KR20170103692A - 마이크로필러를 이용한 시료 박편의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 필러를 이용한 시료 박편의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법은 종래의 3차원 배양 또는 절편 제조기술과 비교하여, 각각의 과정에서 발생할 수 있는 세포의 구조 및 기능의 손상을 최소화시켜 다세포 구상체의 박편을 효과적으로 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 절편 내 3차원 세포를 어레이 형태로 배열하여 약물 분포 또는 효능의 신속한 스크리닝 및 효능 관련 분자의 탐색을 가능하게 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

마이크로필러를 이용한 시료 박편의 제조방법 {Method for preparing section sample using micropillar}
본 발명은 마이크로필러를 이용한 시료 박편의 제조방법에 관한 것이다.
신약 개발의 성공 여부는 유효한 선도 물질을 초기에 도출할 수 있는지 여부에 달려있다. 약물의 흡수 (Absorption), 분포 (Distribution), 대사 (Metabolism), 배설 (Excretion)을 의미하는 ADME는 약물의 유효성을 결정하는 약물 동태적 특성이며, 이러한 특성이 불량할 경우, 신약개발에 실패하게 된다. 따라서, 이를 예측하기 위한 in vitro 평가 모델 및 기법이 개발되어 신약의 탐색 초기에 적용됨으로써 신약 개발의 실패율을 감소시켜 왔다.
이러한 노력에도 불구하고, 항암제의 신약 개발에 있어서, '유효성' 확보의 미검증 때문에 임상개발 단계에서의 항암 효능의 부족으로 인한 실패율이 여전히 높은 실정이다. 상기 ADME의 경우와 유사하게 항암제의 유효성을 개발 초기 단계에서 검증하는 것이 필요하다. 종래의 유효성 평가는 In-vitro 2D 세포 배양 모델 기반으로 이루어졌으나, 이러한 방법은 고형암의 역동적인 조직병리를 반영할 수 없어 임상 유효성 예측에 한계가 있었다. 따라서, 항암제의 유효성 평가를 위한 최선의 방법으로, 고형암의 고유 특징인 3D 구조 (3-Dimensionality)와 이질적 세포 상호작용 (Heterotypic cell interaction) 등 종양의 미세 환경적 (Tumor microenvironment) 특징이 재현되는 3D 세포 배양계를 이용하는 방법이 주목받고 있다.
3차원 배양계를 이용한 생체 모사형 조직 배양계는 약물의 분포나 세포 내 축적을 연구하는데 좋은 모델로 평가받고 있으며, 약동-약력학적 평가에도 사용됨이 보고된 바 있다. 이러한 3차원 배양계는 1980년 이후 다양한 조직 병리학적인 연구 목적에 따라 활용되어 왔으며, 최근 많은 연구진에 의해 다층 세포 배양계와 다세포 구상체 등의 3차원 배양계가 더욱 활발히 연구되고 있다. 일례로서, 세포 밀집도에 따른 약물의 조직 분포 연구, 저산소에서 독성을 나타내는 약물의 평가와 항암 약물과 방사선 치료의 병용 실험 등에 활용되고 있다.
한편, 암은 크게 혈액암과 고형암으로 나뉘는데 고형암은 일반적으로 위, 대장, 간 등 장기에 발생하는 암으로 전체 암의 95% 이상을 차지하고 있다. 오늘날, 대규모의 다국적 제약 회사들이 새로운 항암제를 개발하고 있으나, 고형암에 (특히 췌장암, 간암, 신장암 등) 대해서는 아직도 만족할 만한 치료율 개선이 이루어지지 않고 있는 실정이다. 특히, 고형암은 종양 미세환경 내의 기질 세포나 세포외 기질과 공존하며, 이들과의 접촉 또는 비접촉의 상호접촉을 통해 병이 진행되고 이를 통해 약물 내성을 획득한다고 알려져 있다. 이와 더불어, 고형암 조직은 약물의 접근이 쉽지 않은 특성을 가지며, 암 조직 내 불완전한 혈관계는 불완전한 혈류, 조직 내 간극 압력 (Interstital Fluid Pressure)의 상승을 유도하여 오히려 약물의 조직 내 분포를 방해하고 결과적으로 항암효과를 떨어뜨리는 요인으로 작용하고 있다. 마찬가지로 세포외 기질 (Extracellular matrix, ECM)도 약물의 투과성에 영향을 미쳐 항암효과에 악영향을 미치고 있다. 이에 비추어 볼 때, 신규 항암제의 개발 성공율을 높이기 위해서는, 개발 초기 단계에서 유효성과 조직 투과 특성을 평가하고 생체 내 또는 임상에서의 유효성과 조직 분포를 함께 예측할 수 있는 시스템이 필요하다.
이러한 배경하에서, 생체 모사형 모델에서의 평가를 위한 3차원 세포 배양기술이 개발되고 있고, 이러한 3차원 배양된 세포에서의 세포 독성 및 세포 내외 발현되는 생체 고분자 물질들 (단백질, 핵산, 당단백) 등의 발현 변화를 분석하는 기술이 절실히 요구되고 있다. 현재, 변화를 추적하는 트레이서 또는 염료와 형광 현미경을 기초로 하는 기술들이 개발되어 사용되고 있으나, 광학적 한계와 이러한 물질들 자체의 투과성의 한계로 불완전한 결과만을 얻고 있는 상황이다. 따라서, 이러한 종래 문제점들이 개선된 조직 절편 제조 기술에 대한 요구가 있으나, 삼차원 배양된 세포들은 그 구조와 상태가 온전히 유지된 상태로 여러 과정을 거치기 쉽지 않기 때문에 실험자가 용이하게 사용할 수 있는 절편 제작 기술은 아직 미비한 실정이다 (한국 공개특허 제2015-0027006호).
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 (a) 세포 시료가 혼입된 바이오 매트릭스가 부착되어 있는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 배양 챔버에 대향하도록 침지시켜 세포를 3차원 배양시키는 단계; (b) 상기 3차원 배양된 세포를 포함하는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 고형화 물질이 함유된 챔버에 대향하도록 침지시켜 고형화 블록을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 고형화 블록으로부터 필러를 상기 침지 방향과 반대 방향으로 제거하고, 상기 필러가 제거된 고형화 블록을 박편으로 절단하는 단계를 포함하는, 시료 박편의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 방법으로 제조된, 후보물질이 처리된 시료 박편으로부터 세포의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 후보물질의 활성 측정방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같은 방법으로 제조된, 후보물질이 처리된 시료 박편에서의 세포 활성을 후보물질 비처리군과 비교하는 단계를 포함하는, 치료물질 또는 선도물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 세포 시료가 혼입된 바이오 매트릭스가 부착되어 있는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 배양 챔버에 대향하도록 침지시켜 세포를 3차원 배양시키는 단계; (b) 상기 3차원 배양된 세포를 포함하는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 고형화 물질이 함유된 챔버에 대향하도록 침지시켜 고형화 블록을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 고형화 블록으로부터 필러를 상기 침지 방향과 반대 방향으로 제거하고, 상기 필러가 제거된 고형화 블록을 박편으로 절단하는 단계를 포함하는, 시료 박편의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 세포는, 암 세포 또는 줄기 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 바이오 매트릭스는, bFGF (Fibroblast growth factor)-알지네이트, 헤파린-알지네이트, 폴리글리콜산, 폴리글리콜산-콜라겐, 라미닌, 메트리젤, 피브린, 콜라겐 또는 알지네이트로 이루어지는 하이드로겔일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (a) 단계 이전에, 필러의 표면에 폴리-L-라이신 (Poly-L-lysine), 폴리-D-라이신 (Poly-D-lysine), 및 도파민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물과 Mg2 +, Ca2 +, Ba2 +, 및 Cu2 +로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 금속 이온을 포함하는 화합물을 처리 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 배양액은, 후보약물이 첨가되어 있을 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 필러는, 세포 시료가 혼입된 바이오 매트릭스가 부착되어 있는 필러의 일측 말단부에 가까워질수록 직경이 작아지는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 고형화 물질은, 파라핀, 동결조직 포매제 (OCT compound) 또는 히스토젤 등 상용화된 포매제일 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기와 같은 방법으로 제조된, 후보물질이 처리된 시료 박편으로부터 세포의 활성을 측정하는 단계를 더 포함하는, 후보물질의 활성 측정방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 방법으로 제조된, 후보물질이 처리된 시료 박편에서의 세포 활성을 후보물질 비처리군과 비교하는 단계를 포함하는, 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 시료 박편의 제조방법은, 종래의 3차원 배양 또는 절편 제조기술과 비교하여, 각각의 과정에서 발생할 수 있는 세포의 구조 및 기능의 손상을 최소화하여 다세포 구상체의 박편을 효과적으로 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 박편 내 3차원 세포를 어레이 형태로 배열함으로써 약물 분포 또는 효능을 실험군간 다중비교하여 신속한 스크리닝을 할 수 있다. 구체적으로, 필러를 이용한 대량 및 고속 3차원 배양계를 기반으로, 항암 후보물질의 약동, 약력학적 특성을 신속하게 스크리닝 (프로파일링)할 수 있으며, 형광 표지자 또는 면역화학염색법, 면역형광염색법 등과 결합한 이미지 획득방법, 및 핵산, 단백질 등 세포 생물학적 인자의 발현을 분석하는 방법을 개발하여 하이 컨텐트 스크리닝 (HCS)을 가능하게 할 수 있을 것이다.
궁극적으로, 이러한 연구를 통해 신약의 타겟 분자/타겟 신호경로 및 바이오 마커 발굴이 가능할 것이며, 항암 약물의 비임상 평가의 효율성을 극대화하여 신약 개발의 성공률 제고에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은, 본 발명의 방법에 의한 시료 박편의 제조과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는, 씨딩 (seeding) 밀도 및 알지네이트 농도의 차이에 의한 다양한 배양 조건에서 3차원 배양된 HT-29 세포 구상체를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 3은, 3차원 배양된 HT-29, DLD-1, HCT-116, 및 Panc-1 세포 구상체를 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4는, (a) 본 발명의 방법에 의해 제조된 HT-29 세포 구상체 동결절편을 헤마톡실린으로 염색한 결과 및 헤마톡실린으로 염색된 HT-29 세포 구상체 동결절편 중 일부를 확대하여 관찰한 결과, (b) 4일 또는 8일 동안 배양시킨 HT-29 세포 구상체의 크기 분포를 정량적으로 비교한 결과이다.
도 5는, 3차원 배양된 HT-29 세포 구상체 동결절편에서, (a) E-cadherin, (b) 제1형 콜라겐, (c) Laminin의 발현을 면역화학염색을 통하여 확인한 결과이다.
도 6은, 3차원 배양된 HT-29 세포 구상체 동결절편에서, Doxorubicin 처리 농도 (25, 50, 75, 및 100M)에 따른 Doxorubicin의 분포를 (a) 대표 슬라이드 및 (b) 5×5 어레이에서 확인한 결과, (c) 노출된 Doxorubicin 농도와 HT-29 세포 구상체 내로 유입된 Doxorubicin간 상관관계를 정량적으로 평가한 결과이다.
도 7은, 3차원 또는 2차원 배양된 HT-29 구상체에서, (a) 5-Fluorouracil, (b) Tirapazamine 노출에 따른 세포 생존율을 정량적으로 비교한 결과이다.
도 8은, 3차원 배양된 HT-29 세포 구상체 동결절편에서, 5-Fluorouracil 또는 Tirapazamine 처리 농도 (3.7, 11.1, 33.3, 및 100M)에 따른 cleaved-PARP의 발현을 (a) 대표 슬라이드 및 (b) 5×5 어레이에서 확인한 결과, (c) 5-Fluorouracil 또는 Tirapazamine 노출에 따른 세포 사멸율을 정량적으로 평가한 결과이다.
도 9는, 본 발명의 방법에 따라 바이오 매트릭스로 알지네이트, 제1형 콜라겐, 또는 메트리젤을 사용하여 제조된 HT-29 세포 구상체 또는 Panc-1 세포 구상체를 헤마톡실린으로 염색한 결과이다.
도 10은, 본 발명의 필러의 형태를 나타낸 측면도이다.
본 발명자들은, 세포 시료와 혼입된 바이오 매트릭스를 부착시킨 필러를 배양액에 침지시킴으로써, 생체 모사형 조건하에서 다세포 구상체를 효과적으로 배양시킬 수 있었다. 이 뿐만 아니라, 필러를 재차 이용하여 상기 배양된 다세포 구상체를 함유하는 고형화된 블록 및 박편을 효과적으로 수득할 수 있었으며, 이를 통해 약물의 분포 또는 효능의 신속한 스크리닝이 가능함을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 시료 박편의 제조방법을 제공한다.
(a) 세포 시료가 혼입된 바이오 매트릭스가 부착되어 있는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 배양 챔버에 대향하도록 침지시켜 세포를 3차원 배양시키는 단계;
(b) 상기 3차원 배양된 세포를 포함하는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 고형화 물질이 함유된 챔버에 대향하도록 침지시켜 고형화 블록을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 고형화 블록으로부터 필러를 상기 침지 방향과 반대 방향으로 제거하고, 상기 필러가 제거된 고형화 블록을 박편으로 절단하는 단계.
이하에서는, 본 발명에 따른 시료 박편의 제조방법의 각각 단계에 대하여 상세히 설명하기로 한다.
단계 (a)에서는, 판 부재의 일면에 구비된 필러에 생물학적 시료가 혼입된 바이오 매트릭스를 부착시키고, 상기 세포 시료가 혼입된 바이오 매트릭스가 부착되어 있는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 배양 챔버에 대향하도록 침지시켜 세포를 3차원 배양시킨다.
본 발명에서 사용되는 용어, "판 부재"는 생물학적 시료를 대상으로 하는 실험을 위해 사용되는 부재를 일컫는 것으로서, 생물학적 시료에 혼입된 바이오 매트릭스가 부착되는 부위을 제공하는 필러가 일 면에 구비되어 있으며, 특별히 재질의 제한을 두지 않는다. 또한, "생물학적 시료"는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함되고, 보다 구체적으로, 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있으며, 바람직하게는 세포 시료, 가장 바람직하게는 암 세포 또는 줄기 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 시료는 사용하기 전에 전처리할 수 있으며, 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 및 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 아울러, "바이오 매트릭스"는 세포가 3차원 배양되는 공간을 제공하는 물질로서, 바람직하게 bFGF (Fibroblast growth factor)-알지네이트, 헤파린-알지네이트, 폴리글리콜산, 폴리글리콜산-콜라겐, 라미닌, 메트리젤, 피브린, 콜라겐 또는 알지네이트로 이루어지는 하이드로겔일 수 있으나, 생체 적합성을 갖는 물질이라면, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 상기 (a) 단계 이전에, 필러의 표면에 폴리-L-라이신 (Poly-L-lysine), 폴리-D-라이신 (Poly-D-lysine), 및 도파민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물과 Mg2 +, Ca2 +, Ba2 +, 및 Cu2 + 등의 2가 금속 이온을 포함하는 화합물을 처리함으로써, 필러의 표면과 바이오 매트릭스간 접착력을 더욱 증진시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, 필러는 기둥 형상을 갖는 구조체로서, 전술한 바와 같이, 생물학적 시료가 혼입된 바이오 매트릭스가 부착되는 부위를 제공한다. 또한, 상기 필러는 도 10에 도시한 바와 같이, 상기 판 부재 (100)와 인접되어 있는 베이스부 (210), 바이오 매트릭스가 부착되는 말단부 (220), 상기 베이스부와 말단부를 연결하는 로드부로 이루어진다. 바람직하게, 상기 필러는 베이스부로부터 말단부로 가까워질수록 직경이 감소하며 (d1>d2), 이러한 필러의 형태는, 본 명세서에 후술되는, 필러를 제거하는 단계를 보다 용이하게 하며, 바이오 매트릭스를 포함하는 고형화 블록의 손상을 최소화시킨다.
한편, 상기 바이오 매트릭스가 부착된 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 배양 챔버에 대향하도록 침지시켜 세포를 3차원 배양시킴으로써, 특히 삼차원 in vitro 모델인 다세포 구상체 (Multicellular spheroid, MCS)를 수득할 수 있다. 종래 다세포 구상체를 배양하기 위하여, 1.5% 아가로즈(agarose)가 코팅된 96-well U-bottom plate를 이용하는 liquid overlay법 또는 상업적으로 구매 가능한 미부착형 96 웰 플레이트를 이용하는 법 등이 이용되어 왔으나, 이러한 방법으로도 배양되지 않는 다세포 구상체들이 존재할 뿐만 아니라, 이들의 응집도가 미약하였는바, 본 발명에서는 바이오 매트릭스가 부착된 필러를 배양액이 함유된 챔버에 침지시키는 방법을 통해 다세포 구상체를 효과적으로 배양하고자 하였다. 본 발명에서 사용되는 배양 챔버는, 세포의 배양 또는 성장을 위해 제공되는 배양물질을 수용하는 공간으로서, 종래 널리 이용되고 있는 96-웰 플레이트일 수 있으며, 보다 바람직하게는 5×5 어레이 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단계 (b)에서는, 상기 3차원 배양된 세포를 포함하는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 고형화 물질이 함유된 챔버에 대향하도록 침지시켜 고형화 블록을 제조함으로써, 3차원 배양된 세포를 고정화시킨다. 본 발명에서 사용되는 용어, 고형화 물질은 챔버에 일정한 높이를 갖는 하나의 층 또는 블록을 형성할 수 있는 물질로서, 3차원 배양된 세포를 포함하는 바이오 매트릭스를 내부에 수용할 수 있으며, 바람직하게 파라핀 또는 동결조직 포매제 (OCT compound) 또는 히스토젤 등 상용화된 포매제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단계 (c)에서는, 상기 고형화 블록으로부터 필러를 상기 침지 방향과 반대 방향으로 제거하고, 상기 필러가 제거된 고형화 블록을 박편으로 절단함으로써, 동결절편 또는 파라핀 절편 등의 시료 박편을 제조한다. 필러를 상기 침지 방향과 반대 방향인, 챔버의 상측면 방향으로 제거함으로써, 고형화 블록에 인접해 있는 필러를 손쉽게 제거할 수 있고, 이에 따라, "┗┛" 형태의 고형화 블록을 수득할 수 있다. 상기 필러가 제거된 고형화 블록의 함몰된 부위에 3차원 배양된 세포를 포함하는 바이오 매트릭스가 위치하게 되며, 상기 고형화 블록의 함몰된 부위가 상측으로로 열려있는 상태 ("┗┛")에서, 윗면에서부터 슬라이스화 또는 절단된다. 이러한 방법은 고형화 블록 내 상기 3차원 배양된 세포의 위치를 명확하게 특정할 수 있어, 동결 절편 제조와 관련된 편이성 및 효율성을 증진시킨다.
한편, 본 발명의 다른 양태로서, (a) 세포 시료가 혼입된 바이오 매트릭스가 부착되어 있는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 후보물질이 함유된 배양 챔버에 대향하도록 침지시켜 세포를 3차원 배양시키는 단계; (b) 상기 3차원 배양된 세포를 포함하는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 고형화 물질이 함유된 챔버에 대향하도록 침지시켜 고형화 블록을 제조하는 단계; (c) 상기 고형화 블록으로부터 필러를 상기 침지 방향과 반대 방향으로 제거하고, 상기 필러가 제거된 고형화 블록을 박편으로 절단하는 단계; 및 (d) 상기 박편에서 세포의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 후보물질의 활성 측정방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, (a) 세포 시료가 혼입된 바이오 매트릭스가 부착되어 있는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 후보물질이 함유된 배양 챔버에 대향하도록 침지시켜 세포를 3차원 배양시키는 단계; (b) 상기 3차원 배양된 세포를 포함하는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 고형화 물질이 함유된 챔버에 대향하도록 침지시켜 고형화 블록을 제조하는 단계; (c) 상기 고형화 블록으로부터 필러를, 상기 침지 방향과 반대 방향으로 제거하고 상기 고형화 블록을 박편으로 절단하는 단계; 및 (d) 상기 박편에서 세포의 활성을 후보물질 비처리군과 비교하는 단계를 포함하는, 치료물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서, 세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있으며, 세포의 활성 변화를 통해 특정 질병의 치료효과 또는 약제 내성 극복 등의 임상적 진단을 가능하게 하는 세포라면, 제한없이 적용될 수 있으며, 바람직하게는 암 세포일 수 있다. 본 발명의 후보물질은 3차원 배양된 세포, 특히 다세포 구상체에서 세포의 형태와 기능 및 활성 변화를 유발함으로써 임상적 치료 및 진단에 응용이 가능한 물질로서, 종래의 약물 또는 신규 약물의 구분없이 적용될 수 있으며, 일 구체예로, 5-Doxorubicin, Fluorouracil, 또는 Tirapazamine과 같은 항암 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 뿐만 아니라, 본 발명의 목적상, 상기 후보물질은 상기 3차원 배양된 세포 내외에서 발현되는 특정 생체 물질들 (단백질, 핵산, 당단백)의 발현에 영향을 미치거나 그 변화를 측정하는 성분까지 포함할 수 있어서, 세포 내 특정분자의 기능을 연구하기 위해서도 본 발명이 응용될 수 있다. 본 발명의 세포의 활성은 상기 세포의 종류 및 후보물질의 처리 목적에 따라 당업계에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 측정될 수 있으며, 예를 들면, 암세포의 경우, CCK-8 colormetric assay, calcein-AM/PI assay, cleaved-PARP과 같은 세포 사멸 인자의 발현 평가 등으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 마이크로 필러 칩을 이용한 다세포 구상체의 3차원 배양
1-1. 알지네이트 stock 용액의 준비 및 필러 표면의 전처리
멸균된 증류수와 알지네이트를 100-ml 글레스 바틀 (glass bottle)에 첨가하여 3% (wt/wt) 알지네이트 stock 용액을 제조하였으며, 알지네이트가 완전히 용해될 수 있도록 마그네틱 바를 이용하여 알지네이트 stock 용액을 교반시켰다. 상기 용액은 이용되기 전까지 -4℃에서 3% 알지네이트 stock 용액의 aliquots로 보관하였다.
Poly-l-lysine (PLL) 용액 (Sigma-Aldrich cat. No. P4707)을 필러의 말단에 처리하고, 생물 안전 작업대 (biosafety cabinet)에서 20분 동안 건조시켰다. 이후, BaCl2 용액을 PLL로 코팅된 필러에 처리하고 다시 20분 동안 건조시켰다.
1-2. 알지네이트/세포 혼합물의 제조
T-75 플라스크로부터 증식용 배지 (growth media)를 제거하고, trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 분리한 뒤, 세포 현탁물을 원심분리시켜, 세포 펠렛을 제조하였다. 전보다 높은 온도에서 세포 펠렛을 재현탁시키고, 37℃의 신선한 증식용 배지에서 세포 현탁물을 수득하였다. 세포 현탁물과 3% 알지네이트 stock 용액을 혼합하여, 1% 알지네이트 내 2×106 cell/ml의 농도로 세포가 존재하는 알지네이트/세포 혼합물을 제조하였다.
1-3. 세포의 로딩
25 필러의 위치와 일치하도록 96-웰 플레이트 내 5×5 웰 각각에 200㎕의 증식용 배지가 첨가된 2개의 플레이트를 준비하였고, 이들을 37℃, CO2 인큐베이터에 20분 이상 두었다. 생물 안전 작업대 내에서 상기 제조된 알지네이트/세포 혼합물의 Droplet을 필러의 말단에 처리하였고, 알지네이트 겔을 형성시키기 위하여 실온에 1분간 방치하였다. 필러 홀더와 상기 96-웰 플레이트를 정렬하고, 알지네이트/세포 혼합물이 로딩된 5×5 어레이 필러의 말단을 200㎕의 증식용 배지를 함유하는 96-웰 플레이트에 담궜다. 이후, 96-웰 플레이트의 뚜껑을 덮고, 과도하게 존재하는 BaCl2를 제거하기 위하여 37℃, CO2 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이팅시킨 후, 본 배양을 진행하였다.
1-4. 다세포 구상체의 3차원 배양
37℃, CO2 인큐베이터에서 4일 내지 6일간 인큐베이팅시켰으며, 이 과정에서, 상기 알지네이트/세포 혼합물이 로딩된 필러를 신선한 증식용 배지가 첨가된 새로운 96-웰 플레이트로 이동시켜, 하루 걸러 한번씩 증식용 배지를 교체하였다.
제조예 2. 3차원 배양된 다세포 구상체에 대한 약물 노출
약물에 노출시키기 위하여, 후보약물 stock 용액으로 희석시킨 배양 배지를 준비하였다. 이후, 96-웰 플레이트 내 5×5 웰 어레이에 상기 약물이 함유된 배지 (200㎕)를 분주하여 약물 노출용 플레이트를 준비하였고, Doxorubicin (DOX)의 최종 농도는 각각 0, 25, 50, 75M이었으며, Tirapazamine (TPZ) 및 5-Fluorouracil (5-FU)는 0, 3.7, 11.1, 33.3M이었다. 구체적으로, 약물이 함유된 4개의 웰, 약물이 함유되지 않은 대조군 웰로 구성하였으며, 각 농도별로 5회 반복 노출되었다. 상기 약물 노출용 플레이트를 37℃, CO2 인큐베이터에서 10분간 둔 후, 여기에 상기 알지네이트/세포 혼합물이 로딩된 필러를 침지시켰다. 후보약물로 Doxorubicin이 사용된 경우에는 30분, Tirapazamine 또는 5-Fluorouracil이 사용된 경우에는 48시간 동안 인큐베이팅되었다. 본 실험에서, 상기와 같은 DOX, 및 TPZ 또는 5-FU의 처리는, 각각 3차원 배양 4일 및 6일째부터 시작하였다.
제조예 3. 3차원 배양된 다세포 구상체에 대한 동결절편의 제조
알지네이트/세포 혼합물이 로딩된 필러를 약물 노출용 플레이트로부터 분리하였다. 이후, 필러 위에서 3차원-배양된 다세포 구상체를 기체상의 액체 질소에 10분간 처리하여 동결시켰으며, 알지네이트/세포 혼합물이 하얀색으로 변색되었는지 여부를 확인하였다. 기체상의 액체 질소에서 칩이 동결되는 동안 tweezer를 사용하여 상기 25 필러를 칩 내에 구비된 중앙 정렬부로 옮겼으며, 이를 통해 5×5 어레이의 크기를 냉동 절편 표본 디스크의 사이즈와 일치시켜 정확하고 효과적인 절개를 가능하게 하였다. 상기와 같이 정렬된 5×5 어레이를 냉동 절편 표본 디스크가 조립되어 있는 엠베딩 지그 (embedding zig)에 위치시키고, OCT를 채웠으며, OCT로 포매된 블록을 microtome의 freezing deck에서 -20℃, 10분 동안 두었다. 이후, 상기 필러 칩만을 제거하여 알지네이트/세포 혼합물 Droplet을 OCT로 포매된 블록에 남겨두었고, 이후, 냉동 절편 표본 디스크에서 임베딩 지그를 분리하여 제거하였다. microtome을 이용하여 OCT/세포 블록을 임베딩 면에 수평이 되도록 절개하여 동결절편을 제조하고, 이를 현미경 슬라이드로 옮겨 현미경을 통해 5×5 스팟 어레이를 확인하였다.
실험예 1. 3차원 배양된 다세포 종양 구상체의 확인
본 실험예에서는, 세 가지 종류의 인간 결직장 선암종 (colorectal adenocarcinoma) 세포주인 HT-29, DLD-1, 및 HCT-116과 인간 췌장상피세포 암종 세포주인 Panc-1를 이용하여 3차원 배양된 다세포 종양 구상체의 형성을 배양배지 또는 동결절편 상에서 관찰하였다. 우선, 씨딩 (seeding) 밀도 및 알지네이트 농도의 차이에 의한 다양한 배양 조건에서, 배양배지 내 HT-29 세포 구상체의 성장을 관찰하였으며, 이와 함께 6일 동안 배양시킨 HT-29, DLD-1, HCT-116, 및 Panc-1 세포 구상체의 성장을 관찰하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, HT-29 세포 구상체는 시간이 경과함에 따라 점진적으로 크기가 증가하였으며 (도 2 참조), 6일 동안 배양시킨 Panc-1 세포는 100μm 직경으로, HT-29, DLD-1, 및 HCT-116 세포는 160μm 직경의 구상체까지 성장함을 확인하였다 (도 3 참조).
또한, 상기 제조예 3의 과정을 통하여, 3차원 배양된 HT-29 세포 구상체에 대한 동결절편을 제조하였으며, 상기 동결절편에 대한 조직 평가를 위하여 헤마톡실린 (hematoxylin)으로 염색하였다. 염색된 동결절편 한 지점에서의 구상체를 관찰하였으며, 4일 또는 8일 동안 배양시킨 HT-29 세포 구상체의 크기 분포를 정량적으로 비교하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 상호간 조밀하게 위치하고 있는 약 60개의 HT-29 세포 구상체가 관찰되었으며, 세포간 상호 작용이 가능할 정도로 구상체는 균등하게 분포하고 있었다. 또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 4일 또는 8일 동안 배양시킨 HT-29 세포 구상체는 평균 직경에서 뚜렷한 차이를 보였다. 구체적으로, 4일 동안 배양시킨 HT-29 세포 구상체의 직경은 100 내지 150μm의 범위 내에서 관찰된 반면, 8일 동안 배양시킨 HT-29 세포 구상체는 전체적인 직경이 크게 증가되어 있었으며, 200μm 이상의 직경을 가지는 구상체도 관찰되었다.
상기 결과로부터 본 발명의 방법은 다세포 종양 구상체를 효과적으로 성장 또는 배양시킬 수 있으며, 이러한 결과는 배양배지에서 뿐만 아니라, 동결절편에서도 관찰됨을 알 수 있었다.
실험예 2. 세포외 기질 단백질 및 세포간 접착 분자의 발현 확인
다세포 종양 구상체의 주요한 특성 중 하나는 세포외 기질 단백질 (Extracellular Matrix, ECM) 및 세포간 접착 분자의 발현이다. 이에 본 실험예에서는, 필러 위에서 3차원 배양된 HT-29 세포에서 E-cadherin, 제1형 콜라겐, Laminin의 발현 양상을 조사하였다. 이를 위하여, 1% 알지네이트로 포매된 HT-29 세포 구상체를 6일 동안 배양시키고, 수득한 동결절편에 면역화학염색을 실시하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 3차원 배양된 HT-29 세포 구상체에서 DAPI로 염색된 핵은 푸른색, 각 단백질의 항체는 붉은색으로 관찰되었으며, 이로부터 E-cadherin (도 5a 참조), 제1형 콜라겐 (도 5b 참조), Laminin (도 5c 참조)의 발현을 확인하였다. 콜라겐의 발현은 다른 두 단백질의 발현과 비교하여 핵 주변에서 뚜렷하게 관찰되었으며, 콜라겐 및 E-cadherin의 발현 양상은 매우 흡사한 반면, Laminin과는 다소 다른 양상을 보였다.
실험예 3. 3차원 배양된 다세포 종양 구상체 내 Doxorubicin 분포 확인
본 실험예에서는, 상기 제조예 2의 과정을 통해 노출시킨 3차원 배양된 HT-29 구상체의 Doxorubicin 분포를 red-fluorescent DOX로 조사하였다. 1%의 알지네이트로 포매되고 5×5 필러에 로딩된, HT-29 세포 구상체는 다양한 농도의 (0, 25, 50, 75, 및 100M) Doxorubicin에 30분간 노출되었고, 이후, 각 지점 당 형광세기는 동결절편 상에서 측정되었다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, HT-29 세포 구상체 내 Doxorubicin은 붉은색 형광으로 관찰되었으며, 노출된 Doxorubicin 농도와 HT-29 세포 구상체 내로 유입된 Doxorubicin, 즉, 붉은색 형광의 세기는 선형비례 관계에 있음을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 본 발명의 방법을 통해 3차원 배양된 다세포 종양 구상체를 약물에 노출 시킨 후, 약물의 조직축적 정도를 정량적으로 분석할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 4. 3차원 배양된 다세포 종양 구상체에 대한 약물 독성 실험
우선, 단일층에서 2차원 배양된 HT-29 세포 구상체 또는 필러 위에서 배양된 HT-29 세포 구상체에 5-Fluorouracil (5-FU) 또는 Tirapazamine (TPZ)을 노출시킨 후, 이들의 세포 생존율을 CCK-8 colormetric assay를 통해 비교하였다. 구체적으로 1%의 알지네이트로 포매되고 5×5 필러에 로딩된, HT-29 세포 구상체를 6일 동안 배양하였고, 2일 동안 5-FU 또는 TPZ에 노출시켰다. 이후, 200㎕의 CCK working 용액을 96-웰 플레이트 내 5×5 웰 어레이에 분주하고, 상기 HT-29 세포 구상체가 로딩된 필러를 CCK working 용액이 함유된 96-웰 플레이트에 담구고, 37℃, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 필러를 제거하고, 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 상기 반응 용액의 흡광도를 450nm에서 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 3차원 배양된 HT-29 구상체는 2차원 배양된 경우에 비해 TPZ에 대해서 높은 민감성 (도 7a 참조), 5-FU에 대해서는 높은 저항성 (도 7b 참조)을 나타내었다. 또한, 이들의 IC50 값을 하기 식 1의 Emax 모델을 이용한 용량 반응 곡선을 분석하여 산출하였으며, 그 결과, 3차원 또는 2차원 배양된 HT-29 세포 구상체의 TPZ에 대한 IC50은 각각 32 및 98M, 5-FU에 대한 IC50은 19 및 5M였다.
Figure pat00001
(여기서, [D]는 약물농도, Kd는 흡광도를 50% 감소시키는 약물농도 (IC50), m은 힐-타입 계수 (Hill-type coefficient), R은 영향을 받지 않은 잔여 분획 (the resistance fraction)을 나타낸다.)
또한, 세포 독성을 관찰하기 위한 다른 방법으로서, 세포 사멸 (apoptosis)과 관련된 세포 내 분자 (cleaved-PARP)의 발현을 측정하였다. 1%의 알지네이트로 포매되고 5×5 필러에 로딩된, HT-29 세포 구상체를 6일 동안 배양하였고, 이후, 동결절편에서 cleaved-PARP에 대한 면역화학염색을 실시하였다. 한편, 세포 사멸율 (% apoptosis)은 DAPI에 의한 푸른색 형광 강도에 대한 cleaved-PARP에 의한 붉은 형광 강도의 비율 %로 나타내었다.
그 결과, 도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, 구상체 내 cleaved-PARP는 붉은색 형광으로 관찰되었으며, 노출된 5-Fluorouracil (도 8a 참조) 또는 Tirapazamine (도 8b 참조)의 농도가 증가할수록 cleaved-PARP의 발현은 증가하였다. 또한, 도 8c에 나타낸 바와 같이, 세포 사멸율은 상기 CCK-8 colormetric assay의 결과와 마찬가지로, HT-29 세포 구상체는 Tirapazamine에 대해 높은 민감성을 나타내었으며, 세포 사멸율은 TPZ 농도가 증가할수록 급격하게 증가하여 100M에서는 약 40%이상 나타내었다.
실험예 5. 다양한 바이오 매트릭스를 이용하여 3차원 배양된 다세포 종양 구상체의 확인
본 실험예에서는, 바이오 매트릭스로 알지네이트, 제1형 콜라겐, 또는 메트리젤을 사용하여 제조예 1 및 제조예 3과 동일한 방법으로 대장암 세포주인 HT-29 세포 또는 췌장암 세포주인 Panc-1 세포를 3차원 배양시키고, 이에 대한 동결절편을 제작하였으며, 상기 동결절편에 대한 조직 평가를 위하여 헤마톡실린 (hematoxylin)으로 염색하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 바이오 매트릭스의 종류와 관계없이, 상호간 조밀하게 위치하고 있는 HT-29 세포 구상체 및 Panc-1 세포 구상체가 관찰되었으며, 이 역시 세포간 상호 작용이 가능할 정도로 상기 구상체는 균등하게 분포하고 있었다.
상기 결과로부터 본 발명의 방법은 알지네이트 뿐만 아니라 다양한 바이오 매트릭스를 사용한 경우에도, 다세포 종양 구상체를 효과적으로 성장 또는 배양시킬 수 있을 뿐만 아니라, 이로부터 상기 세포의 손상을 최소화하면서, 구상체의 생물학적 활성을 스크리닝 또는 평가할 수 있는 시료 박편을 수득할 수 있음을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (9)

  1. (a) 세포 시료가 혼입된 바이오 매트릭스가 부착되어 있는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 배양 챔버에 대향하도록 침지시켜 세포를 3차원 배양시키는 단계;
    (b) 상기 3차원 배양된 세포를 포함하는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 고형화 물질이 함유된 챔버에 대향하도록 침지시켜 고형화 블록을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 고형화 블록으로부터 필러를 상기 침지 방향과 반대 방향으로 제거하고, 상기 필러가 제거된 고형화 블록을 박편으로 절단하는 단계를 포함하는, 시료 박편의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포는, 암 세포 또는 줄기 세포인 것을 특징으로 하는, 시료 박편의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바이오 매트릭스는, bFGF (Fibroblast growth factor)-알지네이트, 헤파린-알지네이트, 폴리글리콜산, 폴리글리콜산-콜라겐, 라미닌, 메트리젤, 피브린, 콜라겐 또는 알지네이트로 이루어지는 하이드로겔인 것을 특징으로 하는, 시료 박편의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계 이전에, 필러의 표면에 폴리-L-라이신 (Poly-L-lysine), 폴리-D-라이신 (Poly-D-lysine), 및 도파민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물과 Mg2 +, Ca2 +, Ba2 +, 및 Cu2 +로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 금속 이온을 포함하는 화합물을 처리 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 시료 박편의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 필러는, 세포 시료가 혼입된 바이오 매트릭스가 부착되어 있는 필러의 일측 말단부에 가까워질수록 직경이 작아지는 것을 특징으로 하는, 시료 박편의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 고형화 물질은, 파라핀 또는 동결조직 포매제 (OCT compound)인 것을 특징으로 하는, 시료 박편의 제조방법.
  7. (a) 세포 시료가 혼입된 바이오 매트릭스가 부착되어 있는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 후보물질이 함유된 배양 챔버에 대향하도록 침지시켜 세포를 3차원 배양시키는 단계;
    (b) 상기 3차원 배양된 세포를 포함하는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 고형화 물질이 함유된 챔버에 대향하도록 침지시켜 고형화 블록을 제조하는 단계;
    (c) 상기 고형화 블록으로부터 필러를 상기 침지 방향과 반대 방향으로 제거하고, 상기 필러가 제거된 고형화 블록을 박편으로 절단하는 단계; 및
    (d) 상기 박편에서 세포의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 후보물질의 활성 측정방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 (d) 단계는, cleaved-PARP의 발현을 측정하는 것을 특징으로 하는, 후보물질의 활성 측정방법.
  9. (a) 세포 시료가 혼입된 바이오 매트릭스가 부착되어 있는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 후보물질이 함유된 배양 챔버에 대향하도록 침지시켜 세포를 3차원 배양시키는 단계;
    (b) 상기 3차원 배양된 세포를 포함하는 필러의 일측 말단부를, 상기 일측 말단부의 하부에 위치하는 고형화 물질이 함유된 챔버에 대향하도록 침지시켜 고형화 블록을 제조하는 단계;
    (c) 상기 고형화 블록으로부터 필러를, 상기 침지 방향과 반대 방향으로 제거하고 상기 고형화 블록을 박편으로 절단하는 단계; 및
    (d) 상기 박편에서 세포의 활성을 후보물질 비처리군과 비교하는 단계를 포함하는, 치료물질의 스크리닝 방법.





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