WO2017183875A1 - 신속한 항생제 감수성 검사를 위한 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치 - Google Patents

신속한 항생제 감수성 검사를 위한 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치 Download PDF

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WO2017183875A1
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정현용
임태근
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Definitions

  • Techniques disclosed herein generally relate to multi-well based cell culture assay devices.
  • the cell in order to observe the cell's response to the drug, the cell is placed in a multi-well plate, and then a liquid drug is injected to observe the change in the cell over time using optical measuring equipment.
  • the method of obtaining the final result is used.
  • antibiotic susceptibility testing in solid medium there is a KB-test method in which the agar medium is sprayed with bacteria, the antibiotic-absorbed paper is loaded and the growth of the bacteria is observed.
  • microdilution test in liquid medium a number of automated equipments such as VITEK2, Microscan, and Phoenix were developed for antibiotic susceptibility test.These drugs were put into a millimeter-sized well, and then bacteria were injected with the liquid medium. The growth of bacteria can be determined by statistically observing through turbidity.
  • the cells When performing a cell reaction test for different drugs, the cells are placed in a liquid or solid medium, and the drug to be tested is mixed with the liquid medium or a paper disk containing the drug absorbed on the solid medium is reacted with the cells.
  • the response to the drug is measured by measuring the growth response of the cell to the drug by turbidity (absorbance).
  • This method is a method of collecting statistical information rather than individual cell changes and takes longer to cultivate (usually 16-24 hours) because more than a certain number of cells (usually 1 million cells per ml) must be grown to obtain statistical results. . In this case, it is not possible to observe changes occurring in individual cells of the drug and real-time observation of individual cells with motility.
  • a method of injecting drugs requires a process of injecting individual drugs individually, which requires a lot of time and effort to test a large number of drugs.
  • KB-test has a limited number of drugs, so a large number of agar medium plates are required for susceptibility testing of several dozen basic antibiotics.
  • VITEK system which is an automated equipment that minimizes such inspection time, the turbidity of bacteria must be increased by a certain level, so there is a limit that requires a relatively long time (about 12 hours).
  • the existing method may be different from the phenomena actually occurring in the human body because the test environment is different from that in the human body (Gregory G. Anderson , et al.
  • a multi-well-based cell culture testing apparatus having an array structure of a plurality of aligned well units, the well unit comprising: a first subwell for receiving a first fluid; A second subwell for receiving a second fluid; And a barrier positioned between the first subwell and the second subwell to partition the first subwell and the second subwell, wherein a bottom surface of the first subwell solidifies the first fluid. And a recess recessed in a depth direction with respect to the bottom surface to accommodate the solid thin film, and wherein the barrier is provided with the first fluid when the first fluid is injected into the first subwell to fill the recess.
  • a multi-well based cell culture assay device having a height such that it does not fall into two subwells.
  • the bottom surface of the concave portion may include at least one micropatterned groove portion.
  • the micropatterned groove portion may have a channel structure of concentric circles with respect to the center of the recess.
  • At least a portion of the bottom surface of the concave portion may be made of an optically transparent material to observe the object in the first fluid through the bottom surface of the concave portion.
  • the bottom surface of the first subwell may include a focusing mark that provides position information of an object to be observed.
  • the width of the recess may be 0.2 or more and 0.99 or less compared to the width of the first subwell.
  • the size of the well unit may correspond to the size of each well of a commercial multi-well plate.
  • each of the wells may have a well arrangement of 1 ⁇ 1, 1 ⁇ 2, 1 ⁇ 4, 2 ⁇ 4, 4 ⁇ 6, 12 ⁇ 8, 24 ⁇ 16, or 48 ⁇ 32.
  • the first fluid may be a mixed solution of a biological medium and a liquid medium containing a solidifying agent.
  • the second fluid may be a solution containing a bioactive material.
  • the second subwell may include a bioactive material in solid form.
  • the second fluid may be a solvent for dissolving the bioactive material.
  • a method for analyzing cells using the above-described cell culture test device (a) a concave formed in the bottom surface of the first subwell a mixed solution of a liquid medium and a biological material containing a solidifying agent Providing to the wealth; (b) solidifying the mixed solution to form a solid thin film to which the biological material is fixed; (c) providing a solution containing a bioactive material to the second subwell or a solvent for dissolving the bioactive material in the second subwell containing a bioactive material in solid form.
  • the change of the biological material may be measured by an hour using an imaging device.
  • the response of the biological material can be observed in a single cell population.
  • the mixed solution may be diluted with a liquid medium containing the solidifying agent by taking the biological material positive for bacterial infection.
  • the liquid medium may comprise a medium for promoting the division of specific cells.
  • MIC Minimal Inhibitory Concentration
  • MBEC Minimal Biofilm Eradication Concentration
  • FIG. 1 shows a multi-well-based cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows a cross section of the well unit of the multi-well-based cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows a cross-section of the well unit of the multi-well-based cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the process of the antibiotic test using the cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 5 illustrates a process of loading a sample into a first subwell according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 illustrates a focus mark provided on a bottom surface of a first subwell according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a result of observing the appearance of the standard strain E. coli ATCC 25922 grows in the absence of antibiotics at certain time intervals using the cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 is a result of observing the process of antibiotic susceptibility test by the injection of the antibiotic Ampicillin to the standard strain S. aureus ATCC 29213 using a cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention at regular intervals .
  • FIG. 10 shows the results of observing the antibiotic susceptibility test at regular intervals by injecting antibiotic azatam (Aztreonam) into the standard strain P. aeruginosa ATCC 27853 using the cell culture test apparatus according to the embodiment of the present invention. to be.
  • antibiotic azatam Aztreonam
  • FIG. 11 shows the results of observing antibiotic susceptibility testing at regular intervals by injecting antibiotic tetracycline into the standard strain E. faecalis ATCC 29212 using a cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention. to be.
  • Figure 12 shows the antibiotic susceptibility test results for Gram-negative strains ( Klebsiella pneumoniae , Enterobacter aerogenes , P.aeruginosa ) obtained from four blood samples using a cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 13 shows the antibiotic susceptibility test results for Gram-positive strains ( Staphylococcus epidermis, Enterococcus faecium, Staphylococcus haemolyticus ) obtained from four blood samples using a cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • first component may be named a second component
  • second component may also be named a first component
  • Figure 1 shows a multi-well-based cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 1 (a) is a perspective view of a multi-well-based cell culture test device, (b) is an enlarged part of the multi-well-based cell culture test device.
  • the multi-well based cell culture test apparatus 100 has an array structure of a plurality of aligned well units 110.
  • the well unit 110 partitions a first subwell 120 for receiving a first fluid, a second subwell 130 for receiving a second fluid, and the first subwell and the second subwell. And a barrier 140 positioned between the first subwell and the second subwell.
  • the well unit 110 may be arranged in plural and have a size similar to that of a commercial multi-well plate as a whole.
  • the center of well unit 110 may coincide with the center of a commercial multi-well.
  • multi-well plates are standard tools for processing and analyzing multiple samples.
  • Multi-well plates can take a variety of forms, sizes and shapes, generally made in standard sizes and shapes, and having a standard arrangement of wells. Standard arrangements of wells include those found in 96-well plates (well arrangement of 12x8), 384-well plates (well arrangement of 24x16), and 1536-well plates (well arrangement of 48x32), and in a variety of other ways There is a multi-well plate.
  • the cell culture test apparatus 100 may be easily compatible with various conventional biological analysis techniques by having specifications similar to those of commercial multi-well plates.
  • the first fluid and the second fluid may typically comprise 80% or 90% or more by weight of water as a dispersion medium or solvent.
  • the first fluid may be a mixed solution of a liquid medium containing a gelling agent and a biological agent.
  • the second fluid may be a solution containing a bioactive material and a solvent for dissolving the bioactive material.
  • Figure 2 shows a cross section of the well unit 210 of the multi-well-based cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 (a) is a top down view of the well unit 210 of the cell culture test apparatus
  • Figure 2 (b) shows a state of the A-A 'cross section of (a).
  • the first subwell 220 is for accommodating the first fluid and may have a well shape having a space having a sufficient size.
  • the volume of the well is not particularly limited but may be of sufficient size to observe the reaction for a long time after the first fluid is injected, for example, 100 ⁇ l to 2000 ⁇ l.
  • the bottom surface of the first subwell 220 may include a concave portion 221 penetrating in the depth direction with respect to the bottom surface to accommodate the solid thin film solidifying the first fluid.
  • the shape of the recess 221 may be circular or oval, and may be a polygon such as a quadrangle, a pentagon, a hexagon, or the like.
  • the width w1 of the concave portion 221 may be 0.5 or more and less than 1 in comparison to the width w2 of the first subwell 220.
  • the shape of the recess and the ratio of the width of the recess to the width of the first subwell are not particularly limited but may be of sufficient size to observe the reaction of the cells after the first fluid is injected.
  • the shape of the recess may be circular.
  • the width w1 of the concave portion 221 may be 0.2 or more and 0.99 or less, more preferably 0.4 or more and 0.8 or less, and still more than the width w2 of the first subwell 220. Preferably it may be 0.55 or more and 0.65 or less.
  • the ratio of the width of the concave portion to the width of the first subwell is less than the range, the volume of the concave portion may be difficult to accommodate the first fluid, so that the observation of cells may be difficult, and the concave portion may not be formed above the range. .
  • the bottom surface of the recess 221 may be made of an optically transparent material so that the object in the first fluid may be observed through the bottom surface of the recess 221.
  • the body of the cell culture testing device may be made of a transparent material.
  • the transparent material may be a polymer resin such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polymethacrylate, polycarbonate.
  • the cell culture test apparatus may be manufactured by injecting a polymer resin.
  • Figure 3 shows the well unit 310 of the multi-well-based cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 (a) shows a well unit according to an embodiment of the present invention
  • Figure 3 (b) shows the AA 'cross section of (a).
  • the bottom surface of the recess 321 may include at least one micropatterned groove 322.
  • the micropatterned groove 322 serves to secure the first fluid to the bottom surface of the recess 321 by capillary action.
  • the micropatterned groove 322 may have a circular or elliptical shape and may be a polygon such as a quadrangle, a pentagon, a hexagon, or the like.
  • the micro-patterned groove portion 322 may be formed in one or a plurality of grooves on the bottom surface of the recess 321.
  • the micropatterned groove 322 may be a plurality of fine wells spaced apart from each other, or may have a shape such as microchannels.
  • the micro-patterned groove portion 322 may be in the form of a donut-like microchannel as shown in FIG. 3 (b), and may have a standard as shown in FIG. 3 (c).
  • the width of the micropatterned groove 322 is for example 500 And a depth (or thickness) of 200 ⁇ m to 1.5 mm.
  • the capillary phenomenon allows the first fluid to be uniformly spread in the first subwell 320 and has a size that is well fixed to the micropatterned groove or recess.
  • the micropatterned groove may be shaped to facilitate cell observation. If the first fluid is a liquid medium containing a solidifying agent may be gelled after a certain time. As a result, a solid thin film may be formed to fill the recess 121 including the micropatterned groove 122.
  • the second subwell 130 is for accommodating the second fluid, and may have a well shape having a space of sufficient size.
  • the second subwell may comprise a bioactive material in solid form lyophilized. When it contains a bioactive material in a solid form, a second fluid may be injected into the second subwell to dissolve the bioactive material, and as a result, a solution containing the bioactive material may be prepared.
  • the barrier 140 may be positioned between the first subwell and the second subwell to partition the first subwell 120 and the second subwell 130.
  • the barrier 140 prevents the first fluid from flowing into the second subwell 130 when the first fluid is injected into the first subwell 120 to fill the recess 121. It can have a height of.
  • the barrier may prevent the first fluid from passing into the second subwell, thereby preventing contamination with the second subwell containing the bioactive material in solid form. Since the contact between the observable subject in the first fluid and the physiologically active substance is a process to be performed after gelling by the solidifying agent in the first fluid, the cell culture test may be performed sequentially by providing the barrier. At the same time, the barrier 140 may have a height sufficient to allow the second fluid to pass into the first subwell 120 when the second fluid is injected into the second subwell.
  • Figure 4 shows the process of the antibiotic test using the cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • a mixed solution of a liquid medium containing a gelling agent and a biological agent is prepared as shown in FIG. 4A.
  • the liquid medium may comprise at least about 95% water and may be solidified by the presence of a solidifying agent.
  • solidifying agents include agar, agarose, gelatin, alginate, collagen, fibrin, and the like.
  • agar or agarose may be used.
  • 0.5 to 4% by weight of agar may be used in the liquid medium.
  • Liquid media typically do not require nutrients, but in some instances may also contain nutrients and may be solutions containing media that promote the division of specific cells.
  • Such biological materials include viruses, bacteria, fungi, algae, protozoa, parasitic pathogens, human or mammalian cells and biofilms, and the like.
  • the biological material may be a mixed state of biological cells and infectious biological cells such as bacteria, viruses, fungi, and the like.
  • infectious biological cells such as bacteria, viruses, fungi, and the like.
  • it could be blood from a person infected with bacteria, which can be distinguished by a change in size from a blood cell using a medium that only promotes the division of bacterial cells to differentiate between blood cells and bacterial cells. have.
  • the biological material may grow in a liquid or solid medium and may be affected by growth depending on the type and concentration of the external bioactive material.
  • the density of the biological material in the solution may be 10 2 to 10 10 cells / ml, preferably 10 4 to 10 10 cells / ml, more preferably 10 5 to 10 9 cells / ml. Below the range it may be difficult to locate the biological material and above the range it may be difficult to determine the state of the individual biological material.
  • the mixed solution is provided to the recess 421 formed on the bottom surface of the first subwell.
  • the mixed solution may be injected by an amount corresponding to the volume of the recess of the first subwell.
  • the volume of the mixed solution injected into the recess of the first subwell may be preferably 10 ⁇ l to 200 ⁇ l. More preferably 10 ⁇ l to 150 ⁇ l.
  • the volume of the mixed solution injected into the first subwell is less than the range, the density of cells included in the mixed solution may be low, and cell observation may be difficult, and when the volume is greater than the range, the mixed solution may be injected into the second subwell. .
  • the at least one micropatterned groove 422 formed on the bottom surface of the concave portion has an effect of spreading the mixed solution evenly throughout the groove by capillary action when the mixed solution is injected.
  • the micropatterned groove allows the mixed solution to be well fixed to a desired area.
  • FIG. 5 illustrates a process of loading a sample into a first subwell 520 according to an embodiment of the present invention. As shown in FIG. 5, a sample having a micropatterned groove 522 may be fixed to a desired area. have.
  • the mixed solution may be in a state in which a biological material and a blood cell cell, which are infectious such as bacteria, are mixed.
  • the mixed solution may include a culture of blood taken from a person infected with bacteria, that is, a culture of blood positive for bacterial infection.
  • a liquid medium that promotes the division of bacterial cells only to distinguish between the blood cells and the bacterial cells that is, a medium
  • the bacterial cells may be distinguished by a change in size from the blood cells.
  • media that can only promote division of bacterial cells include Mueller-Hinton broth (MHB), Mueller-Hinton agar (MHA), Luria-Bertani broth (LBB), and Luria-Bertani agar (LBA).
  • the test time can be shortened by taking a blood sample positive for bacterial infection and diluting it with a medium containing a solidifying agent without going through the process of separating the bacteria from the blood sample.
  • the mixed solution is solidified to form a solid thin film to which the biological material is fixed.
  • the medium solidifies, thereby degrading the movement of the biological material.
  • the fixation makes it possible to easily observe the mobile biological material.
  • the cell culture testing device or the bottom surface of the recess may preferably be made of a transparent material for optical imaging.
  • the recess 321 of the first subwell of the cell culture test apparatus may be solidified by applying a liquid medium to form a solid thin film.
  • the liquid medium is introduced through the recess 321 and undergoes a solidification process.
  • the thickness of the solid thin film may be determined according to the depth of the recess 321.
  • the depth of the recess is 1 ⁇ m to 5 mm, or 1 ⁇ m to 3 mm, or 1 ⁇ m to 2 mm, or 1 ⁇ m to 1.5 mm, or 1 ⁇ m to 1 mm, or 1 ⁇ m to 800 ⁇ m, or 1 ⁇ m to 500 ⁇ m, 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, or 10 ⁇ m to 3 mm, or 100 ⁇ m to 500 ⁇ m, or 10 ⁇ m to 1 mm, or 100 ⁇ m to 1 mm, or 200 ⁇ m to 1 mm, or 500 ⁇ m to 1 mm, 100 ⁇ m to 500 ⁇ m It may be in the range of.
  • the depth of the recess is 100 ⁇ m to 500 ⁇ m. Since the depth of the recess has a thickness in the above-described range, the biological material immobilized therein can be easily observed in units of single cells or single cell colonies.
  • the width of the recess 321 may be 100 ⁇ m to 5 mm, or 300 ⁇ m to 5 mm, or 500 ⁇ m to 3 mm, or 1 mm to 3 mm in consideration of the size of the image area.
  • the width of the recess is 1mm to 3mm.
  • the concave portion having the width in the above-described range is formed in the first subwell to provide a space for fixing the cells in the desired area, and not larger than the specification of the imaging device, so that the entire region of the concave portion can be observed.
  • the shape or width of the recess is not particularly limited, but it is possible that a large amount of mixed solution (liquid medium containing a solidifying substance and a biological substance) can be introduced while maintaining the specification and width to react with the bioactive substance. Easy to control accurately In addition, it is preferable that the entire area of the recess can be observed without moving the cell culture test apparatus because it is not larger than the specification of the imaging apparatus.
  • the thickness and width of the solid thin film are determined according to the depth and width of the recess.
  • the term "thin film” is not particularly limited as long as the membrane has a thickness that can be observed in a single cell unit or a single cell population by fixing the biological material, but generally 1 ⁇ m to 5 mm, or 1 ⁇ m to 3 mm, or 1 ⁇ m to 2 mm, or 1 ⁇ m to 1.5 mm, or 1 ⁇ m to 1 mm, or 1 ⁇ m to 800 ⁇ m, or 1 ⁇ m to 500 ⁇ m, 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, or 10 ⁇ m to 3 mm, or 100 ⁇ m It refers to a thin layer having a range of any one of to 500 ⁇ m or 10 ⁇ m to 1 mm, or 100 ⁇ m to 1 mm, or 200 ⁇ m to 1 mm, or 500 ⁇ m to 1 mm.
  • the thickness of the solid thin film may correspond to a size in a direction perpendicular to the surface of the solid thin film to be observed. Since the solid thin film has a thickness in the above-described range, the biological material immobilized therein may be observed in single cell or single cell colony units.
  • the bottom surface of the first subwell may include a focusing mark 623 that provides position information of an object to be observed.
  • 6 illustrates a focus mark provided on a bottom surface of a first subwell according to an embodiment of the present invention.
  • the focusing marker 623 may be labeled on the bottom surface of the first subwell so as to automatically track the observation area of the cell culture test apparatus.
  • the focusing mark provided on the bottom surface is manufactured on the bottom surface in the form of microchannels through the injection molding method. Since the biological material in the solid thin film is fixed, if the image is captured by using the focusing mark 623, the same region may be photographed at each photographing time.
  • the focusing mark serves to correct the position in the three axis directions of the x-axis, y-axis, and z-axis in the automatic tracking of the aforementioned observation area.
  • the second subwell is provided with a solvent in which the bioactive material is dissolved in the second subwell 430 including the bioactive material in a solid form.
  • a solution containing the bioactive material may be provided to the second subwell 430.
  • the physiologically active substance may include any one of antibiotics, anticancer agents, drugs such as immunosuppressants, nutrients, cell secretions, signaling substances, viruses, cells, micro RNA, proteins, antigens, antibodies, DNA, and the like. have. In this case, as shown in (b) of FIG.
  • the bioactive material when the second subwell includes the bioactive material in a solid form, the bioactive material may be in a freeze-dried state.
  • Water, a cell culture medium, Dimethylformadide (DMF), Dimethyl sulfoxide (DMSO) may be used as a solvent to dissolve the lyophilized bioactive material.
  • the solvent for dissolving the bioactive substance may be introduced while pipetting to completely dissolve the bioactive substance in solid form and to have a uniform concentration of the solution after dissolution.
  • the solvent for dissolving the bioactive material exceeds the height of the barrier 440.
  • the bioactive material is diffused into the solid thin film in the first subwell 420 by injection. This is because when the bioactive material is not present in the second subwell 430, the solution containing the bioactive material may be provided to the second subwell so that the solution containing the bioactive material is raised in the height of the barrier.
  • the physiologically active material is diffused into the solid thin film in the first subwell 420 by being injected so as to be passed.
  • the volume of the solution containing the bioactive material or the solvent dissolving the bioactive material injected into the second subwell 430 exceeds the height of the barrier 440 and the solid thin film formed on the first subwell 420 and the bioactive material. It is good enough to form an interface with a solution containing a substance. Preferably 50 ⁇ l to 200 ⁇ l. More preferably 75 ⁇ l to 125 ⁇ l.
  • Minimal Inhibitory Concentration or Minimal Biofilm Eradication Concentration (MBEC) can be measured by observing changes in biological material for bioactive substances in single cell populations.
  • the cell culture assay device of the present invention can be very useful for biofilm assays as well as antibiotic sensitivity tests.
  • Biofilm is a membrane that appears in the area where microorganisms are infected or attached and forms a microbial complex of mucus formed by microorganisms wrapped with a polymer substrate. The formation of biofilms can have a significant impact on human health. Biofilms include pulmonary infections, otitis media, and periodontitis. However, bacteria in biofilms are more than 1000 times more resistant to antibiotics than suspended forms.
  • the cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention may be an excellent alternative.
  • the optical measuring device can be used for observation.
  • the optical measuring device may include a photographing device such as a CCD or CMOS camera.
  • the optical measuring device may also include lenses, illumination and light guides, etc. necessary to focus and image the light.
  • the optical measuring device may also include an image processing system for processing and analyzing image data observed by the camera.
  • the optical measuring device records and analyzes the growth change of the biological material in the inspection process at high speed to obtain the inspection result.
  • the imaging area may be a center of the first subwell in which the gelled first fluid and the second fluid form an interface, and the imaging area may have a size of about 400 ⁇ m * 800 ⁇ m to 800 ⁇ m * 1600 ⁇ m. .
  • the amount of drugs and cells required for drug testing can be significantly reduced compared to the prior art, and the growth of single cell or single cell population Changes can be tracked at high speeds, so fast drug results can be obtained within two hours, usually within six hours. This is the highest inspection speed known to date.
  • Figure 7 is a result of observing the appearance of the standard strain E. coli ATCC 25922 grows in the absence of antibiotics at certain time intervals using the cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention. As time goes by, the size of the bacterial colony increases, and in the case of E. coli ATCC 25922, the bacterial community can be visually identified after 4 hours.
  • Figure 9 is a result of observing the process of antibiotic susceptibility test by the injection of the antibiotic Ampicillin to the standard strain S. aureus ATCC 29213 using a cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention at regular intervals .
  • S. aureus ATCC 29213 was found to be observed colony from 2 hours after the ampicillin 0.25 ⁇ g / ml conditions, after 6 hours it was confirmed that the size of the colonies became larger and clearer.
  • Ampicillin 0.5 ⁇ g / ml condition was late in the colony observation than 0.25 ⁇ g / ml condition, but after 6 hours was able to see a clear colony.
  • the MIC of S. aureus ATCC 29213 was found to be 1.0 ⁇ g / ml.
  • FIG. 10 shows the results of observing the antibiotic susceptibility test at regular intervals by injecting antibiotic azatam (Aztreonam) into the standard strain P. aeruginosa ATCC 27853 using the cell culture test apparatus according to the embodiment of the present invention. to be.
  • antibiotic azatam Aztreonam
  • FIG. 10 shows the results of observing the antibiotic susceptibility test at regular intervals by injecting antibiotic azatam (Aztreonam) into the standard strain P. aeruginosa ATCC 27853 using the cell culture test apparatus according to the embodiment of the present invention. to be.
  • antibiotic azatam Aztreonam
  • FIG. 11 shows the results of observing antibiotic susceptibility testing at regular intervals by injecting antibiotic tetracycline into the standard strain E. faecalis ATCC 29212 using a cell culture test apparatus according to an embodiment of the present invention. to be.
  • E. faecalis ATCC 29212 was small in size but clear in colonies after 6 hours at 4.0 ⁇ g / ml tetracycline.
  • the MIC of E. faecalis ATCC 29212 was found to be 8.0 ⁇ g / ml.
  • FIG. 12 shows antibiotic susceptibility test results for Gram-negative clinical strains ( Klebsiella pneumoniae , Enterobacter aerogenes , P.aeruginosa ) obtained from four blood samples using a cell culture test apparatus (denoted as DRAST) according to an embodiment of the present invention. As shown, the drugs in use at the test laboratory were tested. Antibiotic susceptibility test was compared with the results of the antibiotic susceptibility test (Broth Microdilution, BMD) used in the cell culture test apparatus of the present invention. Klebsiella pneumoniae , Enterobacter aerogenes and P.aeruginosa were detected in four blood samples. The susceptibility of E.
  • aerogenes to colistin showed susceptibility (S) in the BMD test, and intermediate resistance (Intermediate, I) in the test using the cell culture assay (DRAST) of the present invention.
  • S susceptibility
  • I intermediate resistance
  • P. aeruginosa is ticarcillin, ticarcillin / clavulanic acid, cefotaxime, aztreonam, trimethoprim / sulfamethoxazole
  • the BMD test showed moderate resistance
  • the test using the cell culture test apparatus of the present invention showed sensitivity.
  • the BMD test result showed susceptibility and the cell culture tester test result of the present invention showed moderate tolerance.
  • test results of the BMD for the above-mentioned antibiotics and the cell culture test apparatus of the present invention are all divided into minor errors due to differences in sensitivity (S) and intermediate resistance (I).
  • K. pneumoniae was consistent with BMD results and test results using the cell culture assay of the present invention for all antibiotics. (The unit of concentration listed in FIG. 12 is ⁇ g / mL.)
  • Figure 13 shows the antibiotic susceptibility test results for Gram-positive clinical strain ( Staphylococcus epidermis , Enterococcus faecium , Staphylococcus haemolyticus ) obtained from four blood samples using a cell culture test device (denoted as DRAST) according to an embodiment of the present invention As indicated, the drugs in use at the test laboratory were tested. Antibiotic susceptibility test was compared with the results of the antibiotic susceptibility test (Broth Microdilution, BMD) used in the cell culture test apparatus of the present invention. Staphylococcus epidermis , Enterococcus faecium and Staphylococcus haemolyticus were detected in four blood samples. S.
  • epidermis is the result of BMD test and cell culture of oxacillin, ciprofloxacin, linezolid, levofloxacin, trimethoprim / sulfamethoxazole.
  • the test results using the test device were different, but the other results except trimethoprim / sulfamethoxazole are classified as minor errors.
  • the same Staphylococcus genus S. haemolyticus shows different results from the BMD results and the cell culture test apparatus of the present invention for ampicillin, tetracycline, clindamycin, levofloxacin, and imipenem. However, results except for ampicillin are classified as minor errors. Except for the above-mentioned antibiotics, the test results using the BMD and the test results using the cell culture test apparatus of the present invention were found to be in agreement.
  • the antibiotic susceptibility test results using the cell culture testing apparatus of the present invention do not exceed 10% as compared to the BMD results. Turned out. Therefore, the cell culture testing device of the present invention can be used in the clinical and can reduce the time required for the test, it is possible to reduce the amount of reagents and cells required for the test.
  • Existing antibiotic tests have been confirmed by placing filter discs containing antibiotics on agar plates inoculated with bacteria and measuring the diameter of the clear zone around the antibiotic filter discs after 16 to 24 hours.
  • the cell culture testing device of the present invention can significantly reduce the amount of drugs and cells required for drug testing compared to the prior art, it is possible to quickly track the growth change of a single cell or single cell population as fast as possible Within two hours it is usually possible to get a fast drug test result in six hours.
  • one cell should be tested for various antibiotic types and various concentrations of antibiotics. While conventional antibiotic sensitivity tests require dozens of agar plates, the cells can be performed in the wells of the cell culture test apparatus of the present invention. Can be reduced in size.
  • the cell culture test apparatus of the present invention is very economical because it can reduce the analysis time, the researcher's effort, the amount of bioactive substances, the amount of medium and the plate size.

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Abstract

복수의 정렬된 웰 유닛들의 어레이 구조를 가지는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치로서, 상기 웰 유닛은 제1 유체를 수용하기 위한 제1 서브웰; 제2 유체를 수용하기 위한 제2 서브웰; 및 상기 제1 서브웰과 상기 제2 서브웰을 구획하도록 상기 제1 서브웰과 상기 제2 서브웰 사이에 위치하는 배리어를 포함하되, 상기 제1 서브웰의 바닥면은 상기 제1 유체를 고화시킨 고체 박막을 수용할 수 있도록 상기 바닥면에 대하여 깊이 방향으로 들어간 오목부를 구비하며, 상기 배리어는 상기 오목부를 채우도록 상기 제1 유체를 상기 제1 서브웰에 주입 시 상기 제1 유체가 상기 제2 서브웰로 넘어가지 않도록 할 정도의 높이를 가지는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치가 제공된다.

Description

신속한 항생제 감수성 검사를 위한 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치
본 명세서에 개시된 기술은 일반적으로 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치에 관한 것이다.
일반적으로 세포의 약물에 대한 반응을 관찰하기 위해서는 멀티-웰 플레이트(multi-well plate)에 세포를 넣은 다음 액체 상태의 약물을 주입하여 시간에 따른 세포의 변화를 광학 측정 장비를 이용해서 관측하여 통계적인 결과를 얻는 방식이 사용된다. 고체 배지에서의 항생제 감수성 검사의 경우, 한천 배지에 균을 뿌리고 항생제를 흡수시킨 종이를 올린 다음 균의 성장을 관찰하는 KB-테스트 방법이 있다. 액체 배지에서의 microdilution test일 경우 항생제 감수성 시험을 위해 VITEK2, Microscan, Phoenix 등의 다수의 자동화 장비가 개발되었으며, 이러한 장비를 사용하여 항생제를 밀리미터 크기의 웰에 넣은 뒤에 균을 액체 배지와 함께 주입하여서 균의 성장을 탁도를 통해 통계학적으로 관측하여 결정할 수 있다.
기존에 서로 다른 약물에 대한 세포의 반응 검사를 수행할 때 세포를 액체 또는 고체 배지에 넣고 검사하고자 하는 약물을 액체 배지와 섞거나 또는 고체 배지 위에 약물을 흡수시킨 종이 디스크를 올려 세포와 반응시킨 다음 세포의 약물에 대한 성장반응을 혼탁도(흡광도)로 측정하여 약물에 대한 반응을 측정한다. 그러나 이러한 방식은 개별 세포의 변화보다 통계학적인 정보를 수집하는 방법이고 통계학적인 결과를 얻기 위해서 세포 수가 어느 정도(보통 1ml 당 백만 개체) 이상 자라야 하기 때문에 배양 시간이 오래 걸린다(보통 16~24시간). 이 경우 약물에 대한 개별 세포에서 발생하는 변화의 관측과 운동성이 있는 개별 세포의 실시간 관측은 불가능하다. 또한 약물을 주입하는 방법에 있어서 개별 약물에 대해서 개별적으로 주입하는 과정이 필요하여 많은 수의 약물을 검사하는데 시간과 노력이 많이 요구된다. 그리고 고체 배지에서의 항생제 감수성 검사의 경우 KB-test는 약물을 올릴 수 있는 개수가 한정되어서 기본 수십 가지의 항생제의 감수성 검사를 위해서 많은 수의 한천배지 플레이트가 필요하다. 그리고 이런 검사시간을 최소화한 자동화 장비인 VITEK 시스템인 경우에도 마찬가지로 균의 탁도가 일정 수준 이상 증가해야 하기 때문에 비교적 오랜 시간(12시간 정도)이 소요되는 한계가 있다. 또한 기존 방법은 테스트 환경이 인체 내 환경과 다르므로 실제로 인체 내 일어나는 현상과 많은 차이점이 있을 수 있다(Gregory G. Anderson, et al.(2003), "Intracellular Bacterial Biofilm-Like Pods in Urinary Tract Infections", Science 301, 105; Gallo et al.(2011), "Demonstration of Bacillus cereus in Orthopaedic-Implant-Related Infection with Use of a Multi-Primer Polymerase Chain Reaction-Mass Spectrometric Assay.", J Bone Joint Surg Am, 93).
따라서 종래 기술보다 정확하고 신속한 항생제 감수성 검사 기술의 개발이 요구된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 복수의 정렬된 웰 유닛들의 어레이 구조를 가지는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치로서, 상기 웰 유닛은 제1 유체를 수용하기 위한 제1 서브웰; 제2 유체를 수용하기 위한 제2 서브웰; 및 상기 제1 서브웰과 상기 제2 서브웰을 구획하도록 상기 제1 서브웰과 상기 제2 서브웰 사이에 위치하는 배리어를 포함하되, 상기 제1 서브웰의 바닥면은 상기 제1 유체를 고화시킨 고체 박막을 수용할 수 있도록 상기 바닥면에 대하여 깊이 방향으로 들어간 오목부를 구비하며, 상기 배리어는 상기 오목부를 채우도록 상기 제1 유체를 상기 제1 서브웰에 주입 시 상기 제1 유체가 상기 제2 서브웰로 넘어가지 않도록 할 정도의 높이를 가지는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치가 제공된다.
일 구현예에 따르면, 상기 오목부의 바닥면은 적어도 하나의 마이크로패터닝된 홈부를 구비할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 마이크로패터닝된 홈부가 상기 오목부의 중심에 대해 동심원 형태의 채널 구조를 가질 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 오목부의 바닥면을 통해 상기 제1 유체 내의 대상을 관찰할 수 있도록 상기 오목부의 바닥면의 적어도 일부가 광학적으로 투명한 재질로 이루어질 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 제1 서브웰의 바닥면은 관찰 대상의 위치 정보를 제공하는 포커싱 표지를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 오목부의 폭은 상기 제1 서브웰의 폭에 대비하여 0.2 이상 0.99 이하일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 웰 유닛의 규격이 상용 멀티-웰플레이트의 각 웰의 규격에 상당할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 각 웰들이 1x1, 1x2, 1x4, 2x4, 4x6, 12x8, 24x16 또는 48x32의 웰 배열을 가질 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 제1 유체는 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 제2 유체는 생리활성물질을 함유한 용액일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 제2 서브웰은 고체 형태의 생리활성물질을 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 제2 유체는 상기 생리활성물질을 용해시키는 용매일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상술한 세포배양검사 장치를 이용한 세포의 분석방법으로서, (a) 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액을 상기 제1 서브웰의 바닥면에 형성된 오목부에 제공하는 단계; (b) 상기 혼합용액을 고화하여 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 형성하는 단계; (c) 생리활성물질을 함유한 용액을 상기 제2 서브웰에 제공하거나 고체 형태의 생리활성물질을 포함하고 있는 상기 제2 서브웰에 생리활성물질을 용해하는 용매를 상기 제2 서브웰에 제공하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 상기 생리활성물질을 함유한 용액 또는 상기 생리활성물질을 용해하는 용매를 상기 배리어의 높이를 넘어가도록 주입하여 상기 제1 서브웰 내에서 상기 고체 박막 내로 상기 생리활성물질을 확산시키는 단계; 및 (e) 상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰하는 단계를 포함하는 세포의 분석 방법이 제공된다.
일 구현예에 따르면, 상기 생물학적 물질의 변화를 이미징 장치를 이용하여 시간별로 측정할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 생물학적 물질의 반응을 단일 세포 군집 단위로 관찰할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 혼합용액은 박테리아의 감염에 대해 양성을 나타낸 상기 생물학적 물질을 채취하여 상기 고형화제를 함유한 액상 매질로 희석한 것일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 액상 매질은 특정 세포의 분열을 촉진시키는 배지를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, (f) 상기 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 군집 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치의 웰 유닛의 단면을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치의 웰 유닛의 단면을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 항생제 검사를 하는 과정을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 제1 서브웰에 샘플을 로딩하는 과정을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 제1 서브웰의 바닥면에 구비된 포커싱 표지(focus mark)를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 표준 균주인 E. coli ATCC 25922가 항생제가 없는 조건에서 자라는 모습을 일정 시간 간격으로 관찰한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 표준 균주인 E. coli ATCC 25922에 항생제 세프타지딤(Ceftazidime)을 주입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 일정 시간 간격으로 관찰한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 표준 균주인 S. aureus ATCC 29213에 항생제 암피실린(Ampicillin)을 주입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 일정 시간 간격으로 관찰한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 표준 균주인 P. aeruginosa ATCC 27853에 항생제 아작탐(Aztreonam)을 주입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 일정 시간 간격으로 관찰한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 표준 균주인 E. faecalis ATCC 29212에 항생제 테트라사이클린(Tetracyline)을 주입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 일정 시간 간격으로 관찰한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 4개의 혈액 샘플로부터 얻은 그람 음성 균주(Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, P.aeruginosa)에 대한 항생제 감수성 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 4개의 혈액 샘플로부터 얻은 그람 양성 균주(Staphylococcus epidermis, Enterococcus faecium, Staphylococcus haemolyticus)에 대한 항생제 감수성 검사 결과를 나타낸 것이다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명의 구현예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고, 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
한편, 본 발명에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다. “제1 ” 또는“제2 ” 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
또, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, “포함하다” 또는 “가지다”등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치를 나타낸다. 도 1의 (a)는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치의 사시도이고, (b)는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치의 일부를 확대한 것이다.
도 1을 참조하면, 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치(100)는 복수의 정렬된 웰 유닛(110)들의 어레이 구조를 가진다. 상기 웰 유닛(110)은 제1 유체를 수용하기 위한 제1 서브웰(120), 제2 유체를 수용하기 위한 제2 서브웰(130) 및 상기 제1 서브웰과 상기 제2 서브웰을 구획하도록 상기 제1 서브웰과 제2 서브웰 사이에 위치하는 배리어(140)를 포함한다. 이 때 상기 웰 유닛(110)이 다수 정렬되어 전체적으로 상용 멀티-웰 플레이트와 유사한 규격을 가질 수 있다. 바람직하게는 웰 유닛(110)의 중심이 상용 멀티-웰의 중심과 일치할 수 있다.
화학적, 생화학적, 및/또는 생물학적 분석에 있어서 멀티-웰 플레이트는 다수의 샘플을 처리하고 분석하기 위한 표준 도구이다. 멀티-웰 플레이트는 다양한 형태, 크기 및 모양을 취할 수 있는데, 일반적으로 표준 크기 및 모양으로 만들어지고, 웰들의 표준 배열을 가진다. 웰들의 표준 배열은 96-웰 플레이트(12x8의 웰 배열), 384-웰 플레이트(24x16의 웰 배열), 및 1536-웰 플레이트(48x32의 웰 배열)에서 발견되는 것을 포함하며, 기타 다양한 방식의 상용 멀티-웰 플레이트가 있다. 세포배양검사 장치(100)가 상용 멀티-웰 플레이트와 유사한 규격을 가짐으로써 종래의 다양한 생물학적 분석 기술과 용이하게 호환될 수 있다.
상기 제1 유체 및 상기 제2 유체는 통상적으로 물을 80중량% 또는 90중량% 이상을 분산매 또는 용매로서 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 유체는 고형화제(gelling agent)를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질(biological agent)의 혼합용액일 수 있다. 또한 예를 들어, 상기 제2 유체는 생리활성물질을 함유한 용액일 수 있고, 생리활성물질을 용해시키는 용매일 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치의 웰 유닛(210)의 단면을 나타낸 것이다. 도 2를 참조하면, 도 2의 (a)는 세포배양검사 장치의 웰 유닛(210)을 위에서 내려다 본 모습이고, 도 2의 (b)는 (a)의 A-A' 단면의 모습을 나타낸 것이다. 상기 제1 서브웰(220)은 상기 제1 유체를 수용하기 위한 것으로, 충분한 크기의 공간을 가지는 웰 형태일 수 있다. 상기 웰의 부피는 특별히 제한되지 않지만 제1 유체를 주입한 후 장시간동안 반응을 관찰하기 위해 충분한 크기를 가질 수 있으며, 예를 들어 100 ㎕ 내지 2000 ㎕일 수 있다.
또한 상기 제1 서브웰(220)의 바닥면은 상기 제1 유체를 고화시킨 고체 박막을 수용할 수 있도록 상기 바닥면에 대하여 깊이 방향으로 들어간 오목부(221)를 구비할 수 있다. 상기 오목부(221)의 형상은 원형 또는 타원형일 수 있고, 사각형, 오각형, 육각형 등과 같은 다각형일 수 있다. 또한 상기 오목부(221)의 폭(w1)은 상기 제1 서브웰(220)의 폭(w2)에 대비하여 0.5 이상 1 미만일 수 있다. 상기 오목부의 형상 및 상기 제1 서브웰의 폭에 대한 상기 오목부 폭의 비율은 특별히 제한되지 않지만 제1 유체를 주입한 후 세포의 반응을 관찰하기 위해 충분한 크기를 가질 수 있는 것이 좋다. 바람직하게는 상기 오목부의 형상은 원형일 수 있다. 또한 바람직하게는 오목부(221)의 폭(w1)은 제1 서브웰(220)의 폭(w2)에 대비하여 0.2 이상 0.99 이하일 수 있고, 더 바람직하게는 0.4 이상 0.8 이하일 수 있고, 더욱 더 바람직하게는 0.55 이상 0.65 이하일 수 있다. 상기 제1 서브웰의 폭에 대한 상기 오목부의 폭의 비율이 상기 범위 미만에서는 제1 유체를 수용하기에 오목부의 부피가 작아 세포 관찰이 어려울 수 있고, 상기 범위 초과에서는 오목부가 형성되지 않을 수 있다.
또한, 오목부(221)의 바닥면을 통해 상기 제1 유체 내의 대상을 관찰할 수 있도록 오목부(221)의 바닥면의 적어도 일부가 광학적으로 투명한 재질로 이루어질 수 있다. 예를 들어 상기 세포배양검사 장치의 몸체가 투명 재질로 이루어질 수 있다. 바람직하게는 상기 투명 재질은 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리카보네이트와 같은 고분자 수지일 수 있다. 세포배양검사 장치는 고분자 수지를 사출하는 방식으로 제조될 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치의 웰 유닛(310)을 나타낸 것이다. 도 3의 (a)는 본 발명의 일 구현예에 따른 웰 유닛을 나타낸 것이고, 도 3의 (b)는 (a)의 A-A' 단면을 나타낸 것이다. 도 3을 참조하면, 오목부(321)의 바닥면은 적어도 하나의 마이크로패터닝된 홈부(322)를 구비할 수 있다. 마이크로패터닝된 홈부(322)는 모세관 현상에 의해 상기 제1 유체를 오목부(321)의 바닥면에 잘 고정시킬 수 있는 역할을 한다. 상기 마이크로패터닝된 홈부(322)의 형상은 원형 또는 타원형일 수 있고, 사각형, 오각형, 육각형 등과 같은 다각형일 수 있다. 마이크로패터닝된 홈부(322)는 상기 오목부(321)의 바닥면에 하나 또는 복수로 형성될 수 있다. 상기 마이크로패터닝된 홈부(322)는 서로 이격된 복수의 미세 우물들이거나, 마이크로채널들과 같은 형태를 가질 수 있다. 예를 들어 마이크로패터닝된 홈부(322)는 도 3 (b)와 같이 도넛 형태의 마이크로채널 형태일 수 있고, 도 3 (c)와 같은 규격을 가질 수 있다. 마이크로패터닝된 홈부(322)의 너비는 예를 들어 500 ㎛ 내지 1.5 mm 수준이고, 깊이(또는 두께)가 200 ㎛ 수준일 수 있다. 그리하여 추후 이미징이 용이하고 모세관 현상에 의해 상기 제1 유체가 제1 서브웰(320) 내에서 균일하게 퍼질 수 있고, 마이크로패터닝된 홈부 또는 오목부에 고정이 잘 되는 규격을 갖는다. 상기 마이크로패터닝된 홈부는 바람직하게는 세포 관찰이 용이한 형상일 수 있다. 상기 제1 유체가 고형화제를 함유한 액상 매질일 경우 일정 시간 후 겔화될 수 있다. 그 결과 마이크로패터닝된 홈부(122)를 포함한 오목부(121)를 채우는 고체 박막이 형성될 수 있다.
도 1을 다시 참조하면, 제2 서브웰(130)은 상기 제2 유체를 수용하기 위한 것으로, 충분한 크기의 공간을 가지는 웰 형태일 수 있다. 상기 제2 서브웰은 동결 건조된 고체 형태의 생리활성물질을 포함할 수 있다. 고체 형태의 생리활성물질을 포함하고 있을 경우, 제2 유체를 제2 서브웰에 주입하여 상기 생리활성물질을 용해시킬 수 있고, 그 결과 생리활성물질을 포함한 용액이 제조될 수 있다.
배리어(140)는 상기 제1 서브웰(120)과 상기 제2 서브웰(130)을 구획하도록 상기 제1 서브웰과 상기 제2 서브웰 사이에 위치할 수 있다. 배리어(140)는 상기 제1 유체를 상기 오목부(121)를 채우도록 상기 제1 서브웰(120)에 주입 시, 상기 제1 유체가 상기 제2 서브웰(130)로 넘어가지 않도록 할 정도의 높이를 가질 수 있다. 상기 배리어는 상기 제1 유체가 상기 제2 서브웰로 넘어가지 않게 하여, 고체 형태의 생리활성물질을 포함하고 있는 제2 서브웰과의 오염을 막을 수 있다. 상기 제1유체 내 관찰 대상과 생리활성물질과의 접촉은 상기 제1 유체 내 고형화제에 의해 겔화된 이후에 수행되어야 할 과정이므로 상기 배리어를 구비함으로써 순차적으로 세포배양검사가 실시될 수 있다. 동시에 상기 배리어(140)는 상기 제2 유체를 상기 제2 서브웰에 주입 시, 상기 제2 유체가 상기 제1 서브웰(120)로 넘어갈 수 있을 정도의 높이를 가질 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 항생제 검사를 하는 과정을 나타낸다.
도 4를 참조하면, 도 4의 (a)와 같이 먼저 고형화제(gelling agent)를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질(biological agent)의 혼합 용액을 만든다. 상기 액상 매질은 약 95% 이상의 물을 포함할 수 있으며 고형화제의 존재에 의해 고체화될 수 있다. 고형화제의 예로 한천(agar), 아가로즈(agarose), 젤라틴(gelatin), 알기네이트(alginate), 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 한천 또는 아가로즈가 사용될 수 있다. 일 예로 액상 매질 내에는 한천이 0.5 내지 4 중량%가 사용될 수 있다. 통상적으로 액상 매질은 영양성분을 필요로 하지 않지만, 몇몇 예에 있어 영양성분을 포함할 수도 있고, 특정 세포의 분열을 촉진시키는 배지를 포함한 용액일 수 있다.
상기 생물학적 물질은 바이러스, 박테리아, 균류, 조류, 원생동물, 기생 병원균, 사람 또는 포유류의 세포 및 바이오필름 등을 포함한다. 또한 상기 생물학적 물질은 박테리아, 바이러스, 균류 등과 같이 감염성을 나타내는 생물학적 물질과 혈구 세포의 혼합 상태일 수 있다. 예를 들어, 박테리아에 감염된 사람으로부터 채취한 혈액일 수 있는데, 이런 경우 혈구 세포와 박테리아 세포를 구별할 수 있도록 박테리아 세포의 분열만 촉진시키는 배지를 사용하여 혈구 세포와의 크기 변화 차이로 구별할 수 있다. 상기 생물학적 물질은 액상 또는 고상의 배지 내에서 성장할 수 있고 외부 생리활성물질의 종류 및 농도에 따라 성장에 영향을 받을 수 있다. 상기 혼합 용액 내에서의 상기 생물학적 물질의 밀도는 102 내지 1010 cells/ml, 바람직하게는 104 내지 1010 cells/ml, 더 바람직하게는 105 내지 109cells/ml일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 생물학적 물질의 위치를 파악하기 어려울 수 있고 상기 범위 초과에서는 개별적인 생물학적 물질의 상태를 파악하기 어려울 수 있다.
다음으로 도 4의 (b)와 같이 상기 혼합 용액을 제1 서브웰의 바닥면에 형성된 오목부(421)에 제공한다. 상기 혼합 용액은 상기 제1 서브웰의 오목부의 부피에 상당하는 양만큼 주입할 수 있다. 제1 서브웰의 오목부에 주입되는 상기 혼합 용액의 부피는 바람직하게는 10 ㎕ 내지 200 ㎕ 일 수 있다. 더 바람직하게는 10 ㎕ 내지 150 ㎕ 일 수 있다. 상기 제1 서브웰에 주입되는 혼합 용액의 부피가 상기 범위 미만에서는 혼합 용액 내 포함된 세포의 밀도가 낮아 세포 관찰이 어려울 수 있고, 상기 범위 초과에서는 배리어를 넘어 제2 서브웰로 주입될 수 있다. 상기 오목부의 바닥면에 형성된 적어도 하나의 마이크로패터닝된 홈부(422)에 의해, 상기 혼합 용액 주입 시 모세관 현상에 의해 상기 혼합 용액이 홈부 전체에 고르게 퍼지는 효과를 가진다. 또한 마이크로패터닝된 홈부에 의해 상기 혼합 용액을 원하는 영역에 잘 고정시킬 수 있다. 도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 제1 서브웰(520)에 샘플을 로딩하는 과정을 나타내는 것으로, 마이크로패터닝된 홈부(522)를 가진 웰로 인해 샘플이 원하는 영역에 한정되어 고정됨을 알 수 있다.
도 4의 (b)와 같이 상기 혼합 용액은 박테리아와 같이 감염성을 나타내는 생물학적 물질과 혈구 세포가 혼합된 상태일 수 있다. 예를 들어, 상기 혼합 용액은 박테리아에 감염된 사람으로부터 채취한 혈액의 배양액, 즉, 박테리아의 감염에 대해 양성을 나타낸 혈액의 배양액을 포함할 수 있다. 이때 혈구 세포와 박테리아 세포를 구별할 수 있도록 박테리아 세포의 분열만 촉진시키는 액상 매질, 즉 배지를 사용하면 혈구 세포와의 크기 변화 차이로 박테리아 세포를 구별할 수 있다. 박테리아 세포의 분열만 촉진시킬 수 있는 배지로는 MHB (Mueller-Hinton broth), MHA (Mueller-Hinton agar), LBB (Luria-Bertani broth), LBA (Luria-Bertani agar) 등이 있다.
혈액 샘플로부터 박테리아를 분리하는 과정을 거치지 않고 박테리아의 감염에 대해 양성을 나타낸 혈액 샘플을 채취하여 고형화제를 함유한 배지로 희석하여 검사함으로써 검사 시간을 줄일 수 있다.
상기 혼합 용액을 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 형성한다. 높은 온도에서 액상 매질의 온도가 내려감에 따라 매질이 고화됨으로써 상기 생물학적 물질의 움직임이 저하된다. 상기 고정에 의하여 운동성이 있는 상기 생물학적 물질을 계속해서 용이하게 관찰할 수 있다.
상기 세포배양검사 장치 또는 상기 오목부의 바닥면은 바람직하게는 광학 이미징을 위해 투명 재질로 이루어질 수 있다. 도 3을 재참조하면, 세포배양검사 장치의 제1 서브웰의 오목부(321)는 액상 매질이 도포되어 고화되어 고체 박막이 형성될 수 있다. 오목부(321)를 통해 상기 액상 매질이 투입되고 고화 과정을 거치는데, 상기 오목부(321)의 깊이에 따라 고체 박막의 두께가 결정될 수 있다. 상기 오목부의 깊이는 1㎛ 내지 5mm, 또는 1㎛ 내지 3mm, 또는 1㎛ 내지 2mm, 또는 1㎛ 내지 1.5mm, 또는 1㎛ 내지 1mm, 또는 1㎛ 내지 800㎛, 또는 1㎛ 내지 500㎛, 1㎛ 내지 100㎛, 또는 10㎛ 내지 3mm, 또는 100㎛ 내지 500㎛, 또는 10㎛ 내지 1mm, 또는 100㎛ 내지 1mm, 또는 200㎛ 내지 1mm, 또는 500㎛ 내지 1mm, 100㎛ 내지 500㎛ 중 어느 하나의 범위일 수 있다. 바람직하게는 상기 오목부의 깊이는 100㎛ 내지 500㎛이다. 오목부의 깊이는 상술한 범위의 두께를 가지므로 내부에 고정된 생물학적 물질을 개별 세포(single cell) 또는 단일 세포 군집 (single cell colony) 단위로 용이하게 관찰할 수 있다.
한편, 오목부(321)의 너비는 이미지 영역의 크기를 고려할 때, 100㎛ 내지 5mm, 또는 300㎛ 내지 5mm, 또는 500㎛ 내지 3mm, 또는 1mm 내지 3mm일 수 있다. 바람직하게는 상기 오목부의 너비는 1mm 내지 3mm이다. 상술한 범위의 너비를 가진 오목부는 제1 서브웰에 형성되어 세포를 원하는 영역에 고정할 수 있는 공간을 제공하고, 이미징 장치의 규격보다 크지 않아 오목부의 전체 영역을 관찰할 수 있다.
상기 오목부의 형상이나 너비는 특별히 제한되지 않지만 상기 규격과 너비를 유지하면서 가능한 한 많은 양의 혼합 용액(고형화 물질 및 생물학적 물질을 함유한 액상 매질)이 도입될 수 있는 것이 생리활성물질과의 반응을 정확하게 제어하는 데 용이하다. 또한, 이미징 장치의 규격보다 크지 않아 세포배양검사 장치를 이동하지 않고도 오목부의 전체 영역이 관찰될 수 있는 것이 좋다.
상기 고체 박막의 두께와 너비는 상기 오목부의 깊이와 너비에 따라 정해진다. 본 명세서에서 "박막"이라 함은 상기 생물학적 물질을 고정하여 단일 세포 단위 또는 단일 세포 군집 단위로 관찰할 수 있을 정도의 두께를 갖는 막이면 특별히 제한되지 않으나, 대체로 1㎛ 내지 5mm, 또는 1㎛ 내지 3mm, 또는 1㎛ 내지 2mm, 또는 1㎛ 내지 1.5mm, 또는 1㎛ 내지 1mm, 또는 1㎛ 내지 800㎛, 또는 1㎛ 내지 500㎛, 1㎛ 내지 100㎛, 또는 10㎛ 내지 3mm, 또는 100㎛ 내지 500㎛ 또는 10㎛ 내지 1mm, 또는 100㎛ 내지 1mm, 또는 200㎛ 내지 1mm, 또는 500㎛ 내지 1mm 중 어느 하나의 범위를 갖는 얇은 층을 의미한다. 여기서 고체 박막의 두께는 관찰하고자 하는 고체 박막 면에 대한 수직방향의 크기에 해당할 수 있다. 고체 박막은 상술한 범위의 두께를 가지므로 내부에 고정된 생물학적 물질을 개별 세포(single cell) 또는 단일 세포 군집 (single cell colony) 단위로 관찰할 수 있다.
상기 제1 서브웰의 바닥면은 관찰 대상의 위치 정보를 제공하는 포커싱 표지(623)를 포함할 수 있다. 도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 제1 서브웰의 바닥면에 구비된 포커싱 표지(focus mark)를 나타낸다. 도 6을 참조하면, 포커싱 표지(623)는 세포배양검사 장치의 관찰 영역을 자동적으로 추적(tracking)할 수 있도록 제1 서브웰 바닥면에 표지될 수 있다. 바닥면에 구비된 포커싱 표지는 사출 몰딩(injection molding)의 방법을 통해서 마이크로채널(microchannel)의 형태로 바닥면에 제작된다. 고체 박막 내 생물학적 물질은 고정되어 있으므로 포커싱 표지(623)를 이용하여 촬영하면, 촬영 시간마다 같은 영역을 촬영할 수 있다. 포커싱 표지는 앞서 이야기한 관찰 영역의 자동 추적에 있어서 x축, y축, z축 3가지 축 방향으로의 위치를 보정하는 역할을 한다.
도 4의 (c)와 같이, 고체 형태의 생리활성물질을 포함하고 있는 상기 제2 서브웰(430)에 생리활성물질을 용해하는 용매를 상기 제2 서브웰에 제공한다. 생리활성물질이 제2 서브웰(430)에 없는 경우, 생리활성물질을 함유한 용액을 상기 제2 서브웰(430)에 제공할 수 있다. 본 명세서에서 상기 생리활성물질은 항생제, 항암제, 면역억제제와 같은 약물, 영양성분, 세포분비물, 신호전달물질, 바이러스, 세포, micro RNA, 단백질, 항원, 항체, DNA 등 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 이 때, 도 4의 (b)와 같이 제2 서브웰에 고체 형태의 생리활성물질을 포함하고 있는 경우, 생리활성물질은 동결 건조된 상태일 수 있다. 동결 건조된 생리활성물질을 용해하는 용매로는 물, 세포배양용 배지, Dimethylformadide(DMF), Dimethyl sulfoxide (DMSO) 가 사용될 수 있다. 상기 생리활성물질을 용해하는 용매는 고체 형태의 생리활성물질을 완전히 용해시키고, 용해된 후 용액의 균일한 농도를 갖도록 하기 위해 피펫팅 하면서 도입될 수 있다.
다음, 도 4의 (c)와 같이 생리활성물질을 용해하는 용매를 상기 제2 서브웰(430)에 제공하는 단계에서, 생리활성물질을 용해하는 용매를 상기 배리어(440)의 높이를 넘어가도록 주입하여 상기 제1 서브웰(420) 내에서 상기 고체 박막 내로 상기 생리활성물질을 확산시킨다. 이는 생리활성물질이 제2 서브웰(430)에 없는 경우에도, 상기 생리활성물질을 함유한 용액을 제2 서브웰에 제공하는 단계에서, 상기 생리활성물질을 함유한 용액을 상기 배리어의 높이를 넘어가도록 주입하여 상기 제1 서브웰(420) 내에서 상기 고체 박막 내로 상기 생리활성물질을 확산시킨다. 제2 서브웰(430)에 주입되는 생리활성물질을 함유한 용액 또는 생리활성물질을 용해하는 용매의 부피는 배리어(440)의 높이를 넘어 제1 서브웰(420)에 형성된 고체 박막과 생리활성물질을 함유한 용액과 계면을 형성할 수 있을 정도가 좋다. 바람직하게는 50 ㎕ 내지 200㎕ 일 수 있다. 더 바람직하게는 75㎕ 내지 125 ㎕ 일 수 있다.
다음, 도 4의 (d)와 같이 상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰한다. 생리활성물질을 포함한 용액이 고체 박막의 계면을 관통하여 확산되면서, 고체 박막 내에 고정되어 있는 생물학적 물질과 만나게 된다. 상기 생물학적 물질이 상기 고체 박막 내부에 고정됨으로써 관찰 방향에 대해 수평적으로 널리 분포하게 되어 결과적으로 단일 세포 단위 또는 단일 세포 군집 단위로 관찰이 가능하다. 일반적으로 단일 세포(single bacteria)의 성장변화는 수십 분(보통 30분) 이내에 관찰이 가능하고, 단일 세포 군집(single colony of bacteria)의 변화에는 보통 4~6시간 이내에 관찰이 가능하기 때문에 생물학적 물질에 대한 생리활성물질의 영향을 기존 방식에 비해 정확하고 빠르게 확인할 수 있다. 예를 들어 박테리아 세포에 대해서 생리활성 검사를 수행할 경우 3~4시간 이내에 검사를 끝낼 수 있다. 상술한 검사 방법을 이용하면 다양한 항생제 조건 하에서 단일 세포 모폴로지의 변화 또는 단일 세포 군집의 변화를 시간 경과 이미징(time-lapse imaging)으로 관찰할 수 있다.
생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 군집 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정할 수 있다. 본 발명의 세포배양검사 장치는 항생제 감수성 시험 뿐 아니라 바이오필름 어세이(biofilm assay)에도 매우 유용하게 활용할 수 있다. 바이오필름은 미생물이 감염되거나 부착된 부분에서 나타나며, 폴리머 기질로 감싸인 미생물에 의해 형성된 점액질의 미생물 복합체를 이루는 막이다. 바이오필름의 형성은 사람의 건강에도 중대한 영향을 끼칠 수 있다. 바이오필름에 의한 감염증으로 폐 감염증, 중이염, 치주염 등이 있다 그런데 바이오필름 내의 세균은 부유 상태보다 항생물질에 대한 내성이 1000배 이상이 되어 문제가 된다. 종래 바이오필름을 연구하기 위한 방법으로 플로우 셀 시스템(flow cell system)이나 웰 기반의 시스템(well based system) 등을 이용한 방법들이 있었으나 이들 어세이 시스템들은 바이오필름 형성을 위해 수일 간의 장시간이 요구되며, 관찰을 위해서는 염색을 해야 하고, 콘포컬 현미경(confocal microscope)을 이용해야 하는 등의 어려운 면들이 있었다. 또한 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)나 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정할 경우 추가적인 실험이 필요하다. 또한 이러한 시스템들은 크기가 매우 클 뿐 아니라, 바이오필름 형성 단계들(biofilm formation stages)을 분명하게 보여주지 못하고 박테리아 감염에 있어 체내(in vivo) 바이오필름 형성을 대표하지 못한다.
따라서 바이오필름의 형성과정과 항생제에 대한 반응성을 연구하기 위한 효율적인 시스템이 요구되며 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치는 훌륭한 대안이 될 수 있다.
관찰을 위해 광학 측정장치가 사용될 수 있다. 상기 광학 측정장치는 CCD 또는 CMOS 카메라와 같은 촬영 장치를 포함할 수 있다. 상기 광학 측정장치는 또한 초점을 맞추고 빛을 이미지화하는 데 필요한 렌즈, 조명 및 빛 가이드 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 광학 측정장치는 카메라에 의해 관찰된 이미지 데이터를 가공 및 분석하기 위한 이미지 처리 시스템을 포함할 수 있다. 상기 광학 측정장치는 검사 과정에 나타난 생물학적 물질의 성장변화를 빠른 속도로 기록하고 분석하여 검사 결과를 얻는다. 겔화된 상기 제1 유체와 상기 제2 유체가 계면을 형성하고 있는 제1 서브웰을 중심이 이미징 영역이 되는데 상기 이미징 영역은 약 400㎛*800㎛ 내지 800㎛*1600㎛의 크기를 가질 수 있다.
결국, 생물학적 물질의 고정과 생리활성물질의 확산방식을 이용하는 상술한 검사 방법을 이용하면 약물 검사에 필요한 약물 및 세포의 양이 종래 기술에 비해 대폭 저감될 수 있고, 단일 세포 또는 단일 세포 군집의 성장변화를 빠른 속도로 추적할 수 있어 빠르면 2 시간 이내에 보통 6 시간 이내에 빠른 약물 검사 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다. 이는 현재까지 알려진 최고의 검사 속도이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 표준 균주인 E. coli ATCC 25922가 항생제가 없는 조건에서 자라는 모습을 일정 시간 간격으로 관찰한 결과이다. 시간이 흐름에 따라서 박테리아 군집(colony)의 크기가 커지며, E. coli ATCC 25922의 경우 4시간 이후부터 육안으로 박테리아 군집을 확인할 수 있다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 표준 균주인 E. coli ATCC 25922에 항생제 세프타지딤(Ceftazidime)을 주입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 일정 시간 간격으로 관찰한 결과이다. CLSI(Clinical & Laboratory Standards Institute)에서 권고한 농도에 따라서 0.25㎍/ml ~ 4.0㎍/ml의 농도로 검사 시작 이후 6 시간까지 2 시간 간격으로 검사를 한 결과이며, 항생제 감수성 검사의 중요한 요소인 최소 억제 농도 (Minimum inhibitory concentration, MIC)를 결정할 수 있음을 도 8을 통해 확인할 수 있다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 표준 균주인 S. aureus ATCC 29213에 항생제 암피실린(Ampicillin)을 주입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 일정 시간 간격으로 관찰한 결과이다. S. aureus ATCC 29213은 암피실린 0.25 ㎍/ml 조건에서, 2시간 이후부터 콜로니가 관찰되기 시작하여 6시간 이후에는 콜로니의 크기가 커지고 선명해진 것을 확인할 수 있었다. 암피실린 0.5 ㎍/ml 조건에서는 0.25 ㎍/ml 조건에서보다 콜로니의 관찰이 뒤늦게 되었지만, 6시간 이후에는 선명한 콜로니를 관찰할 수 있었다. S. aureus ATCC 29213의 MIC는 1.0 ㎍/ml인 것으로 확인되었다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 표준 균주인 P. aeruginosa ATCC 27853에 항생제 아작탐(Aztreonam)을 주입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 일정 시간 간격으로 관찰한 결과이다. P. aeruginosa ATCC 27853은 아작탐 1.0, 2.0 ㎍/ml 조건에서, 6시간 이후 콜로니가 선명하게 관찰되었다. 아작탐 4.0 ㎍/ml 조건에서도 6시간 이후 크기는 작지만 콜로니가 관찰되었다. P. aeruginosa ATCC 27853의 MIC는 8.0 ㎍/ml인 것으로 확인되었다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 표준 균주인 E. faecalis ATCC 29212에 항생제 테트라사이클린(Tetracyline)을 주입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 일정 시간 간격으로 관찰한 결과이다. E. faecalis ATCC 29212은 테트라사이클린 4.0 ㎍/ml 조건에서 6시간 이후 크기는 작지만 콜로니가 선명하게 관찰되었다. E. faecalis ATCC 29212의 MIC는 8.0 ㎍/ml인 것으로 확인되었다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치(DRAST로 표기)를 이용하여 4개의 혈액 샘플로부터 얻은 그람 음성 임상 균주(Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, P.aeruginosa)에 대해서 항생제 감수성 검사 결과를 나타낸 것으로, 검사 기관에서 사용 중인 약제들을 대상으로 테스트하였다. 항생제 감수성 검사는 기존에 이용하는 항생제 감수성 검사(Broth Microdilution, BMD)와 본 발명의 세포배양검사 장치로 항생제 감수성 검사를 하였을 때의 결과를 비교하였다. 4개의 혈액 샘플에서 Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, P.aeruginosa이 검출되었다. 콜리스틴(colistin)에 대한 E. aerogenes의 감수성 결과는 BMD 테스트에서는 감수성(Susceptible, S)을 나타내었고, 본 발명의 세포배양검사장치(DRAST)를 이용한 테스트에서는 중간내성(Intermediate, I)을 나타내었다. P. aeruginosa는 치카르실린(ticarcillin), 치카르실린/클라불란산(ticarcillin/clavulanic acid), 세포탁심(cefotaxime), 아즈트레오남(aztreonam), 트리메소프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole)에 대하여 BMD 테스트에서는 중간 내성을 나타내었으나, 본 발명의 세포배양검사 장치를 이용한 테스트에서는 감수성을 나타내었다. 콜리스틴(colistin)에 대해서는 BMD 테스트 결과 감수성을, 본 발명의 세포배양검사장치 테스트 결과 중간 내성을 나타내었다. 위에서 언급한 항생제에 대한 BMD와 본 발명의 세포배양검사 장치의 테스트 결과는 모두 감수성(S)과 중간내성(I)의 차이로 소오류(minor error)로 구분된다. K. pneumoniae는 모든 항생제에 대하여 BMD 결과와 본 발명의 세포배양검사 장치를 이용한 테스트 결과가 일치하였다. (도 12에 기입된 농도의 단위는 μg/mL이다.)
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치(DRAST로 표기)를 이용하여 4개의 혈액 샘플로부터 얻은 그람 양성 임상 균주(Staphylococcus epidermis, Enterococcus faecium, Staphylococcus haemolyticus)에 대해서 항생제 감수성 검사 결과를 나타낸 것으로, 검사 기관에서 사용 중인 약제들을 대상으로 테스트하였다. 항생제 감수성 검사는 기존에 이용하는 항생제 감수성 검사(Broth Microdilution, BMD)와 본 발명의 세포배양검사 장치로 항생제 감수성 검사를 하였을 때의 결과를 비교하였다. 4개의 혈액 샘플에서 Staphylococcus epidermis, Enterococcus faecium, Staphylococcus haemolyticus이 검출되었다. S. epidermis는 옥사실린(oxacillin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 리네졸리드(linezolid), 레보플록사신(levofloxacin), 트리메소프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole)에 대하여 BMD 테스트 결과와 본 발명의 세포배양검사 장치를 이용한 테스트 결과가 다르게 나타났으나, 트리메소프림/설파메톡사졸을 제외한 나머지 결과는 소오류(minor error)로 구분된다. 같은 Staphylococcus 속인 S. haemolyticus는 암피실린(ampicillin), 테트라사이클린(tetracycline), 클린다마이신(clindamycin), 레보플록사신(levofloxacin), 이미페넴(imipenem)에 대해서 BMD 결과와 본 발명의 세포배양검사 장치를 이용한 결과가 다르게 나타났으나, 암피실린을 제외한 나머지 결과는 소오류(minor error)로 구분된다. 위에서 언급한 항생제를 제외하고는 BMD를 이용한 테스트 결과와 본 발명의 세포배양검사 장치를 이용한 테스트 결과는 일치하는 것으로 나타났다.
다른 샘플로부터 분리된 2개의 E. faecium의 경우, 하나는 리팜핀(rifampicin), 리네졸리드(linezolid), 반코마이신(vancomycin)에 대하여 BMD 테스트 결과와 본 발명의 세포배양검사 장치를 이용한 테스트 결과가 다르게 나타났으나, 감수성(S)-중간내성(I) 또는 중간내성(I)-내성(R)로 나타나 소오류(minor error)로 구분된다. 다른 하나는 트리메소프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole)에 대한 결과를 제외하고 항생제 감수성 결과가 일치하는 것으로 나타났다. (도 13에 기입된 농도의 단위는 μg/mL이다.)
도 12와 도 13의 결과를 바탕으로 본 발명의 세포배양검사 장치를 이용한 항생제 감수성 검사 결과는 BMD 결과와 비교하여 소오류(minor error) 비율이 10%를 넘지 않아, FDA 권고 기준에 부합하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 발명의 세포배양검사 장치는 임상에서의 사용이 가능하고 검사에 소요되는 시간을 줄일 수 있고, 검사에 필요한 시약과 세포의 양을 줄일 수 있다. 기존의 항생제 검사는 박테리아가 접종된 한천 플레이트 상에 항생제를 함유한 필터 디스크를 놓고, 16시간 내지 24시간이 지난 후에 항생제 필터 디스크 주위의 투명대(clear zone) 직경을 측정함으로써 확인되었다. 그러나, 본 발명의 세포배양검사 장치를 이용하면 약물 검사에 필요한 약물 및 세포의 양이 종래 기술에 비해 대폭 저감될 수 있고, 단일 세포 또는 단일 세포 군집의 성장변화를 빠른 속도로 추적할 수 있어 빠르면 2 시간 이내에 보통 6시간에 빠른 약물 검사 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다. 또한, 하나의 세포에 대해 다양한 항생제 종류와 다양한 항생제 농도에 대한 검사를 하여야 하는데, 기존의 항생제 감수성 검사는 수십 개의 한천 플레이트를 요구하는데 반해 본 발명의 세포배양검사 장치 내 웰 안에서 수행할 수 있어 플레이트 크기를 줄일 수 있다.
따라서 본 발명의 세포배양검사 장치는 분석 시간, 연구자의 노력, 생리활성물질의 양, 배지의 양 및 플레이트의 크기 등을 줄일 수 있어서 매우 경제적이다.
이상에서는 다양한 도면 및 구현예들을 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 명세서에 기재된 구현예들을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (18)

  1. 복수의 정렬된 웰 유닛들의 어레이 구조를 가지는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치로서,
    상기 웰 유닛은 제1 유체를 수용하기 위한 제1 서브웰; 제2 유체를 수용하기 위한 제2 서브웰; 및 상기 제1 서브웰과 상기 제2 서브웰을 구획하도록 상기 제1 서브웰과 상기 제2 서브웰 사이에 위치하는 배리어를 포함하되,
    상기 제1 서브웰의 바닥면은 상기 제1 유체를 고화시킨 고체 박막을 수용할 수 있도록 상기 바닥면에 대하여 깊이 방향으로 들어간 오목부를 구비하며,
    상기 배리어는 상기 오목부를 채우도록 상기 제1 유체를 상기 제1 서브웰에 주입 시 상기 제1 유체가 상기 제2 서브웰로 넘어가지 않도록 할 정도의 높이를 가지는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 오목부의 바닥면은 적어도 하나의 마이크로패터닝된 홈부를 구비한 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 마이크로패터닝된 홈부가 상기 오목부의 중심에 대해 동심원 형태의 채널 구조를 갖는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 오목부의 바닥면을 통해 상기 제1 유체 내의 대상을 관찰할 수 있도록 상기 오목부의 바닥면의 적어도 일부가 광학적으로 투명한 재질로 이루어진 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 제1 서브웰의 바닥면은 관찰 대상의 위치 정보를 제공하는 포커싱 표지를 포함하는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 오목부의 폭은 상기 제1 서브웰의 폭에 대비하여 0.2 이상 0.99 이하인 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 웰 유닛의 규격이 상용 멀티-웰플레이트의 각 웰의 규격에 상당하는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치.
  8. 제7 항에 있어서,
    상기 각 웰들이 1x1, 1x2, 1x4, 2x4, 4x6, 12x8, 24x16 또는 48x32의 웰 배열을 갖는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치.
  9. 제1 항에 있어서,
    상기 제1 유체는 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액인 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치.
  10. 제1 항에 있어서,
    상기 제2 유체는 생리활성물질을 함유한 용액인 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치.
  11. 제1 항에 있어서,
    상기 제2 서브웰은 고체 형태의 생리활성물질을 포함하고 있는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치.
  12. 제11 항에 있어서,
    상기 제2 유체는 상기 생리활성물질을 용해시키는 용매인 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치.
  13. 제1 항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 세포배양검사 장치를 이용한 세포의 분석방법으로서,
    (a) 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액을 상기 제1 서브웰의 바닥면에 형성된 오목부에 제공하는 단계;
    (b) 상기 혼합용액을 고화하여 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 형성하는 단계;
    (c) 생리활성물질을 함유한 용액을 상기 제2 서브웰에 제공하거나 고체 형태의 생리활성물질을 포함하고 있는 상기 제2 서브웰에 생리활성물질을 용해하는 용매를 상기 제2 서브웰에 제공하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 상기 생리활성물질을 함유한 용액 또는 상기 생리활성물질을 용해하는 용매를 상기 배리어의 높이를 넘어가도록 주입하여 상기 제1 서브웰 내에서 상기 고체 박막 내로 상기 생리활성물질을 확산시키는 단계; 및
    (e) 상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰하는 단계를 포함하는 세포의 분석 방법.
  14. 제13 항에 있어서,
    상기 생물학적 물질의 변화를 이미징 장치를 이용하여 시간별로 측정하는 세포의 분석 방법.
  15. 제13 항에 있어서,
    상기 생물학적 물질의 반응을 단일 세포 군집 단위로 관찰하는 것인 세포의 분석 방법.
  16. 제13 항에 있어서,
    상기 혼합용액은 박테리아의 감염에 대해 양성을 나타낸 상기 생물학적 물질을 채취하여 상기 고형화제를 함유한 액상 매질로 희석한 것인 세포의 분석 방법.
  17. 제13 항에 있어서,
    상기 액상 매질은 특정 세포의 분열을 촉진시키는 배지를 포함한 용액인 세포의 분석 방법.
  18. 제13 항에 있어서,
    (f) 상기 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 군집 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정하는 단계를 더 포함하는 세포의 분석 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019116775A1 (ja) * 2017-12-13 2019-06-20 株式会社日立ハイテクノロジーズ 細菌検査用抗菌剤導入プレート、および透明プレート
US11060054B2 (en) 2017-07-05 2021-07-13 SCREEN Holdings Co., Ltd. Specimen container

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101711105B1 (ko) * 2016-04-21 2017-03-06 주식회사 퀀타매트릭스 신속한 항생제 감수성 검사를 위한 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치
CA3102043A1 (en) * 2018-05-30 2019-12-05 Sun Bioscience Sa Well for cultivating biological material
KR102170803B1 (ko) 2018-10-19 2020-10-27 주식회사 이지다이아텍 세포의 격리 및 형태학적 분석 방법
KR20200044450A (ko) * 2018-10-19 2020-04-29 주식회사 이지다이아텍 세포의 격리 및 형태학적 분석 방법
KR102203994B1 (ko) * 2019-01-25 2021-01-18 한국기술교육대학교 산학협력단 감염원에 대한 항생제 감수성 검사용 유체 칩 및 이의 제조방법
KR102145842B1 (ko) * 2020-03-06 2020-08-19 주식회사 퀀타매트릭스 정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치
KR102127765B1 (ko) * 2020-03-06 2020-06-29 주식회사 퀀타매트릭스 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치
KR102132630B1 (ko) * 2020-03-16 2020-07-10 주식회사 퀀타매트릭스 섬 구조물을 포함하는 신속한 세포배양검사 장치
KR102132635B1 (ko) * 2020-03-16 2020-07-10 주식회사 퀀타매트릭스 유체막 두께가 일정한 신속한 세포배양검사 장치

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR200325376Y1 (ko) * 2002-12-16 2003-09-04 신수 디스크확산원리를 이용한 항생제 감수성 검사에서 측정범위가 명기된 투명판
KR20130089619A (ko) * 2012-02-02 2013-08-12 주식회사 퀀타매트릭스 고형화제를 이용한 세균 고정, 약물 확산, 세균 단일 세포 추적과 이를 기반으로 한 빠른 약물 검사 시스템
KR101446526B1 (ko) * 2013-05-02 2014-10-08 주식회사 퀀타매트릭스 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치
JP2015029431A (ja) * 2013-07-31 2015-02-16 大日本印刷株式会社 細胞培養容器
KR101711105B1 (ko) * 2016-04-21 2017-03-06 주식회사 퀀타매트릭스 신속한 항생제 감수성 검사를 위한 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7902746A (nl) 1978-05-26 1979-11-28 Biotest Serum Institut Gmbh Cultuurbeker voor het nemen van een monster en het bepalen van het kiemgetal.
SE460472B (sv) 1986-04-04 1989-10-16 Biodisk Ab Testbricka och saett foer att karaktaerisera biologiska material
GB8915938D0 (en) 1989-07-12 1989-08-31 Proteus Biotech Ltd Apparatus for microbiological testing
WO1992020359A1 (en) * 1991-05-14 1992-11-26 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Method and apparatus for in vitro fertilization
US5272084A (en) * 1991-12-18 1993-12-21 Corning Incorporated Cell culture vessels having interior ridges and method for cultivating cells in same
EP0962524B1 (de) * 1998-05-27 2004-11-03 Micronas GmbH Verfahren und Vorrichtung zur intrazellulären Manipulation einer biologischen Zelle
US6039804A (en) * 1998-09-09 2000-03-21 Emerald Biostructures, Inc. Crystallization tray
JP3736278B2 (ja) * 2000-04-12 2006-01-18 松下電器産業株式会社 生化学物質の観察方法
US6982171B2 (en) * 2002-03-12 2006-01-03 Surface Logix, Inc. Cell motility and chemotaxis test device and methods of using same
US20080207465A1 (en) * 2002-10-28 2008-08-28 Millipore Corporation Assay systems with adjustable fluid communication
US9637715B2 (en) * 2005-07-07 2017-05-02 Emd Millipore Corporation Cell culture and invasion assay method and system
US20080247915A1 (en) * 2007-04-05 2008-10-09 Genx International, Inc. Apparatus for the preparation of mammalian specimens for cryopreservation and/or vitrification, and for thawing and using susch specimens
WO2009032174A1 (en) 2007-08-30 2009-03-12 President And Fellows Of Harvard College Bio-matrix stretcher
WO2010047132A1 (ja) 2008-10-24 2010-04-29 株式会社クラレ 細胞培養キット、スクリーニング方法、及び細胞培養キットの製造方法
JP4724854B2 (ja) 2009-02-09 2011-07-13 大日本印刷株式会社 細胞培養容器
US9169460B2 (en) 2009-05-19 2015-10-27 Lifeglobal Group Llc Flooding dish and method for changing media in the dish in the preparation of mammalian specimen culture and for cryo-preservation, freezing, vitrification and the thawing and warming of such specimens
GB201010736D0 (en) * 2010-06-25 2010-08-11 Imp Innovations Ltd IWAP (Interwell assay plate)
US9260684B1 (en) * 2010-11-11 2016-02-16 Stemcell Technologies Inc. Cell culture device
KR101412083B1 (ko) 2012-07-24 2014-06-26 주식회사 새한마이크로텍 세포 배양 유닛, 세포 배양 장치 및 세포 배양 시스템
AU2014223300B2 (en) * 2013-02-26 2017-02-23 Ddnt Consultants Australia Pty Ltd Structure for culturing cells
KR20150101178A (ko) 2014-02-26 2015-09-03 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 격자로 형성된 복수의 세포 배양 웰 및 이를 연결하는 복수의 채널로 이루어진 유체 세포 배양장치
CN107109340B (zh) * 2014-10-29 2021-10-22 康宁股份有限公司 球状体捕获插入件

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR200325376Y1 (ko) * 2002-12-16 2003-09-04 신수 디스크확산원리를 이용한 항생제 감수성 검사에서 측정범위가 명기된 투명판
KR20130089619A (ko) * 2012-02-02 2013-08-12 주식회사 퀀타매트릭스 고형화제를 이용한 세균 고정, 약물 확산, 세균 단일 세포 추적과 이를 기반으로 한 빠른 약물 검사 시스템
KR101446526B1 (ko) * 2013-05-02 2014-10-08 주식회사 퀀타매트릭스 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치
JP2015029431A (ja) * 2013-07-31 2015-02-16 大日本印刷株式会社 細胞培養容器
KR101711105B1 (ko) * 2016-04-21 2017-03-06 주식회사 퀀타매트릭스 신속한 항생제 감수성 검사를 위한 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GALLO ET AL.: "Demonstration of Bacillus cereus in Orthopaedic-Implant-Related Infection with Use of a Multi-Primer Polymerase Chain Reaction-Mass Spectrometric Assay", J BONE JOINT SURG AM, vol. 93, 2011
GREGORY G. ANDERSON ET AL.: "Intracellular Bacterial Biofilm-Like Pods in Urinary Tract Infections", SCIENCE, vol. 301, 2003, pages 105

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11060054B2 (en) 2017-07-05 2021-07-13 SCREEN Holdings Co., Ltd. Specimen container
EP3425038B1 (en) * 2017-07-05 2022-01-26 SCREEN Holdings Co., Ltd. Specimen container
WO2019116775A1 (ja) * 2017-12-13 2019-06-20 株式会社日立ハイテクノロジーズ 細菌検査用抗菌剤導入プレート、および透明プレート
JP2019105572A (ja) * 2017-12-13 2019-06-27 株式会社日立ハイテクノロジーズ 細菌検査用抗菌剤導入プレート、および透明プレート
JP7076203B2 (ja) 2017-12-13 2022-05-27 株式会社日立ハイテク 細菌検査用抗菌剤導入プレート、および透明プレート
US11571698B2 (en) 2017-12-13 2023-02-07 Hitachi High-Tech Corporation Bacterial test plate having antibacterial agent introduced thereinto, and transparent plate

Also Published As

Publication number Publication date
EP3434370A4 (en) 2019-10-30
KR101711105B1 (ko) 2017-03-06
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