CN117230057A - 一种裂解液和核酸提取试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种裂解液和核酸提取试剂盒，本发明能够提高核酸提取效率，稳定提高核酸提取纯度。所述裂解液包括脱氧胆酸钠、盐酸胍、三氟乙酸银、非离子表面活性剂和缓冲液。所述酸提取试剂盒包括所述裂解液、所述核酸提取试剂盒还包括磁珠、结合液、富集液、清洗液I、清洗液II和洗脱液。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种裂解液和核酸提取试剂盒。
背景技术
在分子生物学实验中，核酸提取是一项最基本且最重要的环节，核酸提取的产量、纯度及完整性直接关系到下游核酸检测、生物学研究或其他新产品开发的成败。磁珠法核酸提取方法是指以超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠(以下简称磁珠)为载体，通过磁珠在高盐溶液中吸附核酸，经过磁性分离和漂洗杂质后，在低盐溶液中核酸从磁珠表面解吸附的原理进行核酸提取的方法。该方法不需离心，操作简单，便于高通量、自动化操作，可以使核酸提取效率显著升高，已成为目前新兴的核酸提取技术。
目前基因组DNA提取纯化的方法有很多种，如苯酚氯仿抽提法、SDS法、离心柱法等，但上述方法存在提取试剂有毒，操作繁琐，易导致污染等问题，而磁珠法不使用有毒试剂，操作简单，不易污染，已经成为目前分子生物学和临床检验医学研究的理想方法。
发明内容
本发明提供一种裂解液和核酸提取试剂盒，能够提高核酸提取效率，稳定提高核酸提取纯度。
本发明中的裂解液包括脱氧胆酸钠、盐酸胍、三氟乙酸银、非离子表面活性剂和缓冲液。其中，非离子表面活性剂可以从聚氧乙烯蓖麻油、烷基苯磺酸钠、NP-40、Tween-20、Triton-X100中选择单一一种或者自由组合选择；缓冲液可以选择pH7.0～8.0的Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液。
本发明提供一种裂解液，其组分和含量为：脱氧胆酸钠3～6mol/L、盐酸胍4～6mmol/L、三氟乙酸银3～5mmol/L、非离子表面活性剂2％～8％和缓冲液0.04～0.05mol/L。一种优选的技术方案中，裂解液的组分和含量为：脱氧胆酸钠3～6mol/L、盐酸胍4～6mmol/L、三氟乙酸银3～5mmol/L、聚氧乙烯蓖麻油2％～8％和磷酸缓冲液0.04～0.05mol/L。
本发明中，使用脱氧胆酸钠和三氟乙酸银可以更高效破坏细胞膜结构，并更加高效、快速地释放核酸，缩短提取时间，增加裂解效率，从而增加核酸提取量。另外，在使用聚氧乙烯蓖麻油作为非离子型表面活性剂的技术方案中，聚氧乙烯蓖麻油可以在裂解的过程中更好地降低干扰物质含量。
本发明还提供一种核酸提取试剂盒，所述试剂盒包括所述裂解液，还包括磁珠、结合液、富集液、清洗液I、清洗液II和洗脱液，应用所述试剂盒实现核酸提取。
本发明提供一种技术方案，所述结合液包括以下成分和含量：葡萄糖10％-20％，异丙醇50％，EDTA0.5mol/L～3mol/L，缓冲液0.04mol/L～0.05mol/L，氯化钠0.02mol/L；所述富集液包括以下成分和含量：醋酸钠0.5mmol/L-5mmol/L，无水乙醇70％；所述清洗液I包括以下成分和含量：盐酸胍1mol/～6mol/L，洋地黄皂苷3mmol/L～6mmol/L，对二乙胺苯甲酸0.5mol/L～3mol/L，非离子表面活性剂0.1％～0.5％，缓冲液0.04mol/L～0.05mol/L，氯化钠1mmol/L-3mmol/L；所述洗脱液包括以下成分和含量：缓冲液0.04mol/L～0.05mol/L，EDTA0.004mol/L～0.04mol/L。此技术方案中，缓冲液可以选择pH7.0～8.0的Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液，非离子表面活性剂可以从聚氧乙烯蓖麻油、烷基苯磺酸钠、NP-40、Tween-20、Triton-X100中选择单一一种或者自由组合选择。需要说明的是，本发明中列举的多个缓冲液和非离子表面活性剂的例子仅为说明性内容，而不应理解为对本发明的限制。
本发明提供一种优选的技术方案，所述结合液还包括聚氧乙烯蓖麻油。聚氧乙烯蓖麻油作为结合液的成分，在裂解富集的过程中，可以更好地降低干扰物质的含量，从而提高核酸纯度。
所述试剂盒中的所述磁珠的粒径在500nm～2000nm之间。本领域技术人员应当理解，本发明中所述磁珠为超顺磁性氧化硅纳米磁性微珠。
本发明还提供一种技术方案，所述试剂盒用于血斑中核酸的提取，所述试剂盒应用于血斑中核酸的提取能够提高核酸提取效率，稳定提高核酸提取纯度。本领域技术人员应当理解，血斑为血凝固后的状态，血斑的样品形成有多种情况，例如将全血滴加在滤纸片上，自然干燥后得到的干血斑；或者是在法医物证检验中遇到的检测项目均涉及到血斑。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、使用脱氧胆酸钠和三氟乙酸银可以更高效破坏细胞膜结构，并更加高效、快速的释放核酸，缩短提取时间，增加裂解效率，从而增加核酸提取量。
2、聚氧乙烯蓖麻油是一种非离子型表面活性剂，具有优良的洗净性、抗静电性、热稳定性等并且优于一般阴离子表面活性剂的耐碱性、耐电解质性，可以更好地降低干扰物质含量，提高核酸纯度。
3、核酸提取过程中，磁珠预封装进入裂解液中，裂解与结合步骤一步完成，从而使本发明在自动化应用时每一步骤的反应试剂可以预先灌装入对应的反应仓内，使用时只需将样本加入指定反应板，即可放入仪器中开始提取操作。因此本发明更适用于全自动核酸提取应用。
4、不使用酚、氯仿等有毒试剂，降低对环境以及操作人员的危害。
附图说明
图1为本发明实施例中琼脂糖凝胶电泳结果示意图；
具体实施方式
下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明。需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明一种裂解液和核酸提取试剂盒的进步性能显著地体现，以下通过实施例对本发明的实施进行举例说明。
实施例1，本实施例中裂解液的组成和含量为：脱氧胆酸钠3mol/L，盐酸胍4mmol/L，三氟乙酸银5mmol/L，聚氧乙烯蓖麻油4％，磷酸缓冲液0.04mol/L。
本实施例中结合液的成分和含量如下：葡萄糖15％，异丙醇50％，EDTA2mol/L，聚氧乙烯蓖麻油0.05mol/L，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.04mol/L，氯化钠0.02mol/L。
富集液的成分和含量如下：醋酸钠3mmol/L，无水乙醇70％。
清洗液I的成分和含量如下：盐酸胍3mol/L，洋地黄皂苷3mmol/L，对二乙胺苯甲酸0.5mol/L，烷基苯磺酸钠0.3％，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.04 mol/L，氯化钠1mmol/L。
清洗液II为75％乙醇。
洗脱液的成分和含量如下：pH7.0～8.0的Tris-HCl0.05 mol/L，EDTA0.02mol/L。
本实施例中磁珠为购自洛阳吉恩特生物科技有限公司的GNT-104核酸提取磁珠。磁珠粒径为500nm，浓度为50mg/ml。
实施例2，本实施例中裂解液的组成和含量为：脱氧胆酸钠3mol/L，盐酸胍4mmol/L，三氟乙酸银3mmol/L，聚氧乙烯蓖麻油4％，磷酸缓冲液0.04mol/L。
本实施例中结合液的成分和含量如下：葡萄糖15％，异丙醇50％，EDTA2mol/L，聚氧乙烯蓖麻油0.05mol/L，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.04mol/L，氯化钠0.02mol/L。
富集液的成分和含量如下：醋酸钠3mmol/L，无水乙醇70％。
清洗液I的成分和含量如下：盐酸胍3mol/L，洋地黄皂苷3mmol/L，对二乙胺苯甲酸0.5mol/L，烷基苯磺酸钠0.3％，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.04 mol/L，氯化钠1mmol/L。
清洗液II为75％乙醇。
洗脱液的成分和含量如下：pH7.0～8.0的Tris-HCl0.05 mol/L，EDTA0.02mol/L。
本实施例中磁珠为购自洛阳吉恩特生物科技有限公司的GNT-104核酸提取磁珠。磁珠粒径为500nm，浓度为50mg/ml。
实施例3，本实施例中裂解液的组成和含量为：脱氧胆酸钠6mol/L，盐酸胍4mmol/L，三氟乙酸银5mmol/L，聚氧乙烯蓖麻油8％，磷酸缓冲液0.04mol/L。
本实施例中结合液的成分和含量如下：葡萄糖15％，异丙醇50％，EDTA2mol/L，聚氧乙烯蓖麻油0.05mol/L，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.04mol/L，氯化钠0.02mol/L。
富集液的成分和含量如下：醋酸钠3mmol/L，无水乙醇70％。
清洗液I的成分和含量如下：盐酸胍3mol/L，洋地黄皂苷3mmol/L，对二乙胺苯甲酸0.5mol/L，烷基苯磺酸钠0.3％，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.04 mol/L，氯化钠1mmol/L。
清洗液II为75％乙醇。
洗脱液的成分和含量如下：pH7.0～8.0的Tris-HCl0.05 mol/L，EDTA0.02mol/L。
本实施例中磁珠为购自洛阳吉恩特生物科技有限公司的GNT-104核酸提取磁珠。磁珠粒径为500nm，浓度为50mg/ml。
实施例4，本实施例中裂解液的组成和含量为：脱氧胆酸钠3mol/L，盐酸胍4mmol/L，三氟乙酸银5mmol/L，聚氧乙烯蓖麻油2％，磷酸缓冲液0.04mol/L。
本实施例中结合液的成分和含量如下：葡萄糖15％，异丙醇50％，EDTA2mol/L，聚氧乙烯蓖麻油0.05mol/L，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.04mol/L，氯化钠0.02mol/L。
富集液的成分和含量如下：醋酸钠3mmol/L，无水乙醇70％。
清洗液I的成分和含量如下：盐酸胍3mol/L，洋地黄皂苷3mmol/L，对二乙胺苯甲酸0.5mol/L，烷基苯磺酸钠0.3％，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.04 mol/L，氯化钠1mmol/L。
清洗液II为75％乙醇。
洗脱液的成分和含量如下：pH7.0～8.0的Tris-HCl0.05 mol/L，EDTA0.02mol/L。
本实施例中磁珠为购自洛阳吉恩特生物科技有限公司的GNT-104核酸提取磁珠。磁珠粒径为500nm，浓度为50mg/ml。
实施例5，本实施例中裂解液的组成和含量为：脱氧胆酸钠3mol/L，盐酸胍4mmol/L，三氟乙酸银3mmol/L，聚氧乙烯蓖麻油8％，磷酸缓冲液0.04mol/L。
本实施例中结合液的成分和含量如下：葡萄糖15％，异丙醇50％，EDTA2mol/L，聚氧乙烯蓖麻油0.05mol/L，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.04mol/L，氯化钠0.02mol/L。
富集液的成分和含量如下：醋酸钠3mmol/L，无水乙醇70％。
清洗液I的成分和含量如下：盐酸胍3mol/L，洋地黄皂苷3mmol/L，对二乙胺苯甲酸0.5mol/L，烷基苯磺酸钠0.3％，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.04 mol/L，氯化钠1mmol/L。
清洗液II为75％乙醇。
洗脱液的成分和含量如下：pH7.0～8.0的Tris-HCl0.05 mol/L，EDTA0.02mol/L。
本实施例中磁珠为购自洛阳吉恩特生物科技有限公司的GNT-104核酸提取磁珠。磁珠粒径为500nm，浓度为50mg/ml。
实施例6，本实施例中裂解液的组成和含量为：脱氧胆酸钠5mol/L，盐酸胍5mmol/L，三氟乙酸银4mmol/L，聚氧乙烯蓖麻油5％，磷酸缓冲液0.05mol/L。
本实施例中结合液的成分和含量如下：葡萄糖20％，异丙醇50％，EDTA3mol/L，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.05mol/L，氯化钠0.02mol/L。
富集液的成分和含量如下：醋酸钠5mmol/L，无水乙醇70％。
清洗液I的成分和含量如下：盐酸胍6mol/L，洋地黄皂苷6mmol/L，对二乙胺苯甲酸3mol/L，烷基苯磺酸钠0.5％，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.05 mol/L，氯化钠3mmol/L。
清洗液II为75％乙醇。
洗脱液的成分和含量如下：pH7.0～8.0的Tris-HCl0.04mol/L，EDTA0.04mol/L。
本实施例中磁珠为购自洛阳吉恩特生物科技有限公司的GNT-104核酸提取磁珠。磁珠粒径为500nm，浓度为50mg/ml。
实施例7，本实施例中裂解液的组成和含量为：脱氧胆酸钠5mol/L，盐酸胍6mmol/L，三氟乙酸银4mmol/L，聚氧乙烯蓖麻油4％，磷酸缓冲液0.045mol/L。
本实施例中结合液的成分和含量如下：葡萄糖10％，异丙醇50％，EDTA0.5mol/L，聚氧乙烯蓖麻油0.05mol/L，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.045mol/L，氯化钠0.02mol/L。
富集液的成分和含量如下：醋酸钠0.5mmol/L，无水乙醇70％。
清洗液I的成分和含量如下：盐酸胍1mol/L，洋地黄皂苷5mmol/L，对二乙胺苯甲酸2mol/L，烷基苯磺酸钠0.1％，pH7.0～8.0的Tris-HCl0.045 mol/L，氯化钠2mmol/L。
清洗液II为75％乙醇。
洗脱液的成分和含量如下：pH7.0～8.0的Tris-HCl0.045mol/L，EDTA0.004mol/L。
本实施例中磁珠为购自洛阳吉恩特生物科技有限公司的GNT-104核酸提取磁珠。磁珠粒径为500nm，浓度为50mg/ml。
实施例8，本实施例中各组分的成分与含量与实施例2的区别之处在于，本实施例中无聚氧乙烯蓖麻油，裂解液中NP-40的含量为2％，Tween-20的含量为2％，其余组分和含量与实施例2相同。
实施例9，本实施例中各组分的成分与含量与实施例2的区别之处在于，本实施例中无聚氧乙烯蓖麻油，裂解液中烷基苯磺酸钠的含量为3％，Triton-X100的含量为1％，其余组分和含量与实施例2相同。
实施例10，本实施例中各组分的成分与含量与实施例2的区别之处在于，本实施例中无聚氧乙烯蓖麻油，裂解液中烷基苯磺酸钠的含量为1％，NP-40的含量为2％，Triton-X100的含量为1％，其余组分和含量与实施例2相同。
实施例11，本实施例中各组分的成分与含量与实施例2的区别之处在于，本实施例中无聚氧乙烯蓖麻油，裂解液中烷基苯磺酸钠的含量为4％，其余组分和含量与实施例2相同。
实施例12，本实施例中各组分的成分与含量与实施例2的区别之处在于，本实施例中无聚氧乙烯蓖麻油，裂解液中NP-40的含量为6％，其余组分和含量与实施例2相同。
实施例13，本实施例中各组分的成分与含量与实施例2的区别之处在于，本实施例中无聚氧乙烯蓖麻油，裂解液中Tween-20的含量为5％，其余组分和含量与实施例2相同。
实施例14，本实施例中各组分的成分与含量与实施例2的区别之处在于，本实施例中无聚氧乙烯蓖麻油，裂解液中Triton-X100的含量为5％，其余组分和含量与实施例2相同。
对比例1，对比例1中各组分的成分与含量与实施例3的区别之处在于，对比例1中脱氧胆酸钠含量为0，其余组分和含量相同。
对比例2，对比例2中各组分的成分与含量与实施例3的区别之处在于，对比例2中裂解液中聚氧乙烯蓖麻油含量为0，结合液中聚氧乙烯蓖麻油含量为0，其余组分与含量相同。
核酸提取试剂盒的使用方法：样品应用本发明中裂解液和试剂盒进行核酸提取实验，本实验选用博科公司BNP32核酸提取仪来对血斑中的核酸进行提取，具体实验步骤如下：
取3片6mm*6mm的血片样品，磁珠预封装加入本实施例中的裂解液中，再将血片样品进行处理，然后取处理过后的上清液加入到预分装的96深孔板中。按以下表格表1预分装试剂：
表1预分装试剂表
分别添加600ul处理后的上清液到A1～H1/A7～H7孔中，使用博科公司的BNP32核酸提取仪。提取程序如下表表2所示：
表2提取程序表
提取完成后，取A5～H5/A11～H11相应孔位的洗脱液得到血斑基因组DNA。按照设备说明书相关说明进行相应操作提取，提取后的实验组的血斑基因组DNA吸取到1.5ml离心管中备用。
实施例1-5、对比例1-2按照上述方法对同一批样本进行核酸提取，得实验组1-5和对照组1-2。
取实验组1-5和对照组1-2用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，其中，琼脂糖购自全式金(货号GS201-01)，荧光核酸染色试剂购自全式金(货号GS101-01)，Marker，购自全式金(货号BM311-01)，电压200V，电流150mA，运行45min。得到如图1所示的电泳结果示意图。如图1所示，图1中从左至右为7个孔道，依次为对照组1孔道、对照组2通道、实验组1的孔道、实验组2的孔道、实验组3的孔道、实验组4的孔道和实验组5的孔道，实验组3条带亮度明显为最亮的，对照组1条带亮度为最暗的，对比例2和实施例1-5的反应条件中均有脱氧胆酸钠参与裂解过程，得到的产物中核酸浓度更高。
另外，取实验组1-5各5份样品和对照组1-2各5份样品提进行紫外分光光度计测量，得到表3-9所示结果。
表3(对照组1)
表4(对照组2)
表5(实验组1)
表6(实验组2)
表7(实验组3)
表8(实验组4)
表9(实验组5)
结果分析：如表1-表7所示，对照组1和实验组3的反应条件的区别在于，对照组1的反应中无脱氧胆酸钠参与，结果显示，实验组3产物的浓度较对照组1的浓度高，脱氧胆酸钠能够提高裂解效率，从而增大核酸提取量；对照组2和实验组3的反应条件的区别在于，对照组1的反应中聚氧乙烯蓖麻油含量为0，结果显示，对照组2中A260/280的值均小于1.80，对照组的产物中含有杂质，实施例3中A260/280的值均接近于1.80，五组数据均值为1.804，结果表明聚氧乙烯蓖麻油的存在，可以更好地降低干扰物质含量，提高核酸纯度。
Claims (9)
1.一种裂解液，其特征在于，所述裂解液包括脱氧胆酸钠、盐酸胍、三氟乙酸银、非离子表面活性剂和缓冲液。
2.根据权利要求1所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液的成分和含量如下：脱氧胆酸钠3～6mol/L、盐酸胍4～6mmol/L、三氟乙酸银3～5mmol/L、非离子表面活性剂2％～8％和缓冲液0.04～0.05mol/L。
3.根据权利要求1或2所述的裂解液，其特征在于，所述非离子表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油、烷基苯磺酸钠、NP-40、Tween-20、Triton-X100中的一种、两种或多种。
4.一种核酸提取试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的裂解液，所述试剂盒还包括磁珠、结合液、富集液、清洗液I、清洗液II和洗脱液。
5.根据权利要求4所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述结合液包括以下成分和含量：葡萄糖10％-20％，异丙醇50％，EDTA0.5mol/L～3mol/L，缓冲液0.04mol/L～0.05mol/L，氯化钠0.02mol/L；所述富集液包括以下成分和含量：醋酸钠0.5mmol/L-5mmol/L，无水乙醇70％。
6.根据权利要求5所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述结合液还包括聚氧乙烯蓖麻油。
7.根据权利要求5所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述清洗液I包括以下成分和含量：盐酸胍1mol/～6mol/L，洋地黄皂苷3mmol/L～6mmol/L，对二乙胺苯甲酸0.5mol/L～3mol/L，非离子表面活性剂0.1％～0.5％，缓冲液0.04mol/L～0.05mol/L，氯化钠1mmol/L-3mmol/L；所述清洗液II为75％乙醇；所述洗脱液包括以下成分和含量：缓冲液0.04mol/L～0.05mol/L，EDTA0.004mol/L～0.04mol/L。
8.根据权利要求4-7任一项所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠的粒径为500nm。
9.根据权利要求4-7任一项所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于血斑中核酸的提取。
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