CN117305295A - 动物组织、细胞的rna快速提取试剂盒 - Google Patents

动物组织、细胞的rna快速提取试剂盒 Download PDF

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徐宜铁
任光琳
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Abstract

本发明提供了一种动物组织、细胞的RNA快速提取试剂盒，属于RNA提取及纯化技术领域。本发明提供了一种动物组织、细胞RNA快速提取试剂盒，包括至少一个基因组DNA清除柱、一个RNA吸附柱以及配合使用的裂解液RLT Plus、去蛋白液RW1、漂洗液RW和洗脱液，并且，当提取物为细胞或选自脑、肺脏、肾脏、脾脏中的任一种动物组织时，上样环境为70％乙醇。该RNA快速提取试剂盒基于无苯酚、氯仿RNA快速提取技术，以及基因组DNA清除柱技术(而非DNase消化)，确保有效清除gDNA残留，整个过程仅需20分钟即可完成。并且，该试剂盒安全性高，无需有毒试剂，通过对组分浓度的摸索，可有效提高RNA的产量和纯度。

Description

动物组织、细胞的RNA快速提取试剂盒
技术领域
本发明属于RNA提取及纯化技术领域，尤其涉及到一种动物组织、细胞的RNA快速提取试剂盒。
背景技术
RNA提取技术是分子生物学中比较常见的一项技术。动物组织中含有大量蛋白质、盐类等其他杂质，在提取过程中很难与RNA分离，往往造成提取的浓度和纯度不高，影响下游实验。
目前提取动物组织细胞RNA的方法主要采用"异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提"一步法来去除蛋白质、盐类等其他杂质。但氯仿、苯酚挥发性较强，易对人体产生危害，整个提取过程步骤繁琐，提取时间较长，导致RNA容易降解。且有机溶剂易在RNA中残留，导致纯度不高，影响后续PCR、RT-PCR实验的扩增效果，使得该方法的应用受到了一定的限制。
因此，目前亟需一种动物组织、细胞RNA快速提取试剂盒以满足客户需求。
发明内容
本发明提供了一种动物组织、细胞的RNA快速提取试剂盒，该RNA快速提取试剂盒基于无苯酚、氯仿RNA快速提取技术，以及基因组DNA清除柱技术(而非DNase消化)，确保有效清除gDNA残留，整个过程仅需20分钟即可完成。并且，该试剂盒安全性高，无需有毒试剂，通过对组分浓度的摸索，可有效提高RNA的产量和纯度。
为了达到上述目的，本发明提供了一种动物组织、细胞RNA快速提取试剂盒，包括至少一个基因组DNA清除柱、一个RNA吸附柱以及配合使用的裂解液RLT Plus、去蛋白液RW1、漂洗液RW和洗脱液，并且，当提取物为细胞或选自脑、肺脏、肾脏、脾脏中的任一种动物组织时，上样环境为70％乙醇。
作为优选，所述裂解液RLT Plus由浓度为3-5mol/L的异硫氰酸胍、pH为6.5-8.5、浓度为10-200mmo/L的Tris-HCl缓冲溶液、1％-10％的表面活性剂、0.5％-10％柠檬酸钠、浓度为25-100mmol/L的EDTA组成。
作为优选，所述表面活性剂选自NP40、TritonX-100和Tween-20中的任一种。
作为优选，所述去蛋白液RW1由浓度为1-5mol/L的盐酸胍，pH为6.0-8.5、浓度为5-100mmo/L的Tris-HCl、体积分数为10％-50％的无水乙醇组成。
作为优选，所述漂洗液RW由pH为6.0-8.5、浓度为5-200mmo/L的Tris-HCl、浓度为10-200mmo/L氯化钠、体积分数为60％-80％的无水乙醇组成。
作为优选，所述RNA洗脱液为向超纯水内加入蛋白酶K，使其终浓度为0.5-1.5ng/mL，经消化25-30min，高压灭菌后获得的水。
作为优选，所述基因组DNA清除柱和RNA吸附柱均为硅膜吸附柱。
本发明还提供了一种动物肝脏组织RNA快速提取试剂盒，包括至少一个基因组DNA清除柱、一个RNA吸附柱以及配合使用的裂解液RLT Plus、去蛋白液RW1、漂洗液RW和洗脱液，并且，当提取物为大鼠肝脏时，上样环境为55％乙醇。
作为优选，所述裂解液RLT Plus由浓度为3.5mol/L的异硫氰酸胍、pH为7.5、浓度为10mmo/L的Tris-HCl、1％ Triton X-100、2％柠檬酸钠、浓度为50mmol/L的EDTA组成；
所述去蛋白液RW1中由浓度为2mol/L的盐酸胍，pH为7.5、浓度为10mmo/L的Tris-HCl缓冲溶液、体积分数为10％的无水乙醇组成。
本发明还提供了一种根据上述技术方案所述的动物组织、细胞RNA快速提取试剂盒，至少包括如下步骤：
采用裂解液处理样品，获得裂解混合物；
将裂解混合物转入基因组DNA清除柱中，离心，收集滤液，加入等体积的70％乙醇或55％乙醇，混匀；
分次转移混合物到RNA吸附柱中，离心，弃掉滤液；
加入去蛋白液RW1，离心，弃掉滤液；
加入漂洗液RW，离心，弃掉滤液，重复一遍；
将吸附柱放入收集管中，再次离心；
将RNA吸附柱中转移到新的离心管中，加入洗脱液，离心，获得动物组织或细胞RNA。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明的组织、细胞RNA快速提取试剂盒，基于无苯酚、氯仿RNA快速提取技术，以及基因组DNA清除柱技术(而非DNase消化)，确保有效清除gDNA残留，得到的RNA可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。更重要的是，本发明对于动物组织(尤其是肝脏)的RNA提取有很好的提升效果。
2、本发明试剂盒中样本经裂解后，DNA被吸附在基因组DNA清除柱上，RNA被吸附在RNA吸附柱上，然后用RNA洗脱液即可获得RNA，操作简便，可以有效提高RNA浓度，满足样品快速提取RNA的需求，整个过程仅需20分钟即可完成。并且，该试剂盒安全性高，无需有毒试剂，不仅降低成本，而且还有利于保护操作者的健康和环境。
3、本发明试剂盒中裂解液RLT Plus特异对异硫氰酸胍、Triton X-100和柠檬酸钠的浓度进行摸索，去蛋白液RW1特异对盐酸胍的浓度进行摸索，筛选出最佳的浓度，可以大幅度提高RNA的提取效率。
4、本发明试剂盒中提取大鼠肝脏组织，通过对无水乙醇的比例进行调整，确定等体积55％乙醇为最佳上柱环境，可有效提高RNA的产量(产量和浓度呈正比关系)和纯度。
附图说明
图1中泳道1为Spark 2000 DNA Marker，泳道2-21为提取的大鼠脑RNA，上样顺序同表1的浓度测定顺序；
图2中泳道1为Spark 2000 DNA Marker，泳道2-9为提取的大鼠肾脏RNA，上样顺序同表2的浓度测定顺序；
图3中泳道1为Spark 2000 DNA Marker，泳道2-11为提取的小鼠肺脏RNA，上样顺序同表3的浓度测定顺序；
图4中泳道1为Spark 2000 DNA Marker，泳道2-9为提取的小鼠脾脏RNA，上样顺序同表4的浓度测定顺序；
图5中泳道1为Spark 2000 DNA Marker，泳道2-11为提取的小鼠肺脏RNA，上样顺序同表5的浓度测定顺序；
图6中泳道1为Spark 2000 DNA Marker，泳道2-7为提取的大鼠脑、肺脏、肾脏、脾脏、293T细胞、vero细胞RNA，上样顺序同表6的浓度测定顺序；
图7中泳道1为Spark 2000 DNA Marker，泳道2-15为提取的大鼠肝脏RNA，上样顺序同表7的浓度测定顺序；
图8中泳道1为Spark 2000 DNA Marker，泳道2-13为提取的大鼠肺脏RNA，上样顺序同表8的浓度测定顺序。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验步骤：
1.在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有350μL/600μL裂解液RLT Plus的1.5mL离心管中，用手剧烈振荡20s，充分裂解。用移液器抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30s)。将裂解物溶液全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。
2.立刻12,000rpm(13,400×g)离心60s，保留滤过液(RNA在滤过液中)。
3.较精确估计滤过液体积(通常为350μL/600μL，滤过时损失体积应减去)，加入等体积的70％乙醇(对于肝组织样本，加入等体积的55％乙醇)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
4.立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入吸附柱RA中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30s，弃废液。
5.加入700μL去蛋白液RW1(需先加入无水乙醇)，室温放置1min，12,000rpm(13,400×g)离心30s，弃废液。
6.加入500μL漂洗液RW(需先加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30s，弃废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。
7.将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
8.取出吸附柱，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL RNA洗脱液，室温放置1min，12,000rpm离心1min。
参照以下具体的实施例对本发明进行说明。
实施例1
1.将动物组织大鼠脑在液氮中研磨成细粉，称取上述研磨后的组织细粉10-20mg转入装有350μL裂解液RLT Plus的离心管中，立即用手剧烈振荡20s，充分裂解。所述裂解液RLT Plus中含有pH为7.5、浓度为10mmo/L的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的EDTA以及如下浓度梯度的异硫氰酸胍。
2.将裂解物溶液全部加到基因组DNA清除柱上，12,000rpm离心60s，保留滤过液。
3.较精确估计滤过液体积(通常为350μL)，加入等体积的70％乙醇，立即吹打混匀。
4.将混合物加入RNA吸附柱中，12,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
5.向吸附柱加入700μL去蛋白液RW1，室温静置1min，12,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。所述去蛋白液RW1中含有浓度为2mol/L的盐酸胍，pH为7.5、浓度为10mmo/L的Tris-HCl缓冲溶液、体积分数为10％的无水乙醇。
6.向吸附柱加入500μL漂洗液RW，12,000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。重复此步骤一次。所述漂洗液RW中含有pH为7.5、浓度为20mmo/L的Tris-HCl缓冲溶液、浓度为100mmo/L氯化钠、体积分数为80％的无水乙醇。
7.将吸附柱放回空收集管中，12,000rpm离心2min。
8.将吸附柱放入一个新离心管中，加50μL RNA洗脱液，室温静置1min，12,000rpm离心1min，即可获得高纯度的组织和细胞的RNA。所述RNA洗脱液为加入蛋白酶K，终浓度0.5-1.5ng/mL，消化30min，高压灭菌后的水。
9.将上述得到的RNA，以RNA洗脱液为空白对照，进行浓度测定和琼脂糖凝胶电泳。浓度结果见下表1，琼脂糖凝胶电泳见图1。
按照以上实施例的方法提取的RNA浓度见下表1，琼脂糖凝胶电泳见图1。
注：A260/A230吸光度比值在2.0-2.5之间，说明RNA提取的纯度较好。
结合表1和图1的结果，裂解液RLT Plus中异硫氰酸胍的浓度在3mol/L-5mol/L时可显著提高RNA浓度，在此范围内，异硫氰酸胍浓度为3.5mol/L时RNA浓度相对较高且纯度达标，而超出范围至6mol/L时，RNA浓度降低且纯度不达标。
实施例2
样本为大鼠肾脏组织，实施方法和实施例1基本相同，不同之处在于：裂解液RLTPlus由浓度为3.5mol/L的异硫氰酸胍、pH为7.5、浓度为10mmo/L的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的EDTA以及浓度为5％的如下不同种类盐组成。
按照以上实施例的方法提取的RNA浓度见下表2，琼脂糖凝胶电泳见图2。
结合表2和图2的结果，可知与无盐类物质的裂解液RLT Plus相比，添加5％氯化钠或5％醋酸钠可显著降低RNA浓度，而添加5％柠檬酸钠，其RNA浓度显著升高。
实施例3
样本为小鼠肺脏组织，实施方法和实施例1基本相同，在实施例2的基础上进一步优化：裂解液RLT Plus由浓度为3.5mol/L的异硫氰酸胍、pH为7.5、浓度为10mmo/L的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的EDTA以及如下浓度梯度的柠檬酸钠组成。
按照以上实施例的方法提取的RNA浓度见下表3，琼脂糖凝胶电泳见图3。
结合表3和图3的结果，可知与裂解液RLT Plus中柠檬酸钠浓度为5％相比，柠檬酸钠浓度浓度为2％时可显著提高RNA浓度。
实施例4
样本为小鼠脾脏组织，实施方法和实施例1基本相同，不同之处在于：裂解液RLTPlus由浓度为3.5mol/L的异硫氰酸胍、pH为7.5、浓度为10mmo/L的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的EDTA、2％柠檬酸钠以及浓度为5％的如下不同种类表面活性剂组成。
按照以上实施例的方法提取的RNA浓度见下表4，琼脂糖凝胶电泳见图4。
结合表4和图4的结果，可知与无表面活性剂的裂解液RLT Plus相比，添加5％表面活性剂NP40或Tween-20，其RNA浓度有所降低，而添加5％表面活性剂Triton X-100，其RNA浓度显著升高。
实施例5
样本为小鼠肺脏组织，实施方法和实施例1基本相同，在实施例4的基础上进一步优化：裂解液RLT Plus由浓度为3.5mol/L的异硫氰酸胍、pH为7.5、浓度为10mmo/L的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的EDTA、2％柠檬酸钠以及如下浓度梯度的Triton X-100组成。
按照以上实施例的方法提取的RNA浓度见下表5，琼脂糖凝胶电泳见图5。
结合表5和图5的结果，可知与裂解液RLT Plus中Triton X-100浓度为5％相比，Triton X-100浓度为1％时可显著提高RNA浓度。
实施例6
样本为大鼠脑、肺脏、肾脏、脾脏、293T细胞、vero细胞，实施方法和实施例1基本相同，不同之处在于：所述裂解液RLT Plus由浓度为3.5mol/L的异硫氰酸胍、pH为7.5、浓度为10mmo/L的Tris-HCl、1％Triton X-100、2％柠檬酸钠、浓度为50mmol/L的EDTA组成。
按照以上实施例的方法提取的RNA浓度见下表6，琼脂糖凝胶电泳见图6。
样本编号 浓度(ng/μL) A260/A280 A260/A230
脑 235 2.03 2.16
肺脏 452 2.05 2.09
肾脏 426 2.02 2.41
脾脏 279 2.02 2.19
293T 457 2.05 2.10
vero 464 2.03 2.23
从图6可以看出采用本方法可以提取到完整性较好的RNA，且无DNA残留，浓度、纯度的检测结果见表6，RNA样品的A260/A280≈2.0(1.8-2.1)，A260/A230＞2.0(2.0-2.5)，说明本方法提取的RNA具有较高的纯度。
实施例7
样本为大鼠肺脏组织，实施方法和实施例1基本相同，不同之处在于：所述裂解液RLT Plus由浓度为3.5mol/L的异硫氰酸胍、pH为7.5、浓度为10mmo/L的Tris-HCl、1％Triton X-100、2％柠檬酸钠、浓度为50mmol/L的EDTA组成。
所述去蛋白液RW1中盐酸胍的浓度，分别为1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L。
按照以上实施例的方法提取的RNA浓度见下表7，琼脂糖凝胶电泳见图7。
结合表7和图7的结果，去蛋白液RW1中盐酸胍的浓度为2mol/L时，提取的RNA浓度最高，且纯度较好，而盐酸胍浓度升高或降低，其浓度和纯度均有所降低。
实施例8
样本为大鼠肝脏组织，实施方法和实施例1基本相同，不同之处在于：所述裂解液RLT Plus由浓度为3.5mol/L的异硫氰酸胍、pH为7.5、浓度为10mmo/L的Tris-HCl、1％Triton X-100、2％柠檬酸钠、浓度为50mmol/L的EDTA组成。
采用不同体积分数的无水乙醇，体积分数分别为40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％。
按照以上实施例的方法提取的RNA浓度见下表8，琼脂糖凝胶电泳见图8。
注：A260/A230吸光度比值在2.0-2.5之间，说明RNA提取的纯度较好。
结合表8和图8的结果，采用等体积55％乙醇的方式提取的RNA浓度最高，且纯度较好，乙醇体积分数升高或降低，其浓度和纯度均有所降低。

Claims (10)

1.动物组织、细胞RNA快速提取试剂盒，其特征在于，包括至少一个基因组DNA清除柱、一个RNA吸附柱以及配合使用的裂解液RLT Plus、去蛋白液RW1、漂洗液RW和洗脱液，并且，当提取物为细胞或选自脑、肺脏、肾脏、脾脏中的任一种动物组织时，上样环境为70％乙醇。
2.根据权利要求1所述的RNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液RLT Plus由浓度为3-5mol/L的异硫氰酸胍、pH为6.5-8.5、浓度为10-200mmo/L的Tris-HCl缓冲溶液、1％-10％的表面活性剂、0.5％-10％柠檬酸钠、浓度为25-100mmol/L的EDTA组成。
3.根据权利要求2所述的RNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂选自NP40、TritonX-100和Tween-20中的任一种。
4.根据权利要求1所述的RNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述去蛋白液RW1由浓度为1-5mol/L的盐酸胍、pH为6.0-8.5、浓度为5-100mmo/L的Tris-HCl、体积分数为10％-50％的无水乙醇组成。
5.根据权利要求1所述的RNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述漂洗液RW由pH为6.0-8.5、浓度为5-200mmo/L的Tris-HCl、浓度为10-200mmo/L氯化钠、体积分数为60％-80％的无水乙醇组成。
6.根据权利要求1所述的RNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述RNA洗脱液为向超纯水内加入蛋白酶K，使其终浓度为0.5-1.5ng/mL，经消化25-30min，高压灭菌后获得的水。
7.根据权利要求1所述的RNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述基因组DNA清除柱和RNA吸附柱均为硅膜吸附柱。
8.动物肝脏组织RNA快速提取试剂盒，其特征在于，包括至少一个基因组DNA清除柱、一个RNA吸附柱以及配合使用的裂解液RLT Plus、去蛋白液RW1、漂洗液RW和洗脱液，并且，当提取物为大鼠肝脏时，上样环境为55％乙醇。
9.根据权利要求8所述的RNA快速提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液RLT Plus由浓度为3.5mol/L的异硫氰酸胍、pH为7.5、浓度为10mmo/L的Tris-HCl、1％Triton X-100、2％柠檬酸钠、浓度为50mmol/L的EDTA组成；
所述去蛋白液RW1中由浓度为2mol/L的盐酸胍，pH为7.5、浓度为10mmo/L的Tris-HCl缓冲溶液、体积分数为10％的无水乙醇组成。
10.根据权利要求1或8所述的动物组织、细胞RNA快速提取试剂盒，其特征在于，至少包括如下步骤：
采用裂解液处理样品，获得裂解混合物；
将裂解混合物转入基因组DNA清除柱中，离心，收集滤液，加入等体积的70％乙醇或55％乙醇，混匀；
分次转移混合物到RNA吸附柱中，离心，弃掉滤液；
加入去蛋白液RW1，离心，弃掉滤液；
加入漂洗液RW，离心，弃掉滤液，重复一遍；
将吸附柱放入收集管中，再次离心；
将RNA吸附柱中转移到新的离心管中，加入洗脱液，离心，获得动物组织或细胞RNA。
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