JPH02501349A - 試験器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 拭菫蓋。

本発明は微生物学的、免疫学的及び／又は生化学的分析による生物材料特性付は 用試験器に関する。更に、この発明は生物材料の特性付は方法に関する。

現在、例えば抗菌物質の最小阻止濃度はとりわけ多数の円形ウェルが存在するプ ラスチック試験プレートを介して行われる。これらの試験ウェル内に特性付けし ようとする抗菌物質の一連の希釈溶液が導入される。分析の際、抗菌物質は各ウ ェル内に溶液形態で導入して行われるか又は前もって各ウェルの底部に乾燥させ た状態で行われる。これらの決定において、各ウェルは別々の抗菌物質濃度を有 する。試験感度が鋭敏となるように培養媒質内で微生物の懸垂固定法が適用され る。この懸濁液の精確な均一量が各ウェルに添加され、その後全試験プレートが インキユベートされる。その後、各ウェルにおける微生物の増殖具合を観察し、 その結果を読取り、このような方法により濃度決定が行われる。

上記従来方式のものは種々の欠点を有する。抗菌物質は各ウェルの底部で乾燥せ しめられ、遷延貯蔵により物質が劣化することになるため、このように調整され たプレートの棚持ち寿命が短かなものとなる。更に、そのようなプレートにおい て抗生物質及び抗生物質濃度の選定が制限される。分析に伴って各ウェルに抗生 物質が添加されると、該物質の一連の希駅液の調整は非常に多くの手間を要する 。このような方法は多大な費用を要するとともに融通性に欠ける。

上記の種々の欠点は本発明の微生物学的、免疫学的及び／又は生化学的分析によ る生物材料特性付は用試験器により解消される。該試験器には複数のウェルが設 けられ、各ウェルは互いに連絡している、試薬ゾーンと読取りゾーンとの２つの 個別ゾーンから構成される。

上記試験器の形状は矩形、丸形又は長円形とされ、該試験器における各ウェルは 種々に設計される。この発明は試験器の特定形状とか該試験器内に形成される各 ウェルの特定設計に限定されるものではない。この発明の試験器は、第１図に幾 つかの実施例を示すように、試験プレートＡ、各ウェルの試薬ゾーンＢ及び読取 りゾーンから構成される。

各ウェルの形状は本発明の範囲内で種々に変形することができる。

１実施例において、各ウェルは鍵穴形状を有し、円形部分が試薬ゾーンであり、 伸長形部分が読取りゾーンである。他の実施例において、各ウェルは２つのゾー ンを形成する伸長部分から成り、該２つのゾーン間に複数の挟挿突起が配置され る。この実施例において、各ウェルの端部は丸味が付けられるか又は直線状とさ れる。この発明のもう１つの実施例において、各ウェルは互いに大きさが異なっ た、４角形の試薬ゾーンと４角形の読取りゾーンから構成される。

第２図は本発明のウェルを有する幾つかの実施例を示し、ここでＢは試薬ゾーン を、Ｃは読取りゾーンを、Ｄは挟挿突起を示す。この発明によれば、他の形状の ウェルが使用可能であり、活性物質のキャリアが試薬ゾーン内に保留されること は重要なことである。また、例えばテーパー状ゾーンを形成するようにしてもよ い。

第３図に示すように、各ウェルは試薬ゾーンと読取りゾーンが互いに積み上げら れた、即ち当該試験器の垂直平面内で重ね合わされた形状、又は互いに連続した 、即ち当該試験器の水平平面内で重ね合わされた形状とされる。図中の各符号の 意味は上述したと同様である。読取りゾーンは第４図に示すようにカバーを取り 付けるようにしてもよい。この図面において２つのゾーンの連結部は符号Ｅをも って示される。

上記試験器は好ましくは不活性材料、例えばプラスチ・ツク又はガラスからウェ ルを一体的に形成し、次いで挟挿突部が形成される。

第５図に、試薬ゾーンＢおよび読取りゾーンＣから成る、鍵穴形状を有するウェ ルの斜視図が示される。試薬ゾーンＢ内にキャリアＦが適用され、該キャリアＦ に抗生物質が含浸せしめられてその最小阻止濃度が判定される。微生物を媒質中 に懸濁せしめた懸濁溶液Ｇが２つのゾーンＢ及びＣにわたって均一に分配される とともにキャリアＦの頂部を被覆する。第６図に、インキュベーシヨン後の結果 が示される。該第６図において、読取りゾーンＨにおいて微生物の増殖が見られ たのに対し、読取りゾーンＫにおいては増殖が見られなかった。Ａ、Ｂ及びＣは 上述したとおりのものである。図中に示される数字はキャリアのマーキングであ る。この場合、抗菌量は各キャリア上に表示される。符号士又は−を付された各 キャリアはそれぞれ正又は負の制御を示す。

また、本発明は微生物学的、免疫学的及び／又は生化学的分析により生物材料を 特性付けする方法に関するものである。本発明によれば、特性付けは互いに連絡 された、試薬ゾーンと読取りゾーンの２つのゾーンにおいて行われ、試薬ゾーン 内のキャリアに試薬が塗布されるとともに特性付けしようとする生物材料が上記 ２つのゾーンに分配され、その後全体が混合され、所望であればインキュベート され、読取りゾーンにおいて当該試薬による反応が読取られる。

試薬は多孔又は無孔円板、ビーズ等の適当なキャリア上の試薬ゾーンに導入され て所定量の試薬が塗布され、又は所要量の試薬を含んだ圧縮錠剤の形態をもって 添加するようにしてもよい。その後、特性付けしようとする生物材料が各ウェル に加えられる。生物材料は液体中に存在するか又は液体中に移送され、好ましく はビペ・ｙ−）により各ウェルに精確な量が加えられる。その後、試験器は注意 深く回転又は振とうされ、全てのウェルにおいて試薬と生物材料との均質混合物 が得られる。試験器は分析形式に応じて全反応期間中又はその部分期間中、回転 され、振とうされ、遠心分離され及び／又はインキュベートされ、その後各ウェ ルにおける結果が読み取られる。

上記全操作工程は好ましくは自動化するようにする。器具は例えば活性キャリア を分配するようにすることができる。この器具はピペットにより自動的に試薬サ ンプルを移すようにすることもできる。

また、読取りは読取りゾーンを照明する適当な分光光度計機器を用いて行うこと ができる。

このように、本発明の試験器は微生物学的、免疫学的及び生化学的分析等におい て、例えば微生物又は他の生物細胞に対して活性である物質濃度の定量等、生物 材料の特性付けを行うのに用いることが出来る。生物材料は微生物の他、例えば 他の生物細胞、抗体、抗原、エンザイム、血液、血清又はその他液状生物材料で あってもよい。試薬は例えば抗菌物質とか微生物学的活性物質とか細胞に対し致 死、中毒、変異誘発抑制もしくは発育促進効果を有する物質等、生物学的又は化 学的活性物質から成る。

標識付けされていない複数のウェルを有する試験器は種々の試薬を異なった濃度 をもって使用することが出来る。試薬濃度を異ならしめるには適当なキャリアを 介して実行され各キャリアに所望濃度の試薬が塗布される。試薬と一緒にした各 キャリアは試薬の単位及び形式に区分して包装するとともに、好ましくは各キャ リア自体に所定標識を付して量を表示する。それとも、試験器の各ウェルは分析 型式毎に別々に標識付けするようにすることも出来る。

“微生物”とは腸バクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、ヘモフィルス、ナイセリ ア菌、バクテロイデス菌及びクロストリジウム菌等の細菌、ミコバクテリア、放 線状菌、マイコプラズマ、ノカルジア、糸状菌、酵母菌及びカンディダ等のウィ ルス及び菌類が含まれる。

“生物細胞”とは癌細胞、正常な人体細胞、動物細胞、昆虫細胞及び植物細胞が 含まれる。

抗菌物質は、例えばアミノグリコシド、ベータ（β）ラクタム抗菌物質、マクロ ライド系抗生物質、ポリミキシン、ポリペプチド及びその他スルフｔンアミド等 の化学療法剤等の抗生物質、例えば５−フルオロシトシン、アンホテリシン等の 抗真菌物質、例えばアデニンアラビノジッド（Ａｒａ　Ａ）　、トリフルオロチ ミジン等の抗ウィルス剤、例えばイン・ニアシト及びシクロセリン等の抗結核菌 剤、並びに消毒剤、例えばクロロへキシジン、エタノール及びペン４ｆ　／ｌ／ 　）ニウム塩化物等の防腐剤及び保存剤等である。

細胞に対し阻止性、致死性、毒性もしくは変異誘発性を有する物質は、例えばア ントラシフリン、マイトマイシン等の抗癌剤、例えばジメチルニトロサミン等の 発癌性／変異誘発性物質、例えばバラコート等の除草剤、農薬、並びに例えばジ コファン（ＤＤＴ）及びクロロキン等の殺虫剤である。

上述した抗菌性物質以外の微生物活性物質は、例えばコリシン等のバクテリオシ ン、例えばペルオキシダーゼ等の酵素、例えばアミノ酸、ビタミン、炭水化物及 びその他の栄養素の種々の生育要素、例えば血清、血液及び血清中の例えばベー タ（β）リジン等の特定組成物等の種々の体液及び生体組成物等である。

生物活性物質は、例えばヒトインターフェロン、ＨｕｌＦＮ−β、ＩＦ４Ｎ−β 等のインターフェロン、ベータ（β）ラクタマーゼ、プロテアーゼ及びウレアー ゼ等の酵素、例えば硝酸塩類、炭水化物、蛋白質、ベータ（β）ラフタン抗生物 質、アミノグリコシド及びクロラムフェニコール等の酵素特定基材、例えば免疫 グロブリン、多糖類、微生物からの毒素等である。

本発明の方法により、例えば抗菌物質の最小阻止濃度を決定することが可能であ る。この決定は互いに連絡された、一方が試薬ゾーン、他方が読取りゾーンであ る２つのゾーンにおいて行われる。抗菌物質は上述したように例えば多孔質ディ スク等の適当なキャリア上の試薬ゾーンに導入される。その後、感度を決定しよ うとする微生物懸濁液が各ウェルに導入される。この懸濁液は適当な培養媒質が 用いられる。これには好ましくは各ウェルにピペットを介して精確な量の微生物 基質が付与される。その後、この試験器を注意深く傾けて全ウェルにおいて抗菌 物質と微生物懸濁液との均一な混合が行われる。例えば、夜通し３７°Ｃにてイ ンキユベートを行い、その結果が、即ち各ウェルにおける微生物の生育阻止状況 が読み取られる。各ウェルにおいて各別の標識が付されたキャリアに互いに異な った濃度で抗菌物質が存在するから、該抗菌物質の最小阻止濃度を直接的に確立 することが容易である。

上述したような最小阻止濃度ＭＩＣ値から最小殺菌濃１ｉＭＢｃを決定すること が出来る。これは種々の方法で行われる。それらのうちの１つの方法では、上記 最小阻止濃度ＭＩＣを決定した後、種々の読取りゾーンに存在する物質から試料 が採取される。これらの試料は他の試験器における各ウェル内の新しい培養媒質 内に導入されるか又は寒天プレート上に拡散される。さらに、インキュベート後 、生育の存在が読み取られるとともに最小殺菌濃度ＭＢＣが決定される。この最 小殺菌濃度ＭＢＣを決定するもう１つの方法では最小阻止濃度ＭＩＣを決定した 後試薬ゾーンから抗生物質と一緒にキャリアが除去される。その後、ウェルに新 しい物質、例えばベータラクタム抗生物質が使用された場合におけるベータラク タマーゼ等の醇素を加え、最小阻止濃度ＭＩＣの決定に使用された抗生物質が不 活性化せしめられる。この不活性化物質は好ましくは前述したようなキャリヤ上 の試薬ゾーンに加えられる。インキュベート後、生育の存在が読み取られるとと もに最小殺菌濃度が決定される。

本発明の方法により種々の物質の発酵、酸化又は同化に基づき生化学パターンを 決定することにより微生物の固定を行うことが出来る。試薬ゾーンに、ビーズ等 の適当なキャリヤ上に所要量のｐＨ−色指示薬を塗布する等により所定の反応に 対する他の試薬を添加し又は添加することなく試験物質が導入される。その後、 各ウェルに、生化学パターンを決定しようとする微生物懸濁液が加えられる。こ の懸濁は適当な培養基を用いて作られる。この場合、ピペットを用いて培養基に 懸濁せしめられた微生物の正確な量が各ウェルに加えられる。全てのウェル内で 試験物質と微生物混濁液との均一な混合物を留置せしめるために、当該試験器は 注意深く回転または振盪される。インキュベート後、当該使用された生化学反応 に応じた種々の方法で結果が読み取られる。例えば生育／非生育を検出すること により同化パターンが確立される一方、発酵又は酸化パターンがｐＨ−指示薬の 色変化により表示することが出来る。

同化パターンの決定に用いられる物質は例えばグルコース、マンノース、ラクト ース、ラフィノース、メリビオース、七ロビオース、グリセロール、キシリトー ル及びグルコン酸塩等である。これらの物質は例えば発酵及び酸化研究用のフェ ノールレッド、ブロムチモールブルー、ブロモクレゾールパープル（ｇｒｏｍｏ ｃｒｅｓｏｌ）等の適当なｐＨ指示剤と組み合わせることが出来る。

本発明の方法はまた酵素／基質反応を決定することにより生物材料の酵素的パタ ーン、いわゆるザイモグラムを特性付けするのに使用することが出来る。この場 合、特性付けは互いに連絡する２つの領域内で行うことが出来る。適当なキャリ ア上に、例えば所望量の色素産生物質を錠剤状に形成して配置したナフタリン誘 導体等の色素産生物質を試薬ゾーンに導入する。次いで、ザイモグラムを決定し ようとする生物材料の懸濁液が各ウェルに加えられる。これは好ましくはピペッ トを用いて各ウェルに精確な量の生物材料が加えられる。次に、該試験器は注意 深く回転して全ウェルに色素産生物質と生物材料懸濁液との均質な混合物を得る 。次に、試験器はインキュベートされ、その後結果、例えば種々のウェルにおけ る酵素／基質反応の色変化が読み取られる。

ザイモグラム研究において使用できる色素産生基材は、例えばフォスファターゼ を検出するナフチルホスフェート、エステラーゼを検出するナフチルブチレート 、リパーゼを検出するナフチルミリステート、アリールラミダーゼ及びトリプシ ンを検出するナフチルアミド、ガラクトシダーゼを検出するナフチルガラクトピ ラノシド、グルコシダーゼを検出するナフチルグルコピラノシド、β−ラクタマ ーゼを検出するニトロセフイン等がある。

更に、本発明の方法は免疫学的特性に基づいて種々の生物学的活性物質の特性付 は及び定量化に用いることが出来る。所定の抗体−乳液コンジユゲートが試薬ゾ ーンに加えられるとともに血清学的パターンを決定しようとする生物材料懸濁液 が２つの領域に均一に分配される。次いで、この試験器を回転して試薬と試料の 均質な混合物を得る。もし、試料が抗原を含むならば、凝集した、即ち集塊した 抗原−抗体反応結果が現れ、試薬内に存在する抗体−コンジユゲートが特定され る。１セツトの種々の所定の抗体−乳液コンジニゲートを用いてバクテリア種属 が例えば血清型に基づいて決定され、各バクテリア種属試料が血清パターンを介 して例えばサルモネラ菌、赤痢菌及び連鎖球菌に分類される。同様に、抗原−乳 液コンジユゲートを用いて生物材料中の抗体の量を決定することが出来る。

以上のように、免疫反応を阻止するような作用物質量を決定することが出来る。

血清中の抗生物質は本発明方法により決定することが出来る。試薬ゾーンにおけ る適当なキャリアに種々の量の所定の抗生物質−抗体コンジユゲートが塗布され る。血清試料又はその希釈試料が決定しようとする抗生物質濃度に対応して２つ の領域に均一に分配されるとともに当該試験器を回転させて混合される。その後 、抗原単位の乳液粒子と結合された所定量の特定抗生物質−蛋白質コンジユゲー トが試薬ゾーンに加えられるとともに抗原−抗体反応のため当該試験器が更に回 転される。抗原及び抗体単位が反応して凝集する。この場合、所定１度を有しか つ抗体単位に対し同等もしくはそれより高い親和力を有した、決定しようとする 特定の抗生物質を添加し、抗体単位と結合させて凝集しなくなるようにすること により乳液状の結合された抗原及び抗体単位の反応を阻止又は禁止する。試料中 の抗生物質量に応じて、凝集は各ウェルにおいて抗生物質試料が最終的に結合し 得る抗体単位の最大濃度のぎりぎりまで阻止される。この抗体単位濃度が大きく なると、現在残存する自由抗体単位が抗原単位と反応して凝集することになる。

試料を読取り、その結果を標準曲線と比較する。該標準曲線は例えば当該抗生物 質の標準溶液を用いて種々の濃度の抗体単位を阻止する最小量を予め決定して得 られたものである。

免疫学的方法により定量化可能な生物材料中の活性物質は抗菌物質、抗生物質、 微生物からの毒素とか多糖類等の抗原体である。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、４ 国際調査報告　ＰＣＴ７ＳＵＩ−７，’Ｏ−、４：１９１＋ｌＩ’１ｍ＋４＋１ ＾１１１１１１・−”ＰＣ丁／Ｓｒ６？１００二１９

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．微生物学的、免疫学的及び／又は生化学的分析により生物材料を特性付けす るための試験器において、上記試験器に複数の試験ウェルを設け、上記各ウェル は個別のキャリヤ上にある試薬を適用するようにした試薬ゾーンと読取りゾーン との２つの隣接ゾーンから形成され、該２つのゾーンを互いに連絡して両ゾーン にわたり特性付けしょうとする生物材料を均一に分配するようにした、試験器。
2. ２．各ウェルの試薬ゾーンと読取りゾーン間に狭搾部を設け、これらのウェルを 、当該試験器の垂直平面内に配列して試薬ゾーンを読取りゾーンの上方に位置せ しめ又は当該試験器の水平面内に配列して試薬ゾーンと読取りゾーンとを互い違 いに位置せしめた、第１項記載の試験器。
3. ３．各ウェルは鍵穴形状に形成してその円形部を試薬ゾーンとするとともに伸長 部を読取りゾーンとし、又は各ウェルは２つのゾーン間に狭搾突部を設けて４角 形の試薬ゾーンと４角形の読取りゾーンとの２つの大きさの異なったゾーンから 成る伸長部を形成し、もしくは幅広部を試薬ゾーンとするとともに幅狭部を読取 りゾーンとするテーパー形状に形成した、第１項又は第２項に記載の試験器。
4. ４．一体的に形成した、第１項〜第３項のいずれかに記載の試験器。
5. ５．微生物学的、免疫学的及び／又は生化学的分析により生物材料を特性付けす るにあたり、 特性付けが互いに連絡されかつ隣接した、試薬ゾーンと読取りゾーンの２つのゾ ーンにおいて行われ、試薬ゾーン内のキャリアに試薬を適用するとともに特性付 けしょうとする生物材料を上記２つのゾーンに均一に分配し、この分配生物材料 を混合しかつ随意選択的にインキユベートし、読取りゾーンにおいて反応を読取 る、生物材料の特性付け方法。
6. ６．最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）及び／又は最小殺菌濃度（ＭＢＣ）が決定され 、生物材料が微生物でありかつ試薬が抗菌物質である、第５項記載の方法。
7. ７．生物材料が微生物から成り、それらの生化学パターンが決定されかつ試薬が 基材である、第５項記載の方法。
8. ８．生物材料の酵素パターンが決定されかつ試薬が色素産生基材である、第５項 記載の方法。
9. ９．生物材料の免疫学的パターンが決定されかつ試薬が特定の抗体−乳液コンジ ュゲート又は特定の抗原−乳液コンジュゲートである、第５項記載の方法。
10. １０．生物材料中の活性物質が特定の抗原−抗体反応を阻止することにより決定 され、試薬が部分的に決定しようとする物質に対する特定の抗体単位から成ると ともに特定の抗原−乳液コンジュゲートから成り、決定しようとする活性物質が 抗体又は抗原部分である、第５項記載の方法。
11. １１．試薬が試薬ゾーン内に設けられた、多孔質もしくは無孔質ディスク、ビー ズ等の適当なキャリヤに塗布されたもの、又は当該試薬を含む錠剤である、第１ 項〜第１０項のいずれかに記載の方法。
12. １２．第１項〜第４項のいずれかに記載の試験器により決定が実行される、第５ 項〜第１１項のいずれかに記載の方法。