JP2009513160A - 毒物学アッセイのための3次元細胞アレイチップおよびプラットフォーム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2005年11月1日に出願された米国仮出願番号60/732,341の恩恵を主張する。上記出願の全教示は参照によって本明細書に援用される。
本発明は、国立衛生研究所からのNIH ES-012619助成金によって、全体的または部分的に支援された。政府は本発明における特定の権利を有する。
過去数十年の間、バイオインフォマティックス、ゲノミクス、およびプロテオミクスの進歩によって見込みある薬剤標的の同定がもたらされた。推定によると、ヒトゲノムプロジェクトの完了によって多くの分子標的は500〜4000に上ると示唆される(Drews, J., Drug discovery: A historical perspective, Science, 287, 1960-1964(2000))。この増加は、これらの標的に関心があり得る潜在的な薬剤候補のさらに大きな増加を意味する。
本発明は、毒物学アッセイおよびスクリーニングに有用な、ハイスループット3次元細胞培養マイクロアレイプラットフォームのための切望された必要性を提起する。本発明は、試験化合物およびリード化合物、プロドラッグ、薬物およびシトクロムP450(本明細書でP450として省略される)生成薬物代謝産物のハイスループット毒物学スクリーニングのための小型化3次元細胞チップを用いるハイスループットスクリーニングプラットフォームに関する。
本発明の好ましい態様の記載は以下の通りである。
本発明によれば、ガラススライド上の小型化3次元(3D)細胞培養の効率的な構築は効率的な表面修飾戦略を必要とし、生細胞が細胞外マトリックス内に封入され得る。封入手順は速くかつ単純であり、広範囲のヒト細胞に適用可能である。さらに、これは細胞増殖を支持する3次元構造を維持する。ガラス基材上の細胞封入コラーゲン滴の直接配置はスライドからのコラーゲン滴の非特異的な結合および表面上の水系スポットの伸展等の有意な欠点を示した。
本発明の3次元細胞チップ(DataChip)は、任意のゾル−ゲルまたは他の無機材料、有機ポリマー、有機−無機ハイブリッド材料、および生物学的材料のマトリックスアレイ中に封入または播種され、官能化ガラススライド上にスポットされる哺乳動物細胞を使用する。好ましいマトリックスとしては、コラーゲン、アルギン酸、ヒアルロン酸(ヒアルロナン(hyaluronan))、ポリ(ビニルアルコール)、およびポリアクリレートが挙げられる。
本発明のDataChip毒物学アッセイプラットフォームは、試験化合物チップへのDataChipの結合を必要とする。試験化合物チップはDrugChipおよびMetachipを含む。
本明細書で使用される場合、「スタンピング」は、DataChipを試験化合物チップに結合する二重スライドプロセスである。この結合は向きに依存するものではない。即ち、DataChipは試験化合物チップ上に置かれ得るか、その逆に置かれ得る。
本発明によれば、本発明のDataChip毒物学アッセイプラットフォームは、DrugchipにDataChipを結合することによって細胞増殖または阻害に対する試験化合物またはリード化合物の効果を評価するために使用され得る。
肝臓中に存在するシトクロムP450を含む薬物代謝酵素がより低い活性の化合物をより高い活性の化合物に転換する場合に、代謝産物の毒性に基づいて化合物をスクリーニングすることが望ましい。モデル系として、DataChip毒物学アッセイプラットフォームがMetachipにDataChipを結合させることでP450生成代謝産物の細胞傷害性を試験するために使用される。
本発明によれば、DataChip毒物学アッセイプラットフォームは、プラットフォームが、ネイティブな微環境をエミュレートするように、より理想的な生理学的マルチパラメーター測定を提供する。
実施例1:細胞培養
MCF7ヒト乳癌細胞(ATCC)を、37℃で加湿された5%CO2インキュベーター(ThermoForma Electron Co., Marietta, OH)中のT-25細胞培養フラスコ中の5% 子牛胎児血清(Invitrogen, Carlsbad, CA製 FBS)及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(Sigma, St. Louis, MO 製 DMEM)中で成長させた。コンフルエントの細胞層を0.05% トリプシン-0.53 mM EDTA(Invitrogen)を用いたトリプシン処理によって2〜3日ごとに継代した。細胞懸濁液を、コンフルエントな細胞単層をトリプシン処理し、4.5 x 106 細胞/mL濃度まで5% FBS-添加DMEM中で細胞を再懸濁することで調製した。
ガラス表面の非常に均一なシラン化のために、表面上のシラノール基(-SiOH)を、強酸を用いて全てのごみを除去することにより曝露した。ボロシリケート顕微鏡スライド(Fisher, Pittsburgh, PA 25 x 75 mm2)を、リムーバルガラススライドラック(Fisher)中に置き、メタノール:HCl (1:1 v/v)の溶液中で2時間浸漬した。
異なる段階のスライド処理のスライド上のアミン密度をモニターするため、APTMS、PS-MAおよびコラーゲンでの修飾後、表面上のアミン基を緑色蛍光FITCで標識した。
コラーゲンDataChip
コラーゲンおよび細胞懸濁液を氷上で、コラーゲン溶液を、5%FBS補充DMEM中のMCF-7細胞懸濁液と、コラーゲンおよび細胞の最終濃度がそれぞれ、1.3mg/mlおよび3×106細胞/mLとなるように混合することにより調製した。
生細胞カウントの確認は、生細胞を緑色蛍光色素で染色する蛍光研究を用いて行なった。緑色のドットは、コラーゲンゲル滴中のMCF7生細胞を表す。印刷エラーによるスポット対スポット蛍光のずれは15%未満であった。異なる細胞密度で播種したスポットの強度を計算することにより蛍光読み取りを細胞数の関数として計算し、目的の範囲において線形関係が見られた。
増殖阻害アッセイを、相補コラーゲンパターンスライド(Drug Chip)上にスポットされた種々の抗癌薬を組み合わせた3次元細胞チップ(DataChip)を用いて行なった。ドキソルビシン、5-フルオロウラシル、およびタモキシフェン(すべてSigma製)を含む薬物を、PBS中で異なる濃度(0〜1000μM)で調製し、60nLの薬物溶液を、マイクロアレイ装置を用いてPS-MA処理スライド上の相補パターンの乾燥コラーゲン上面にスポットした(30nLスポット、14×40スポットアレイ)。スポットを乾燥させた後、60nLの5%FBS補充DMEMをコラーゲン薬物スポット上面にスポットした。
P450-コラーゲン溶液(120μL)を、氷上で、24μLのCYP3A4バキュロソーム(baculosome)(1.1nmol P450/mL、Invitrogen製)、24μLの100mMリン酸カリウムバッファー(pH8.0)、12μLの再生系(100mリン酸カリウムバッファー、pH8中333mMグルコース-6-ホスフェートおよび40U/mLグルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびに60μLのラット尾I型コラーゲン(3.9mg/mL)を混合することにより調製した。表面上で安定な半球状のP450-コラーゲンスポットを確保するため、30nLのP450-コラーゲン溶液を、マイクロアレイ装置を用いてPS-MA処理スライド上にスポットし、使用前に2時間室温でゲル化させた。また、CYP1A2を類似の方法を用いてコラーゲンゲル中に封入した。P450反応を14×40スポット(各30nL)からなる560スポットアレイにおいて、シクロホスファミド(CP)またはTegafur(登録商標)(ともにSigma製)を含む60nLのプロドラッグ溶液を各P450 コラーゲンスポットの上面に分配することにより行なった。
薬物(または薬物代謝産物)の細胞傷害性を、生細胞由来の緑色蛍光応答をもたらすLive/Dead試験キット(Molecular Probes)で、細胞を含むスライドを染色することによって測定した。スタンピング後、3日間の培養期間の最後に、3次元細胞チップ(DataChip)をPBS中で各々5分間3回すすいだ。色素溶液の損失を妨ぐための障壁としての機能を果たす1mm厚周長(perimeter)ガスケットを有するガラススライドを用いて、0.5μMカルセインAMを含有する1mLの色素溶液を各3次元細胞チップに適用した。
生細胞の割合 = (FReaction/FMax)×100
(式中、FReactionは、反応スポットの緑色蛍光強度であり、FMaxは未処理の完全生存細胞の緑色蛍光強度である)
を用いて生細胞の割合を計算した。
DataChip 毒物学アッセイプラットホームの対照として、細胞傷害性アッセイを、MCF7細胞の2D単層および3Dコラーゲン培養を用いた96ウェルプレート(Fisher)において行なった。
効率的なスタンピングのため、スライドの周縁部にゾル-ゲル障壁を含むようにMTMOSコーティングガラススライドを作製した。
アルギン酸マトリックス中でのP450の固有の反応性を評価するため、反応を384ウェルプレートのウェル中で行なった。P450含有アルギン酸ゾルを、24μLのP450バキュロソーム(1nmol P450/mL)、36μLの蒸留水、および60μLの蒸留水中にアルギン酸(2%)を分配することにより調製した。5マイクロリットルのこの溶液を、384ウェル中の5μLの乾燥PLL-バリウムスポット上にスポットした。P450-アルギン酸ゲル滴を-80℃で1日保存した後、50mMリン酸カリウムバッファー(pH8)中250μM NADP+およびその再生系(8mMグルコース-6-ホスフェートおよび1U/mLグルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ)を含有する25μLの青色蛍光発生基材(CYP3A4ではBOMCCならびにCYP1A2およびCYP2D6ではEOMCC)を、解凍したP450-アルギン酸ゲル滴上に分配した。
確認され、これらのデータを表1に示す。すべての場合において、
蛍光発生基材を用いたkcat/Kmの値は、液相反応の2倍以内であった。
DataChip毒物学アッセイプラットホームを、すべて、MCF7細胞に対して細胞傷害性であることが知られている異なる用量の3種類のモデル化合物-ドキソルビシン(DOX)、5-フルオロウラシル (5-FU)、およびタモキシフェン(TAM)に対するMCF7細胞の細胞傷害性応答を用いて評価した。この目的のため、1mMまでの濃度の60nLの各化合物を、14×40アレイ内に乾燥コラーゲンスポットのみ(例えば、続いて3次元コラーゲンゾル-ゲルを添加しない)を含むスライド上に分配した。このアレイを、次いで、DataChip上面にスタンピングし、二重スライド系を6時間37℃でインキュベートした。以前のとおり、DataChip上の細胞は、106細胞/mLの密度で播種した。
いくつかのことがこれらの結果から自明である。
マイクロスケールでのヒト細胞培養のための有用な3Dマトリックスとしての機能を果たすコラーゲンの能力にもかかわらず、材料は急速にゲル化し、それにより細胞播種コラーゲンゾルが溶液状態で維持され得る時間が限定される。さらに、より長いインキュベーション時間では、コラーゲンマトリックスは、おそらく細胞培養物中のプロテアーゼの存在のために分解し、このため、3Dマトリックスからの細胞の漏れ出しがもたらされた。
DataChipのスループットを増大させるため、アルギン酸を有する20nL細胞培養スポット容量を用いた20×54(1,080)スポットDataChipを作製した。
なかでも、Cytoxan(登録商標)、Tegafur(登録商標)、パクリタキセル、ドキソルビシン、5-FU、タモキシフェン、リンダン、ニコチンおよびアセトアミノフェンを含む合計27個の化合物およびそのP450生成代謝産物の細胞傷害性を、ヒトHep3BおよびMCF7細胞で評価した。
Claims (47)
- 複数の独立したスポットが上面にスポットされ、各スポットが
(a)マトリックス底面層、および
(b)細胞を含むマトリックス表面層
を含む化学修飾されたガラススライドを含む、マイクロアレイ分析用3次元細胞チップ。 - ガラススライドの化学修飾が、3-(アミノプロピル)トリメトキシシラン(APTMS)での官能化の後、ポリ(スチレン-コ-無水マレイン酸)(PS-MA)での官能化を含む、請求項1記載の3次元細胞チップ。
- ガラススライドの化学修飾が、メチルトリメトキシシラン(MTMOS)のコーティングを用いた官能化を含む、請求項1記載の3次元細胞チップ。
- マトリックス底面層がポリ-L-リシン(PLL)-塩化バリウム混合物を含む、請求項2記載の3次元細胞チップ。
- (b)の細胞を含むマトリックス表面層のマトリックスがアルギン酸を含む、請求項4記載の3次元細胞チップ。
- 前記マトリックス底面層および前記細胞を含むマトリックス表面層の間に配置された中間層をさらに含む、請求項2記載の3次元細胞チップ。
- 中間層がヒアルロナンを含む、請求項6記載の3次元細胞チップ。
- マトリックス底面層のマトリックスが、ゾル-ゲル、無機材料、有機ポリマー、ハイブリッド無機-有機材料、生物学的材料、またはその任意の組合せから選択される、請求項2記載の3次元細胞チップ。
- 細胞を含むマトリックス表面層のマトリックスが、ゾル-ゲル、無機材料、有機ポリマー、ハイブリッド無機-有機材料、生物学的材料、またはその任意の組合せから選択される、請求項2記載の3次元細胞チップ。
- マトリックス底面層のマトリックスが生物学的材料である、請求項8記載の3次元細胞チップ。
- 生物学的材料がI型コラーゲンを含む、請求項10記載の3次元細胞チップ。
- 生物学的材料がアルギン酸を含む、請求項10記載の3次元細胞チップ。
- 細胞を含むマトリックス表面層のマトリックスが生物学的材料である、請求項8記載の3次元細胞チップ。
- 生物学的材料がコラーゲンを含む、請求項13記載の3次元細胞チップ。
- 生物学的材料がアルギン酸を含む、請求項13記載の3次元細胞チップ。
- 少なくとも1000個、少なくとも3000個または少なくとも5000個の独立したスポットを含む、請求項2記載の3次元細胞チップ。
- 少なくとも1080個の独立したスポットを含む、請求項2記載の3次元細胞チップ。
- 少なくとも560個の独立したスポットを含む、請求項2記載の3次元細胞チップ。
- 独立したスポットの各々が約0.6mmの大きさであり、約1.2mmの中心間距離を有する、請求項18記載の3次元細胞チップ。
- 560個の独立したスポットは規則的に間隔が空けられている、請求項18記載の3次元細胞チップ。
- マトリックス表面層内に含まれた細胞は、マトリックス内に実質的に規則的なパターンで封入される、請求項1記載の3次元細胞チップ。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項1記載の3次元細胞チップ。
- 哺乳動物細胞が、ヒト肝癌細胞、Hep3B細胞、ヒト胚性腎細胞、A293T細胞および乳癌細胞、MCF-7細胞からなる群より選択される、請求項22記載の3次元細胞チップ。
- (a)ガラススライドを官能化する工程、ここで、官能化は3-(アミノプロピル)トリメトキシシラン(APTMS)での処理の後、ポリ(スチレン-コ-無水マレイン酸)(PS-MA)での処理を含む、および
(b)官能化されたガラススライド上に複数の個々のスポットを配置する工程、前記配置は、
(i)官能化されたガラススライドの上面に、マトリックス底面層を構成する複数の個々のスポットを配置する工程
(ii) (i)のマトリックス底面層の表面上に細胞を含むマトリックス表面層を配置する工程
を含む、マイクロアレイ分析用3次元細胞チップの作製方法。 - (c)細胞培養培地中で、堆積された個々のスポットを有する官能化されたガラススライドをインキュベートする工程をさらに含む、請求項24記載の方法。
- マトリックス底面層のマトリックスがポリリシンおよび塩化バリウムを含む、請求項24記載の方法。
- 細胞を含むマトリックス表面層のマトリックスがアルギン酸を含む、請求項25記載の方法。
- (c)細胞培養培地中で、堆積された個々のスポットを有する官能化されたガラススライドをインキュベートする工程をさらに含む、請求項26記載の方法。
- マトリックス底面層のマトリックスがコラーゲンを含み、細胞を含むマトリックス表面層のマトリックスがコラーゲンを含む、請求項24記載の方法。
- 官能化されたガラススライドの上面のマトリックス底面層を構成する前記複数の個々のスポットと、マトリックス底面層の表面上の前記細胞を含むマトリックス表面層との間に、中間層を配置する工程をさらに含む、請求項24記載の方法。
- 中間層がヒアルロナンまたはその酸を含む、請求項30記載の方法。
- (a)3次元細胞チップを作製する工程、
(b)試験化合物チップを作製する工程、
(c)3次元細胞チップおよび試験化合物チップを共にスタンピングする工程
、ならびに
(d)生細胞カウントに基づいて試験化合物のIC5O値を計算する工程
を含む、細胞に対する試験化合物の細胞傷害効果のアッセイ方法。 - (e)(d)のIC5O値を試験化合物の細胞傷害性プロフィールと相関させる工程をさらに含む、請求項32記載の方法。
- スタンピング工程(c)の持続時間が約6時間である、請求項32記載の方法。
- スタンピング中の3次元チップおよび試験化合物チップ間の連絡がアレイ状の1対1のパターンで起こる、請求項32記載の方法。
- 生細胞カウントが蛍光系アッセイまたは比色定量アッセイを用いて測定される、請求項32記載の方法。
- 試験化合物チップが、
(a)上面にコラーゲンスポットアレイを有する化学修飾されたガラススライド、および
(b)(a)の各コラーゲンスポットの上面に堆積された少なくとも1つの試験化合物
を含む、請求項32記載の方法。 - 3次元細胞チップが、
(a)コラーゲンマトリックス底面層を構成するコラーゲンスポットアレイを上面に有する化学修飾されたガラススライド、および
(b)(a)の各コラーゲンスポットの上面に堆積された細胞を含むコラーゲンマトリックス表面層
を含む、請求項37記載の方法。 - 3次元細胞チップが、
(a)ポリリシンおよび塩化バリウムマトリックス底面層を含むマトリックススポットアレイを上面に有する化学修飾されたガラススライド、ならびに
(b)(a)の各マトリックススポットの上面に堆積された細胞を含むアルギン酸マトリックス表面層
を含む、請求項37記載の方法。 - 試験化合物チップが、
(a)上面にコラーゲンスポットアレイを有する化学修飾されたガラススライド、
(b)(a)のアレイされたコラーゲンスポットの各々に封入された少なくとも1種類の薬物代謝酵素、ならびに
(c)(a)のアレイされたコラーゲンスポットの各々の上面に堆積された少なくとも1種類の試験化合物
を含む、請求項32記載の方法。 - 3次元細胞チップが、
(a)コラーゲンマトリックス底面層を含むコラーゲンスポットアレイを上面に有する化学修飾されたガラススライド、および
(b)(a)の各コラーゲンスポットの上面に堆積された細胞を含むコラーゲンマトリックス表面層
を含む、請求項40記載の方法。 - 3次元細胞チップが、
(a)ポリリシンおよび塩化バリウムマトリックス底面層を含むマトリックススポットアレイを上面に有する化学修飾されたガラススライド、ならびに
(b)(a)の各マトリックススポットの上面に堆積された細胞を含むアルギン酸マトリックス表面層
を含む、請求項40記載の方法。 - 少なくとも1種類の試験化合物が、候補薬物、薬物、プロドラッグおよび薬物代謝産物からなる群から選択される、請求項42記載の方法。
- 少なくとも1種類の試験化合物が、候補薬物、薬物およびプロドラッグからなる群から選択される、請求項43記載の方法。
- 試験化合物が薬物を含み、該薬物が、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル、およびタモキシフェンからなる群から選択される、請求項44記載の方法。
- 試験化合物がプロドラッグを含み、該プロドラッグが、シクロホスファミド(CP)および5-フルオロ-1-(テトラヒドロ-2-フルフリル)-ウラシルからなる群から選択される、請求項43記載の方法。
- (a)3次元細胞チップ、
(b)試験化合物チップ、および
(c)生細胞カウントの測定のためのデバイス
を含む、毒物学アッセイ用マイクロアレイプラットホーム。
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