CN112007012A - 一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法 - Google Patents

一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法，其制备方法包括以下步骤：A、将PBMC细胞使用培养基培养，得到离体成熟树突状细胞；B、向离体成熟树突状细胞中加入Proteinase K进行预处理；C、向预处理后的离体成熟树突状细胞中加入0.3～1.2倍体积的外泌体提取试剂，离心30～50min，收集上清液，且离心力为3000～5000g；D、将上清液离心100～150min，再次收集上清液。本发明制备的脂质微囊体积小，容易在体内循环，易于到达损伤组织，同时也增加了其被机体胃肠粘膜吸收的速度和吸收量，体内吸收好，从而达到较高的生物利用度和快速发挥药效的作用，且本脂质微囊制备条件温和、简单可控、适宜规模化生产、制备成本低、使产品具有价格优势。

Description

一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体为一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法。
背景技术
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡（30-150nm），现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡，1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johns tone将其命名为“exosome”，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，微囊右侧微型胶囊，是指固态或液态药物（囊心物，core or fill material）被囊材（shellmaterial）包裹而成的药库型微型胶囊，微囊中包载的药物可在特定的部位和介质中释放，具有缓释、控释或靶向释放等不同的释药特征，但现有的脂质微囊体积较大，不容易被机体胃肠粘膜吸收，且制备要求高，过程复杂，从而增加了其制备成本，为此，我们提出一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法，其制备方法包括以下步骤：
A、将PBMC细胞使用培养基培养，得到离体成熟树突状细胞；
B、向离体成熟树突状细胞中加入Proteinase K进行预处理；
C、向预处理后的离体成熟树突状细胞中加入0.3～1.2倍体积的外泌体提取试剂，离心30～50min，收集上清液，且离心力为3000～5000g；
D、将上清液离心100～150min，再次收集上清液，沉淀部分另作他用，且离心力为10000～12500g；
E、将沉淀部分加入PBS重混后，离心100～120min，舍弃上清液，收集沉淀，沉淀用PBS混悬，离心力为12000～15000g；
F、在PBS混悬液中加入甘露醇至终浓度为10％，混匀后滤膜过滤；
G、向过滤液中加入外泌体溶解试剂，得到外泌体溶解液；
H、向外泌体溶解液中加入纯化微球，静置后离心，收集上清液即为高纯度外泌体；
I、将高纯度外泌体和稳定剂通过研磨、高速气流粉碎或高压均质制备外泌体平均粒径范围为20～200nm纳米晶体，分散在水中形成混悬液；
J、加入足量无水乙醇，并将混悬液在0.083～0.095MPa和50～70℃下蒸发回收乙醇至干，残余物质加入足量浓度为0.35～0.48g/L吐温20水溶液，并在超声条件下使其充分溶解，溶解完全后静置8～15min，得到外泌体纳米晶体混悬液；
K、将磷脂溶于有机溶剂后与外泌体纳米晶体混悬液混合乳化，随即除去液相干燥即可制成外泌体纳米晶体脂质微囊。
优选的，所述培养基包括0.5～1.3v/v％自体血浆、GM-CSF 50～70ng/mL、IL-4 30～50ng/mL和TNF-α5～10ng/mL。
优选的，所述稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、羟丙甲基纤维素、泊洛沙姆或聚氧乙烯-聚氧丙烯醚嵌段共聚物中的一种或两种以上混合物。
优选的，所述磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、氢化磷脂、神经鞘磷脂和二棕榈酰甘油磷脂中的一种或两种以上混合物。
优选的，所述除去液相干燥的方法为冷冻干燥或喷雾干燥，且外泌体纳米晶体脂质微囊的粒径范围为50～200μm。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明制备的脂质微囊体积小，容易在体内循环，易于到达损伤组织，同时也增加了其被机体胃肠粘膜吸收的速度和吸收量，体内吸收好，从而达到较高的生物利用度和快速发挥药效的作用，且本脂质微囊制备条件温和、简单可控、适宜规模化生产、制备成本低、使产品具有价格优势。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法，其制备方法包括以下步骤：
A、将PBMC细胞使用培养基培养，得到离体成熟树突状细胞；
B、向离体成熟树突状细胞中加入Proteinase K进行预处理；
C、向预处理后的离体成熟树突状细胞中加入0.3倍体积的外泌体提取试剂，离心30min，收集上清液，且离心力为3000g；
D、将上清液离心100min，再次收集上清液，沉淀部分另作他用，且离心力为10000g；
E、将沉淀部分加入PBS重混后，离心100min，舍弃上清液，收集沉淀，沉淀用PBS混悬，离心力为12000g；
F、在PBS混悬液中加入甘露醇至终浓度为10％，混匀后滤膜过滤；
G、向过滤液中加入外泌体溶解试剂，得到外泌体溶解液；
H、向外泌体溶解液中加入纯化微球，静置后离心，收集上清液即为高纯度外泌体；
I、将高纯度外泌体和稳定剂通过研磨、高速气流粉碎或高压均质制备外泌体平均粒径范围为20nm纳米晶体，分散在水中形成混悬液；
J、加入足量无水乙醇，并将混悬液在0.083MPa和50℃下蒸发回收乙醇至干，残余物质加入足量浓度为0.35g/L吐温20水溶液，并在超声条件下使其充分溶解，溶解完全后静置8min，得到外泌体纳米晶体混悬液；
K、将磷脂溶于有机溶剂后与外泌体纳米晶体混悬液混合乳化，随即除去液相干燥即可制成外泌体纳米晶体脂质微囊。
制备的脂质微囊体积小，容易在体内循环，易于到达损伤组织，同时也增加了其被机体胃肠粘膜吸收的速度和吸收量，体内吸收好，从而达到较高的生物利用度和快速发挥药效的作用，且本脂质微囊制备条件温和、简单可控、适宜规模化生产、制备成本低、使产品具有价格优势。
培养基包括0.5v/v％自体血浆、GM-CSF 50ng/mL、IL-4 30ng/mL和TNF-α5ng/mL。
稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮、羟丙甲基纤维素和泊洛沙姆或聚氧乙烯-聚氧丙烯醚嵌段共聚物三种的混合物，且聚乙烯吡咯烷酮、羟丙甲基纤维素和泊洛沙姆或聚氧乙烯-聚氧丙烯醚嵌段共聚物之间的比例为1.7：2：1.5。
磷脂为大豆磷脂、卵磷脂和二棕榈酰甘油磷脂三种的混合物，且大豆磷脂、卵磷脂和二棕榈酰甘油磷脂之间的比例为2：2：1.5。
除去液相干燥的方法为冷冻干燥或喷雾干燥，且外泌体纳米晶体脂质微囊的粒径范围为50μm。
实施例二：
一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法，其制备方法包括以下步骤：
A、将PBMC细胞使用培养基培养，得到离体成熟树突状细胞；
B、向离体成熟树突状细胞中加入Proteinase K进行预处理；
C、向预处理后的离体成熟树突状细胞中加入1.2倍体积的外泌体提取试剂，离心50min，收集上清液，且离心力为5000g；
D、将上清液离心150min，再次收集上清液，沉淀部分另作他用，且离心力为12500g；
E、将沉淀部分加入PBS重混后，离心120min，舍弃上清液，收集沉淀，沉淀用PBS混悬，离心力为15000g；
F、在PBS混悬液中加入甘露醇至终浓度为10％，混匀后滤膜过滤；
G、向过滤液中加入外泌体溶解试剂，得到外泌体溶解液；
H、向外泌体溶解液中加入纯化微球，静置后离心，收集上清液即为高纯度外泌体；
I、将高纯度外泌体和稳定剂通过研磨、高速气流粉碎或高压均质制备外泌体平均粒径范围为200nm纳米晶体，分散在水中形成混悬液；
J、加入足量无水乙醇，并将混悬液在0.095MPa和70℃下蒸发回收乙醇至干，残余物质加入足量浓度为0.48g/L吐温20水溶液，并在超声条件下使其充分溶解，溶解完全后静置15min，得到外泌体纳米晶体混悬液；
K、将磷脂溶于有机溶剂后与外泌体纳米晶体混悬液混合乳化，随即除去液相干燥即可制成外泌体纳米晶体脂质微囊。
制备的脂质微囊体积小，容易在体内循环，易于到达损伤组织，同时也增加了其被机体胃肠粘膜吸收的速度和吸收量，体内吸收好，从而达到较高的生物利用度和快速发挥药效的作用，且本脂质微囊制备条件温和、简单可控、适宜规模化生产、制备成本低、使产品具有价格优势。
培养基包括1.3v/v％自体血浆、GM-CSF 70ng/mL、IL-4 50ng/mL和TNF-α10ng/mL。
稳定剂为聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、羟丙甲基纤维素和泊洛沙姆三两种的混合物，且聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、羟丙甲基纤维素和泊洛沙姆之间的比例为1.3：1.8：2。
磷脂为氢化磷脂、神经鞘磷脂和二棕榈酰甘油磷脂三种的混合物，且氢化磷脂、神经鞘磷脂和二棕榈酰甘油磷脂之间的比例为1：1：2。
除去液相干燥的方法为冷冻干燥或喷雾干燥，且外泌体纳米晶体脂质微囊的粒径范围为200μm。
使用时，制备的脂质微囊体积小，容易在体内循环，易于到达损伤组织，同时也增加了其被机体胃肠粘膜吸收的速度和吸收量，体内吸收好，从而达到较高的生物利用度和快速发挥药效的作用，且本脂质微囊制备条件温和、简单可控、适宜规模化生产、制备成本低、使产品具有价格优势。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
A、将PBMC细胞使用培养基培养，得到离体成熟树突状细胞；
B、向离体成熟树突状细胞中加入Proteinase K进行预处理；
C、向预处理后的离体成熟树突状细胞中加入0.3～1.2倍体积的外泌体提取试剂，离心30～50min，收集上清液，且离心力为3000～5000g；
D、将上清液离心100～150min，再次收集上清液，沉淀部分另作他用，且离心力为10000～12500g；
E、将沉淀部分加入PBS重混后，离心100～120min，舍弃上清液，收集沉淀，沉淀用PBS混悬，离心力为12000～15000g；
F、在PBS混悬液中加入甘露醇至终浓度为10％，混匀后滤膜过滤；
G、向过滤液中加入外泌体溶解试剂，得到外泌体溶解液；
H、向外泌体溶解液中加入纯化微球，静置后离心，收集上清液即为高纯度外泌体；
I、将高纯度外泌体和稳定剂通过研磨、高速气流粉碎或高压均质制备外泌体平均粒径范围为20～200nm纳米晶体，分散在水中形成混悬液；
J、加入足量无水乙醇，并将混悬液在0.083～0.095MPa和50～70℃下蒸发回收乙醇至干，残余物质加入足量浓度为0.35～0.48g/L吐温20水溶液，并在超声条件下使其充分溶解，溶解完全后静置8～15min，得到外泌体纳米晶体混悬液；
K、将磷脂溶于有机溶剂后与外泌体纳米晶体混悬液混合乳化，随即除去液相干燥即可制成外泌体纳米晶体脂质微囊。
2.根据权利要求1所述的一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法，其特征在于：所述培养基包括0.5～1.3v/v％自体血浆、GM-CSF 50～70ng/mL、IL-4 30～50ng/mL和TNF-α5～10ng/mL。
3.根据权利要求1所述的一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法，其特征在于：所述稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、羟丙甲基纤维素、泊洛沙姆或聚氧乙烯-聚氧丙烯醚嵌段共聚物中的一种或两种以上混合物。
4.根据权利要求1所述的一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法，其特征在于：所述磷脂为大豆磷脂、卵磷脂、氢化磷脂、神经鞘磷脂和二棕榈酰甘油磷脂中的一种或两种以上混合物。
5.根据权利要求1所述的一种类外泌体结构的脂质微囊制备方法，其特征在于：所述除去液相干燥的方法为冷冻干燥或喷雾干燥，且外泌体纳米晶体脂质微囊的粒径范围为50～200μm。
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