CN110592207B - 一种外泌体microRNA的应用及制备的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种外泌体microRNA的应用及制备的试剂盒。本发明通过生化试验证明了外泌体microRNA‑8064在系统性硬皮病样本中的异常表达，提示其可以成为系统性硬皮病检测的生物标志物，并可应用于与之相关的产品制备、疾病诊断中；外泌体microRNA‑8064诊断SSc能够更加及时反映系统性硬皮病患者的疾病状态，避免既往繁杂检测，节约时间人力成本，便于临床医生及时采取个性化的防治方案；同时外泌体样本易于获得，临床可操性更强且创伤性更小，而且外泌体microRNA稳定性更好，检测更便利。

Description

一种外泌体microRNA的应用及制备的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种外泌体microRNA的应用及制备的试剂盒。

背景技术

系统性硬皮病(Systemic sclerosis，SSc)是一种累及多个系统的自身免疫性疾病，主要表现为皮肤及内脏器官结缔组织纤维化、硬化和萎缩。该疾病患病率达到0.24‰，在我国结缔组织病中发病率仅次于类风湿关节炎与红斑狼疮，其中位生存时间约11年，如多个内脏器官受累则更低。患者除生命受到严重威胁以外，生存质量也显著下降。SSc具体发病机制尚不明确，现有相关发病学说包括免疫学说、胶原合成异常学说、血管学说等。目前认为T淋巴细胞、B淋巴细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞以及细胞因子/趋化因子是五个主要的因素，它们数量和(或)功能的异常贯穿该病的整个病理过程。其中，成纤维细胞异常活化后分泌过量的胶原纤维(collagen)是SSc关键的致病因素之一，而成纤维细胞的活化与患者外周血中一些细胞因子的升高有关。细胞因子间可能构成复杂的转录调控网络，参与激活SSc患者成纤维细胞胶原基因转录。

有研究表明，外泌体在多种纤维化疾病中发挥重要作用。外泌体是由细胞分泌的直径为30～150nm的小囊泡，内涵丰富的脂质、磷脂、胆固醇、蛋白质、mRNA、miRNA和其他小的非编码RNA，表面富集跨膜或与脂质结合的细胞外蛋白质(CD9、CD63、CD81、细胞粘附分子和生长因子受体等)，因其具有双层脂质结构，可避免内容物降解。CD63、CD9和CD81外泌体广泛分布在各种体液及细胞当中，例如：血液、尿液、乳汁、肺泡灌洗液等。它具有多种生理病理功能，可介导细胞间通讯，在自身免疫反应的诱导、维持、调节中也起到重要作用。外泌体在免疫调节过程中起重要作用，并与自身免疫性疾病的免疫发病有关，包括SSc、类风湿性关节炎(RA)，干燥综合征(SS)和系统性红斑狼疮(SLE)等。

MicroRNA(miR)是近年来在真核生物中新发现的一类内源性的参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA。通过与目的基因靶mRNA的3'-UTR碱基序列的不完全或者完全配对，从而导致目的基因翻译的抑制或者基因表达沉默。miR普遍存在于多细胞生物中，而且数量十分可观，约占整个基因组基因总数的2％左右。据报道30％以上的蛋白质编码基因的表达受miRs调控，在细胞生长发育、增殖、凋亡、炎症反应、肿瘤形成及自身免疫反应方面等病理生理过程中发挥重要作用，属于调节因子家族中数量最为丰富的一族。近年来，研究人员在血液、唾液、尿液等多种体液中检测到microRNA，提出循环microRNA的概念。血液、尿液等体液标本易于获得，临床可操性强且创伤性小，而且循环microRNA稳定性好，检测便利，因此，循环microRNA具有作为自身免疫性疾病无创性生物标志物的潜能，且适用于所有人群。新近研究发现，循环中miR被包裹于外泌体中，从而避免被RNA酶降解，最终激活靶细胞纤维化相关的通路，因此，miR在多种纤维化疾病中发挥重要作用。

然而目前关于循环microRNA作为检测指标的研究仍存在以下不足：(1)大部分研究只是挑选了前人报道的在皮损组织表达失调的microRNA作为候选指标，可能无法全面客观反映循环microRNA的情况；(2)部分研究样本量少，缺乏多中心验证。因此，目前仍然有必要发现具有临床应用价值的系统性硬皮病检测指标。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供外泌体microRNA-8064作为生物标志物在涉及系统性硬皮病检测中的相关应用。

microRNA-8064的序列为AGCACACUGAGCGAGCGGAC(SEQ ID NO.1)，目前针对表达失调的microRNA的筛选多是以皮损组织为样本，但是筛选结果中并没有获得microRNA-8064表达失调的结论。

本发明以系统性硬皮病病人血清样本7例、健康对照血清样本4例为标本进行实时荧光定量PCR检测，结果显示与正常人相比，硬皮病人血清外泌体中microRNA-8064的表达水平显著降低；

本发明以系统性硬皮病病人晨尿样本15例、健康对照晨尿样本16例为标本进行实时荧光定量PCR检测，结果显示与正常人相比，硬皮病人尿液外泌体中microRNA-8064的表达水平显著降低；

相对于其他标本，血清标本和尿液标本的获取较为简单，这其中尿液标本具有更简单和无创的优势。基于上述的试验结果，本发明提出了外泌体microRNA-8064作为生物标志物在制备系统性硬皮病检测产品中的应用；外泌体microRNA-8064在制备系统性硬皮病生物标志物中的应用；检测外泌体microRNA-8064的试剂在制备系统性硬皮病检测产品中的应用。

其中，所述检测产品为试剂盒，在本发明具体实施方式中试剂盒为基于实时荧光定量PCR的检测试剂盒，所述外泌体为尿液外泌体或血清外泌体。

在本发明具体实施方式中，本发明基于实时荧光定量PCR技术对系统性硬皮病病人血清、晨尿样本进行了microRNA-8064的表达量检测，其中所涉及的试剂可以作为一种检测系统性硬皮病的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒以外泌体microRNA-8064作为生物标志物，包括外泌体提取系统、外泌体总RNA提取系统、反转录系统、扩增microRNA-8064cDNA和内参cDNA系统，以及相对定量内参标准化系统。

其中，所述相对定量内参标准化系统为cel-miR-39-3p，序列如SEQ ID NO.2所示；所述扩增microRNA-8064cDNA以及内参cDNA系统包括Forward Primer(10μM)、Uni-ReversePrimer(10μM)、2×SYBR Green Mix、RNase-free water。

在本发明具体实施方式中，扩增microRNA-8064cDNA的引物为：

正向引物：5'ACTGAGCGAGCGGACATC3'(SEQ ID NO.3)；

反向引物：3'CGAGGCGACCGAGGGTTT5'(SEQ ID NO.4)；

扩增cel-miR-39-3p cDNA的引物为：

正向引物：5'GAGAACACCGGGGAAACAG3'(SEQ ID NO.5)

反向引物：3'TCTTGTGGCCCCTTTGTCG5'(SEQ ID NO.6)

作为优选，所述外泌体提取系统为ExoQuick-TC试剂盒，例如ExoQuick-TC^TMExosome Precipitation Solution(SBI)；

作为优选，所述外泌体总RNA提取系统包括TRIzolLS Reagent、氯仿、异丙醇、75％酒精、RNase-free water(无酶水)；

作为优选，所述反转录系统包括RTase mix、5×RTase Buffer、Uni-RT Primer。

此外，本发明还提供了利用上述试剂盒对待测样本中microRNA-8064表达量检测的方法，包括样本预处理、外泌体提取、外泌体总RNA提取、逆转录、qPCR扩增反应步骤；

检测microRNA的相对表达变化量时，相对表达量的计算用公式RQ＝2-^ΔCt，ΔCt＝Ct_miR-Ct_{cel-miR-39-3p}。统计学分析采用SPSS 22.0统计分析软件，P<0.05时，认为结果在统计学上有显著性差异。当检测样本中microRNA-8064表达量＜14.14时，提示该患者患有系统性硬皮病。

由以上技术方案可知，本发明通过生化试验证明了外泌体microRNA-8064在系统性硬皮病样本中的异常表达，提示其可以成为系统性硬皮病检测的生物标志物，并可应用于与之相关的产品制备、疾病诊断中；外泌体microRNA-8064诊断SSc能够更加及时反映系统性硬皮病患者的疾病状态，避免既往繁杂检测，节约时间人力成本，便于临床医生及时采取个性化的防治方案；同时血清以及尿液外泌体样本易于获得，临床可操性更强且创伤性更小，而且外泌体microRNA稳定性更好，检测更便利。

附图说明

图1所示为本发明所提供的microRNA-8064在系统性硬皮病、健康对照尿液外泌体样本经qPCR相对定量分析图；

图2所示为本发明所提供的microRNA-8064在系统性硬皮病、健康对照血清外泌体样本经qPCR相对定量分析图；

图3所示为用透射电镜的方法鉴定所提取的尿液外泌体；

图4和图5所示为NTA法检测病人尿液中的外泌体直径分布；

图6所示为SSc患者进行15mg泼尼松治疗5天前后的尿液外泌体microRNA-8064经qPCR相对定量分析图；Control代表治疗前，experiment代表治疗后；

图7所示为本发明所提供的microRNA-8064在系统性硬皮病尿液外泌体样本中的ROC诊断分析图。

具体实施方式

本发明公开了一种外泌体microRNA的应用及制备的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用和试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述应用和试剂盒进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中使用系统性硬皮病病人血清7例、晨尿样本15例及健康对照血清4例、晨尿样本16例。所有患者符合美国风湿病学会(American Colleage of Rheumatology，ACR)1980年制定的硬皮病分类标准，并排除其它自身免疫性疾病、无其他肾脏疾病、无尿路感染以及近期无其他重大疾病。匹配年龄、性别。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下就本发明所提供的一种尿液外泌体microRNA的应用及制备的试剂盒做进一步说明。

实施例1：检测系统性硬皮病患者血清/尿液外泌体样本、健康对照血清/尿液外泌体样本中microRNA的表达

本实施例中使用系统性硬皮病病人血清7例、晨尿样本15例及健康对照血清4例、晨尿样本16例。

1、血清、尿液样本的处理：

血清2ml/晨尿50ml，4h内处理，室温3000rpm/h离心15min，分离上清。

2、外泌体的提取：

所有外泌体提取均按照ExoQuick-TC^TMExosome Precipitation Solution(SBI)所提供的步骤。

收集得到的外泌体沉淀用10ul的无酶水重悬，-80℃保存。

3、提取外泌体中总RNA：

10ul外泌体重悬液加1000ul TRIzol LS Reagent(Ambion)，上下吹打混匀；

加入5fM cel-miR-39-3p Standard RNA 5ul，上下吹打混匀，室温放置5min；

12000g，5min，4℃离心，转移上清液至新的EP管；

加入200ul氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min；

12000g，15min，4℃离心，转移最上层清液至新的EP管；

加入2倍体积异丙醇混匀，室温静置20min；

4℃，12000g，离心8分钟，RNA沉于管底，形成白色絮状物；

弃上清，加入1ml 75％酒精洗涤RNA；

4℃，7500g离心RNA悬浮液5min；

弃酒精漂洗液，并于室温放置约5分钟使RNA干燥，加无酶水10ul使RNA充分溶解，55-60℃孵育10-15分钟；

4、RNA样品的质量分析

用Nandrop2000分光光度计检测所得TotalRNA的浓度，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28S:18S≥1.5可以初步判定总RNA质量较好。

5、逆转录：

使用polyA尾法，具体步骤参照miDETECT A TrackTM miRNA qRT-PCR StarterKit说明书。

冰上制备反应体系，加入500ng RNA、2ul 5×Poly(A)Polymerase Buffer、1ulPoly(A)Polymerase，用无酶水补至总体积10ul；混匀上述反应体系，在PCR仪中37℃反应1h，得到10ul Poly(A)加尾产物；往上述加尾产物中加入4ul RTase mix、4ul 5×RTaseBuffer、2ul Uni-RT Primer，混匀上述反应体系，在PCR仪中42℃反应1h，然后于72℃孵育10min，反应完成后所得cDNA置于冰上备用。

6、qPCR反应：

1)引物设计

扩增microRNA-8064的引物

正向引物：5'ACTGAGCGAGCGGACATC3'(SEQ ID NO.3)

反向引物：3'CGAGGCGACCGAGGGTTT5'(SEQ ID NO.4)

扩增cel-miR-39-3p的引物

正向引物：5'GAGAACACCGGGGAAACAG3'(SEQ ID NO.5)

反向引物：3'TCTTGTGGCCCCTTTGTCG5'(SEQ ID NO.6)

2)所有反应均做两个复孔，如两个Ct值差异较大(>0.5)，则重复做一次。配置反应体系：0.5ul Forward Primer(10μM)、0.5Uni-Reverse Primer(10μM)、10ul 2×SYBRGreen Mix、2ul cDNA，加无酶水补足总体积至20ul，利用定量PCR仪Light

96进行实时荧光PCR反应，具体步骤可参照miDETECT A TrackTM miRNA qRT-PCR Starter Kit说明书。

7、结果

如图1和图2所示，与正常人相比，硬皮病人血清、尿液外泌体中microRNA-8064的表达水平显著降低。

8、外泌体的鉴定

分离的外泌体采用PBS重悬，通过透射电镜分析表明，所提取尿液外泌体具有典型的形态(图3)。利用纳米粒子追踪分析技术(NTA)检测外泌体的直径分布(图4和图5)，所提取的尿液外泌体99.6％直径为138.9nm。

9、泼尼松治疗前后的microRNA-8064表达水平

分别取泼尼松治疗前、后的系统性硬皮病病人晨尿样本，进行qPCR反应，检测结果见图6，由图6可以明显看出SSc患者进行15mg泼尼松治疗5天前后的尿液外泌体microRNA-8064表达量有显著差异(p＜0.05)。

实施例2：本发明所述检测试剂盒

包括尿液外泌体提取系统、外泌体总RNA提取系统、反转录系统、扩增系统和相对定量内参标准化系统；所述的试剂盒是通过定量检测尿液外泌体microRNA分子标志物microRNA-8064来判断是否患有系统性硬皮病。

具体包括以下：

所述尿液外泌体提取系统包括ExoQuick-TC；

所述外泌体总RNA提取系统包括TRIzolLS Reagent、氯仿、异丙醇、75％酒精、RNase-free water(无酶水)；

所述反转录系统包括RTase mix、5×RTase Buffer、Uni-RT Primer；

所述扩增系统包括Forward Primer(10μM)、Uni-Reverse Primer(10μM)、2×SYBRGreen Mix、RNase-free water。

所述的相对定量内参标准化系统由cel-miR-39-3p组成。

本发明的试剂盒的使用步骤如下；

1)获取来源于被检测个体的尿液样本；

2)提取尿液中的外泌体；

3)提取外泌体总RNA；

4)利用特异性的检测技术检测样本中生物标志物的表达；

5)判断被检测个体是否患有系统性硬皮病。

上述方法中生物标志物的检测是对分离的尿液外泌体纯化的总RNA样本进行检测。特异性检测技术为实时荧光定量PCR技术。

该实施例中，分别以15例系统性硬皮病病人、16例健康对照尿液外泌体为样本，用microRNA生物标志物microRNA-8064进行试验，荧光定量PCR定量检测microRNA的相对表达变化量时，相对表达量的计算用公式RQ＝2-^ΔCt，ΔCt＝Ct_miR-Ct_{cel-miR-39-3p}。统计学分析采用SPSS 22.0统计分析软件，P<0.05时，认为结果在统计学上有显著性差异。根据图7ROC曲线计算，当检测样本中microRNA-8064表达量＜14.14时，提示该患者患有系统性硬皮病。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中南大学湘雅二医院

<120> 一种外泌体microRNA的应用及制备的试剂盒

<130> MP1921411

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcacacuga gcgagcggac 20

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ucaccgggug uaaaucagcu ug 22

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actgagcgag cggacatc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttgggagcc agcggagc 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagaacaccg gggaaacag 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctgtttccc cggtgttct 19

Claims (7)

1.外泌体microRNA-8064作为生物标志物在制备系统性硬皮病检测产品中的应用。

2.外泌体microRNA-8064在制备系统性硬皮病生物标志物中的应用。

3.检测外泌体microRNA-8064的试剂在制备系统性硬皮病检测产品中的应用。

4.根据权利要求1或3所述应用，其特征在于，所述检测产品为试剂盒。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒。

6.根据权利要求1-3任意一项所述应用，其特征在于，所述外泌体为尿液外泌体或血清外泌体。

7.根据权利要求1-3任意一项所述应用，其特征在于，所述外泌体microRNA-8064序列如SEQ ID NO.1所示。

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