S | TGGCTTCGCCATTTTATAGACA | 398 |
| RV Vp4 anti | ATTTCGGACCATTTATAACC | |||
| C | HAV | HAV-S | GTTTTGCTCCTCTTTACCATGCTATG | 230 |
| HAV-Anti | GGAAATGTCTCAGGTACTTTCTTTG | |||
| D | Entervirus | EnV-S | CGGTACCTTTGTGCGCCTGT | 415 |
| EnV-Anti | TTAGGATTAGCCGCATTCAG | |||
| E | AdenovirusHexon | AdVP1 | GCCCGAGTGGTCTTACATGCACATC | 301 |
| AdVP2 | CAGCACGCCGCGGATGTCAAAGT | |||
| AdVP3 | GCCACCGAGACGTACTTCAGCCTG | 161 | ||
| AdVP4 | TTGTACGAGTACGCGGTATCCTCGCGGTC | |||
| F | NV-GI | NVG1-S | YTTYTCHTTYTAYGGKGATGATGA | 450 |
| NVG1-Anti | GAASCGCATCCARCGGAACA |
| G | NV-GII | NVGII-S | CARYGGAACTCCAYYRCCCACTG | 574 |
| NVGII-Anti | TGCGATCGCCCTCCCAYGTG |
(3)PCR扩增
反应体系如表15所示：
表15.PCR的反应体系
| 试剂 | 加样量(μL) |
| cDNA | 2 |
| dNTPmix | 0.5 |
| 20μM上游引物 | 0.5 |
| 20μM下游游引物 | 0.5 |
| 10×PCR buffer | 2 |
| 25mM Mg2+ | 1.6 |
| Taq酶 | 0.3 |
| dH2O | 12.6 |
| 反应总体积 | 20 |
反应程序如表16所示：
表16.PCR的反应程序
| 温度/℃ | 时间 | 内容 | |
| 95 | 3min | 预变性 | |
| 94 | 1min | 变性 | 重复40个循环 |
| 55 | 45s | 退火 | |
| 72 | 1min | 延伸 | |
| 72 | 10min | 延伸 | |
反应结束后，将样品做凝胶电泳。图4-9所示为凝胶电泳照片，照片中字母A-G代表七种病毒(如表14所示)，1-17代表水样编号，见表12。
RT-PCR结果如图4-9所示，从RT-PCR结果可以看出，水样经浓缩后利用RT-PCR直接检测，在Q污水处理厂5月进水(图6中A7)、二级出水(图6中A8)，X污水处理厂5月进水(图8中A13)、二级出水(图8中A14)和实验室生活污水(图8种A15)中检出轮状病毒RV-SA-11；在X污水处理厂5月进水(图8中B13)中检测出有人轮状病毒RV-Wa；在颐和园地表水中检出了诺沃克病毒(NV-GII)(图4.7中A7)。
上述实验结果表明，本发明的浓集方法能有效浓集水样痕量病毒，在17个水样中，检测病毒呈阳性的有5个，检测出有轮状病毒和诺瓦克病毒存在，特别是在小红门污水厂进水中，检测出有人轮状病毒存在。
6.用ICC-RT-PCR测定水中具有感染性的病毒
(1)细胞感染方法
(a)将浓集后1ml水样用0.2μm的滤膜过滤除菌。
(b)在除菌后的水样中加入100μl浓度为0.002％的胰酶，37℃孵育1h。
(c)取一瓶(25cm2)生长至单层的MA-104细胞(ATCC，美国细胞典藏中心，保藏号为ATCC CRL-2378.1)，去掉培养基，用pH为7.2的无菌PBS洗一次，加入37℃孵育后的水样和1ml无血清DMEM培养基(购自Hyclone公司)。37℃，5％CO2孵育1.5～2h，每20min平摇一次，以便病毒充分进入细胞。
(d)孵育1.5～2h后，去掉水样和无血清DMEM培养基，加入4ml含有2％胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养2～3天。
(e)培养2天后，观察细胞病变情况。完全去掉上清，加入1ml Trizol，充分混匀，用于细胞总RNA提取。
(2).Trizol法提取细胞总RNA
(a)去掉细胞上清液，加入1ml Trizol，平摇5min，使之与细胞充分混匀。
(b)收集1ml Trizol充分混匀的细胞液体于1.5ml的eppendorf管中，室温放置10min。
(c)加入200ul的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管(溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象)，室温放置10min。
(d)离心4℃、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管(切忌吸动白色中间相)。
(e)加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。
(f)离心4℃、13000r/min、15min，(这时会发现靠近管底的壁上有一星点的白色沉淀物，就是它了)用移液器小心吸去所有上清。
(g)1ml 75％乙醇洗一遍，离心4℃、8000r/min、10min，用移液器小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min。
(h)加入20μl DEPC处理水。
立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后冻存于-70℃，可保存一年；若加入DEPC水后则只能在-20℃保存1个月左右。
同时直接将浓集水样提取RNA后，用RT-PCR检测病毒，作为对照。
ICC-RT-PCR实验结果如图10所示，直接用RT-PCR实验结果如图11所示，图10和图11中照片中字母A-G代表七种病毒(如表14所示)，1-17代表水样编号，见表12。
从图中可以看出，Q污水处理厂3月水样经浓缩后利用细胞感染和RT-PCR结合的技术，在进水(图10中G1)和出水(图10中G2)中检测出诺沃克病毒(NV-GII)，在出水中检测出甲型肝炎病毒HAV(图10中C2)。但是这三个水样直接利用RT-PCR方法没有检测出任何病毒(图11)，本研究结果表明ICC-RT-PCR方法比直接利用RT-PCR方法灵敏，而且，本研究结果表明，在清河污水处理厂3月份的进水、二级出水和再生水中都存在一定浓度的具有感染性的甲型肝炎病毒和诺沃克病毒。
Claims (10)
1.一种浓集污水或污水处理厂尾水中病毒的方法，包括以下步骤：
1)调节水样条件：取污水或污水处理厂尾水水样，加入Al3+，使Al3+终浓度为0.5-1mol/L，将pH值调节至3.0-3.5；
2)吸附：在步骤1)的水样中，加入硅胶颗粒，搅拌吸附；
3)洗脱：收集步骤2)吸附后的硅胶，用pH3.0-3.5的H2SO4溶液冲洗后，放入pH值为9.0-9.5的尿素-赖氨酸缓冲液中振荡涡漩，离心收集上清液得到洗脱液；
4)洗脱液浓缩：将步骤3)得到的洗脱液超滤浓缩得到浓缩了病毒的污水样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，Al3+终浓度为1mol/L，所述Al3+是通过AlCl3加入的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，将污水或污水处理厂尾水的pH值调节至3.0。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述硅胶颗粒的粒径为200目，所述硅胶颗粒的添加量为1-4g/L污水或污水处理厂尾水，优选为1g/L污水或污水处理厂尾水。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述搅拌吸附的时间为10-20分钟。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，收集步骤2)吸附后的硅胶是用滤纸过滤收集，所述滤纸优选为定性滤纸；所述尿素-赖氨酸缓冲液为的pH值为9.0；所述冲洗用H2SO4溶液pH值为3.0，所述H2SO4溶液的用量为10-20ml/g硅胶颗粒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，尿素-赖氨酸缓冲液的用量为20-30ml/g硅胶颗粒；所述振荡涡漩的时间为20-30分钟。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中还包括在洗脱液超滤前先每50ml尿素-赖氨酸缓冲液加入1ml 50×TE缓冲液，并调水样pH为7.0。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述超滤后每1L污水或污水处理厂尾水水样浓缩至0.1-1.5ml。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：当所述污水为生活污水时，所述步骤1)中，还包括将所述污水在调节水样前进行过滤。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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