WO2021187702A1 - 섬 구조물을 포함하는 신속한 세포배양검사 장치 - Google Patents

섬 구조물을 포함하는 신속한 세포배양검사 장치 Download PDF

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WO2021187702A1
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antibiotic
cell culture
island structure
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김정수
임태근
이기윤
김동영
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주식회사 퀀타매트릭스
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Definitions

  • the technology disclosed herein relates to a cell culture test device, and more particularly, to a cell culture test device including an island structure, which is evenly distributed in the well of a chip during fluid dispensing, so that accurate observation is easy.
  • Antibiotic susceptibility testing is generally performed by culturing an infectious agent in a microwell mixed with a culture medium and antibiotic at various concentrations for about 18 hours and then determining whether or not the growth is made by light transmittance. Many products are being developed for
  • microfluids are dispensed and disposable plastic plates with micro-scale structures that can be adjusted to a desired shape and sequence are rapidly introduced. is a trend to
  • the present applicant has developed an antibiotic susceptibility test system to determine whether or not the growth of bacteria is present by introducing such a microfluidic plate using a microscope imaging method.
  • an antibiotic susceptibility test system to determine whether or not the growth of bacteria is present by introducing such a microfluidic plate using a microscope imaging method.
  • the shape of the channel must be complicated, and there is a limitation in that it is difficult to spread the culture medium and drug over a long distance.
  • the present invention is to provide a cell culture test apparatus that includes an island structure and is evenly distributed in the well of a chip during fluid dispensing, so that accurate observation is easy.
  • the present invention provides a cell culture test apparatus having a plurality of well units, the well unit comprising: a first injection unit for injecting a first fluid; a first accommodating part communicating with the first injecting part so that the first fluid injected from the first injecting part flows and is accommodated; a second injection unit for injecting a second fluid; and a second receptacle for receiving a second fluid; An island structure connected by an island connection structure extended from a wall surface of the second accommodation unit is formed inside the second accommodation unit, and a third injection unit into which an antibiotic is injected is formed on the upper side of the island structure, and the inner surface of the island structure And it provides a cell culture test device in which the antibiotic injected from the third injection unit is accommodated and fixed on the outer surface.
  • the center of the island structure coincides with the center of the first accommodating part, and may be arranged to have a predetermined distance from the first accommodating part.
  • the lower end of the island structure is installed 0.1 to 1 mm apart from the bottom surface of the second accommodation part, and the bottom surface of the island structure may be opened.
  • the second fluid may be in contact with the inner and outer surfaces of the island structure upon injection, and may dissolve antibiotics fixed to the inner and outer surfaces of the island structure to diffuse into the first fluid.
  • the thickness and width of the first accommodating part may be determined so that the first fluid injected through the first injection part may be filled through capillary action.
  • the first receiving portion may have a width of 0.3 to 2 mm and a thickness of 100 to 500 ⁇ m.
  • a side surface of the second accommodating part and an inner surface of the first accommodating part may communicate with each other so that the first fluid and the second fluid meet each other to enable material movement into the first fluid.
  • the first accommodating part has an open microfluidics structure, and a side of the first accommodating part is opened, and the open surface may be connected to the side surface of the second accommodating part by a capillary valve structure.
  • the capillary valve structure may have a thickness and width determined so that the first fluid does not flow into the second accommodating part during or after the flow into the first accommodating part when the first fluid is injected.
  • the capillary valve may have a thickness of 100 to 500 ⁇ m and a width of 100 ⁇ m to 2 mm.
  • the cell culture test apparatus may include a rear bonding means for preventing leakage of the first fluid and the second fluid on the rear side.
  • the back bonding means may be an optically transparent film.
  • the rapid cell culture test apparatus including the islet structure according to the present invention enables an even dispersion and rapid diffusion of antibiotics, so it is possible to perform an accurate test compared to the existing antibiotic test apparatus. It is possible to quickly test antibiotic susceptibility compared to the existing device because it observes the effect of
  • the growth change of single cells can be observed within several tens of minutes (usually 30 minutes), and single colony of bacteria Because the changes in the body temperature can usually be observed within 4 to 6 hours, the effect of bioactive substances on biological substances can be confirmed more accurately and quickly compared to conventional methods.
  • the rapid cell culture test apparatus comprising the islet structure according to the present invention observes the change of biological material for the physiologically active material in a single cell population unit to minimize inhibitory concentration (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) or minimum biofilm eradication concentration ( Since Minimum Biofilm Eradication Concentration (MBEC) can be measured, it can be very usefully used not only for antibiotic susceptibility tests but also for biofilm assays.
  • inhibitory concentration Minimum Inhibitory Concentration, MIC
  • MBEC Minimum Biofilm Eradication Concentration
  • FIG. 1 shows an embodiment of a cell culture test apparatus.
  • FIG. 2 shows a cross-section of a well unit of a cell culture test device according to an embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG 3 shows a process of introducing a first fluid and a second fluid into a well unit and performing an antibiotic susceptibility test.
  • FIG. 4 shows the first fluid introduced into the microfluidic channel of the well unit, (a) is a plan view, (b) is a cross-section taken along the (a) drawing A-A′, respectively.
  • 5 is a diagram briefly illustrating the behavior of the fluid and the antibiotic when the antibiotic is dried and attached to the third injection unit and then the second fluid is supplied to the second injection unit.
  • FIG. 6 shows an island structure and an island connection structure 143 having various shapes according to an embodiment of the present invention, and is a plan view, a perspective view, and a cross-sectional view, respectively.
  • FIG. 7 is a view showing a mold for manufacturing a cell culture test device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 shows a rear bonding means and an adhesive applied to the rear bonding means according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 9 is an enlarged photograph of a solid thin film according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10 is the observation result of the solid thin film according to an embodiment of the present invention, the concentration of colistin (a) is 0mg / ml (b) is 0.12mg / ml, (c) is 0.25mg / ml, (d) is 0.5 mg/ml, (e) is 1 mg/ml, (f) is 2 mg/ml, respectively.
  • FIG. 11 is a photograph showing the behavior of the fluid according to the separation height of the island structure according to an embodiment of the present invention.
  • each process constituting the method may occur differently from the specified order unless a specific order is clearly described in context. That is, each process may occur in the same order as specified, may be performed substantially simultaneously, or may be performed in the reverse order.
  • a cell culture test apparatus having a plurality of well units is provided.
  • 1 shows an embodiment of a cell culture test apparatus.
  • Figure 1 (a) is a view showing the overall configuration of the cell culture test apparatus, (b) is an enlarged part of the cell culture test apparatus, (c) shows a cross section of the well unit.
  • the cell culture test apparatus 100 includes a plurality of aligned well units 110 .
  • a plurality of the well units 110 may be aligned to have a standard similar to that of a commercial multi-well plate as a whole.
  • the center of the well unit 110 may coincide with the center of a commercial multi-well.
  • the well unit 110 includes a first injection unit 132 for injecting a first fluid; a second injection unit 134 for injecting a second fluid; a first accommodating part 150 communicating with the first injecting part so that the first fluid injected from the first injecting part 132 flows; There is a second accommodating part 120 for accommodating the second fluid.
  • multi-well plates are a standard tool for processing and analyzing large numbers of samples.
  • Multi-well plates can take a variety of shapes, sizes, and shapes, and are generally made of standard sizes and shapes and have a standard arrangement of wells.
  • the plurality of well units is a 96-well plate (12x8 well array), 384-well plate (24x16 well array), and 1536-well plate (48x32 well array). It may have a standard well arrangement, and may have the same or similar arrangement as a commercial multi-well plate of various other methods. Since the cell culture test apparatus 100 has the same or similar specifications as a commercial multi-well plate, it can be easily compatible with various conventional biological analysis techniques. Accordingly, in the present invention, the plurality of well units may have a well arrangement of 1x1, 1x2, 1x4, 2x4, 4x6, 12x8, 24x16, or 48x32.
  • Figure 2 (a) shows the well unit of the antibiotic test chip, (b) is a cross-sectional view taken along line A-A' of Figure 2 (a).
  • the first injection unit 132 and the second injection unit 134 are generally located on the top of the well unit 110 and may have an open front or a partially open shape.
  • the first injection unit 132 and the second injection unit 134 may have a single or a plurality of openings.
  • the first fluid and the second fluid may be introduced into the well unit 110 through the first injection unit 132 and the second injection unit 134 by pipetting or injection.
  • the first injection part 132 is used for introducing the first fluid, and the lower end communicates with the first accommodation part 150 so that the injected first fluid can be supplied to the first accommodation part 150 .
  • the first injection part 132 is simply used for supplying the first fluid, it is preferable to be manufactured in a cylindrical shape, a conical shape with an open top, or a tapered shape so that the first fluid supplied to the inside flows smoothly. do.
  • the first injection part when manufactured in a tapered type, it is easy to detach from the mold during injection molding, and the enlarged diameter of the injection port facilitates injection of the first fluid, and a point where the injected first fluid meets the first receiving part 150 . It can be used more preferably because it is collected and supplied.
  • the first injection part may be in communication with the second injection part or may have a structure included in the second injection part.
  • the second injection unit 134 is used to inject the second fluid into the second accommodation unit 120 and may be located at the upper end of the second accommodation unit 120 .
  • the second injection unit 134 is an island structure 142 including a third injection unit 140 connected to the inside of the second receiving unit 120 by an island connection structure 143 as well as injecting the second fluid. ), it is preferable to have a larger diameter than that of the first injection part 132 .
  • the second injection unit may include the first injection unit as long as the second fluid is controlled not to enter the first injection unit.
  • the second injection unit 134 may be manufactured to have the same cross-sectional shape as that of the second receiving unit 120, but may have a shape in which a part of the cross-sectional shape of the second receiving unit is deformed for the specificity and convenience of the injection location. .
  • the deformed portion may act as an assistant for inducing smooth entry of an injection means such as a pipette during injection of the second fluid, and accordingly, it is possible to introduce an accurate amount of the second fluid at an accurate location.
  • the first fluid and the second fluid may typically contain 70 to 99% by weight of water, preferably 85 to 99% by weight, and most preferably 93 to 99% by weight of water as a dispersion medium or solvent.
  • the first fluid may be a mixed solution of a liquid medium containing a gelling agent and a biological agent. Within the above range, water may exhibit optimal performance as a dispersion medium.
  • the liquid medium may contain at least about 95% water and may be solidified in the presence of a solidifying agent.
  • the solidifying agent include agar, agarose, gelatin, alginate, collagen, and fibrin.
  • agar or agarose may be used.
  • 0.3 to 4 wt% of agar may be used in the liquid medium.
  • the liquid medium does not require nutrients, but in some instances, it may contain nutrients, and may be a solution containing a medium that promotes the division of specific cells. If the agar is included in less than 0.3% by weight, solidification may not be made, and if it exceeds 4% by weight, diffusion of the biological material may not be easy due to excessive solidification.
  • the biological material includes viruses, bacteria, fungi, algae, protozoa, parasitic pathogens, human or mammalian cells and biofilms, and the like.
  • the biological material may be a mixture of a biological material exhibiting infectivity, such as bacteria, viruses, fungi, and the like, and blood cells.
  • it may be blood from a person infected with bacteria. have.
  • the biological material may grow in a liquid or solid medium, and growth may be affected by the type and concentration of an external physiologically active material. the mixing
  • the density of the biological material in the solution may be 10 2 to 10 10 cells/ml, preferably 10 4 to 10 10 cells/ml, more preferably 10 5 to 10 9 cells/ml. Below the above range, it may be difficult to determine the location of the biological material, and above the above range, it may be difficult to determine the state of the individual biological material.
  • the first accommodating part 150 may communicate with the first injecting part 132 so that the first fluid introduced from the first injecting part 132 may fill the first accommodating part 150 .
  • the first receiving part 150 may be manufactured in an open microfluidic channel structure, and has a width of, for example, several hundred ⁇ m to several mm, and a depth (or thickness) of several hundred ⁇ m, so that it is easy to image later and is resistant to capillary action.
  • the first fluid may have a standard that can fill the inside of the first accommodating part 150 .
  • the first fluid when the first fluid is a liquid medium containing a solidifying agent, it may be gelled after a certain period of time.
  • the first accommodating part may be manufactured in a donut shape surrounding the second accommodating part.
  • the first fluid injected into the first accommodating part is solidified and at the same time it is in contact with the second fluid to form a bulky thin film.
  • the first accommodating part is It may be manufactured in a donut shape surrounding the outer surface of the receiving unit.
  • the second accommodating part has a polygonal shape such as a square triangle, it is preferable to manufacture the first accommodating part in a shape suitable for such a shape so that the contact part with the second fluid located on the inner circumferential surface of the first accommodating part can be maximized.
  • the injected first fluid may be solidified to form a solid thin film.
  • the first fluid is injected through the first injection unit and undergoes a solidification process, and the thickness of the solid thin film may be determined according to the depth of the first receiving unit 150 .
  • the thickness of the first accommodating part may be in any one of 1 ⁇ m to 500 ⁇ m, 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, or 100 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the depth of the first receiving portion is 500 ⁇ m or less, more preferably 100 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the width of the first receiving part may be 100 ⁇ m to 5 mm, or 300 ⁇ m to 5 mm, or 500 ⁇ m to 3 mm, or 1 mm to 3 mm, in consideration of the size of the image area.
  • the width of the microfluidic channel is 0.3 mm to 2 mm.
  • the thickness and width of the solid thin film are determined according to the depth and width of the microfluidic channel.
  • the term "thin film” is not particularly limited in thickness as long as it can be observed as a single cell unit by fixing the biological material, but generally 1 ⁇ m to 5 mm, or 1 ⁇ m to 3 mm, or 1 ⁇ m to 2 mm, or 1 ⁇ m to 1.5 mm, or 1 ⁇ m to 1 mm, or 1 ⁇ m to 800 ⁇ m, or 1 ⁇ m to 500 ⁇ m, 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, or 10 ⁇ m to 3 mm, or 100 ⁇ m to 500 ⁇ m or 10 ⁇ m to 1 mm , or 100 ⁇ m to 1 mm, or 200 ⁇ m to 1 mm, or 500 ⁇ m to 1 mm.
  • the thickness of the solid thin film may correspond to a size in a direction perpendicular to the surface of the solid thin film to be observed. Since the solid thin film has a thickness within the above-described range, the biological material fixed therein can be observed in units of individual cells (single cell).
  • the first accommodating part 150 may communicate with the side surface of the second accommodating part 120 so that the first fluid and the second fluid come into contact to form an interface perpendicular to the bottom surface.
  • the first fluid and the second fluid were manufactured to form an interface parallel to the bottom surface, but in this case, there was a disadvantage that the change due to the antibiotic could be observed only at a specific height.
  • an appropriate biological material eg, bacteria, mold, etc.
  • no change may be observed or the reliability of the test may be reduced.
  • the effect of the antibiotic according to the concentration may further reduce the reliability of the test result.
  • an interface perpendicular to the bottom surface is formed so that the position of the interface can be accurately confirmed during observation, and the 1 Changes can be easily observed even when the fluid contains a smaller amount of biological material.
  • the center of the island structure is also the same, so that an interface between the first fluid and the second fluid is formed at the same distance from the center.
  • the antibiotic injected into the third injection unit or attached to the island structure is diffused into the second fluid and delivered to the interface, a uniform antibiotic concentration can be achieved as the interface has the same distance from the initial antibiotic.
  • the inner circumferential surface of the first accommodating part and the side surface of the second accommodating part 120 may be made to match.
  • the entire inner peripheral surface of the first accommodating part is preferably in communication with the lower side of the second accommodating part, and the first accommodating part and the first fluid introduced through the outer peripheral surface do not pass through the communicating inner peripheral surface as described above.
  • the lower side of the second receiving part is preferably connected through a capillary valve.
  • the second accommodating part 120 is for accommodating the second fluid introduced from the second injection part 134 , and the island structure 142 and the third injection part 140 are formed therein into the island connection structure 143 .
  • the second accommodating part 120 may have a well shape having a space sufficient to inject the second fluid and hold the second fluid.
  • the volume of the second accommodation part is not particularly limited, but may have a sufficient size to observe the reaction for a long time after the injection of the second fluid, and preferably may be 100 ⁇ l to 2000 ⁇ l. If the volume of the second receiving portion is less than 100 ⁇ l, the size of each well may be reduced, making it difficult to observe smoothly, and if it exceeds 2000 ⁇ l, efficiency may be reduced as the amount of samples and reagents required increases.
  • the island connection structure 143 is a structure for positioning the third injection part 140 and the island structure 142 inside the second accommodation part 120 , and the island connection structure 143 and the second accommodation part 120 . It is preferable that the second fluid be introduced into the space between the inner walls of the part 120 . To this end, the island connection structure 143 has a structure extending from the wall surface of the second accommodation unit 120 to the inside, and the third injection unit 140 and the island structure 142 may be located in the center. . In addition, in the case of an island structure, since it should be positioned with a distance of less than a predetermined distance from the second accommodation unit, the island connection structure 143 extends from the inner wall surface of the second accommodation unit 120 toward the center of the lower end and protrudes. It is preferable that the shape is
  • the third injection unit 140 and the island structure 142 may be located inside the second accommodation unit 120 through one island connection structure 143 , but preferably a plurality of island connection structures. It can be connected through (143), more preferably 2 to 4, and most preferably having two elongated structures can facilitate injection of the second fluid.
  • the island connection structure 143 may have various shapes as shown in FIG. 6 .
  • 6 shows a top view, a perspective view, and a cross-sectional view of the island structure and the island connection structure 143 having various shapes.
  • the island structure can be in both an open passage form (2, 3, 4, 5 in the figure above) / a closed basket form (1 in the figure above), and it is possible to trap antibiotics rather than the shape of the island structure. performance is important.
  • the open passage type is more advantageous for antibiotic diffusion during injection of the second fluid than the closed basket type.
  • an optimized design is required so that it does not leak into the open space from antibiotic injection to drying.
  • the island connection structure 143 is a structure connected between the island structure and the second accommodation unit.
  • the island structure can be fixed using one island connection structure 143, but in injection molding, it is recommended that the island connection structure 143 is symmetrical or wide in order to stabilize the separation process in the mold, and the second fluid
  • two or more symmetrical or single helical island connection structures 143 are preferred.
  • it is necessary to optimize the number and shape size of the island connection structures 143 because it is stable in the separation process from the mold in injection molding, and it is necessary to secure a space for smooth dispensing of the second fluid. do.
  • the contact area is wide and thus the most stable during the separation process, but it is difficult to use because it can be injected only in one direction when the second fluid is injected. It is preferable to use two (143) to be symmetrically connected to the second accommodating part.
  • the third injection unit 140 is a part for injecting antibiotics, and may be connected to the upper portion of the island structure and located inside the second receiving unit 120 .
  • An island structure is communicated under the third injection unit 140 to accommodate the injected antibiotic (see FIG. 5 ). Since the third injection unit 140 is simply used for the supply of antibiotics, it is preferable to be manufactured in a cylindrical shape, a cone shape with an open top, or a tapered shape so that the antibiotic supplied therein smoothly flows into the island structure. .
  • the island structure 142 is a part to which the antibiotic introduced from the third injection unit is received or to which the dried antibiotic (antibiotic in solid form) is attached, and is fixed to the inside of the second receiving unit from the island connection structure 143 .
  • the introduced liquid antibiotic may be accommodated in the island structure 142 or may be accommodated in the space between the island structure and the bottom surface of the second accommodation unit 120 by opening the bottom surface of the island structure. As long as the liquid antibiotic does not protrude to the outside of the island structure 142 due to surface tension, the antibiotic injected into the island structure 142 may be spaced apart from the bottom surface of the second accommodation unit 120 .
  • the antibiotic may be dried and attached within the island structure 142 or between the island structure 142 with an open bottom and the bottom surface of the second accommodation unit 120, and the second fluid is It may be supplied dispersed or dissolved.
  • the antibiotic When the antibiotic is injected into the island structure with the bottom surface open, when the ascending agent is attached to the island spaced apart from the bottom surface, the antibiotic storage volume increases and the diffusion path of the dried antibiotic after introduction of the second fluid is shortened, which is advantageous for smooth diffusion.
  • the shape of the antibiotic should be maintained by surface tension in the space between the island structure and the second accommodation unit.
  • the separation distance of the island structure for maintaining the surface tension of the antibiotic is preferably 0.1 to 1 mm. If the separation distance is less than 0.1mm, the space required for diffusion is reduced, so it takes a lot of time to check the sensitivity of the antibiotic. May leak out of island structures.
  • the antibiotic When the third injection unit 140 contains the antibiotic in a solid form, the antibiotic may be in a dried state (see FIG. 5(b)).
  • water, a cell culture medium, dimethylformadide (DMF), and dimethyl sulfoxide (DMSO) may be used as the solvent for dissolving the dried antibiotic, that is, the second fluid.
  • the solvent for dissolving the antibiotic may be introduced while pipetting in order to completely dissolve the antibiotic in the solid form and to have a uniform concentration of the solution after dissolution (FIG. 5(d)).
  • the antibiotic can be dried by using without limitation as long as it is a drying method that does not decrease the efficacy, but preferably can be dried using room temperature drying, heat drying, freeze drying, or reduced pressure drying, and most preferably dried through heating drying.
  • the antibiotic may be dried using the drying method as described above, and then injected into the third injection unit, and the antibiotic solution may be injected into the third injection unit and then dried using the drying method.
  • the antibiotic when the fluid containing the antibiotic is directly introduced into the third injection unit 140 , the antibiotic may be dissolved in a solvent having the same component as the second fluid. However, a different solvent may be used for ease of storage and handling of the antibiotic. In this case, it is preferable to select and use a solvent that is easily mixed or diffused with the second fluid as the solvent containing the antibiotic. In addition, it is preferable that the antibiotic has a constant surface tension so that it can be dried with a constant shape in the space between the island structure and the second receiving part. In this case, since most antibiotics have a viscosity similar to that of water, it is preferable to prepare the separation standard between the island structure and the second receiving part based on water.
  • the capillary valve 152 is a point at which the inner surface of the second accommodating part and the inner surface of the first accommodating part are connected. is a structure that The thickness and angle of the capillary valve 152 may control the flow of the first fluid.
  • the first fluid entering the small width of the first receiving portion has a large surface tension as an interface with air.
  • the interface of the first fluid in the first accommodating part forms a contact angle and surface tension in a direction supporting the flow direction.
  • a contact angle and surface tension are formed in a direction in which the interface of the first fluid resists the entry into the second accommodating part due to the changed angle of the edge.
  • the capillary valve can be used to discharge the air in the channel when the first fluid is supplied to the first accommodating part and to eliminate the pressure difference with the first injection part, so that the inside of the first accommodating part 150 is uniformly distributed with the first fluid.
  • the thickness and width of the capillary valve are preferably determined so that the diffusion path is not obstructed, and usually a thickness of 100 to 500 ⁇ m, and a width of 100 ⁇ m to 2 mm. can have However, when the thickness of the capillary valve is the same as the thickness of the first accommodating part, the width can be freely selected and used.
  • the capillary valve in the above range When the capillary valve in the above range is used, the air in the first receiving part 150 is easily discharged and the second fluid is easily diffused without leakage of the first fluid, but the capillary valve having a specification less than the above range. In case of using , it is not easy to discharge air and diffusion of substances in the second fluid. Detection of results can be difficult.
  • the shape of the well is configured so that the upper part has a wider embossed gradient shape than the lower part.
  • embossed gradient shape it is easy to remove from the mold after injection molding and has the advantage of minimizing damage during removal.
  • an island structure exists inside the second receiving part, and when the first receiving part wider than the diameter of the second receiving part has the lower end, an undercut-shaped mold is required, so that injection cannot be performed at once.
  • the island structure 142 and the island connection structure 143 are positioned between the upper mold for production and the lower mold, and the upper mold of the embossed gradient is the upper mold, and the lower part of the intaglio gradient is the boundary.
  • the cell culture test device can be manufactured by injecting a polymer resin.
  • it may be made of an optically transparent polymer resin such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polymethacrylate, or polycarbonate.
  • a bonding means 160 for preventing leakage of the first fluid and the second fluid is attached to the rear surface of the unit with a bonding material so that the first accommodating part 150 and the second accommodating part 120 are connected to the first fluid and the second fluid. It can be manufactured to accommodate fluids.
  • the bonding means 160 may be manufactured in a thin film shape having the same size as the rear portion of the cell culture test device, and may be manufactured to bond the rear surface of each well unit at a time, and manufactured to fit the size of each well unit.
  • the bonding means may be made of an optically transparent material so that the object in the first fluid can be observed through the bottom surface of the first receiving part.
  • the bonding means may be an optically transparent film such as polyethylene, polyvinyl chloride, polystyrene, or the like.
  • the bonding material is placed on the cell culture device or the bonding means on the bottom of the first and second receptors. It is preferable to print only the side excluding the side on which the side is located (see FIG. 8).
  • the bonding material should not be deformed after printing and before and after bonding between the bonding means and the well unit.
  • a non-reactive adhesive is recommended for the bonding material to avoid affecting the biological material.
  • a pressure sensitive adhesive which is mainly used as an adhesive tape, is preferable. Adhesives with ester-based adhesives reinforced on the basis of natural rubber, synthetic rubber, silicone rubber, and acrylate are possible. do.
  • a material having a high transmittance is preferable.
  • the rapid cell culture test apparatus including the islet structure according to the present invention is provided in a way that can be opened and closed through a fastening structure, or silicone, polyethylene terephthalate (PET), polyethylene (PE), polypropylene (PP), polystyrene (PS) , polycarbonate (PC), Teflon or polyvinyl chloride (PVC) may be provided by treating the cover film.
  • a cross or X-shaped punch may be formed at a position corresponding to the lower first injection part of the cover film, and may act as a first fluid inlet for facilitating the introduction of a small amount of the first fluid.
  • a cross or X-shaped punch is also formed at a position corresponding to the lower second injection part and the third injection part of the film, so that it may act as a fluid inlet for facilitating the injection of the fluid.
  • the shape of each fluid inlet is different.
  • a bottom surface of the second receiving unit may include a focusing mark that provides location information of an object to be observed.
  • the focusing label may be labeled on the bottom surface of the first sub-well so as to automatically track the observation area of the cell culture test device.
  • the focusing mark provided on the bottom surface is manufactured on the bottom surface in the form of microchannels through an injection molding method. Since the biological material in the solid thin film is fixed, the same area can be photographed every imaging time by using a focusing marker. In the automatic tracking of the observation area, the focusing mark serves to correct the position in three directions of the x-axis, y-axis, and z-axis.
  • FIG. 3 shows a process of introducing the first fluid and the second fluid into the well unit to test the antibiotic susceptibility
  • FIG. 4 shows the shape in which the first fluid is supplied to the first receiving unit.
  • the present invention also provides a method for analyzing cells using a cell culture test apparatus having a plurality of well units having an array structure in which a plurality of well units are aligned, the well unit comprising: A first injection part for injecting a first fluid, which is a mixed solution of a liquid medium containing a solidifying agent and a biological material, water, a cell culture medium, and a second solvent containing dimethylformamide (DMF) or dimethyl sulfoxide (DMSO) A second injection unit for injecting a fluid, a third injection unit for injecting an antibiotic into the island structure, a first receiving unit for accommodating the first fluid, a second receiving unit for accommodating the second fluid, the Including an island structure inside the second accommodation part, (a) injecting the antibiotic into the third injection part of the island structure to fix it on the inner surface and the outer surface of the island structure; (b) injecting the first fluid into the first injection unit, and solidifying the mixed solution after the injected first fluid flows into the first
  • the first fluid which is a mixed solution of a liquid medium containing a gelling agent and a biological agent, is prepared in a capacity greater than the capacity of the first receiving unit and introduced into the first injection unit.
  • the first fluid introduced into the first injection unit 132 flows into the first receiving unit with an appropriate dynamic contact angle with the help of gravity and surface tension (capillary phenomenon).
  • flow in a flow space with a closed wall is blocked by the pressure caused by the air trapped inside, but since the first accommodating part has an open microfluidic channel structure connected to the second accommodating part, air is not trapped and the first accommodating part without a pressure difference Free-flowing inside the buoy.
  • the radial flow of the first fluid reaches the capillary valve, which is a point connected to the second receiving part, and the angle of the wall surface in the capillary valve is rapidly changed so that the interface of the first fluid does not form an appropriate dynamic contact angle on the changed wall surface.
  • a biological material for example, a bacteria
  • a solid thin film can be formed.
  • the second fluid is injected into the receiving unit 120 through the second injection unit 134 to supply the antibiotic.
  • the second fluid is supplied to the receiving unit 120 through the second injection unit 134, but the second fluid is supplied through the empty space surrounded by the outer wall of the island structure, the island connecting structure 143, and the inner wall of the second receiving unit. 2 It is directly injected into the bottom of the receiving part 120.
  • the second fluid is injected in an amount sufficient to submerge the island structure, so that the antibiotic can be dissolved and diffused through the second fluid.
  • the dissolved antibiotic is directly injected through the third injection unit 130, the antibiotic and the solvent may be diffused while mixing with the second fluid, and when the dried antibiotic is attached to the island structure, the second injected As the antibiotic dissolves in the fluid, it spreads at the same time. Since the antibiotic is attached to the island structure located in the center of the first receiving unit, it is uniformly diffused into the first receiving unit to minimize the antibiotic concentration gradient (see FIG. 5 ).
  • the second fluid supplied to the accommodating part reaches the capillary valve 152 located on the lower side and comes into contact with the first fluid. Since the first fluid and the second fluid are the same or similar solvent, the antibiotic susceptibility to the antibiotic can be observed under a microscope by observing the change in the growth of the antibiotics diffuse into the gel matrix and the bacteria immobilized in the gel matrix.
  • the response of the biological material to the antibiotic is observed.
  • the biological material is fixed on the solid thin film, it is distributed two-dimensionally, and as a result, it is possible to observe in a single cell unit.
  • growth changes of individual cells can be observed within tens of minutes (usually 30 minutes), so the effect of antibiotics on biological substances can be confirmed more accurately and quickly than conventional methods.
  • a bioactivity test is performed on bacterial cells, the test can be completed within 3 to 4 hours.
  • such a rapid bioactivity test method will be referred to as single-cell morphological analysis (SCMA).
  • SCMA single-cell morphological analysis
  • An optical measuring device may be used for observation.
  • the optical measuring device may include an imaging system such as a CCD or CMOS camera.
  • the optical measuring device may also include lenses, lights and light guides, etc. necessary to focus and image the light.
  • the optical measuring device may also include an image processing system for processing and analyzing image data observed by the camera.
  • the optical measuring device records and analyzes the growth change of the biological material shown in the test process at a high speed to obtain the test result.
  • a periphery of the interface between the solid thin film of the first fluid and the second fluid is an imaging area, and the imaging area may have a size of about 300 ⁇ m*300 ⁇ m to 4000 ⁇ m*4000 ⁇ m.
  • at least a cross-section of the first sub-well has a greater width than the imaging area.
  • the amount of drug and cells required for drug test can be significantly reduced compared to the prior art, and the growth change of single cells can be tracked at a fast rate. It has the advantage of being able to obtain fast drug test results in usually 3 to 4 hours within 2 hours at the earliest. This is the highest scan rate known to date.
  • a biofilm is a membrane forming a mucous microbial complex formed by microorganisms wrapped in a polymer matrix and appearing at the part where microorganisms are infected or attached.
  • the formation of biofilms can also have a significant impact on human health. Infections caused by biofilms include lung infections, otitis media, and periodontitis.
  • a cell culture test device having an array of 8 x 2 aligned well units was prepared by injection molding a thermoplastic resin (polystyrene) into the structure shown in FIGS. 1 and 2 .
  • colistin as an antibiotic was injected into the islet structure through the third inlet. At this time, 10 ⁇ l of the antibiotic was injected, dried and fixed in the shape shown in FIG. 5 (b).
  • the thickness of the first accommodating part was manufactured to have a thickness of 300 ⁇ m and a width of 1 mm, and a capillary valve structure having a thickness of 300 ⁇ m and the same thickness as the thickness of the first accommodating part was designed at a portion in contact with the second accommodating part.
  • the island structure was spaced 300 ⁇ m apart from the bottom surface of the second accommodation unit, and was manufactured to coincide with the center of the island structure and the center of the second accommodation unit.
  • a PMMA film having a thickness of 100 ⁇ m was used as the bonding means.
  • Example 1 The same procedure was performed except that in Example 1, the thickness of the first accommodating part was 500 ⁇ m and the separation height of the island structure was 500 ⁇ m.
  • Example 1 the thickness of the first accommodating part was 500 ⁇ m, and the separation height of the island structure was 500 ⁇ m, and the same procedure was performed except that the bonding means was used as a PET film.
  • Example 2 The same procedure was performed except that in Example 1, a capillary valve structure having a thickness of 100 ⁇ m and a width of 100 ⁇ m was used.
  • Example 1 the thickness of the first accommodating part was 500 ⁇ m, and the separation height of the island structure was 500 ⁇ m, and the same procedure was performed except that a capillary valve structure having a thickness of 100 ⁇ m and a width of 100 ⁇ m was used.
  • Example 1 the same procedure was performed except that the bottom of the island structure was closed.
  • Example 1 the thickness of the first accommodating part was 500 ⁇ m and the separation height of the island structure was 500 ⁇ m, and the same procedure was performed except that the bottom of the island structure was closed.
  • Example 1 The same procedure was performed except that the width of the first receiving part in Example 1 was 0.5 mm.
  • Example 1 the thickness of the first accommodating part was manufactured to be 500 ⁇ m, the separation height of the island structure to be 500 ⁇ m, and the same was performed except that the width of the first accommodating part was used as 0.5 mm.
  • Example 1 the thickness of the first accommodating part was manufactured to be 500 ⁇ m, the separation height of the island structure was 500 ⁇ m, and the same was performed except that the width of the first accommodating part was used as 0.1 mm.
  • Example 1 to 8 and Comparative Examples 1 to 4 Ten cell culture test apparatuses of Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1 to 4 were fabricated, respectively, and then, whether the solid thin film formed by the first fluid was defective and the sensitivity of antibiotics according to each point was evaluated. Antibiotic susceptibility was evaluated by selecting four points of the first receptacle, and the four points were selected as points forming an angle of 90 with respect to the position of the first inlet (a, b, c, d, respectively). After the second fluid was injected, P. aeruginosa ATCC 27853 at each point was observed 6 hours later to evaluate whether the MIC was included in the QC range based on the colistin CLSI. Whether the solid thin film was defective was determined by visually observing the solid thin film in the first receiving unit.
  • FIG. 9 it is an enlarged photograph of the solid thin film after 4 hours without using the antibiotic (colistin) in Example 1, and FIG. 10 is a colistin concentration 0 (a), 0.12 (b), 0.25 (c) ), 0.5(d), 1(e), 2(f) at mg/ml for 6 h.
  • the reaction according to each concentration is clearly shown, and the effect of the antibiotic can be clearly confirmed especially at 1mg/ml or more.
  • Examples 2, 4, 6, and 8 having a relatively high thickness of the first receiving part had a slightly higher defect rate than Examples 1, 3, 5, and 7. In many cases, penetration into the second accommodating part occurred.

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Abstract

복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치로서, 상기 웰 유닛은 제1 유체를 주입하기 위한 제1 주입부; 상기 제1 주입부에서 주입된 제1 유체가 유동하여 수용되도록 제1 주입부와 연통된 제1 수용부; 제2 유체를 주입하기 위한 제2 주입부; 및 제2 유체를 수용하기 위한 제2 수용부를 포함하되; 상기 제2 수용부의 내부에는 제2 수용부의 벽면에서 확장된 섬 연결 구조물에 의하여 연결되어 있는 섬 구조물을 포함하고, 상기 섬 구조물의 상측에는 항생제가 투입되는 제3 주입부가 형성되며, 상기 섬 구조물 내면 및 외면에는 상기 제3 주입부에서 주입된 항생제가 수용되어 고정되는 세포배양검사 장치가 제공된다.

Description

섬 구조물을 포함하는 신속한 세포배양검사 장치
본 명세서에 개시된 기술은 세포배양검사 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 섬 구조물을 포함하는 것으로 유체 분주시 칩의 웰 내에서 고르게 분포하여 정확한 관찰이 용이한 세포배양검사 장치에 관한 것이다.
인체 감염균에 의한 감염 시 적절한 시기에 항생제를 처방 받는 것은 생존율에 큰 영향을 끼친다. 올바른 항생제 처방을 위해서는 우선 감염 원인 균주의 생장이 특정 항생제의 특정 농도에서 억제되는지에 대한 확인이 필요한데, 이러한 확인을 항생제 감수성 검사라고 부른다.
항생제 감수성 검사는 일반적으로 감염 원인균을 배양액과 항생제를 다양한 농도로 섞은 마이크로 웰에서 18시간 가량 배양한 후 자랐는지 여부를 광투과성으로 판단하게 되는데, 여기에 소요되는 배양 시간을 최소화하고 업무를 자동화 하기 위한 제품이 많이 개발되고 있다.
배양 시간을 최소화하기 위해서는 우선 배양 환경의 소형화가 기본적인 조건이며, 이러한 소형화와 자동화를 위해 미세 유체를 분주하고 원하는 형상과 시퀀스로 조정할 수 있는 마이크로 단위의 구조물을 가지는 일회용 플라스틱 플레이트를 도입하는 사례가 급증하는 추세이다.
한편 본 출원인은 이러한 미세유체 플레이트를 도입하여 현미경 이미징 방식으로 균의 성장 여부를 판단하는 항생제 감수성 검사 시스템을 개발하였는데, 본 시스템을 이용하면 수 시간 내에 항생제 검수성 검사를 마칠 수 있는 장점이 있으나, 3차원 세포 고정과 배양액 및 약물의 공급을 위해서는 채널의 형상이 복잡해져야 하며 배양액 및 약물의 확산이 먼 거리까지 이루어지기 어렵다는 점에 한계가 있다.
전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 섬 구조물을 포함하는 것으로 유체 분주시 칩의 웰 내에서 고르게 분포하여 정확한 관찰이 용이한 세포배양검사 장치를 제공하고자 한다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 본 발명은 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치로서, 상기 웰 유닛은 제1 유체를 주입하기 위한 제1 주입부; 상기 제1 주입부에서 주입된 제1 유체가 유동하여 수용되도록 제1 주입부와 연통된 제1 수용부; 제2 유체를 주입하기 위한 제2 주입부; 및 제2 유체를 수용하기 위한 제2 수용부를 포함하되; 상기 제2 수용부의 내부에는 제2 수용부의 벽면에서 확장된 섬 연결 구조물에 의하여 연결되어 있는 섬 구조물을 포함하고, 상기 섬 구조물의 상측에는 항생제가 투입되는 제3 주입부가 형성되며, 상기 섬 구조물 내면 및 외면에는 상기 제3 주입부에서 주입된 항생제가 수용되어 고정되는 세포배양검사 장치를 제공한다.
일 구현예에 있어서, 상기 섬 구조물의 중심은 상기 제1 수용부의 중심과 일치하며, 상기 제1 수용부와 일정한 거리를 가지도록 배치될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 섬 구조물의 하단은 제2 수용부의 바닥면으로부터 0.1~1mm 이격되어 설치되며, 섬 구조물의 바닥면이 개방될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제2 유체는 주입시 섬 구조물의 내면 및 외면과 접촉하며, 섬 구조물 내면 및 외면에 고정된 항생제를 용해하여 제1유체로 확산시킬 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 수용부는 상기 제1 주입부를 통하여 주입된 제1 유체가 모세관 현상을 통하여 채워질 수 있도록 두께와 너비가 정해질 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 수용부는 폭이 0.3~2mm이며, 두께가 100~500㎛일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 유체와 상기 제2 유체가 서로 만나 제1 유체로 물질이동이 가능하도록 상기 제2 수용부의 측면과 상기 제1 수용부의 내면이 연통될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 제1 수용부는 개방형 미세유체(Open microfluidics) 구조로 제1 수용부의 일부 면이 개방되어있으며, 개방된 면은 상기 제2 수용부의 측면과 모세관 밸브 구조로 연결될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 모세관 밸브 구조는 상기 제1 유체의 주입시 제1 수용부로의 유동 중 또는 유동 후 상기 제2 수용부로 유입되지 않도록 두께와 너비가 정해해질 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 모세관 밸브의 두께는 100 내지 500㎛이고, 너비는 100㎛ 내지 2mm일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 세포배양검사 장치는 후면부에 제1 유체와 제2 유체의 누출을 방지하기 위한 후면 본딩 수단을 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 후면 본딩 수단은 광학적으로 투명한 필름일 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 복수의 웰 유닛들이 정렬되어 형성된 어레이 구조를 가지는 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치를 이용한 세포의 분석 방법으로서, 상기 웰 유닛은 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액인 제1 유체를 주입하기 위한 제1 주입부, 물, 세포배양용 배지, Dimethylformamide(DMF) 또는 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 포함하는 용매인 제2 유체를 주입하기 위한 제2 주입부, 항생제를 섬 구조물에 주입하기 위한 제3 주입부, 상기 제1유체를 수용하기 위한 제1 수용부, 상기 제2유체를 수용하기 위한 제2 수용부, 상기 제2 수용부 내부의 섬 구조물을 포함하며, (a) 상기 항생제를 섬 구조물의 제3 주입부에 주입하여 섬 구조물의 내면과 외면에 고정시키는 단계; (b) 상기 제1 유체를 상기 제1 주입부에 주입하여, 주입된 제1 유체가 제1 수용부로 유동한 후 상기 혼합용액을 고화하여 고체 박막을 형성하는 단계; (c) 상기 제2 유체를 제2 주입부에 주입하여 제2 수용부에 수용되면서 제2 수용부 내에 위치한 섬 구조물에 접촉시키는 것으로 항생제를 분산 또는 용해하며, 제2 유체를 상기 제1 수용부와 제2 수용부가 연결된 면에서 제1 유체의 고체 박막과 접촉시키는 것으로 상기 항생제를 상기 고체 박막으로 확산시키는 단계; 및 (d) 상기 제1 유체의 고체 박막과 상기 제2 유체가 서로 만나 형성된 계면과, 제1 유체의 고체 박막 내부에서 일어나는 생물학적 물질의 변화를 단일세포 단위로 관찰하는 단계를 포함하는 세포의 분석 방법을 제공한다.
일 구현예에 있어서, (d) 상기 항생제에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 섬 구조물을 포함하는 신속한 세포배양검사 장치는 항생제의 고른 분산 및 빠른 확산이 가능하여 기존의 항생제 검사장치에 비하여 정확한 검사를 수행할 수 있으며, 고체박막 내에 고정된 세포를 이용하여 항생제의 효과를 관찰하고 있어 기존의 장치에 비하여 신속한 항생제 감수성 검사가 가능하다.
또한 본 발명에 의한 섬 구조물을 포함하는 신속한 세포배양검사 장치는 일반적으로 단일 세포(single bacteria)의 성장변화는 수십 분(보통 30분) 이내에 관찰이 가능하고, 단일 세포 군집(single colony of bacteria)의 변화에는 보통 4~6시간 이내에 관찰이 가능하기 때문에 생물학적 물질에 대한 생리활성물질의 영향을 기존 방식에 비해 정확하고 빠르게 확인할 수 있다.
또한 본 발명에 의한 섬 구조물을 포함하는 신속한 세포배양검사 장치는 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 군집 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정할 수 있음에 따라, 항생제 감수성 시험 뿐 아니라 바이오필름 어세이(biofilm assay)에도 매우 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 세포배양검사 장치의 일 구현예를 나타낸다.
도 2는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치의 웰 유닛의 단면을 나타낸 것이다.
도 3은 제1 유체 및 제2 유체를 웰 유닛에 도입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 나타낸다.
도 4는 웰 유닛의 미세 유체 채널에 도입된 제1 유체를 나타낸 것으로 (a)는 평면도 (b)는 상기 (a)도면을 A-A`따라 절단한 단면을 각각 나타낸 것이다.
도 5는 항생제를 제3 주입부에 건조하여 부착한 다음, 제2 주입부로 제2 유체를 공급할 때 유체 및 항생제의 거동을 간략히 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 다양한 형상을 가지는 섬 구조물 및 섬 연결 구조물(143)을 나타낸 것으로 평면도, 사시도 및 단면도를 각각 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양검사 장치 제조용 금형에 관하여 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 후면 본딩수단 및 상기 후면 본딩수단에 도포되는 접착제를 도시한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 의한 고체 박막의 확대사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 의한 고체박막의 관찰결과로 콜리스틴의 농도가 (a)는 0mg/ml (b)는 0.12mg/ml, (c)는 0.25mg/ml, (d)는 0.5mg/ml, (e)는 1mg/ml (f)는 2mg/ml에서의 관찰결과를 각각 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 의한 섬구조물의 이격 높이에 따른 유체의 거동을 나타낸 사진이다.
이하 본 명세서에 개시된 기술에 대해 도면을 참조하여 보다 상세히 설명하고자 한다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 명세서에 개시된 기술의 구현예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 명세서에 개시된 기술은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 기술의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고, 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
한편, 본 명세서에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다. "제1 " 또는 "제2 " 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
또, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함하다" 또는 "가지다"등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치가 제공된다. 도 1은 세포배양검사 장치의 일 구현예를 나타낸다. 도 1의 (a)는 세포배양검사 장치의 전체적인 구성을 나타낸 도면이고, (b)는 세포배양검사 장치의 일부를 확대한 것이고 (c)는 웰 유닛의 단면을 나타낸 것이다. 도 1을 참조하면, 세포배양검사 장치(100)은 복수의 정렬된 웰 유닛(110)들을 구비한다. 이 때 상기 웰 유닛(110)이 다수 정렬되어 전체적으로 상용 멀티-웰 플레이트와 유사한 규격을 가질 수 있다. 바람직하게는 웰 유닛(110)의 중심이 상용 멀티-웰의 중심과 일치할 수 있다. 웰 유닛(110)은 제1 유체를 주입하기 위한 제1 주입부(132); 제2 유체를 주입하기 위한 제2 주입부(134); 상기 제1 주입부(132)에서 주입된 제1 유체가 흐르도록 제1 주입부와 연통된 제1 수용부(150); 제2 유체를 수용하기 위한 제2 수용부(120)가 존재한다.
화학적, 생화학적, 및/또는 생물학적 분석에 있어서 멀티-웰 플레이트는 다수의 샘플을 처리하고 분석하기 위한 표준 도구이다. 멀티-웰 플레이트는 다양한 형태, 크기 및 모양을 취할 수 있는데, 일반적으로 표준 크기 및 모양으로 만들어지고, 웰들의 표준 배열을 가진다. 상기 멀티-웰 플레이트와의 호환성을 위하여 상기 복수의 웰유닛은 96-웰 플레이트(12x8의 웰 배열), 384-웰 플레이트(24x16의 웰 배열), 및 1536-웰 플레이트(48x32의 웰 배열)의 표준 웰배열을 가질 수 있으며, 기타 다양한 방식의 상용 멀티-웰 플레이트와 동일 또는 유사한 배열을 가질 수 있다. 세포배양검사 장치(100)이 상용 멀티-웰 플레이트와 동일 또는 유사한 규격을 가짐으로써 종래의 다양한 생물학적 분석 기술과 용이하게 호환될 수 있다. 따라서 본 발명에서 복수의 웰 유닛은 1x1, 1x2, 1x4, 2x4, 4x6, 12x8, 24x16 또는 48x32의 웰 배열을 갖는 것일 수 있다.
도 2의 (a)는 항생제 검사용 칩의 웰유닛을 나타낸 것이고 (b)는 상기 도2(a)의 A-A`을 따라 절단한 단면도이다.
[제1 주입부와 제2 주입부의 위치]
제1 주입부(132) 및 제2 주입부(134)는 통상 웰 유닛(110)의 상부에 위치하며 전면이 개방된 형태 또는 부분적으로 개방된 형태일 수 있다. 제1 주입부(132) 및 제2 주입부(134)는 단일 또는 복수의 개구부를 구비할 수 있다. 피펫팅이나 인젝션 등에 의해 상기 제1 유체 및 상기 제2 유체가 제1 주입부(132) 및 제2 주입부(134)을 통해 웰 유닛(110) 내부에 도입될 수 있다.
[제1 주입부의 특징]
상기 제1 주입부(132)는 제1 유체의 도입을 위하여 사용되는 것으로 하단부는 제1 수용부(150)와 연통되어 주입된 제1 유체가 제1 수용부(150)로 공급될 수 있도록 한다. 상기 제1 주입부(132)는 단순히 제1 유체의 공급을 위하여 사용되는 것이기 때문에 원통형, 상부가 개방된 원뿔형, 또는 테이퍼 형으로 제작되어 내부로 공급된 제1 유체가 원활하게 흐르도록 하는 것이 바람직하다. 특히 테이퍼 형으로 제작되는 경우 사출성형 제작 시 금형에서 이탈이 용이하며, 확대된 주입구의 직경은 제1 유체의 주입이 용이하고, 주입된 제1 유체를 제1 수용부(150)와 만나는 한 지점으로 모아서 공급하기 때문에 더욱 바람직하게 사용될 수 있다. 제1 유체가 제1 수용부로의 유동이 원활하다면 제1 주입부는 제2 주입부와 연통되어있거나, 제2 주입부 내에 포함된 구조일 수 있다.
[제2 주입부의 특징]
제2 주입부(134)는 제2 유체를 제2 수용부(120)에 주입하기 위하여 사용되는 것으로 제2 수용부(120)의 상단에 위치할 수 있다. 상기 제2 주입부(134)는 제2 유체를 주입해야 할 뿐만 아니라 제2 수용부(120)의 내부에 섬 연결 구조물(143)로 연결된 제3 주입부(140)를 포함하는 섬 구조물(142)을 가져야하기 때문에 상기 제1 주입부(132)에 비하여 직경이 크게 제작되는 것이 바람직하다. 또한 제2 유체가 제1 주입부로 침입하지 않도록 제어한다면 제2 주입부는 제1 주입부도 포함할 수 있다. 상기 제2 주입부(134)는 제2 수용부(120)의 단면형상과 동일하게 제작될 수도 있지만 주입 위치의 특정 및 편의성을 위하여 제2 수용부 단면형상의 일부가 변형된 형상을 가질 수도 있다. 이때 변형된 부분은 제2 유체 주입시 피펫 등의 주입수단의 원활한 진입을 유도하는 보조자로 작용할 수 있으며, 이에 따라 정확한 위치에 정확한 양의 제2 유체 도입이 가능하다.
[제1 유체 및 제2 유체의 특징]
상기 제1 유체 및 상기 제2 유체는 통상적으로 물을 70~99중량% 바람직하게는 85~99중량%, 가장 바람직하게는 93~99중량%의 분산매 또는 용매로서 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 유체는 고형화제(gelling agent)를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질(biological agent)의 혼합용액일 수 있다. 상기 범위 내에서 물은 분산매로서 최적의 성능을 발휘할 수 있다.
[제1 유체의 액상 매질 특징]
상기 액상 매질은 약 95% 이상의 물을 포함할 수 있으며 고형화제의 존재에 의해 고체화될 수 있다. 고형화제의 예로 한천(agar), 아가로즈(agarose), 젤라틴(gelatin), 알기네이트(alginate), 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 한천 또는 아가로즈가 사용될 수 있다. 일예로 액상 매질 내에는 한천이 0.3 내지 4 중량%가 사용될 수 있다. 통상적으로 액상 매질은 영양성분을 필요로 하지 않지만, 몇몇 예에 있어 영양성분을 포함할 수도 있고, 특정 세포의 분열을 촉진시키는 배지를 포함한 용액일 수 있다. 상기 한천이 0.3중량% 미만으로 포함되는 경우 고형화가 이루어지지 않을 수 있으며, 4중량%를 초과하는 경우 과도한 고형화로 인하여 생물학적 물질의 확산이 용이하지 않을 수 있다.
[제1 유체의 생물학적 물질 특징]
상기 생물학적 물질은 바이러스, 박테리아, 균류, 조류, 원생동물, 기생 병원균, 사람 또는 포유류의 세포 및 바이오필름 등을 포함한다. 또한 상기 생물학적 물질은 박테리아, 바이러스, 균류 등과 같이 감염성을 나타내는 생물학적 물질과 혈구 세포의 혼합 상태일 수 있다. 예를 들어, 박테리아에 감염된 사람으로부터 채취한 혈액일 수 있는데, 이런 경우 혈구 세포와 박테리아 세포를 구별할 수 있도록 박테리아 세포의 분열만 촉진시키는 배지를 사용하여 혈구 세포와의 크기 변화 차이로 구별할 수 있다. 상기 생물학적 물질은 액상 또는 고상의 배지 내에서 성장할 수 있고 외부 생리활성물질의 종류 및 농도에 따라 성장에 영향을 받을 수 있다. 상기 혼합 용액 내에서의 상기 생물학적 물질의 밀도는 10 2 내지 10 10 cells/ml, 바람직하게는 10 4 내지 10 10 cells/ml, 더 바람직하게는 10 5 내지 10 9 cells/ml일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 생물학적 물질의 위치를 파악하기 어려울 수 있고 상기 범위 초과에서는 개별적인 생물학적 물질의 상태를 파악하기 어려울 수 있다.
[제1 수용부의 특징]
제1 수용부(150)는 상기 제1 주입부(132)에서 도입된 제1 유체가 제1 수용부(150)를 채울 수 있도록 제1 주입부(132)와 연통될 수 있다. 통상 제1 수용부(150)는 개방형 미세유체 채널 구조로 제작될 수 있으며 너비가 예를 들어 수백 ㎛ 내지 수 mm 수준이고, 깊이(또는 두께)가 수백 ㎛ 수준으로 추후 이미징이 용이하고 모세관 현상에 의해 상기 제1 유체가 제1 수용부(150) 내부를 채울 수 있는 규격을 가질 수 있다. 또한 상기 제1 유체가 고형화제를 함유한 액상 매질일 경우 일정 시간 후 겔화될 수 있다. 그 결과 미세 유체 채널 내부를 채우는 고체 박막이 형성될 수 있다. 아울러 상기 제1 수용부는 제2 수용부를 감싸는 도넛 형상으로 제작될 수 있다. 상기 제1 수용부에 주입된 제1 유체는 고형화 됨과 동시에 제2 유체와 접촉하면서 거체박막을 형성하게 되는데 생성된 고체 박막과 제2 유체사이의 접촉면적을 최대화 하기 위하여 상기 제1 수용부는 제2 수용부의 외면을 감싸는 도넛형상으로 제작될 수 있다. 다만 상기 제2 수용부가 사각형 삼각형 등의 다각형을 가지는 경우 이러한 형상에 맞는 형상으로 제1 수용부를 제작하여 제1 수용부 내주면에 위치하는 제2 유체와의 접촉부가 최대화 될 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
제1 수용부(150)는 주입된 제1 유체가 고형화되어 고체 박막이 형성될 수 있다. 상기 제1 주입부를 통해 상기 제1 유체가 투입되고 고화 과정을 거치는데, 상기 제1 수용부(150)의 깊이에 따라 고체 박막의 두께가 결정될 수 있다. 상기 제1 수용부의 두께는 1㎛ 내지 500㎛, 1㎛ 내지 100㎛, 또는 100㎛ 내지 500㎛ 중 어느 하나의 범위일 수 있다. 바람직하게는 상기 제1 수용부의 깊이는 500㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 100㎛ 내지 500㎛이다. 상기 제1 유체 수용부의 두께가 상기 범위를 초과하는 경우 박막의 두께가 두꺼워져 필요한 검체의 양이 많아지거나 정확한 관찰이 어려울 수 있으며 상기 범위 미만에서는 동일 면적당 관찰 가능한 생물학적 물질의 양이 적어 정확한 관찰과 판단이 어려울 수 있다.
한편, 상기 제1 수용부의 너비는 이미지 영역의 크기를 고려할 때, 100㎛ 내지 5mm, 또는 300㎛ 내지 5mm, 또는 500㎛ 내지 3mm, 또는 1mm 내지 3mm일 수 있다. 바람직하게는 상기 미세유체 채널의 너비는 0.3mm 내지 2mm이다. 상기 제1 유체 수용부의 너비가 상기 범위 미만인 경우 관찰 가능 시야가 좁아져 정확한 관찰이 어려울 수 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우 필요한 검체의 양이 늘어남에 따라 비효율적이다.
[제1 수용부의 고체 박막 규격]
상기 고체 박막의 두께와 너비는 상기 미세유체 채널의 깊이와 너비에 따라 정해진다. 본 명세서에서 "박막"이라 함은 상기 생물학적 물질을 고정하여 단일 세포 단위로 관찰할 수 있을 정도면 두께가 특별히 제한되지 않으나, 대체로 1㎛ 내지 5mm, 또는 1㎛ 내지 3mm, 또는 1㎛ 내지 2mm, 또는 1㎛ 내지 1.5mm, 또는 1㎛ 내지 1mm, 또는 1㎛ 내지 800㎛, 또는 1㎛ 내지 500㎛, 1㎛ 내지 100㎛, 또는 10㎛ 내지 3mm, 또는 100㎛ 내지 500㎛ 또는 10㎛ 내지 1mm, 또는 100㎛ 내지 1mm, 또는 200㎛ 내지 1mm, 또는 500㎛ 내지 1mm 중 어느 하나의 범위를 갖는 얇은 층을 의미한다. 여기서 고체 박막의 두께는 관찰하고자 하는 고체 박막 면에 대한 수직방향의 크기에 해당할 수 있다. 고체 박막은 상술한 범위의 두께를 가지므로 내부에 고정된 생물학적 물질을 개별 세포(single cell) 단위로 관찰할 수 있다.
[제1 수용부의 고체 박막의 계면 특징]
또한 상기 제1 유체와 상기 제2 유체가 접촉되어 바닥면에 수직한 계면을 형성할 수 있도록 제1 수용부(150)는 상기 제2 수용부(120)의 측면과 연통될 수 있다. 이때 기존의 발명에서는 상기 제1 유체와 상기 제2 유체가 바닥면에 평행한 계면을 형성하도록 제작하였지만 이 경우 특정 높이에서만 항생제에 의한 변화를 관찰할 수 있다는 단점을 가지고 있었다. 특히 관찰하는 특정 높이가 적절한 생물학적 물질(예를 들어 세균, 곰팡이 등)이 위치하지 못하는 경우 변화가 아예 관찰되지 않거나 검사의 신뢰성이 떨어질 수 있다. 또한 상기와 같이 수평의 계면은 제1 유체의 용량 오차에 따라 높이의 오차가 발생하면 항생제의 농도구배가 발생하는 경우 농도에 따른 항생제의 효과가 검사결과의 신뢰성이 더욱 떨어질 수도 있다. 하지만 본원 발명의 경우 상기 제1 수용부가 상기 제2 수용부의 내측면에 연결됨에 따라, 바닥면에 수직한 계면을 형성하여 관찰시 계면 위치를 정확히 확인할 수 있으며, 계면과 주변을 특히 관찰함으로 써 제1 유체에 더욱 소량의 생물학적 물질이 포함된 경우에도 용이하게 변화를 관찰할 수 있다.
아울러 상기와 같이 제2 수용부의 중심과 제1 수용부의 중심이 동일하게 내면이 연결된 경우 상기 섬 구조물의 중심도 동일하여 중심으로부터 동일한 거리에 제1 유체와 제2 유체의 계면이 형성된다. 특히 제3 주입부로 주입되거나 섬 구조물에 부착된 항생제가 제2 유체로 확산되어 계면으로 전달될 때 계면이 초기 항생제와의 거리가 동일함에 따라 균일한 항생제 농도를 달성할 수 있다. 이를 위하여 상기 제1 수용부의 내주면과 상기 제2 수용부(120) 측면이 일치되어 제작될 수 있다. 즉 상기 제1 수용부의 내주면의 전체는 상기 제2 수용부 하단 측면과 연통되어 있는 것이 바람직하며, 외주면을 통하여 도입되는 제1 유체가 상기와 같이 연통된 내주면을 통과하지 못하도록 상기 제1 수용부와 상기 제2 수용부 하단 측면은 모세관 밸브를 통하여 연결되는 것이 바람직하다.
[제2 수용부의 특징]
제2 수용부(120)는 상기 제2 주입부(134)에서 도입된 제2 유체를 수용하기 위한 것으로 내부에 섬 구조물(142) 및 제3 주입부(140)가 섬 연결 구조물(143)로 연결될 수 있다. 상기 제2 수용부(120)는 상기 제2 유체를 투입하고 상기 제2 유체를 보유하기에 충분한 크기의 공간을 가지는 웰 형태를 가질 수 있다. 상기 제2 수용부의 부피는 특별히 제한되지 않지만 제2 유체를 주입한 후 장시간 동안 반응을 관찰하기 위해 충분한 크기를 가질 수 있으며, 바람직하게는 100㎕ 내지 2000㎕일 수 있다. 제2 수용부의 부피가 100㎕ 미만인 경우 각 웰의 크기가 감소하여 원활한 관찰이 어려울 수 있으며, 2000㎕를 초과하는 경우 필요한 샘플 및 시약의 양이 늘어남에 따라 효율이 감소될 수 있다.
[섬 연결 구조물의 특징]
상기 섬 연결 구조물(143)은 제3 주입부(140)와 섬 구조물(142)을 상기 제2 수용부(120)의 내부에 위치하도록 하는 구조물로서, 섬 연결 구조물(143)과 상기 제2 수용부(120)의 내벽 사이의 공간으로 제2 유체의 도입이 가능하도록 제작되는 것이 바람직하다. 이를 위하여 상기 섬 연결 구조물(143)은 상기 제2 수용부(120)의 벽면에서 내부로 연장된 구조를 가지고 있으며, 중심부에는 제3 주입부(140)와 섬 구조물(142)이 위치할 수 있다. 또한 섬 구조물의 경우 상기 제2 수용부와 일정거리 미만의 간격을 가지고 위치해야 하므로, 상기 섬 연결 구조물(143)은 상기 제2 수용부(120)의 내부 벽면에서 하단부의 중심방향으로 연장되어 돌출된 형상인 것이 바람직하다.
이때 상기 제3 주입부(140)와 섬 구조물(142)의 경우 1개의 섬 연결 구조물(143)을 통하여 상기 제2 수용부(120)의 내부에 위치할 수도 있지만 바람직하게는 복수의 섬 연결 구조물(143)을 통하여 연결될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2~4개, 가장 바람직하게는 2개의 연장된 구조를 가지는 것이 제2 유체의 주입이 용이할 수 있다.
이외에도 상기 섬 연결 구조물(143)의 경우 도 6에 나타난 바와 같이 다양한 형상을 가질 수 있다. 도 6에는 다양한 형상을 가지는 섬 구조물 및 섬 연결 구조물(143)의 상면도, 사시도 및 단면도를 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 섬 구조물은 열린 통로 형태(위 그림의 2,3,4,5)/닫힌 바구니 형태(위 그림의 1)가 모두 가능하며, 섬구조물의 형상보다는 항생제를 가두어 둘 수 있는 성능이 중요하다. 이때 열린 통로 형태는 닫힌 바구니 형태보다 제 2 유체 주입 시 항생제 확산에 더욱 유리하다. 단 항생제 주입부터 건조될 때까지 열린 공간으로 새어나가지 않도록 최적화한 설계가 필요로 한다.
또한 섬 연결 구조물(143)은 섬 구조물과 제2 수용부 간에 연결된 구조이다. 이때 한 개의 섬 연결 구조물(143)을 사용하여 섬 구조물을 고정할 수 있지만, 사출성형에서 금형에서의 분리 과정이 안정적이기 위해서 섬 연결 구조물(143)은 대칭적이거나 넓은 것이 권장되며, 제 2 유체의 분주에도 방해를 주지 않기 위해서는 2개 이상의 대칭형 또는 단일 나선 구조의 섬 연결 구조물(143)이 바람직하다. 복수의 섬 연결 구조물(143)이 될 경우 사출성형에서 금형에서의 분리과정에서 안정적이면서, 제 2 유체의 분주가 원활한 공간 확보가 필요해서 섬 연결 구조물(143)의 개수 및 형상 크기는 최적화가 필요하다. 나선형의 구조를 가지는 섬 연결 구조물(143)의 경우 접촉면적이 넓어 분리과정에서 가장 안정적이지만 제2 유체의 주입시 일방향에서만 주입 가능하여 사용에 어려움이 있으며 섬 구조물 직경과 동일한 두께의 두꺼운 섬 연결 구조물(143)을 2개 사용하여 대칭적으로 제2 수용부와 연결되는 것이 바람직하다.
[제3 주입부의 특징]
제3 주입부(140)는 항생제를 주입하기 위한 부분으로, 상기 섬 구조물의 상부에 연결되어 제2 수용부(120)의 내부에 위치할 수 있다. 제3 주입부(140) 아래에는 섬 구조물이 연통되어 주입된 항생제를 수용할 수 있도록 한다(도 5 참조). 상기 제3 주입부(140)는 단순히 항생제의 공급을 위하여 사용되는 것이기 때문에 원통형, 상부가 개방된 원뿔형, 또는 테이퍼 형으로 제작되어 내부로 공급된 항생제가 원활하게 섬 구조물 내로 흐르도록 하는 것이 바람직하다.
[섬 구조물의 특징]
섬 구조물(142)은 제3 주입부로부터 도입된 항생제를 수용하거나 건조된 항생제(고체 형태의 항생제)가 부착되어 있는 부분으로, 상기 섬 연결 구조물(143)로부터 제2 수용부의 내부에 고정된다. 도입된 액상의 항생제는 섬 구조물(142)의 내에 수용되거나, 섬 구조물의 바닥면을 개방하여 섬 구조물과 상기 제2 수용부(120)의 바닥면 사이의 공간에 수용할 수 있다. 액상의 항생제가 표면장력으로 인하여 섬 구조물(142)의 외부로 돌출되지 않는 이상, 상기 섬 구조물(142) 내부에 주입된 항생제는 상기 제2 수용부(120)의 바닥면으로부터 이격될 수 있다. 항생제는 섬 구조물(142)내에 또는 바닥면이 개방된 섬 구조물(142)과 제2 수용부(120)의 바닥면 사이에 건조되어 부착될 수 있으며, 제2 유체의 도입에 따라 제2 유체의 분산 또는 용해되어 공급될 수 있다. 바닥면이 개방된 섬 구조물에 항생제가 주입되는 경우 상기 상행제가 바닥면으로부터 이격되어 부착되면 상기 항생제 수용 부피가 늘고 제2 유체 도입 후 건조된 항생제의 확산 경로를 단축하여 원활한 확산에 유리하다. 또한 액상의 항생제 도입 시 섬 구조물과 제2 수용부 사이 공간 내에서 섬 구조물 밖으로 퍼지지 않으려면 상기 항생제는 섬 구조물과 제2 수용부 사이 공간 내에 표면장력으로 그 형상이 유지되어야 한다. 이때 상기 항생제의 표면장력을 유지하기 위한 섬 구조물의 이격 거리는 0.1~1mm가 바람직하다. 이 이격거리가 0.1mm미만인 경우 확산에 필요한 공간이 줄어들어 항생제의 감수성을 확인하는 것이 많은 시간이 필요하며, 1mm를 초과하여 이격되어 있는 경우 항생제가 표면장력으로 그 형상을 유지할 수 없어 주입된 항생제가 섬 구조물 밖으로 누출될 수 있다.
[섬 구조물에 위치하는 항생제의 특징]
제3 주입부(140)에 고체 형태의 항생제를 포함하고 있는 경우, 상기 항생제는 건조된 상태일 수 있다(도 5의 (b)참조). 이 경우 건조된 항생제를 용해하는 용매 즉 제2 유체로서는 물, 세포배양용 배지, Dimethylformadide(DMF), Dimethyl sulfoxide (DMSO)가 사용될 수 있다. 상기 항생제를 용해하는 용매는 고체 형태의 항생제를 완전히 용해시키고, 용해된 후 용액의 균일한 농도를 갖도록 하기 위해 피펫팅하면서 도입될 수 있다(도 5의 (d)). 아울러 상기 항생제는 효능을 떨어트리지 않는 건조법이라면 제한 없이 사용하여 건조할 수 있지만 바람직하게는 상온건조, 가열건조, 동결건조 또는 감압건조를 이용하여 건조될 수 있고 가장 바람직하게는 가열건조를 통하여 건조될 수 있다. 또한 상기 항생제는 상기와 같은 건조법을 이용하여 건조된 다음, 상기 제3 주입부에 주입될 수 있으며, 제3 주입부에 항생제 용액을 주입한 다음, 상기 건조법을 이용하여 건조시키는 것도 가능하다.
또한 항생제를 포함하는 유체를 제3 주입부(140)에 직접 도입하는 경우 항생제는 제2 유체와 동일한 성분을 가지는 용매에 용해된 것일 수 있다. 다만 항생제의 보관 및 취급의 용이성을 위하여 상이한 용매를 사용할 수도 있으며, 이 경우 항생제를 포함하는 용매는 상기 제2 유체와 혼합 또는 확산이 용이한 용매를 선택하여 사용하는 것이 바람직하다. 아울러 상기 항생제는 일정한 표면장력을 가짐으로써 상기 섬 구조물과 제2수용부 사이의 공간내에서 일정한 모양을 가지고 건조될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 이때 항생제의 경우 대부분 물과 유사한 점도를 가지게 되므로 섬 구조물과 제2 수용부 사이의 이격 규격은 물을 기준으로 하여 제작하는 것이 바람직하다.
[모세관 밸브 특징]
상기 모세관 밸브(152)는 제2 수용부 내면과 제1 수용부 내면이 연결되는 지점으로, 상기 제1 유체가 제1 수용부에서 유동 중 또는 유동 후 제2 수용부(120)로 유입되지 않도록 하는 구조이다. 상기 모세관 밸브(152)의 두께와 각도는 제1 유체의 유동을 제어할 수 있다. 작은 폭의 제1 수용부에 진입한 제1 유체는 공기와의 계면으로 큰 표면장력을 갖는다. 제1 수용부에서 제1 유체의 계면은 유동방향을 지지하는 방향으로 접촉각과 표면장력을 형성한다. 반면 제2 수용부와 제1 수용부의 경계에서는 변경되는 모서리의 각도로 인해 제1 유체의 계면이 제2 수용부로의 진입에 저항하는 방향으로 접촉각과 표면장력을 형성한다. 또한 모세관 밸브는 상기 제1 유체가 제1 수용부로 공급될 때 채널 내부 공기의 배출 및 제1 주입부와의 압력 차이 해소에 사용될 수 있어 상기 제1 수용부(150) 내부를 균일하게 제1 유체로 채울 수 있다. 아울러 상기와 함께 제2 유체 내 물질의 확산이 용이하기 위하여 상기 모세관 밸브의 두께와 너비는 확산 경로가 방해되지 않도록 결정하는 것이 바람직하며, 통상 100 내지 500㎛의 두께, 100㎛ 내지 2mm의 너비를 가질 수 있다. 다만 모세관 밸브의 두께가 상기 제1 수용부의 두께와 동일할 경우에는 너비를 자유롭게 선택하여 사용할 수 있다. 상기와 같은 범위의 모세관 밸브를 사용하는 경우 제1 수용부(150) 내부의 공기 배출이 용이하면서도 제1 유체의 누출이 없이 제2 유체의 확산이 용이하지만, 상기 범위 미만의 규격을 가지는 모세관 밸브를 사용하는 경우 공기의 배출 및 제2 유체 내 물질의 확산이 용이하지 못하며, 상기 규격을 초과하는 모세관 밸브를 사용하는 경우에는 제1 유체가 제2 수용부로 유출되어 더욱 많은 샘플이 필요하거나 정확한 실험결과의 검출이 어려울 수 있다.
[칩 제조와 관련한 특징]
또한 기존의 일회용 플라스틱 칩(멀티 웰 플레이트)의 경우 일반적으로 사출성형 방식으로 제작됨에 따라 상단부가 하단부보다 넓은 양각구배의 형상을 가지도록 웰의 형상을 구성하고 있다. 이러한 양각구배 형상을 가지는 경우 사출 성형 이후 금형에서 제거하기 쉬우며 제거시의 파손을 최소화 할 수 있다는 장점을 가진다. 하지만 양각구배 제품의 특성상 본원 발명과 같이 제2 수용부의 내부에 섬 구조물이 존재하며, 제2 수용부의 직경보다 넓은 제1 수용부를 하단에 가지는 경우 언더컷 형상의 금형이 필요하여 한번에 사출이 불가능하다. 하지만 상기 세포배양검사 장치는 제작용 상부금형과 하부금형의 사이에 상기 섬 구조물(142) 및 섬 연결 구조물(143)를 위치시키고 이를 경계로 위는 양각구배의 상부금형, 아래는 음각구배의 하부금형으로 설계하는 경우 본원 발명과 같이 복잡한 형성을 가지는 멀티 웰 플레이트의 성형이 가능하다(도 7참조). 따라서 세포배양검사 장치는 고분자 수지를 사출하는 방식으로 제조될 수 있다. 또한 상기 세포배양검사 장치 광학적 관찰을 위하여 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리카보네이트와 같은 광학적으로 투명한 고분자 수지로 제작될 수 있다.
[본딩 수단, 본딩 물질의 특징]
다만 이렇게 제작된 세포배양검사 장치는 제1 수용부(150) 및 제2 수용부(120)의 하단부가 외부에 노출되어 제1 유체 및 제2 유체를 수용할 수 없는 형상이므로 상기 세포배양검사 장치의 후면부에 제1 유체 및 제2 유체의 누출을 방지하기 위한 본딩 수단(160)을 본딩 물질로 부착하여 상기 제1 수용부(150) 및 제2 수용부(120)가 제1 유체 및 제2 유체를 수용할 수 있도록 제작할 수 있다. 이때 상기 본딩 수단(160)은 상기 세포배양검사 장치의 후면 부위와 동일한 크기의 얇은 필름 형상으로 제작되어 각 웰 유닛의 후면을 한 번에 본딩하도록 제작될 수 있으며 각각의 웰 유닛의 크기에 맞게 제작되어 각각의 웰 유닛을 따로따로 본딩하도록 제작되어 사용하는 것도 가능하다. 아울러 본원 발명의 경우 제1 수용부의 바닥면을 통해 상기 제1 유체 내의 대상을 관찰할 수 있도록 상기 본딩 수단은 적어도 일부가 광학적으로 투명한 재질로 이루어질 수 있다. 상기 본딩 수단은 폴리에틸렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리스티렌 등과 같은 광학적으로 투명한 필름일 수 있다. 상기 본딩 물질은 상기 본딩 수단의 광학적 투명성을 유지하고 제1 유체 및 제2 유체와의 접촉으로 인한 영향을 피하기 위해, 상기 세포배양검사 장치 또는 상기 본딩 수단 위에 제 1 수용부 및 제2 수용부의 바닥면이 위치하는 면을 제외한 면만 프린팅 하는 것이 바람직하다(도 8 참조). 또한 상기 본딩 물질은 프린팅 후 및 본딩 수단과 웰 유닛간의 접착 전후에 변형이 없어야한다. 본딩 물질은 생물학적 물질에 영향을 피하기 위하여 비반응성 접착제가 권장된다. 주로 점착 테이프로 사용되는 압력-민감성 접착제(Pressure sensitive adhesive, PSA)가 바람직하며, 이에 사용되는 재료인 천연고무, 합성고무, 실리콘고무, 아크릴레이트 기반에 에스테르 계열의 점착물질이 보강된 점착제들이 가능하다. 또한, 광학적 관찰 시 광량 감소를 피하기 위해 투광도가 높은 물질이 바람직하다.
본 발명에 따른 섬 구조물을 포함하는 신속한 세포배양검사 장치는 체결 구조를 통해 개폐 가능한 방식으로 제공하거나 혹은 실리콘, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리스티렌(PS), 폴리카보네이트(PC), 테프론 또는 폴리비닐클로라이드(PVC)를 포함하는 재질의 커버 필름으로 처리하여 제공할 수 있다. 상기 커버 필름의 하부 제1 주입부에 대응하는 위치에 십자 혹은 X자 형태의 타발이 형성되어, 미소량의 제1 유체 투입을 용이하게 하는 제1 유체 투입구로서 작용할 수 있다. 상기 필름의 하부 제2 주입부 및 제3주입부에 대응하는 위치에도 십자 혹은 X자 형태의 타발이 형성되어 유체의 투입을 용이하게 하는 유체 투입구로서 작용할 수 있다. 사용상 편의를 고려하여, 각 유체 투입구의 형태는 각기 달리 하는 것이 바람직하다.
상기 제2 수용부의 바닥면은 관찰 대상의 위치 정보를 제공하는 포커싱 표지를 포함할 수 있다. 포커싱 표지는 세포배양검사 장치의 관찰 영역을 자동적으로 추적(tracking)할 수 있도록 제1 서브웰 바닥면에 표지될 수 있다. 바닥면에 구비된 포커싱 표지는 사출 몰딩(injection molding)의 방법을 통해서 마이크로채널(microchannel)의 형태로 바닥면에 제작된다. 고체 박막 내 생물학적 물질은 고정되어 있으므로 포커싱 표지를 이용하여 촬영하면, 촬영 시간마다 같은 영역을 촬영할 수 있다. 포커싱 표지는 관찰 영역의 자동 추적에 있어서 x축, y축, z축 3가지 축 방향으로의 위치를 보정하는 역할을 한다.
이하 본 발명을 실험방법을 통하여 상세히 설명한다. 도 3은 제1 유체 및 제2 유체를 웰 유닛에 도입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 나타낸 것이고 도4는 제1 유체가 제1 수용부에 공급된 형상을 나타낸 것이다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 또한 복수의 웰 유닛들이 정렬되어 형성된 어레이 구조를 가지는 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치를 이용한 세포의 분석 방법으로서, 상기 웰 유닛은 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액인 제1 유체를 주입하기 위한 제1 주입부, 물, 세포배양용 배지, Dimethylformamide(DMF) 또는 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 포함하는 용매인 제2 유체를 주입하기 위한 제2 주입부, 항생제를 섬 구조물에 주입하기 위한 제3 주입부, 상기 제1유체를 수용하기 위한 제1 수용부, 상기 제2유체를 수용하기 위한 제2 수용부, 상기 제2 수용부 내부의 섬 구조물을 포함하며, (a) 상기 항생제를 섬 구조물의 제3 주입부에 주입하여 섬 구조물의 내면과 외면에 고정시키는 단계; (b) 상기 제1 유체를 상기 제1 주입부에 주입하여, 주입된 제1 유체가 제1 수용부로 유동한 후 상기 혼합용액을 고화하여 고체 박막을 형성하는 단계; (c) 상기 제2 유체를 제2 주입부에 주입하여 제2 수용부에 수용되면서 제2 수용부 내에 위치한 섬 구조물에 접촉시키는 것으로 항생제를 분산 또는 용해하며, 제2 유체를 상기 제1 수용부와 제2 수용부가 연결된 면에서 제1 유체의 고체 박막과 접촉시키는 것으로 상기 항생제를 상기 고체 박막으로 확산시키는 단계; 및 (d) 상기 제1 유체의 고체 박막과 상기 제2 유체가 서로 만나 형성된 계면과, 제1 유체의 고체 박막 내부에서 일어나는 생물학적 물질의 변화를 단일세포 단위로 관찰하는 단계를 포함하는 세포의 분석 방법을 제공한다.
고형화제(gelling agent)를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질(biological agent)의 혼합용액인 제1 유체는 제1 수용부의 용량보다 많은 용량으로 준비되어 제1 주입부로 도입된다. 제1 주입부(132)로 도입된 제1 유체는 중력과 표면장력(모세관 현상)의 도움으로 적절한 동적접촉각을 갖추며 제1 수용부로 유동한다. 일반적으로 벽면이 폐쇄된 유동공간에서 유동은 내부에 갇힌 공기가 유발하는 압력으로 저지되지만, 제1 수용부는 제2 수용부로 연결된 개방형 미세유체 채널 구조이기 때문에 공기가 갇히지 않고, 압력차 없이 제1 수용부 내부를 자유유동 한다. 한편 제1 유체의 반지름 방향 유동은 제2 수용부와 연결된 지점인 모세관 밸브에 도달하는데, 모세관 밸브에서 벽면의 각도가 급격히 변경되어 제1 유체의 계면은 이 변경된 벽면에 적절한 동적접촉각을 형성하지 않는 한 전진이 억제된다. 이후 제1 유체는 고화됨으로써 제2 수용부로 진입하지 않고 제1 수용부 내에만 고정되며, 생물학적 물질, 예를 들어 박테리아가 겔 매트릭스 내에 고정될 수 있도록 할 수 있으며, 후술할 제2 유체와 접촉할 수 있는 고체 박막을 형성할 수 있다.
이후 제2 유체를 상기 제2 주입부(134)를 통하여 수용부(120)에 주입하여 항생제를 공급하게 된다.
이를 더욱 상세히 살펴보면 상기 제2 주입부(134)를 통하여 수용부(120)에 제2 유체를 공급하되 상기 섬 구조물 외벽과 섬 연결 구조물(143), 제2 수용부의 내벽으로 둘러싸인 빈 공간을 통하여 제2 수용부(120)의 바닥으로 직접 주입하게 된다.제2 유체는 섬 구조물이 충분히 잠기게 하는 양으로 주입하여, 항생제가 상기 제2 유체를 통하여 용해 및 확산될 수 있다. 이때 상기 제3 주입부(130)를 통하여 용해된 항생제를 직접 주입하는 경우 상기 제2 유체와 혼합되면서 항생제 및 용매가 확산될 수 있으며, 섬 구조물에 건조된 항생제가 부착되어 있는 경우 주입되는 제2 유체에 항생제가 용해됨과 동시에 확산하게 된다. 상기 항생제는 상기 제1 수용부의 중심부에 위치하는 섬 구조물에 부착되어 있기 때문에 제1 수용부로 균일하게 확산되어 항생제 농도구배를 최소화 할 수 있다(도 5 참조).
상기와 같이 수용부에 공급된 제2 유체는 하단 측면에 위치하는 모세관 밸브(152)에 도달하여 제1 유체와 접촉한다. 제1 유체와 제2 유체는 동일 또는 유사한 용매이므로 항생제가 겔 매트릭스 내로 확산되고 겔 매트릭스 내에 고정된 박테리아의 성장 변화를 관찰함으로써 항생제에 대한 감수성을 현미경으로 관찰할 수 있다.
다음으로, 상기 항생제에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰한다. 상기 생물학적 물질이 상기 고체 박막에 고정됨으로써 2차원적으로 분포하게 되어 결과적으로 단일 세포 단위로 관찰이 가능하다. 일반적으로 개별세포의 성장변화는 수십 분(보통 30분) 이내에 관찰이 가능하기 때문에 생물학적 물질에 대한 항생제의 영향을 기존 방식에 비해 정확하고 빠르게 확인할 수 있다. 예를 들어 박테리아 세포에 대해서 생리활성 검사를 수행할 경우 3~4시간 이내에 검사를 끝낼 수 있다. 본 명세서에서 이러한 빠른 생리활성 검사 방법을 단일 세포 모폴로지 분석(single-cell morphological analysis, SCMA)라고 칭하기로 한다. 상술한 어레이 구조를 가지는 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치를 이용하면 다양한 항생제 조건 하에서 단일 세포 모폴로지의 변화를 시간 경과 이미징(time-lapse imaging)으로 관찰할 수 있다.
관찰을 위해 광학 측정장치가 사용될 수 있다. 상기 광학 측정장치는 CCD 또는 CMOS 카메라와 같은 이미지화 시스템을 포함할 수 있다. 상기 광학 측정장치는 또한 초점을 맞추고 빛을 이미지화하는 데 필요한 렌즈, 조명 및 빛 가이드 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 광학 측정장치는 카메라에 의해 관찰된 이미지 데이터를 가공 및 분석하기 위한 이미지 처리 시스템을 포함할 수 있다. 상기 광학 측정장치는 검사 과정에 나타난 생물학적 물질의 성장변화를 빠른 속도로 기록하고 분석하여 검사 결과를 얻는다. 상기 제1 유체의 고체 박막과 상기 제2 유체가 접하는 계면 주위가 이미징 영역이 되는데 상기 이미징 영역은 약 300㎛*300㎛ 내지 4000㎛*4000㎛의 크기를 가질 수 있다. 적어도 상기 제1 서브웰의 횡단면은 상기 이미징 영역보다 큰 너비를 가지는 것이 바람직하다.
결국, 생물학적 물질의 고정과 항생제의 확산방식을 이용하는 상술한 검사 방법을 이용하면 약물 검사에 필요한 약물 및 세포의 양이 종래 기술에 비해 대폭 저감될 수 있고, 단일 세포의 성장변화를 빠른 속도로 추적할 수 있어 빠르면 2 시간 이내에 보통 3~4 시간에 빠른 약물 검사 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다. 이는 현재까지 알려진 최고의 검사속도이다
일 구현예에 있어서, (d) 상기 항생제에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
바이오필름은 미생물이 감염되거나 부착된 부분에서 나타나며, 폴리머 기질로 감싸인 미생물에 의해 형성된 점액질의 미생물 복합체를 이루는 막이다. 바이오필름의 형성은 사람의 건강에도 중대한 영향을 끼칠 수 있다. 바이오필름에 의한 감염증으로 폐 감염증, 중이염, 치주염 등이 있다 그런데 바이오필름 내의 세균은 부유 상태보다 항생물질에 대한 내성이 1000배 이상이 되어 문제가 된다. 종래 바이오필름을 연구하기 위한 방법으로 플로우 셀 시스템(flow cell system)이나 웰 기반의 시스템(well based system) 등을 이용한 방법들이 있었으나 이들 어세이 시스템들은 바이오필름 형성을 위해 수일 간의 장시간이 요구되며, 관찰을 위해서는 염색을 해야하고, 컨포칼 현미경(confocal microscope)을 이용해야 하는 등의 어려운 면들이 있었다. 또한 최소 억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)나 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정할 경우 추가적인 실험이 필요하다. 또한 이러한 시스템들은 크기가 매우 클 뿐 아니라, 바이오필름 형성 단계들(biofilm formation stages)을 분명하게 보여주지 못하고 박테리아 감염에 있어 체내(in vivo) 바이오필름 형성을 대표하지 못한다
바이오필름의 형성과정과 항생제에 대한 반응성을 연구하기 위한 효율적인 시스템이 요구되며 본 발명의 일 구현예에 따른 어레이 구조를 가지는 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치는 훌륭한 대안이 될 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
실시예 1
열가소성 플라스틱 수지(폴리스티렌)를 도 1 및 도 2에 도시된 구조로 사출 성형하여 8 x 2개의 정렬된 웰 유닛의 어레이를 갖는 세포배양검사 장치를 준비하였다.
준비된 웰 유닛에 항생제로서 콜리스틴(Colistin)을 제3 주입구를 통하여 섬 구조물에 주입하였다. 이때 상기 항생제는 10㎕를 주입하였으며, 건조하여 도 5의 (b)에 나타난 형상으로 고정하였다.
이후 제1 유체로서 아가로오즈와 균액(P. aeruginosa ATCC 27853)의 혼합물 10㎕를 제1 주입부를 통하여 제1 수용부에 분주하였다. 제1 수용부에 제1유체가 주입 완료된 이후 제2 주입구를 통하여 제2 수용부에 제2 유체(배양액) 100㎕를 주입하였다.
이때 상기 제1 수용부의 두께는 두께 300㎛ 폭 1mm로 제작하였으며, 제2 수용부와 접촉하는 부분에는 두께 300㎛로 제1 수용부의 두께와 동일한 두께의 모세관 밸브 구조가 설계되었다. 섬 구조물은 상기 제2수용부의 바닥면으로부터 300㎛가 이격되며, 섬 구조물의 중심과 제2 수용부의 중심을 일치하도록 제작되었다. 본딩 수단은 100㎛두께의 PMMA 필름을 사용하였다.
실시예 2
상기 실시예 1에서 제1 수용부의 두께를 500㎛, 섬 구조물의 이격높이를 500㎛로 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 3
상기 실시예 1에서 본딩 수단을 PET 필름으로 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 4
상기 실시예 1에서 제1 수용부의 두께를 500㎛, 섬 구조물의 이격 높이를 500㎛로 제작하고, 본딩수단을 PET 필름으로 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 5
상기 실시예 1에서 두께 100㎛, 너비 100㎛의 모세관 밸브 구조를 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 6
상기 실시예 1에서 제1 수용부의 두께를 500㎛, 섬 구조물의 이격 높이를 500㎛로 제작하고, 두께 100㎛, 너비 100㎛의 모세관 밸브 구조를 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 7
상기 실시예 1에서 섬 구조물의 바닥이 닫혀있는 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 8
상기 실시예 1에서 제1 수용부의 두께를 500㎛, 섬 구조물의 이격 높이를 500㎛로 제작하고, 섬 구조물의 바닥이 닫혀있는 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
비교예 1
상기 실시예 1에서 제 1 수용부의 너비를 0.5mm로 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
비교예 2
상기 실시예 1에서 제1 수용부의 두께를 500㎛, 섬 구조물의 이격 높이를 500㎛로 제작하고, 제 1 수용부의 너비를 0.5mm로 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
비교예 3
상기 실시예 1에서 제 1 수용부의 너비를 0.1mm로 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
비교예 4
상기 실시예 1에서 제1 수용부의 두께를 500㎛, 섬 구조물의 이격 높이를 500㎛로 제작하고, 제 1 수용부의 너비를 0.1mm로 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
실험예
상기 실시예 1~8 및 비교예 1~4의 세포배양검사 장치를 각각 10개씩 제작한 다음, 제1 유체에 의하여 형성된 고체박막의 불량여부 및 각 지점에 따른 항생제의 감수성 평가를 실시하였다. 제1 수용부의 4개 지점을 선정하여 항생제 감수성 평가를 실시하였으며, 상기 4개의 지점은 제1 주입구 위치를 기준으로 90의 각을 이루는 지점을 선정하였다(각각 a, b, c, d). 제2 유체가 주입된 다음, 6시간 이후 각 지점의 P. aeruginosa ATCC 27853를 관찰하여 콜리스틴 CLSI 기준 QC range 안에 MIC가 포함되는지 여부로 평가하였다. 고체 박막불량여부는 제1 수용부 내의 고체박막을 육안으로 관찰하여 불량여부를 판정하였다.
도 9의 경우 실시예 1에 항생제(콜리스틴)를 사용하지 않고 4시간이 경과한 다음의 고체박막의 확대 사진이며, 도 10은 콜리스틴 농도 0(a), 0.12(b), 0.25(c), 0.5(d), 1(e), 2(f) mg/ml 에서 6h 관찰 결과이다. 각 농도에 따른 반응이 명확하게 나타나고 있으며, 특히 1mg/ml이상에서는 항생제의 효과를 확연하게 확인할 수 있다.
고체박막 불량 QC range 통과
a b c d
실시예 1 1 7 8 8 8
실시예 2 1 6 8 9 9
실시예 3 0 9 10 10 10
실시예 4 1 8 9 10 10
실시예 5 0 6 8 8 7
실시예 6 2 6 6 5 6
실시예 7 1 7 7 7 9
실시예 8 2 5 8 7 7
비교예 1 4 4 5 5 5
비교예 2 5 2 4 4 4
비교예 3 8 0 2 2 1
비교예 4 10 0 0 0 0
표 1에 나타난 바와 같이 본원 발명의 실시예 1~8의 경우 고체박막의 불량이 거의 발생하지 않았으며, 불량이 아닌 웰에서 항생제 감수성 검사의 신뢰도도 높게 나타났다.이에 반하여 제1 수용부의 폭이 감소한 비교예들의 경우 좁아진 수용부 내부로 제1 유체의 유동이 원활하지 못하여 다 채우지 못하거나, 제2 수용부로의 칩입이 발생하여 불량이 많이 발생하였다.
제1 수용부의 두께가 비교적 높은 실시예 2,4,6,8 은 실시예 1,3,5,7 보다 불량률이 약간 높게 발생하였다. 많은 경우가 제2 수용부로의 칩입이 발생하였다.
더 친수성을 가지는 PET 필름을 이용한 실시예 3,4 는 제1 수용부 내에 흐름이 수월해져 불량률이 낮게 나타났다.
좁은 모세관밸브가 설치된 실시예 5, 6은 제1 수용부 내에 흐름은 수월해져서 불량률은 낮으나, 항생제가 확산되어 고체박막으로 진입하기 어려워져 QC range에 통과하는 경우가 적어졌다.
또한 도 11에 나타난 바와 같이, 실시예 1(좌측부터 1,2,5,6번째 웰) 와 실시예 2(좌측부터 3,4,7,8번째 웰) 의 분주 결과 섬 구조물의 이격 높이에 따라 유체의 거동이 달라지는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치로서,
    상기 웰 유닛은 제1 유체를 주입하기 위한 제1 주입부;
    상기 제1 주입부에서 주입된 제1 유체가 유동하여 수용되도록 제1 주입부와 연통된 제1 수용부;
    제2 유체를 주입하기 위한 제2 주입부; 및
    제2 유체를 수용하기 위한 제2 수용부를 포함하되;
    상기 제2 수용부의 내부에는 제2 수용부의 벽면에서 확장된 섬 연결 구조물에 의하여 연결되어 있는 섬 구조물을 포함하고,
    상기 섬 구조물의 상측에는 항생제가 투입되는 제3 주입부가 형성되며,
    상기 섬 구조물 내면 및 외면에는 상기 제3 주입부에서 주입된 항생제가 수용되어 고정되는 세포배양검사 장치.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 섬 구조물의 중심은 상기 제1 수용부의 중심과 일치하며, 상기 제1 수용부와 일정한 거리를 가지도록 배치된 세포배양검사 장치.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 섬 구조물의 하단은 제2 수용부의 바닥면으로부터 0.1~1mm 이격되어 설치되며, 섬 구조물의 바닥면이 개방되어 있는 세포배양검사 장치.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 제2 유체는 주입시 섬 구조물의 내면 및 외면과 접촉하며, 섬 구조물 내면 및 외면에 고정된 항생제를 용해하여 제1유체로 확산시키는 세포배양검사 장치.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 제1 수용부는 상기 제1 주입부를 통하여 주입된 제1 유체가 모세관 현상을 통하여 채워질 수 있도록 두께와 너비가 정해진 세포배양검사 장치.
  6. 제5 항에 있어서,
    상기 제1 수용부는 폭이 0.3~2mm이며, 두께가 100~500㎛인 세포배양검사 장치.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 제1 유체와 상기 제2 유체가 서로 만나 제1 유체로 물질이동이 가능하도록 상기 제2 수용부의 측면과 상기 제1 수용부의 내면이 연통된 세포배양검사 장치.
  8. 제7 항에 있어서,
    상기 제1 수용부는 개방형 미세유체(Open microfluidics) 구조로 제1 수용부의 일부 면이 개방되어있으며, 개방된 면은 상기 제2 수용부의 측면과 모세관 밸브 구조로 연결된 세포배양검사 장치.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 모세관 밸브 구조는 상기 제1 유체의 주입시 제1 수용부로의 유동 중 또는 유동 후 상기 제2 수용부로 유입되지 않도록 두께와 너비가 정해진 세포배양검사 장치.
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 모세관 밸브의 두께는 100 내지 500㎛이고, 너비는 100㎛ 내지 2mm인 세포배양검사 장치.
  11. 제1 항에 있어서,
    상기 세포배양검사 장치는 후면부에 제1 유체와 제2 유체의 누출을 방지하기 위한 후면 본딩 수단을 포함하는 세포배양검사 장치.
  12. 제11 항에 있어서,
    상기 후면 본딩 수단은 광학적으로 투명한 필름인 세포배양검사 장치.
  13. 복수의 웰 유닛들이 정렬되어 형성된 어레이 구조를 가지는 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치를 이용한 세포의 분석 방법으로서,
    상기 웰 유닛은 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액인 제1 유체를 주입하기 위한 제1 주입부, 물, 세포배양용 배지, Dimethylformamide(DMF) 또는 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 포함하는 용매인 제2 유체를 주입하기 위한 제2 주입부, 항생제를 섬 구조물에 주입하기 위한 제3 주입부, 상기 제1유체를 수용하기 위한 제1 수용부, 상기 제2유체를 수용하기 위한 제2 수용부, 상기 제2 수용부 내부의 섬 구조물을 포함하며,
    (a) 상기 항생제를 섬 구조물의 제3 주입부에 주입하여 섬 구조물의 내면과 외면에 고정시키는 단계;
    (b) 상기 제1 유체를 상기 제1 주입부에 주입하여, 주입된 제1 유체가 제1 수용부로 유동한 후 상기 혼합용액을 고화하여 고체 박막을 형성하는 단계;
    (c) 상기 제2 유체를 제2 주입부에 주입하여 제2 수용부에 수용되면서 제2 수용부 내에 위치한 섬 구조물에 접촉시키는 것으로 항생제를 분산 또는 용해하며, 제2 유체를 상기 제1 수용부와 제2 수용부가 연결된 면에서 제1 유체의 고체 박막과 접촉시키는 것으로 상기 항생제를 상기 고체 박막으로 확산시키는 단계; 및
    (d) 상기 제1 유체의 고체 박막과 상기 제2 유체가 서로 만나 형성된 계면과, 제1 유체의 고체 박막 내부에서 일어나는 생물학적 물질의 변화를 단일세포 단위로 관찰하는 단계;를 포함하는 세포의 분석 방법.
  14. 제13 항에 있어서,
    (d) 상기 항생제에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정하는 단계를 더 포함하는 세포의 분석 방법.
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