SE460472B - Testbricka och saett foer att karaktaerisera biologiska material - Google Patents

Description

J4f§óßr4r(2lfi§tjfÉ1gkfitl f ii; ' Ä Formen pa teethrickan.kan vara-fvrkantig, rund eller §““”¶ -oval, och urtagningarna i teetbrickan kan föreligga i olika ÉÜ i mönster. ,Föreliggande uppfinning är ej begränsad till någon Q eärekild form pa teetbrickan eller nagra särskilda mönster, i 5 enligt vilka_urtagningarna är gjorda i teetbrickan. I fig. 1 - visae nagra utföringeformer av teetbrickan enligt uppfinningen 'beteende av.ejölva teetbriekan A, en reagenezon B och en av- läeningezon C i¿varÄe¿urtagning.W I ,Formen'pafurtagningarna kan variera inom ramen för före- '10A liggande.uppfinning, ooh enligt en utföringeform är urtagnin- garna nvckelhaleformade, varvid den oirkelformade delen utgör reagenezon och den langetrackta delen utgör avläeningeron. I l_ en annan utföringeformiutgöree varje urtagning av en lang- É , sträckt del omfattande de bada ronerna, varvid det föreligger t 15 begräneningeklaokar mellan zonerna. I denna utföringeform kan ändarna av urtagningarna vara avrundade eller raka. I en annan utföringeform av uppfinningen utgöres varje urtagning av en fyrkantig reagenezon och en fyrkantig avläeningezon, vilka zo- ner är olika stora. I fig. 2 vieas nagra olika utföringeformer 20 av urtagningar enligt uppfinningen, och däri betecknas rea- genezonen med B, avläeningezonen med C och begräneningeklac- karna med D. Även andra former pa urtagningar kan användas en- ligt föreliggande uppfinning, och det som är av vikt är att bäraren för den aktiva eubatansen kvarhallee i reagenezonen. 25 Man kan exempelvis även ha zoner som är avemalnande.

Saeom vieae i fig. 3 kan urtagningarna vara utformade ea att reagenezon.och_avläeningezon ligger över varandra, d.v.e, i teetbrickane vertikalplan, eller efter varandra, d.v.e. i íï- teetbrickane horiaontalplan. Beteokningarna i figuren har ti- f 30 digare angiven betydeleef iAv'fig, 4.framgàr att avläaningezo- [Å inen kan vara täckt ovanifran. I denna figur har det omrade där ;É kommunikation mellan de bada zonerna föreligger erhållit be- N _teokningen E. , i A b :li V. , 'å _. '_Teethrickan är_lämpligen av nagot inert material,~eaeom 335Li nagon plaet eller glae, ooh den kan vara i ett etycke eller f,V¿göraa medfurtagningar, varefter eventuella begräneningsklaokar i if':seraçiekgivipvvagwyeian',vvlav: en. nyçngeinaieformad ' wn I ¶iiiJï> mezon"Broendenëavläeningezon C. Ii 10- 15 20 25 ' bada zonerna, a; \-: ; - W~~ w, . - .-.f..,,« H ..,-- f" ,, --V,..w',.~~w.... _, ._ Wwlw, á._Raí gág 46Üt472 freagenszonen B är anbringad en bärare F, som är impregnerad tïmed den substans vars minsta hömmandefkoncentrstion skall be- Vstämmasl En uppslamning G av mikroorganismer i substrat är 'jämnt fördelad över de bada ronerna B och C, och är saledes h-ovanpa.bäraren F.¿I fig. 6 visas resultatet efter inkubation, »varvid växt av mikroorganismen finnes vid H i avläsningszonen, fonder det att en_hämning av växten föreligger vid K. A, B och VC.har angiven betyde1se¿ De i figuren atergivna siffrorna är märkning av börarna; 1 detta fall anges antibiotikamängden pa frespektive bärare. Ds börare som är märkta med plus- respekti- ve minustecken utgör positiv respektive negativ kontroll.

A V Föreliggande uppfinning avser även sätt att karakterise- .ra biologiska materia1.medelst mikrobiologiska, immnnologiska och/eller biokemiska analyser, enligt vilket karakterisering- men genomföres i tva med varandra kommunicerande zoner, av vil- ka den ena är en reagenszon och den andra en avläsningszon, ett reagene pa en bärare anbringas i reagenszonen, och det biologiska material som skall karakteriseras fördelas över de varefter det hela blandas, fordras, och eventuell reaktion avläsas i avlösningazonen. I reagenszonentinföres reagenset pa en lämplig bärare, saeom en poröe eller icke-porös lapp, en pärla överdragen med erforder- lig mängd reagens, eller sa kan det tillföras i form av en inkuberas om sa er- tablett som innehaller erforderlig mängd reagens. Därefter pa- föres varje urtagning av det biologiska material som skall karakteriseras. Det biologiska materialet är i eller bringas till vätskeform och paföres lämpligen med pipett, varvid mank tillser att exakta mängder av material tillföras varje urtag- gning, Därefter roteras eller skakas tastbrickan försiktigt för att uonna Jämn blandning av reagene och biologiskt material i :khg¿¿ qrtagningen. Alltefter typ av karakterisering roteras, “{itskakas;Åoentrifogeraskooh/ellertinkuberss det hela under del öavwellergnnder hela reaktionenljvarefter resultatet i de olika urtašfikëššfinafavlösesj \ïfi>P"”“ ..,,.,f~t¶.w.,.,. 10, 15 20 25 _. « 1 .- - 040 Itt A Qcc eq- ,°_ Misamtldesin{ektionsmede1; antiseptikum och konserveringsmedel,' ;sasom kwäßrioker enligt föreliggande uppfinning kan således an- vändas vid karakterisering av biologiska material, sasom vid mikrobiologiska, immunologiska och biokemiska analyser, exem- pelvis koncentrationsbestämningar av ämnen vilka är aktiva mot mikroorganismer eller andra biologiska celler. Biologiskt Å material kan förutom mikroorganismer exempelvis vara andra biologiska celler, antikroppar, antigener eller enzymer, blod, serum eller annat biolooiskt material i vätskeform. Reagsnset utoöres av biologiskt eller kemiskt aktiva substanser, såsom antimikrobislla substanser, mikrobiologiskt aktiva substanser, substanser med inhiberande, letal, toxisk, mutagen eller växt- befrämjande effekt pä celler.“ ußrickor, vars urtaoningar ej är märkta, kan användas för olika-slags reagens i olika koncentrationer. De senare paföree med tillhjälp av lämpliga bärare, på vilka reagenset i önskad _koncentration finns anbringat. Bärare med reagene finns för- packade i separata enheter, och typ av reagens samt mängd an- ges lämpligen medelst märkning pa själva bäraren. Alternativt kan brickan (invid urtagningarna) förses med lämplig märkning för olika typer av analyser.

Ned uttrycket ”mikroorganism” avses bakterier, sasom en- terobacteriaceae, stafylokocker, streptokocker, hemofilus, neisseriaceae, bscteroides och clostridia, mykobakterier, samt svampar, såsom actinomyces, mycoplasma, nocardia, virus, mögelsvamp, Jästsvamp och candida.

Uttrycket “biologiska celler" omfattar cancerceller, vanliga humanceller, animaliska celler, insektceller och växt- _cel1er av "stamcelltyp".

Antimikrobiella substanser är antibiotika, exempelvis aminoqlykosider,yß-laktamantibiotika, makrolidantibiotika, polymykiner, polypeptider och andra ksmoterapeutika, sasom V,sul§onamiaer}Üantimykotika, t§sx.n5f§luorcytosin, amfotericin, ¿antivirala medel, såsom aoeninarabinosid (§ra4A>, trifluorty- ä'fiti#tas9ixu1ö¿Å~m§dè1j sas§m“i¿oaíg;¿s ash cvkisssrin, »=;1f@S“:h«=-¿¶i¶ ?1i,,1f#é s@=fl°1iÅ},¿=°h b°ofëflëpill=°fliumkla°=id i afcellerïäriantiçancermeoel,qexempelvis antracyk- gn§ssmÄginfihafisaisitašisxfifištai, toxisk eller muta- Hc no ropenaYm taoena ämnen, såsom dimetyl- 10 15 20 ^.nitroeamin, herbicider,;eåeom paráquat och pesticider Åsamtaineekticider,¿såsomidikofan (BDT) och klorokin.g 9 rm; , ror, vitaminer, kolhydrater och andra näringsämnen, olika -över natt) avläees resultatet, d.v.s. huruvida växt av mikro- _med att den antimikrobiella substansen föreligger i olika kon- Q_ scentrationer på märkta bärare i de olika urtagningarna är det :J jlätt att direkt fas ställa den minsta hämmsnde-koncentrationen ' ”fälld ' "m ”WP '” HW* " " ~v=~ww , _ . .vi -vrwn-ïfl-ïïíw ß ,. , ^ m - , _ , 1 A ß i* n4eß l72 lvfflikrobiologiekt aktiva substanser är, förutom angivna antimikrobiella ämnen, bakteriociner, t.ex. koliciner, enzy- mer; t.ex. peroxidaser, olika tillväxtfaktorer; såsom aminosy- kroppevätskor och komponenter-därav, såsom serum, blod och_ specifika komoonenter~i-serum; exempelvis 8-lysin. lßiologiebt abtivaisdbstanser är interferoner, såsom humaninterferonf'HuIFN-B,VIF4N-Bl enzymer, såsom B-laktamaser, proteaser och ureaeer, enzymepecifika eubstrat, såsom nitra- ter, ko1hydrater_och proteiner, B-laktamantibiotika, aminogly- koeideriochfkloramfenikol, antigen, såsom immunoglobuliner, «f polysackarider och toxiner från mikroorganismer. // Medelst sättet enligt föreliggande uopfinning kan man \ exempelvis bestämma minsta hämmande koncentration av en anti- mikrobiell substans. Bestämningen genomföras i två med varand- ra kommunicerande zoner, varvid den ena är en reagenszon och den andra en avläsningszon. I reagenszonen införas den anti- mikrobiella substansen på en lämplig bärare, såsom någon av de angivna. t.ex. en porös lapp. Därefter införes i varje urtag- ning en uppslamning av den mikroorganism. hetsbeetämmas. Uppslamningen är i ett lämpligt odlingsmedium.

Denna paföres lämpligen med pipett, varvid man tillser att varje som skall känslig- exakta mängder av mikroorganiem i substrat tillföres urtagning; Därefter vickae testbrickan försiktigt för att upp- nå jämn blandning av substansen och suepensionen av mikroorga- nismer i hela urtagningen¿ Efter inkubering organiemen föreligger eller-ej i de olika urtagningarna. I och '¿MningfenïÅ9ämPV§§ Ran men fortsätta med _” Ä ggugelífigsiggïiijçqšgicençgatviqnf msc) .' “ Tlbaíeättfëfinligtiettbav dessa ter men Iialjëomfflinnsgi¿dekelika4avläsningezoner- Dessa orover7§moae'på färskt od-_ _10 v15 20 25 ,meiibl§š¿,§B11§p§9§,l » t, »räv t,»4¿íÛ ¿4;ï2iAA,e.: * fibdf bfi~lingsmedium som finnes i urtagningar i en annan testbrieka ,§eller*strykas ut pa agarplattor¿*Efter inkubering avläees var! eventuell växt föreligger, och den minsta baktericida koncen- Vvcratisnen zußcá bestämmas, ett anna: Bartlet: bestämma mac ar n s , g att man efter MICfbestämningen.enligt ovan avlägsnar bäraren tmedfantimikrobiell substans från reagenszonen. Till nrtagning- engsöttes sedan ett Ämne som är inaktiverande för den antimik- 'robiella_substans som använts vid NIC-bestämningen, t.ex. ett "enzvm,,sasom ett ßëlaktamas i de fall ett 3-laktamantibiotikum fanväntsL Det inaktiverande ämnet tillföras lämpligen pa en bä- . rare, saeom~nagon av de angivna, till reagenszonen. Efter in- Vvkubering avläsas om växt föreligger eller ej och MBC bestäm- mes.A _ eVidare kan man medelst sättet enligt föreliggande upp- finning även identifiera mikroorganismer genom att bestämma deras biokemiska mönster medelst fermentation, oxidation eller assimilation av olika ämnen. I reagenszonen införas ett* _testämns med eller utan tillsats av andra reagens för pà- visande av reaktion, t.ex. en pH-färgindikator på en lämplig bärare, såsom en pärla överdragen med erforderlig mängd därav.

Därefter paföres varje_urtagning en uppslamning av den mikro- organism, vars biokemiska mönster skall bestämmas. Uppslam- ningen är i ett lämpligt odlingsmedium. Denna paföres exemr pelvis med pipett, varvid man tillser att exakta mängder av i odlingsmedium uppelammade mikroorganismer tillföras varje urtagning. För att uppnå en jämn blandning av ämnet och uppslamningen av mikroorganismer i hela urtagningen roteras eller skakas testbrickan försiktigt. Efter inkubering avläsas resultatet na olika sätt alltefter använd biokemisk reaktion.l _vAssimilationsmönster fastställes t.ex. genom förekomst eller frånvaro av.växt, medan fermsntations- eller oxidationsmönstsr kan indikeras med färgemslag hos en pHfindikator¿, VA>lmö5¥5WPel]pa ämnen'vid bestämning av assimilationsmöneter fg1yc¿šs1,f;y1¿t§i§§çn'giakonaç.'oçßßali '"”íça:5¿í§çert¿§a§m fenalröct, *Wiflbïèé 1§ë=åP1ii 9¿ a nPl r°m§vm9i ëàflfl;f$ÉêåEi§59¥å§§?§ï7§ë¥ fáÉ®§à¿¿#i°še' OC? °Xidfl~'¶ ,i ~"r<^*-" ß - os. oo _ eo 3:e oc. ef; sole UI _ _ 10 15 20 25 h) O 7 lg 4eo'472 Sättet enligt föreliggande uppfinning kan även användas för att karakterisera biologiska materials enzymmönster zymograml genom att.bestämma enzym/substratreaktionar, vari bestümningsn genomföras i de tva med varandra kommunicerande zonerna. I reagenszonen införes ett kromogent substrat, t.ex. ett naftalenderivat, pa en lämplig bärare, exempelvis i form av tablett som innehåller den erforderliga mängden kromogent subetrat. Därefter paföres varje urtagning en uppslamning av det biologiska material, vars zymogram skall bestämmas. Denna paföres lämpligen med pipett, varvid man tillser att exakta mängder av biologiskt material tillföras varje urtagning. Där- efter roteras testbrickan försiktigt sa att en jämn blandning av kromogent substrat och uppslamningen av det biologiska ma- terialet uppnås över hela urtagningen. Det hela inkuberas och därefter avläsas resultatet, d.v.s. huruvida färgomelag från enzym/substratreaktion föreligger eller ej i de olika urtag- ningarna. V Kromogena substrat som kan användas vid zymogramstudier är t.ex. kromogena naftalenderivat, såsom naftylfosfat för pa- visande av fosfataser, naftylbutyrat för pavisande av ester- assr, naftylmyristat för pavisande av lipaser, naftylamider för påvisands av arylamidaser och trypsin, naftylgalaktopyra- nosider för pavisande av galaktoeidaser, naftylglukopyranosi- der för pavisande av glukosidaeer, nitrocefin för pàvisande av B-laktamaser o.s.v.

Sättet enligt föreliggande uppfinning kan vidare använ- das för att karakterisera och kvantifiera olika biologiskt ak- tiva ämnen baserade på dess immunologiska egenskaper. Ett spe- cifikt antikroppa-latexkonjugat anbringas i reagenszonen och en uppslamning av det-biologiska material, vara serologiska mönster skall bestämmas, fördelas jämnt över de bada zonerna.

Därefter roteras brickan för att uppna en jamn blandning av reageneet och provet. En antigen-antikroppsrsaktion som resul- terar i aggkutïåation, dvs. klumpning kommer'att ske om provet 'innehåller antigen som är specifika för antikroppar som finns i¿} reagenset. Genom att använda en uppsättning av olika speci- fika antikropps-latexkonjugater kan t.ex. en bakteriestam serotypas, och exempel pa bakteriespecies som kan klassifice- ;_ras med serologiskt mönster är salmonella, ehigella, strepto- 10 15 20 25 30 35, i,,kooker.fPá motsvarande sätt som det här beskrivna kan man be-r ”stämman mängden 'antikfoppttr- i ett biologisktfmaterial genom att använda ett antigen-latexkonjugat. 4 I _Pa motsvarande sätt kan man bestämma den mängd av ett aktivt ämne som kan hämma en immunologisk reaktion. Bestämning av antibiotika i serum kan utföras med denna teknik..En be- stämd men varierande mängd av en antibiotikum-antikroppssnhet anbringas i reagenszonerna pa en lämplig bärare. Serumprovet eller en epädning därav, vars motsvarande antibiotikumkoncen- tration skall bestämmas, fördelas jämnt i de bada zonerna me- delst rotation av brickan. En bestämd mängd av det specifika antibiotiknm-proteinkonjugatet bundát till latsxpartiklar (antigenenhet) anbringas sedan till reagenszonerna, och för antigen-antikroppsreaktionen roteras brickan ytterligare.

Reaktionen mellan antigen och antikroppaenheter resulterar i 1 detta fail ett apati- agglutination. Tillsate av de ämnen, fikt antibiotikum, vars koncentration skall bestämmas och vil- ka har samma eller högre affinitet för antikroppsenheten, hindrar eller hämmar reaktionen mellan det latexbundna antige- net och antikroppsenheterna genom att binda till antikroppsen- heterna, vilket-resulterar i utebliven agglutination. Beroende pa mängden antibiotikum i provet hämmas agglutinationen i de olika urtagningarna upp till den maximala koncentrationen av antikroppsenheter som antibiotikaprovet totalt kan binda till.

När denna koncentration av antikroppsenheter överskrids, rea- gerar de nu överblivna fria antikroppeenheterna med antigenen- heterna och resulterar i agglutination. Vid avläsning av pro- vet jämflöres resultatet därav med t.ek. en standardkurva, som erhållits genom att den lägsta mängden av antibiotikum som hämmar olika koncentrationer av antikroppsenheter bestäms i förväg med etandardlösningar av detta antibiotikum.

Aktiva ämnen i biologiska vätskor som kan kvantifieras med en immunologisk teknik är antimikrobiella substanser, an- ütikroppar,'antigensr sasom toxiner och polysackarider fràn j mikroorgsniemer.h

Claims (12)

~š%fl"~'r' 'att den cirkelformade delen av urtagningen utgör reagenezon g yk ä n n eft e c kin a tu av att karakteriseringen genomföras i " furtagningar i en testbricka, vilka var och en omfattar tva Wf;till,varandra gränsande och med varandra kommunicerande zoner, 'ifvarvid den ena är en reagensáon och den andra en avläs- wyf v w -»~~ w www-Ü» » I f, W... .e ., ,...,,t... _ ,_ _ _ _ > v www w ..,,( .,,~ ...w-rm .. .wvw wVw, _ __, gnvv, 4¿o 47? Patentkrav

1. Testbricka för karakterisering av biologiska material Amedelst mikrobiologiska, immunologiska och/eller biokemiska analyser, i vilken testbricka ett flertal urtagningar finnes, k ä n n e t-e c k n^a d av att varje urtagning omfattar tva till varandra gränsande zoner, varav den ena är en reagenszon avsedd för anbringande av reagens på en bärare och den andra en avläaningszon, att formen pa reagenezonen är sadan att bäraren kvarhalles däri, teh att de bada zonerna kommunicerar med varandra sa att en jämn blandning av reagens och det biologiska material som skall karakteriseras kan uppnås i hela urtagningen.

2. , Testbricka enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att varje urtagning uppvisar en förträngning och att rea- gene- och avläeningezonerna är anbringade i testbrickans vertikalplan, aa att reagenszonen ligger över avläsningszonen, eller i testbrickane horieontalplan, sa att reagenssonen och avläeningszonen ligger efter varandra. '

3. Teatbricka enligt nagot av krav 1 och 2, k ä n n e - t e c k n a d av att urtagningarna är nyckelhàlsformade och och den langsträckta delen av urtagningen utgör avläsningszon, eller att varje urtagning utgöres av en langsträckt del om- fattande de bada zonerna och att det är begränsningsklackar mellan zonerna, eller att varje urtagning utgöres av en fyrkantig reagenszon och en fyrkantig avläeningszon och att de bada zonerna är olika stora, eller att varje urtagning är avsmalnande och att reagenszonen är i den bredare delen och avläaningezonen i den smalare delen av urtagningen.

4. Teetbricka enligt nagot av kraven 1-3, k ä n n e ~_ t e c k n a d av att den är i'ett stycke.

5. Sätt att karakterieera biologiskt material medelst mikrobiologiska, immunologiska och/eller biokemiska analyser, ningscon, att ett roagens pa en harare anbringas i reagens- ^ *° äviionen, att bäraren under reaktionen kvarhàlles i reagenszonen .det biologiska materialet utgöres av mikroorganismer, att det 'bestämmas och att reagenset är ett specifikt antikropp-latex- itestbrika enligt något av kraven 1-4. I \ 1, x K f tack vara dennas form, att reagens och biologiskt material blandas och jämnt fördelas°i hela urtagningen, och att eventuell reaktion avläsas i evläsningszonen.

6. Sätt enligt krav 5, k ä n n e tee c k n a t av att det är den minsta hämmande koncentrationen (MIC) och/eller den minsta bektericida koncentrationen (MSC) som bestämmes, att ,det biologiska materialet utgöres av mikroorganismer och att reageneet är en antimikrobiell substans.

7. Sätt enligt krav 5, k ä n n e t e_c k nga t av att är dessas biokemiska mönster som bestämmas och att reagenset är ett substrat.

8. Sätt enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att det är det biologiska materialets enzymmönster som bestämmas och att reagenset är ett kromogent substrat.

9. Sätt enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att det är det biologiska materialets immunologiska mönster som konjugat eller ett specifikt antigen-latexkonjugat.

10. Sätt enligt krav 5, k ä n n_e t e c k n a«t av att det är ett aktivt ämne i det biologiska materialet som bestäm- mes genom hämning av en specifik antigen~antikroppsreaktion, att reagenset består dels av en specifik antikroppsenhet mot det ämne som skall bestämmas och dels av ett specifikt anti- gen-letexkonjugat, varvid det aktiva ämne som skall bestämmas utgör antingen antikropps- eller antigendelen.

11. Sätt enligt nagot av kraven 5~10, k ä n n e - t e c k n a t av att reagenset anbringas i reagenszonen pa en lämplig bärare, såsom en porös eller icke~porös lapp, pärla eller i en tablett innehällande_reegenset.'

12. sätt enlig: mage: sv'krsvsn s-11, x ä n n 8 - t e cïk n a t av att bestämningen genomföras med hjälp av -u-nen-uun-u-u-unm-e--s--n--n--m