CN110511994B

CN110511994B - miRNA-4769-3p及其同源物的应用

Info

Publication number: CN110511994B
Application number: CN201910848183.5A
Authority: CN
Inventors: 肖嵘; 唐瑞; 曾茁桐; 凌光辉; 陆前进; 赵明; 吴海竞; 邓前程; 史雅倩; 唐冰思; 喻江帆; 邹璞玉; 曾光明; 熊炜平; 周成赟; 宋彪
Original assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2019-09-09
Filing date: 2019-09-09
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2039-09-09
Also published as: CN110511994A

Abstract

本发明涉及生物医学工程技术领域，公开了miRNA‑4769‑3p及其同源物的应用。本发明首次发现了miRNA‑4769‑3p表达水平与硬皮病的发生发展相关，抑制miRNA‑4769‑3p的表达可减轻皮肤硬化萎缩症状，通过检测受试者miRNA‑4769‑3p的表达水平，可以判断受试者是否患有硬皮病，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案，miRNA‑4769‑3p抑制剂可作为一种可用于制备防治硬皮病的药物用于硬皮病治疗。

Description

miRNA-4769-3p及其同源物的应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程技术领域，具体是涉及miRNA-4769-3p及其同源物的应用，尤其是涉及miRNA-4769-3p及其同源物以及抑制剂在制备诊断或治疗硬皮病中的产品中的应用。

背景技术

硬皮病是以皮肤以及内脏器官结缔组织纤维化、硬化和萎缩为主要表现的自身免疫病，主要以皮肤炎性、变性、增厚和纤维化进而硬化和萎缩为特征，属于结缔组织病。硬皮病可以引起多系统损害，其中系统性硬化除皮肤、滑膜、指(趾)动脉出现退行性病变外，消化道、肺、心脏和肾等内脏器官也可受累。硬皮病的病因仍不明确，可能在遗传、环境因素(病毒感染、化学物质如硅等)、女性激素、细胞及体液免疫异常等因素作用下，成纤维细胞合成并分泌胶原增加，导致皮肤和内脏的纤维化。有报道该疾病患病率达到0.24‰，在我国结缔组织病中发病率仅次于类风湿关节炎与红斑狼疮，其中位生存时间约11年，该病患者除生命受到严重威胁以外，生存质量也显著下降。

miRNAs是一类长约22nt的单链小RNA，有细胞内源产生的发卡结构转录本加工而来，其序列在物种间高度保守，它们通过结合靶信使RNA的3’非翻译区，引起靶mRNA失活和/或转录后抑制，从而调控靶基因表达，在细胞内具有多种重要的调节作用。实验证据表明，miRNA可通过调控其靶标基因参与细胞凋亡信号通路，影响成纤维细胞的增殖与凋亡，还可以通过不同的靶基因同时影响胶原的合成，炎症的发生发展等。miRNA的发现为硬皮病发病机制的研究提供了新的思路，为肿瘤诊断和治疗提供了新的策略。

目前越来越多的miRNA作为人类疾病的生物标志物及治疗靶点被发现，寻找硬皮病中特异表达的、参与成纤维细胞凋亡的miRNA，阐明其作用机理，对于开发以miRNA为策略的硬皮病的诊断、治疗具有及其重要的意义和应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供了miRNA-4769-3p及其同源物以及抑制剂在制备诊断或治疗硬皮病中的产品中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了miRNA-4769-3p或其同源物在制备诊断硬皮病的产品中的应用。

其中，所述产品为测定miRNA-4769-3p或其同源物的水平产品。

进一步，所述测定miRNA-4769-3p或其同源物的水平的方法包括qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序。

进一步，miRNA-4769-3p的同源物包括miRNA-4769-3p的组成型核酸分子的功能等同物。

本发明还提供了一种诊断硬皮病的产品，包括芯片或试剂盒；

所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针；所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miRNA-4769-3p或其同源物的部分或全部序列；

所述试剂盒包括用于检测miRNA-4769-3p或其同源物表达水平的试剂；所述试剂包括针对miRNA-4769-3p或其同源物的引物和/或探针。

在一些实施方案中，所述试剂盒中针对miRNA-4769-3p的引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种治疗硬皮病的药物，包含I或II:

I.抑制miRNA-4769-3p或其同源物的表达的试剂；

II.减弱miRNA-4769-3p或其同源物功能的试剂。

在一些实施方案中，所述抑制miRNA-4769-3p表达的试剂为miRNA-4769-3pinhibitor和miRNA-4769-3p Antagomir。

进一步的，在一些实施方案中，所述药物还包括药学上可接受的载体。

进一步所述药物还包括一种或多种治疗硬皮病的其它药物。

本发明的有益效果：本发明首次发现了miRNA-4769-3p表达水平与硬皮病的发生发展相关，抑制miRNA-4769-3p的表达可减轻皮肤硬化萎缩症状，通过检测受试者miRNA-4769-3p的表达水平，可以判断受试者是否患有硬皮病，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案，miRNA-4769-3p抑制剂可作为一种可用于制备防治硬皮病的药物用于硬皮病治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示利用qRT-PCR检测miRNA-4769-3p在硬皮病病人血浆中的表达情况；

图2示利用qRT-PCR检测miRNA-4769-3p对成纤维细胞中胶原的表达情况；其中，mimic为过表达的药物；NC代表对照组；

图3示利用masson染色检测miRNA-4769-3p Antagomir对胶原生成和脂肪的影响。

具体实施方式

本发明公开了miRNA-4769-3p及其抑制剂的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

miRNA-4769-3p的序列为5’-ucugccauccucccucccuac-3’(SEQ ID NO.1)。miRNA芯片表达谱的检测结果显示miRNA-4769-3p在正常人和硬皮病人血浆中的表达存在显著差异，与正常人血浆相比，硬皮病人血浆中miRNA-4769-3p的水平显著升高。qPCR-PCR验证miRNA-4769-3p在正常人和硬皮病人血浆样本的差异表达与miRNA芯片结果一致。表明血浆中的miRNA-4769-3p可以作为硬皮病诊断标志物。因此本发明提供了miRNA-4769-3p或其同源物在制备诊断硬皮病的产品中的应用。

进一步，所述产品为测定miRNA-4769-3p或其同源物的水平产品，通过测定miRNA-4769-3p或其同源物的水平以诊断硬皮病。

本领域技术人员应当知道，本发明所述miRNA-4769-3p的同源物包括miRNA-4769-3p的组成型核酸分子的功能等同物，即变体。“变体”是指，与对应野生型miRNA基因产物具有少于100％的同一性并且具有对应野生型miRNA基因产物的一个或多个生物活性的miRNA。此类生物活性的实例包括但不限于，与硬皮病发生发展的细胞过程(例如，细胞分化、细胞生长、细胞死亡)的抑制。这些变体包括物种变体和由于miRNA基因的一个或多个突变(例如置换、缺失、插入)而产生的变体。在某些实施方案中，变体与对应野生型miRNA基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。

本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miRNA-4769-3p功能的条件下，对miRNA-4769-3p进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的miRNA-4769-3p的同源物的保护范围之内。

本发明的miRNA-4769-3p核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟的miRNA-4769-3p主要呈单链形式，而miRNA-4769-3p前体是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。

本发明提供了一种诊断硬皮病的产品，所述产品能够通过检测miRNA-4769-3p或其同源物的水平来诊断硬皮病。

进一步，所述产品包括芯片或试剂盒。

其中，所述芯片包括固相载体，以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miRNA-4769-3p或其同源物的部分或全部序列。

所述试剂盒包括用于检测miRNA-4769-3p或其同源物的表达水平的试剂，所述检测miRNA-4769-3p或其同源物表达水平的试剂包括针对miRNA-4769-3p或其同源物的引物和/或探针。

根据SEQ ID NO.1：5’-UCUGCCAUCCUCCCUCCCUAC-3’所示的miRNA-4769-3p核酸序列，可以生成用于给定miRNA基因产物的RNA印记杂交的合适探针，包括但不限于与目标miRNA基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或完全互补的探针。标记的DNA和RNA采用常规方法制备，例如核酸探针用下述物质标记，如放射性核素3H、32P、33P、14C或35S，重金属，能起到标记配体的特异性结合对成员功能的配体如生物素、抗生物素蛋白或抗体等，荧光分子，化学发光分子、酶等。

通过切口平移法或随机引物法，可以将探针标记成高比放射性，后者是从单链DNA或从RNA模板合成高比放射性的32P-标记的探针的选择方法。例如，通过根据切口平移法用高效放射性的核苷酸替换现有的核苷酸，可以制备比放射性大大超过108cpm/微克的32P-标记的核酸探针。然后通过使杂交的滤膜曝光于照相胶片，可以进行杂交的放射自显影检测。对杂交的滤膜曝光的照相胶片的光密度扫描，会提供miRNA基因转录产物水平的精确测量。

进一步，上面所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊断硬皮病的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断硬皮病的情况也包含在本发明的保护范围之内。

进一步，上面所述试剂还包括针对现有技术中已经报道的诊断硬皮病miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合诊断硬皮病的情况也包含在本发明的保护范围之内。

所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control ofgeneexpression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人、蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

本发明还提供了一种治疗硬皮病的药物，包含I或II:

I.抑制miRNA-4769-3p或其同源物的表达的试剂；

II.减弱miRNA-4769-3p或其同源物功能的试剂。

所述抑制miRNA-4769-3p或其同源物表达或减弱miRNA-4769-3p或其同源物功能的试剂的靶标不限于miRNA-4769-3p或其同源物本身，还包括miRNA-4769-3p或其同源物的上下游，例如：编码miRNA-4769-3p的基因组序列，miRNA-4769-3p靶基因、调控miRNA-4769-3p的蛋白或者基因。

进一步，抑制miRNA-4769-3p或其同源物表达或减弱miRNA-4769-3p或其同源物功能的试剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物。

优选地，所述的试剂是miRNA-4769-3p的模拟物、miRNA-4769-3p的抑制剂、前体miRNA-4769-3p、携带miRNA-4769-3p的载体。

根据miRNA-4769-3p序列设计出它的抑制剂，miRNA-4769-3p的抑制剂是化学合成的小RNA，将miRNA-4769-3p抑制剂转移到人体内后，它们能够明显下调miRNA-4769-3p的表达。

进一步，所述药物还包括药学上可接受的载体。所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

所述药物可以制成包括但不限于显微注射剂、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。对于固体药物，可使用常规的无毒性固体药学上可接受的载体例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。例如，用于口服给药的固体药物可包含上列的任何载体和赋形剂和10-95％，优选25％-75％的至少一种miRNA-4769-3p基因产物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。用于气雾剂(吸入)给药的药物组合物可包含封装在上述脂质体中的按重量计算0.01％-20％、优选按重量计算1％-10％的至miRNA-4769-3p基因产物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)和喷射剂。当需要时也可包含载体，如用于鼻内递送的卵磷脂。

本发明的药物可以进一步包含一种或多种治疗硬皮病的其它药物，组成药物组合物。组合物包含至少一种miRNA-4769-3p基因产物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)和至少一种硬皮病治疗药物。

本发明的miRNA-4769-3p可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miRNA-4769-3p的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核表达载体。

本发明的可药用载体可包括但不限于：病毒、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。相关的递送载剂可包括但不限于：脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。

病毒载体可以是能够接受miRNA基因产物的编码序列的任何病毒载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。可通过用来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型化载体或通过置换不同的病毒衣壳蛋白(如果合适)来改变病毒载体的趋向性。

真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。

可以表达miRNA-4769-3p的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找miRNA-4769-3p在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定miRNA-4769-3p初始miRNA的位置，在miRNA-4769-3p初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达miRNA-4769-3p的DNA片段。

所述药物可以单独施用或者与其他能够治疗硬皮病的药物进行组合施用。施用有效量的miRNA-4769-3p基因产物或其分离的变体或生物活性片段，以便受试者中成纤维细胞被抑制，脂肪细胞增殖。

在本发明中，“阵列”或“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。微阵列可从产生自已知miRNA序列的基因-特异的寡核苷酸探针来制备。阵列可含有每个miRNA的2种不同的寡核苷酸探针，一种含有活性的成熟序列，而另一种特异于miRNA的前体。阵列还可含有对照，诸如与人类直向同源物仅几个碱基不同的一种或多种小鼠序列，其可作为杂交严紧条件的对照。来自两个物种的tRNA也可印在微芯片上，提供了特异杂交的内部、相对稳定的阳性对照。非特异杂交的一个或多个适当的对照也可包括于微芯片上。

在本发明中，miRNA基因产物的“生物活性片段”是指，具有对应野生型miRNA基因产物的一个或多个生物活性的miRNA基因产物的RNA片段。如上文中所述，此类生物活性的实例包括但不限于，硬皮病的成纤维细胞和脂肪细胞增殖与凋亡过程。在某些实施方案中，生物活性片段在长度上为至少约5、7、10、12、15或17个核苷酸。在具体的实施方案中，可将分离的miRNA基因产物与一种或多种另外的硬皮病治疗组合来给受试者施用。

在本发明中，可将miRNA-4769-3p基因产物作为裸RNA与递送试剂一起作为核酸(如重组质粒或病毒载体)给受试者施用，所述核酸包含表达miRNA-4769-3p基因产物的序列。递送试剂可以是亲脂试剂、聚阳离子、脂质体等。miRNA-4769-3p基因产物的序列的重组质粒和病毒载体以及用于递送此类质粒和载体至癌细胞的技术是本领域众所周知的。

脂质体用于将miRNA-4769-3p基因产物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至受试者。脂质体可以增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质(其通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇)形成用于本发明的合适的脂质体。通常，通过考虑入目的脂质体的大小和血流中直追半衰期等因素，指导脂质的选择。

用于本发明的脂质体可包含将脂质体靶向细胞的配体分子。结合成纤维细胞中普遍存在的受体的配体。还可对用于脂质体进行修饰，以避免被单核巨噬细胞系统和网状内皮系统清除。此类修饰的脂质体具有存在于表面上或整合入脂质体结构中的调理作用抑制部分。优选的，脂质体可包含调理作用抑制部分和配体两者。

适用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选是具有500至约40000道尔顿和优选约20000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯酮；线性的、分支的或树状聚酰胺-胺；聚丙烯酸；多元醇如羧基或氨基化学连接至其的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂。此外调理作用抑制性聚合物可以是PEG与多聚氨基酸、多糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。调理作用抑制性聚合物也可以是包含氨基酸或羧酸如半乳糖醛酸、葡萄醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉菜胶的天然多糖；氨化多糖或寡糖；羧化多糖或低聚糖如与碳酸的衍生物反应，获得羧基的连接。优选的，调理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。

本发明的药物组合物包含对核酸酶的降解具有抗性的至少一种miRNA-4769-3p基因产物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。本领域技术人员可容易地合成对核酸酶具有抗性的核酸，如通过将一个或多个在2’位置被修饰的核糖核苷酸掺入miR基因产物。合适的2’-修饰的核糖核苷酸包括在2’位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和O-烯丙基修饰的核糖核苷酸。

所述药物可以体内施用：将miRNA-4769-3p抑制剂、前体miRNA-4769-3p或者miRNA-4769-3p的表达载体直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA或RNA。

在本发明中，术语“治疗”是指改善与疾病或病症相关的症状，包括阻止或延迟疾病症状的发作和/或减少疾病或病症的严重度或频率。术语“受试者”、“患者”或“个体”在本文定义为包括动物如哺乳动物，包括但不限于，灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛族动物、羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物或鼠类物种。优选的，动物为人。

术语“抑制成纤维细胞的增殖”是指杀死细胞或永久性地或临时性地阻止或减缓细胞的生长。如果在施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物后，受试者中成纤维细胞的数目保持恒定或减少，那么可推断此类细胞的增殖被抑制。如果成纤维细胞的绝对数目增加但胶原产生速率减小也可推断成纤维细胞的增殖被抑制。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了miRNA-4769-3p表达水平与硬皮病的发生发展相关，抑制miRNA-4769-3p的表达可减轻皮肤硬化萎缩症状，通过检测受试者miRNA-4769-3p的表达水平，可以判断受试者是否患有硬皮病，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案，miRNA-4769-3p抑制剂可作为一种可用于制备防治硬皮病的药物用于硬皮病治疗。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的材料、试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。其中，所述miRNA-4769-3p inhibitor和miRNA-4769-3p Antagomir购自广州锐博生物技术有限公司

实施例1、与硬皮病相关的miRNA的筛选

1、样本获取：各收集4例正常人和硬皮病血浆样本。上述所有样本均得到中南大学湘雅二医院临床学院伦理委员会的批准，所有受试对象在参加研究前，均向其详细介绍研究内容，自愿参加，同时签署书面知情同意书。

2、样本总RNA的提取

具体步骤如下：

1)取血浆样本250μl和2-8μl Polyacryl Carrier加入750μl TRI Reagent BD中，将管盖盖紧，涡旋充分震荡混匀；

2)样本室温放置5分钟，使核蛋白复合物彻底裂解；

3)为彻底裂解复合物，每750μl TRI Reagent BD中加入氯仿200μl，盖紧后剧烈震荡15s；

4)混合物室温放置2-5分钟，置于离心机4℃，12,000g，离心15分钟，离心后，混合物分成三层，RNA存在于上层无色液体中；

5)把上层无色液体转至新的EP管，保留中层和下层有机相用于下一步的DNA和蛋白提取；

6)加异丙醇沉淀RNA并颠倒几次混匀(每750μl TRI Reagent BD加入500μl异丙醇)，室温放置5-10分钟；

7)4℃，12,000g，离心8分钟，RNA沉于管底，形成白色絮状物；

8)弃上清，加入75％酒精洗涤RNA，1ml TRI Reagent BD加入75％酒精750μl；

9)4℃，7,500g离心RNA悬浮液5分钟，若RNA沉淀位于管壁或者处于漂浮状态，继续在12,000g速度下离心；

10)弃酒精漂洗液，并于室温放置约5分钟使RNA干燥，溶解RNA放于滤纸上吸干，加无酶ddH₂O使RNA充分溶解，55-60℃孵育10-15分钟；

3、RNA样品的质量分析

用Nandrop2000分光光度计检测所得TotalRNA的浓度，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，AgilentTechnologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为28S:18S≥1.5可以初步判定总RNA质量较好。

4、使用的由美国Agilent公司提供的Human microRNA microarray，AgilentHuman miRNA芯片V21.0数据库来源于microRNA数据库(miRBase)21.0版本，覆盖2549个人类相关的miRNA。芯片设计采用了Agilent公司独特的microRNAs检测技术，能特异性地检测出成熟的microRNAs并能很好地区分高度同源的microRNAs分子。具体操作按照相应说明书。

5、miRNA芯片扫描与数据提取：

1)用Agilent Scan Control software软件进行芯片扫描。

2)用Agilent Feature Extraction(AFE)software version 10.7.1.1或更高版本的软件进行数据提取。

6、结果：

分析miRNA芯片表达谱的检测结果，可知miRNA-4769-3p在正常人和硬皮病人血浆中的表达存在显著差异，与正常人血浆相比，硬皮病人血浆中miRNA-4769-3p的水平显著升高。

实施例2、qRT-PCR验证差异表达的miRNA-4769-3p

1、根据miRNA芯片的检测结果选择miRNA-3926-1进行大样本qPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择正常人和硬皮病人血浆样本各83例。

2、RNA提取过程同实施例1。

3、逆转录：

使用茎环法，具体步骤参照美国GeneCopoeia(复能基因)All-in-One^TMmiRNA逆转录试剂盒说明书。

4、QPCR反应：

1)引物设计

扩增miRNA-4769-3p的引物

正向引物：ggg tctgccatcctccct(SEQ ID NO.2)

反向引物：gtgcagggtccgaggt(SEQ ID NO.3)

扩增U6snRNA的引物

正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA；

反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT2。

利用定量PCR仪

96进行实时荧光PCR反应，具体步骤可参照美国GeneCopoeia(复能基因)All-in-One^TMmiRNA qPCR试剂盒说明书。

5、结果

如图1所示，与正常人相比，硬皮病人血浆中miRNA-4769-3p的表达水平显著升高，与miRNA芯片结果一致。

实施例3、qRT-PCR验证miRNA-4769-3p对成纤维细胞胶原表达的影响

1、转染miRNA-4769-3p inhibitor至成纤维细胞内，具体步骤参照广州锐博生物技术有限公司miRNA转染试剂说明书。

2、24小时后提取成纤维细胞总RNA，RNA提取过程同实施例1。

3、逆转录为cDNA，具体步骤参照TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser试剂盒说明书。

4、QPCR反应：

1)引物设计

扩增colⅠ的引物

正向引物：5’-GAACGCGTGTCATCCCTTGT-3’

反向引物：5’-GAACGAGGTAGTCTTTCAGCAACA-3’

利用定量PCR仪

5、结果

如图2所示，抑制miRNA-4769-3p表达后，成纤维细胞Ⅰ型胶原表达降低。

实施例4、动物实验验证miRNA-4769-3p对硬皮病的影响

1、6周龄小鼠使用博来霉素制备硬皮病小鼠模型，具体步骤可参照《博来霉素诱导硬皮病动物模型的建立及免疫学特征检测》。

2、实验组及对照组分别注射miRNA-4769-3p Antagomir和PBS，每周注射一次。

3、两周后处死小鼠，取小鼠注射部位周围皮肤固定。

4、masson染色观察小鼠皮肤变化：

1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min、无水乙醇Ⅰ10min、无水乙醇Ⅱ10min、95％酒精5min、90％酒精5min、80％酒精5min、70％酒精5min、蒸馏水洗。

2)苏木素染细胞核：Weigert氏铁苏木素染5min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，流水冲洗数分钟返蓝。

3)丽春红染色：丽春红酸性品红液染5-10min，蒸馏水快速漂洗。

4)磷钼酸处理：内磷钼酸水溶液处理约3-5min。

5)苯胺蓝染色：不用水洗，直接用苯胺蓝液复染5min。

6)分化：1％冰醋酸处理1min。

7)脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min、95％酒精II 5min、无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、二甲苯Ⅰ5min、二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

5、结果

如图3所示，与正常小鼠皮肤相比，使用miRNA-4769-3pAntagomir的小鼠皮肤胶原减少，皮肤变薄，脂肪细胞增多。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中南大学湘雅二医院

<120> miRNA-4769-3p及其同源物的应用

<130> MP1921412

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ucugccaucc ucccucccua c 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggtctgcca tcctccct 18

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgcagggtc cgaggt 16

Claims

1.检测血浆miRNA-4769-3p表达水平的试剂在制备诊断硬皮病的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为测定miRNA-4769-3p水平产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述测定miRNA-4769-3p水平的方法包括qRT-PCR、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序。

4.抑制miRNA-4769-3p的表达的试剂在制备治疗硬皮病的药物中的应用；所述抑制miRNA-4769-3p表达的试剂为miRNA-4769-3p inhibitor和miRNA-4769-3p Antagomir。

5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。

6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物还包括一种或多种治疗硬皮病的其它药物。