WO2021177531A1 - 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치 - Google Patents

고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치 Download PDF

Info

Publication number
WO2021177531A1
WO2021177531A1 PCT/KR2020/013587 KR2020013587W WO2021177531A1 WO 2021177531 A1 WO2021177531 A1 WO 2021177531A1 KR 2020013587 W KR2020013587 W KR 2020013587W WO 2021177531 A1 WO2021177531 A1 WO 2021177531A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fluid
well
sub
cell culture
thin film
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/013587
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
임태근
이기윤
김정수
김동영
Original Assignee
주식회사 퀀타매트릭스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 퀀타매트릭스 filed Critical 주식회사 퀀타매트릭스
Priority to EP20923237.0A priority Critical patent/EP4006137A4/en
Publication of WO2021177531A1 publication Critical patent/WO2021177531A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/40—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/44—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of volume or liquid level
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0689—Sealing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/12—Specific details about manufacturing devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0472—Diffusion
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells

Definitions

  • the technology disclosed in the present specification relates to a rapid cell culture test device capable of preventing the escape of a solidified fluid, and more particularly, a cell culture test for easy accurate observation because it can prevent the escape from within the well of the chip during fluid dispensing. It's about the device.
  • Antibiotic susceptibility test generally determines whether or not the causative bacteria are grown in microwells in which the culture medium and antibiotics are mixed at various concentrations for about 18 hours by light transmittance. Many products are being developed for
  • microfluids are dispensed and disposable plastic plates with micro-scale structures that can be adjusted to a desired shape and sequence are rapidly introduced. is a trend to
  • the present applicant has developed an antibiotic susceptibility test system that determines whether or not the growth of bacteria is performed by microscopic imaging by introducing such a microfluidic plate.
  • the previously injected fluid may escape due to the sequential injection of the fluid, which may distort the antibiotic susceptibility test result, so a new solution is needed.
  • the present invention is to provide a cell culture test apparatus that can prevent separation from within the well of a chip during fluid dispensing, so that accurate observation is easy.
  • a cell culture test apparatus having a plurality of well units, the well unit comprising: an inlet for injecting a first fluid and a second fluid; and a bottom in which a first sub-well including a first fluid accommodating part for accommodating the first fluid is formed, the first fluid accommodating part; A rim groove capable of accommodating a portion of the first fluid is formed along the outer peripheral surface of the lower end; Or it provides a cell culture test device that increases in diameter in the direction from the upper end to the lower end.
  • the first fluid receiving unit may prevent the solidified first fluid from being moved or dropped by the supply of the second fluid.
  • the edge groove may be formed with a thickness of 1 ⁇ 2000um and a width of 300 ⁇ 2000um.
  • the cell culture test apparatus may include a rear bonding means for preventing leakage of the first fluid in the rear portion.
  • the back bonding means may be an optically transparent film.
  • the rear bonding means may include a pressure control channel for facilitating the injection of the first fluid into the first fluid receiving part and the edge groove.
  • the bottom part may accommodate the second fluid and may include a second sub-well for loading an antibiotic at a specific location.
  • the well unit since there is a stepped portion protruding in the center direction of the well unit along the periphery of the inner wall of the well unit, the well unit may have a lower end having an inner width narrower than the upper end of the inlet portion. .
  • the step portion may have an angle of 90 degrees or more with respect to the forward direction of the second fluid to prevent vertical advancement from the bottom when the second fluid is injected.
  • the step portion may have a shape of a corner connected along the circumference of the inner wall.
  • the height of the step portion may be less than or equal to the distance from the inner edge of the bottom portion to the center of the bottom portion.
  • the inner corners of the bottom portion formed by the bottom portion and the inner wall of the unit may have an angle of 70 to 120° with respect to the bottom portion.
  • a method for analyzing cells using a cell culture test apparatus having a plurality of well units comprising: an inlet for injecting a first fluid and a second fluid; and a first sub-well having a first fluid accommodating part for accommodating the first fluid and a bottom part having a second sub-well for accommodating a second fluid and for loading an antibiotic, wherein the first fluid is accommodated
  • the part is formed with an edge groove that can accommodate a portion of the first fluid along the outer peripheral surface of the lower end; or an increase in diameter from an upper end to a lower end, (a) injecting the first fluid into the first sub-well, and solidifying the mixed solution to form a solid thin film; (b) injecting the second fluid into the second subwell to disperse or dissolve the antibiotic, and injecting the second fluid up to the well unit above the second subwell to form a solid thin film of the first fluid inside the first subwell diffusing the antibiotic into the solid thin film by contacting it with and (c)
  • the rapid cell culture test apparatus capable of preventing the escape of the solidified fluid according to the present invention can prevent the detachment of the solidified thin film as much as possible after the injection of the fluid, so that it can perform an accurate test compared to the existing antibiotic test apparatus. , the antibiotic behavior is observed using cells fixed in a solid thin film, enabling rapid antibiotic susceptibility testing compared to existing devices.
  • the rapid cell culture test apparatus capable of preventing the escape of the solidified fluid according to the present invention can generally observe the growth change of single cells within several tens of minutes (usually 30 minutes), and Because changes in a single colony of bacteria can be observed within 4 to 6 hours, the effect of bioactive substances on biological substances can be confirmed more accurately and quickly compared to conventional methods.
  • the rapid cell culture test apparatus capable of preventing the escape of the solidified fluid according to the present invention observes the change of biological material with respect to the physiologically active material in a single cell population unit to obtain a minimum inhibitory concentration (MIC) or minimum As the biofilm eradication concentration (Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC) can be measured, it can be very usefully used not only for antibiotic susceptibility tests but also for biofilm assays.
  • MIC inhibitory concentration
  • MBEC Minimum Biofilm Eradication Concentration
  • FIG. 1 shows an embodiment of a cell culture test apparatus.
  • FIG. 2 shows a cross-section of a well unit of a cell culture test device according to an embodiment of the technology disclosed herein.
  • FIG. 3 shows a solid thin film used in a conventional well, (a) is a cross-section and photograph of the solid thin film existing in place, and (b) is a cross-section and photograph of the solid thin film separated by an external force, respectively.
  • FIG. 5 shows the movement of the mold when manufacturing the well unit.
  • (a) shows a case in which the same mold as the conventional method is used, and
  • (b) shows a case in which a mold modified according to the shape of the undercut is used.
  • FIG. 6 is a view showing the structure of the sacrificial groove according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 (a) shows a fluid that is not evenly spread on a part of the inner wall due to surface tension, (b) is a cross section of each.
  • FIG. 10 is a diagram schematically illustrating a fluid movement pattern in a step portion.
  • FIG. 11 schematically shows the behavior when a fluid is injected into the well unit.
  • FIG. 12 is a diagram schematically illustrating the behavior of the fluid according to the presence or absence of a stepped portion when the fluid is injected into the well unit.
  • each process constituting the method may occur differently from the specified order unless a specific order is clearly described in context. That is, each process may occur in the same order as specified, may be performed substantially simultaneously, or may be performed in the reverse order.
  • a cell culture test apparatus having a plurality of well units is provided.
  • 1 shows an embodiment of a cell culture test apparatus.
  • Figure 1 (a) is a view showing the overall configuration of the cell culture test apparatus, (b) is an enlarged part of the cell culture test apparatus, (c) shows a cross section of the well unit.
  • a plurality of the well units 110 may be aligned to have a standard similar to that of a commercial multi-well plate as a whole.
  • the center of the well unit 110 may coincide with the center of a commercial multi-well.
  • the well unit 110 includes an inlet part 120 for inputting the first fluid and the second fluid, and a bottom part 130 having the first sub-well 132 and the second sub-well 134 .
  • the first sub-well 132 includes a first fluid accommodating part for accommodating the first fluid, and along the outer peripheral surface of the lower end of the first fluid accommodating part, an edge groove 150 for accommodating a portion of the first fluid is provided. exist.
  • multi-well plates are a standard tool for processing and analyzing large numbers of samples.
  • Multi-well plates can take a variety of shapes, sizes, and shapes, and are generally made of standard sizes and shapes and have a standard arrangement of wells.
  • the plurality of well units is a 96-well plate (12x8 well array), 384-well plate (24x16 well array), and 1536-well plate (48x32 well array). It may have a standard well arrangement, and may have the same or similar arrangement as a commercial multi-well plate of various other methods. Since the cell culture test apparatus 100 has the same or similar specifications as a commercial multi-well plate, it can be easily compatible with various conventional biological analysis techniques. Accordingly, in the present invention, the plurality of well units may have a well arrangement of 1x1, 1x2, 1x4, 2x4, 4x6, 12x8, 24x16, or 48x32.
  • the inlet part 120 is usually located on the top of the well unit 110 and may have an open front or a partially open shape.
  • the inlet portion 120 may have a single or a plurality of openings.
  • the first fluid and the second fluid may be introduced into the well unit 110 through the inlet part 120 by pipetting or injection.
  • the bottom part 130 has a first sub-well 132 recessed in the depth direction, and the first sub-well 132 is a first fluid for receiving the first fluid introduced through the inlet part 120 . It may include a accommodating part 135 . It is also possible to directly inject the second fluid into the inlet part 120 , but preferably, a second sub-well 134 is installed in the bottom part of the inlet part 120 to prevent the second fluid introduced through the inlet part 120 . At least some of them can be accommodated.
  • the first sub-well 132 may have a circular or oval cross-section
  • the second sub-well 134 may have an oval or crescent-shaped cross-section.
  • the diameter of the first sub-well 132 is substantially limited to 2/3 of the diameter of the bottom part 130 .
  • the first sub-well 132 is manufactured to have an elliptical cross-section, a wider field of view can be secured without changing the size of the second sub-well 134, and the second sub-well 134 is formed to have an oval or crescent shape.
  • the diameter of the first sub-well 132 can be made larger while maintaining the capacity of the second sub-well 134 .
  • first sub-well 132 and the second sub-well 134 may be physically separated through the separation barrier rib 142 .
  • the separation partition wall 142 serves to separate the first sub-well 132 and the second sub-well 134 in the horizontal direction, but does not physically separate in the vertical direction, so that when the second fluid is supplied A second fluid may be supplied to the first sub-well through an upper portion of the separation partition wall.
  • the height of the separation barrier is the side surface of the first sub-well 132 and the second sub-well 134 . It is desirable to have a height similar to the wall.
  • the first fluid and the second fluid may typically contain 70 to 99% by weight of water, preferably 85 to 99% by weight, and most preferably 93 to 99% by weight of water as a dispersion medium or solvent.
  • the first fluid may be a mixed solution of a liquid medium containing a gelling agent and a biological agent. Within the above range, water may exhibit optimal performance as a dispersion medium.
  • the liquid medium may contain water and may be solidified by the presence of a solidifying agent.
  • the solidifying agent include agar, agarose, gelatin, alginate, collagen, and fibrin.
  • agar or agarose may be used.
  • 0.3 to 4 wt% of agar may be used in the liquid medium.
  • the liquid medium does not require nutrients, but in some instances, it may contain nutrients, and may be a solution containing a medium that promotes the division of specific cells. If the agar is included in an amount of less than 0.3% by weight, solidification may not be made, and if it exceeds 4% by weight, diffusion of the biological material may not be easy due to excessive solidification.
  • the biological material includes viruses, bacteria, fungi, algae, protozoa, parasitic pathogens, human or mammalian cells and biofilms, and the like.
  • the biological material may be a mixture of a biological material exhibiting infectivity, such as bacteria, viruses, fungi, and the like, and blood cells.
  • it may be blood from a person infected with bacteria. have.
  • the biological material may grow in a liquid or solid medium, and growth may be affected by the type and concentration of an external physiologically active material. the mixing
  • the density of the biological material in the solution may be 10 2 to 10 10 cells/ml, preferably 10 4 to 10 9 cells/ml, more preferably 10 5 to 10 8 cells/ml. Below the above range, it may be difficult to determine the location of the biological material, and above the above range, it may be difficult to determine the state of the individual biological material.
  • the antibiotic may be in a dried state.
  • a solvent for dissolving the dried antibiotic water, a cell culture medium, dimethylformamide (DMF), and dimethyl sulfoxide (DMSO) may be used.
  • the solvent for dissolving the antibiotic may be introduced while pipetting in order to completely dissolve the antibiotic in the solid form and to have a uniform concentration of the solution after dissolution.
  • the antibiotic can be dried by using without limitation as long as it is a drying method that does not decrease the efficacy, but it can be dried using heat drying, freeze drying, or reduced pressure drying, and most preferably, it can be dried by heating drying.
  • the antibiotic may be dried using the drying method as described above and then injected into the bottom portion or the first sub-well, and then the antibiotic solution is injected into the bottom portion or the first sub-well and then dried using the drying method. It is also possible to do
  • the antibiotic is dried in the second sub-well.
  • the second fluid is injected into the second sub-well to dissolve the antibiotics present in the second sub-well and fill the well bottom 130 and the well bottom 112 .
  • the second fluid may be a solution containing an antibiotic or a solvent dissolving the antibiotic.
  • the second fluid containing the antibiotic may be loaded in the second sub-well 134 .
  • the volume of the second sub-well 134 may vary depending on the scale of the target system, but may be 1 ⁇ l to 50 ⁇ l, which is an achievable range. If the volume of the second sub-well is less than 1 ⁇ l, the size of the well may be reduced, which may make pipetting and drying difficult, and if it exceeds 50 ⁇ l, the efficiency may decrease as the amount of required samples and reagents increases.
  • FIG. 2 shows a cross-section of a well unit of a cell culture test device according to an embodiment of the technology disclosed herein.
  • (a) of FIG. 2 is a top down view of the well unit 110 of the cell culture test apparatus, and FIG. 2 (b) shows a cross-section A-A' of (a).
  • the first sub-well 132 is for accommodating the first fluid, and may be in the form of a well having a space of sufficient size.
  • the volume of the first sub-well 132 is not particularly limited, but may have a size sufficient to observe the reaction for a long time after the injection of the first fluid, and may be, for example, 1 ⁇ l to 50 ⁇ l. If the volume of the first sub-well is less than 1 ⁇ l, it may be difficult to observe smoothly due to a decrease in the size of the well, and if it exceeds 50 ⁇ l, efficiency may decrease as the amount of required samples and reagents increases.
  • the first sub-well 132 includes a first fluid accommodating part 135 for accommodating a first fluid, and along the outer peripheral surface of the lower end of the first fluid accommodating part, the first It is that it has a rim groove 150 that can accommodate a part of the fluid or that the first fluid accommodating part 135 is installed such that the diameter increases from the upper end to the lower end.
  • the edge groove 150 is located in a portion not observed when looking down the sub-well from the top, but can accommodate a portion of the first fluid supplied to the first sub-well 132 .
  • the shape of the well is configured so that the upper end does not have a wider undercut shape than the lower end.
  • it is easy to remove from the mold after injection molding and has the advantage of minimizing damage during removal.
  • the bottom surface is chemically treated or protrusions are formed on the bottom and wall surfaces to prevent drop-off due to friction.
  • the method of chemical treatment can affect the cells to be tested, and it is known that the effect is not so great. may appear.
  • a portion of the first fluid supplied to the first fluid accommodating part of the first sub-well 132 may be accommodated in the edge groove 150 , and then the first fluid is solidified.
  • the first fluid inside the edge groove 150 may also be solidified.
  • the edge groove 150 may be formed in a size of 1 to 2000um in thickness and 300 to 2000um in width.
  • the movement of the solid thin film is prevented by the first fluid flowing into the edge groove 150, but when the edge groove 150 is manufactured below the above range, this movement and drop-off prevention effect falls, and when the edge groove 150 is manufactured with a size exceeding the above range, the amount of the sample required for inspection increases as the amount of the first fluid flowing into the edge groove 150 increases, which is inefficient.
  • the diameter may be increased in the direction from the upper end to the lower end.
  • the first fluid accommodating part 135 is a space for accommodating the first fluid supplied to the first sub-well 132, and as shown in FIGS. 2 and 3, the diameter of the lower end is larger than that of the upper end.
  • the first fluid serves to prevent the solid thin film from moving upward or from leaving.
  • the first fluid accommodating part 135 may be formed in a circular shape or an elliptical shape in the same manner as the first sub-well 132 .
  • the wall surface of the first fluid accommodating part may be manufactured to have a reverse inclination of 1 to 80° with respect to a vertical line.
  • the wall surface of the first fluid accommodating part has a reverse inclination of less than 1°, there is no effect of preventing separation of the solid thin film. It may not be easy to observe.
  • the diameter of the lower end of the first fluid accommodating part 135 and the rim groove are larger than the upper end of the first fluid accommodating part. Therefore, it has an undercut shape and has a disadvantage that it is difficult to manufacture only by injection molding. This is possible.
  • FIG. 5 in the case of manufacturing the lower mold in the conventional way (FIG. 5 (a)), the mold separation of the first fluid receiving part and the mold of the edge groove part becomes larger than the upper part by the undercut.
  • FIG. 5 in (b) of FIG. 5 , when the first fluid receiving part and the edge groove part are molded into the lower mold and manufactured, the mold can be separated without an undercut part.
  • the cell culture test device manufactured in this way has a shape that cannot accommodate the first fluid because the lower ends of the first fluid receiving part 135 and the edge groove 150 are exposed to the outside, but the first fluid on the rear side of the cell culture test device.
  • a rear bonding means 160 for preventing leakage of the first fluid accommodating part 135 and the edge groove 150 may be manufactured to accommodate the first fluid.
  • the bonding means 160 may be manufactured to have the same size as the rear surface of the well plate and to bond the rear surface of each well unit at a time, and may be manufactured to fit the size of each well unit to form each well unit. It is also possible to use and manufacture to bond separately.
  • an optically transparent film as the bonding means.
  • the rear bonding means may include a pressure control channel.
  • the pressure control channel is used as a passage for gas present in the first fluid receiving part and the edge groove when the first fluid is injected, and the pressure control channel communicates with the first fluid receiving part or the edge groove and is exposed to the atmosphere.
  • the air inside may be discharged to the outside.
  • the pressure control channel communicates with the edge groove.
  • the pressure control channel and the first fluid receiving part or the edge groove are connected by a capillary valve.
  • a portion of the first fluid may be injected into the pressure control channel when the first fluid is injected.
  • the thickness of the solid thin film generated by the solidification of the first fluid may vary, and in this case, the analysis may be affected.
  • a capillary valve is formed between the pressure control channel and the first fluid receiving part or the edge groove so that the same amount of the first fluid is always present in the first fluid injection part, and the pressure control channel and the first fluid receiving part or the edge groove. It is preferable that the first fluid does not flow into the pressure control channel while discharging the contained air. That is, the thickness and width of the capillary valve 160 are controlled to maintain the capillary phenomenon, and may typically have a thickness of 1 ⁇ m to 500 ⁇ m and a width of 200 ⁇ m to 2 mm. When the capillary valve is within the above range, the first fluid does not flow into the pressure control channel and only air can be discharged. However, when the capillary valve is within the above range, the air is not smoothly discharged, and when it exceeds the above range, the first fluid is may be introduced into the pressure control channel.
  • the first fluid which is a mixed solution of a liquid medium containing a gelling agent and a biological agent, is introduced into the first fluid receiving part located below the first sub-well 132 and then solidified, thereby causing biological Substances, such as bacteria, may be immobilized within the gel matrix.
  • the second fluid is introduced through the inlet part 120 to dissolve the antibiotic, and as the volume of the second fluid gradually increases, the gel matrix filled in the first sub-well 132 and the lower part of the well unit 110 are filled. to form an interface.
  • antibiotics are diffused into the gel matrix through the interface and the susceptibility to antibiotics can be observed under a microscope by observing the growth changes of the bacteria immobilized in the gel matrix.
  • the supplied first fluid forms a solid thin film through the solidification process as described above.
  • an external force along with the first fluid solidified in the first fluid receiving part By this, the solid thin film may serve as a fixture to prevent escape.
  • the fluid supplied to the first sub-well is supplied to the first fluid accommodating part located at the lower end of the first sub-well and the edge groove formed on the outer circumferential surface.
  • the first fluid receiving part is manufactured to have a larger diameter than the upper part as described above, the solid thin film solidified as described above cannot escape in the inlet direction.
  • the first fluid fills the edge groove using capillary action and surface tension.
  • the first fluid supplied to the first sub-well and the edge groove is then solidified to form a solid thin film. At this time, it is solidified together with the first fluid injected into the edge groove, and serves to fix the solid thin film.
  • the injection direction of the fluid coincides with the direction of the interface between the solid thin film and the wall surface of the well unit, so the movement and drop-off of the solid thin film by the second fluid is much In some cases, accurate image acquisition was difficult because the second fluid was introduced to the lower part of the solid thin film.
  • the bottom surface of the well unit may be made of an optically transparent material so that the object in the first fluid can be observed through the bottom surface of the place where the first sub-well 132 is located for microscopic observation.
  • the bonding means since the bonding means forms the bottom of the first sub-well, optical observation is easily possible when the bonding means is made of a transparent material.
  • the bonding means may be a polymer resin such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polymethacrylate, or polycarbonate.
  • the bonding means may be an optically transparent film.
  • the film may be an optically transparent film such as polyethylene, polyvinyl chloride, polystyrene, or the like.
  • the well unit part of the cell culture test apparatus may be manufactured by injecting a polymer resin.
  • an adhesive for bonding the bonding means and the well plate may be used.
  • the adhesive when it comes into contact with the first fluid, it may affect the experimental results. In order to minimize this, it is preferable to install a sacrificial groove on the outer peripheral surface of the edge groove 150 .
  • the sacrificial groove is manufactured higher than the edge groove 150 to form a capillary valve so that the first fluid filling the edge groove is difficult to escape. Therefore, it is possible to block the case where the first fluid and the adhesive come into direct contact, and stable loading is possible (see FIG. 6 ).
  • a stepped portion 140 protruding toward the center of the well unit 110 along the circumference of the inner wall of the well unit 110 .
  • the well unit 110 has a lower end 112 having a narrower inner width than the upper end 114 on the inlet 120 side.
  • the step portion 140 has a shape of a corner connected along the circumference of the inner wall.
  • the function of the step 140 may be specifically described as follows.
  • Fig. 7 (a) shows a fluid that is not evenly spread on a part of the inner wall due to surface tension, and (b) shows a cross section thereof.
  • the fluid when the second fluid is trapped in a part of the structure in a form opposite to the intended and does not spread evenly, the fluid has a form with a higher ratio of length to width, and has a form that is tilted toward the lower end rather than the upper end due to the influence of gravity.
  • the interface between the fluid and the structure can be viewed as having a sharp shape due to the low contact angle (FIG. (b)).
  • the contact angle of the surface of the structure to the fluid be maintained within 90 degrees, and the surface tension of the fluid is the strongest except for some fluids. It is preferable to have a case where it is lower than or equal to the surface tension of water. More specifically, it is preferable to have a contact angle of 10 degrees or more and 90 degrees or less. In addition, it is preferable that the density is 0.1 g/mL or more and 10 g/mL or less, the viscosity is 0.1 mPa/s or more and 10 mPa/s or less, and the volume is 10 ⁇ l or more and 200 ⁇ l or less.
  • the fluid may act to completely spread over the structure, and a fluid exceeding the above range may not spread evenly over the structure.
  • the surface tension, density, and viscosity of the fluid are similar to those of water (72 dyne/cm, 1 g/mL, 1 mPa/s), the contact angle is 50 degrees, and the volume is approximately 100 ⁇ l.
  • the fluid When the contact angle is about 50 degrees, the fluid does not spread slightly on the surface of the well unit structure but aggregates in a round shape. As shown in FIG. 8 , an effect of lowering the contact angle between the fluid and the surface of the structure occurs at the edge where the two surfaces of the structure meet, thereby allowing the fluid to spread to a greater distance.
  • the contact angle ⁇ between the fluid and one surface is within the Concus-Finn range (for example, when the two surfaces form an angle of 90 degrees, the contact angle between the fluid and one surface is within 45 degrees)
  • the fluid is It moves an infinite distance along the edge.
  • the contact angle ⁇ ′ between the fluid and the two surfaces at the edge can be calculated according to Equation 1 below.
  • Equation 1 the contact angle ⁇ always has a value smaller than the contact angle ⁇ , which can be confirmed in Equation 2 below.
  • the inner corners of the bottom formed by the bottom and the inner wall of the unit have an angle of 70 to 120° with respect to the bottom.
  • the angle of the inner corner is less than 70°, the size of the right side of the inlet is small, making it difficult to inject the fluid, and the size of the well unit is small, making it difficult to conduct a smooth inspection. Since the moving distance of the fluid moving along with it is shortened, injection of the fluid may not be smooth.
  • the fluid injected into the well unit 110 rises up the wall due to the surface tension, and the height is determined in balance with the gravity of the fluid (FIG. 9).
  • the length of the section (a, b in FIG. 11 ) formed by the fluid on the wall surface and the bottom surface increases with the volume of the fluid and is affected by gravity. Therefore, the length of the section formed by the fluid on the wall surface and the floor surface forms a relationship of a ⁇ b.
  • the role of the first step is to reduce the surface area occupied by the fluid by interfering with the vertical advancement of the fluid and to increase the effect of gravity to apply a force in the horizontal direction of the fluid and to further advance it.
  • the shape to which the fluid is added may be inclined in the horizontal direction.
  • the advancing direction of the solution is limited to the opposite direction of the step, so it is preferable to apply the above design when the height (b′) of the first step is smaller than the length (a′) of the radius of the bottom surface do. That is, the relation 0 ⁇ b ⁇ a ⁇ is established.
  • the fluid can be sufficiently spread without a step difference, and accordingly, the height (b′) of the first step portion is preferably lower than h in Equation 4 (ie, b′ ⁇ h).
  • h may have a different value depending on each fluid, but in the case of water, it is about 4 mm, so in the present invention using a first fluid having a similar or lower h value to water, the height (b ⁇ ) of the first step is 4 mm or less. it is preferable
  • the height of the first step may vary depending on the volume of the second fluid, assuming that the volume of the second fluid is 100 ⁇ l and the diameter of the bottom surface of one well is approximately 8 mm to constitute a 96-well plate, the first step It can be seen that the height of the part is at least 0.5 mm. If it is assumed that the volume of the second fluid is 10 ⁇ l and the diameter of the bottom surface of one well is 4 mm to constitute a 384-well plate, it can be seen that the height of the first step is 0.2 mm. Therefore, it is preferable that the height (b') of the first step portion is 0.2 mm or more.
  • the height of the step portion is preferably 0.2 to 4 mm.
  • the step has a height of less than 0.2 mm, there is no advantage of using the step because the second fluid fills the upper part of the step. there may not be
  • the flow of the fluid above a certain height is blocked by the step portion and at the same time, the fluid moves quickly through the bottom inner edge.
  • the fluid can be dispensed evenly and quickly.
  • the thickness and width of the solid thin film are determined according to the width of the first sub-well and the amount of the first fluid injected.
  • the term "thin film” is not particularly limited in thickness as long as it can be observed as a single cell unit by fixing the biological material, but generally 1 ⁇ m to 5 mm, or 1 ⁇ m to 3 mm, or 1 ⁇ m to 2 mm, or 1 ⁇ m to 1.5 mm, or 1 ⁇ m to 1 mm, or 1 ⁇ m to 800 ⁇ m, or 1 ⁇ m to 500 ⁇ m, 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, or 10 ⁇ m to 3 mm, or 100 ⁇ m to 500 ⁇ m or 10 ⁇ m to 1 mm , or 100 ⁇ m to 1 mm, or 200 ⁇ m to 1 mm, or 500 ⁇ m to 1 mm.
  • the thickness of the solid thin film may correspond to a size in a direction perpendicular to the surface of the solid thin film to be observed. Since the solid thin film has a thickness within the above-described range, the biological material fixed therein can be observed in units of individual cells (single cell).
  • the first fluid is injected into the edge groove when the fluid is dispensed, and then solidifies as a solid thin film formed by the first fluid. It is possible to minimize the movement or drop-out of the tissue, and it is possible to accurately image the growth change of the target biological material during the antibiotic susceptibility test using an optical microscope.
  • the first fluid accommodating part has a certain level difference from the second sub-well, and may be physically separated through the separation barrier rib.
  • the second fluid when the second fluid is injected into the second sub-well and then supplied to the upper part of the first sub-well, bubbles may be generated at the edge of the bottom surface.
  • the wall surface of the first sub-well may be formed to have a curved surface having a predetermined inclination.
  • the wall on the side of the separation barrier is made with a curved surface to prevent bubbles from being generated at the lower end of the separation barrier when the second fluid is supplied to the first sub-well, and at the same time, the second fluid is uniformly injected into the first sub-well can make it happen
  • the rapid cell culture test apparatus capable of preventing the escape of the solidified fluid according to the present invention is provided in a way that can be opened and closed through a fastening structure, or silicone, polyethylene terephthalate (PET), polyethylene (PE), polypropylene (PP) , polystyrene (PS), polycarbonate (PC), Teflon or polyvinyl chloride (PVC) may be provided by treating the cover film.
  • a cross or X-shaped punch is formed at a position corresponding to the lower first sub-well 120 of the cover film, and may serve as a first fluid inlet for facilitating the introduction of a small amount of the first fluid.
  • a cross or X-shaped punch is also formed at a position corresponding to the lower second sub-well 130 of the film to serve as a second fluid inlet for facilitating the introduction of the second fluid.
  • the shape of the first fluid inlet and the shape of the second fluid inlet are different.
  • a bottom surface of the first sub-well may include a focusing mark providing positional information of an object to be observed.
  • the focusing label may be labeled on the bottom surface of the first sub-well so as to automatically track the observation area of the cell culture test device.
  • the focusing mark provided on the bottom surface is manufactured on the bottom surface in the form of microchannels through an injection molding method. Since the biological material in the solid thin film is fixed, the same area can be photographed every imaging time by using a focusing marker. In the automatic tracking of the observation area, the focusing mark serves to correct the position in three directions of the x-axis, y-axis, and z-axis.
  • a method for analyzing cells using a cell culture test apparatus having a plurality of well units comprising: an inlet for injecting a first fluid and a second fluid; and a first sub-well having a first fluid accommodating part for accommodating the first fluid and a bottom part having a second sub-well for accommodating a second fluid and for loading an antibiotic, wherein the first fluid is accommodated
  • the part is formed with an edge groove that can accommodate a portion of the first fluid along the outer peripheral surface of the lower end; or an increase in diameter from an upper end to a lower end, (a) injecting the first fluid into the first sub-well, and solidifying the mixed solution to form a solid thin film; (b) injecting the second fluid into the second subwell to disperse or dissolve the antibiotic, and injecting the second fluid up to the well unit above the second subwell to form a solid thin film of the first fluid inside the first subwell diffusing the antibiotic into the solid thin film by contacting it with and (c) observing,
  • a mixed solution (first fluid) of a liquid medium containing a gelling agent and a biological agent is prepared.
  • the liquid medium may contain at least about 95% water and may be solidified in the presence of a solidifying agent.
  • a solidifying agent include agar, agarose, gelatin, alginate, collagen, and fibrin.
  • agar or agarose may be used.
  • 0.3 to 4 wt% of agar may be used in the liquid medium.
  • the liquid medium does not require nutrients, but may contain nutrients in some instances.
  • the biological material includes viruses, bacteria, fungi, algae, protozoa, parasitic pathogens, human or mammalian cells and biofilms, and the like.
  • the biological material may grow in a liquid or solid medium, and growth may be affected by the type and concentration of an external physiologically active material.
  • the density of the biological material in the mixed solution may be 10 2 to 10 10 cells/ml, preferably 10 4 to 10 9 cells/ml, more preferably 10 5 to 10 8 cells/ml. Below the above range, it may be difficult to determine the location of the biological material, and above the above range, it may be difficult to determine the state of the individual biological material.
  • a first fluid is supplied to the first sub-well.
  • the supplied first fluid is injected into the edge groove formed in the first fluid accommodating part, and thus drop-off can be prevented when the solid thin film is formed.
  • the wall surface of the first fluid receiving part may be installed so that the diameter increases from the upper end to the lower end to prevent drop-off.
  • 1 ⁇ l or more and 50 ⁇ l or less of the first fluid may be supplied, and after the injection is completed, the first fluid may be solidified to form a solid thin film in which the biological material is fixed.
  • the temperature of the liquid medium decreases at a high temperature, the medium solidifies, thereby reducing the movement of the biological material. By means of the fixation, it is possible to continue and easily observe the biological material in motion.
  • the thickness and width of the solid thin film are determined according to the width of the first sub-well and the amount of the first fluid injected.
  • the term "thin film” is not particularly limited in thickness as long as it can be observed as a single cell unit by fixing the biological material, but generally 1 ⁇ m to 5 mm, or 1 ⁇ m to 3 mm, or 1 ⁇ m to 2 mm, or 1 ⁇ m to 1.5 mm, or 1 ⁇ m to 1 mm, or 1 ⁇ m to 800 ⁇ m, or 1 ⁇ m to 500 ⁇ m, 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, or 10 ⁇ m to 3 mm, or 100 ⁇ m to 500 ⁇ m or 10 ⁇ m to 1 mm , or 100 ⁇ m to 1 mm, or 200 ⁇ m to 1 mm, or 500 ⁇ m to 1 mm.
  • the thickness of the solid thin film may correspond to a size in a direction perpendicular to the surface of the solid thin film to be observed. Since the solid thin film has a thickness within the above-described range, the biological material fixed therein can be observed in units of individual cells (single cell).
  • a second fluid which is a solvent including water, a cell culture medium, and dimethylformamide (DMF) or dimethyl sulfoxide (DMSO), is supplied to the well unit 110 .
  • the second fluid serves to disperse or dissolve the antibiotic loaded in the well unit 110 and supply it.
  • the second fluid is continuously supplied after completely filling the bottom part 130 and the bottom part 112 to fill the well unit.
  • the second fluid filling the well unit as described above is supplied to the first sub-well and comes into contact with the solid thin film of the first fluid. Accordingly, the antibiotic dispersed or dissolved in the second fluid may diffuse into the solid thin film.
  • the shape of the edge groove or the wall surface of the first fluid accommodating part it is possible to prevent the drop-off or movement of the solid thin film due to the injection of the second fluid.
  • the response of the biological material to the antibiotic is observed.
  • the biological material is fixed on the solid thin film, it is distributed two-dimensionally, and as a result, it is possible to observe in a single cell unit.
  • growth changes of individual cells can be observed within tens of minutes (usually 30 minutes), so the effect of antibiotics on biological substances can be confirmed more accurately and quickly than conventional methods.
  • a bioactivity test is performed on bacterial cells, the test can be completed within 3 to 4 hours.
  • this rapid bioactivity test method will be referred to as single-cell morphological analysis (SCMA).
  • SCMA single-cell morphological analysis
  • An optical measuring device may be used for observation.
  • the optical measurement device may include an imaging system such as a CCD or CMOS camera.
  • the optical measurement device may also include lenses, lights and light guides, etc. necessary to focus and image the light.
  • the optical measuring device may also include an image processing system for processing and analyzing image data observed by the camera.
  • the optical measuring device records and analyzes the growth change of the biological material shown in the test process at a high speed to obtain the test result.
  • a periphery of an interface between the solid thin film of the first fluid and the second fluid is an imaging area, and the imaging area may have a size of about 100 ⁇ m*100 ⁇ m to 4000 ⁇ m*4000 ⁇ m.
  • at least a cross-section of the first sub-well has a greater width than the imaging area.
  • the amount of drug and cells required for drug test can be significantly reduced compared to the prior art, and the growth change of single cells can be tracked at a fast rate. It has the advantage of being able to obtain fast drug test results in usually 3 to 4 hours within 2 hours at the earliest. This is the highest scan speed known to date.
  • a biofilm is a membrane forming a mucous microbial complex formed by microorganisms wrapped in a polymer matrix and appearing at the part where microorganisms are infected or attached.
  • the formation of biofilms can also have a significant impact on human health. Infections caused by biofilms include lung infections, otitis media, and periodontitis.
  • Conventionally, as a method for studying biofilms there have been methods using a flow cell system or a well-based system, but these assay systems require a long time of several days to form a biofilm. , there were difficult aspects such as staining for observation and use of a confocal microscope.
  • a chip for antibiotic susceptibility testing having an array of 12 x 8 aligned well units was prepared by injection molding a thermoplastic resin (polystyrene) into the structure shown in FIGS. 1 and 2 . Thereafter, a polypropylene film was attached to the rear side to complete the antibiotic susceptibility test chip. At this time, the wall of the first fluid receiving part was manufactured vertically, and the edge groove was manufactured to have a thickness of 100 ⁇ m and a width of 500 ⁇ m.
  • a thermoplastic resin polystyrene
  • Example 1 the same procedure was performed except that the wall surface of the first fluid receiving part was manufactured to have a reverse inclination of 30° with respect to the vertical plane.
  • Example 2 The same procedure was carried out except that in Example 2, there was no rim groove.
  • Example 1 the same procedure was performed except that the wall surface of the first fluid receiving part was manufactured to have a reverse inclination of 85° with respect to the vertical plane.
  • Example 1 the same procedure was performed except that the edge groove was manufactured to have a thickness of 0.5 ⁇ m and a width of 200 ⁇ m.
  • Example 2 The same procedure was performed except that in Example 1, the thickness of the edge groove was 2500 ⁇ m and the width was 2500 ⁇ m.
  • Example 2 It was carried out in the same manner as in Example 1, except that it was manufactured without a rim groove.
  • Comparative Example 4 in which the wall of the first fluid accommodating part was manufactured vertically and the edge groove was not manufactured, it was confirmed that the most thin film separation occurred. That is, as in Examples 1 and 2 of the present invention, the In this case, it was possible to prevent separation of the solid thin film, and as in Example 3, it was confirmed that the separation prevention effect was maximized even when the wall surface of the first fluid accommodating part was made to be inclined at a certain angle.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치로서, 상기 웰 유닛은 제1 유체 및 제2 유체를 주입하기 위한 입구부; 및 상기 제1 유체를 수용하기 위한 제1유체 수용부를 포함하는 제1 서브웰이 형성된 바닥부를 포함하되, 상기 제1 유체 수용부는; 하단부 외주면을 따라 상기 제1 유체의 일부를 수용할 수 있는 테두리 홈이 형성되어 있는 것; 또는 상단부에서 하단부 방향으로 직경이 증가하는 것인 세포배양검사 장치가 제공된다.

Description

고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치
본 명세서에 개시된 기술은 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유체 분주시 칩의 웰 내에서 이탈을 막을 수 있어 정확한 관찰이 용이한 세포배양검사 장치에 관한 것이다.
인체 감염균에 의한 감염 시 적절한 시기에 항생제를 처방 받는 것은 생존율에 큰 영향을 끼친다. 올바른 항생제 처방을 위해서는 우선 감염 원인균주의 생장이 특정 항생제의 특정 농도에서 억제되는지에 대한 확인이 필요한데, 이러한 확인을 항생제 감수성 검사라고 부른다.
항생제 감수성 검사는 일반적으로 감염 원인균을 배양액과 항생제를 다양한 농도로 섞은 마이크로 웰에서 18시간 가량 배양한 후 자랐는지 여부를 광투과성으로 판단하게 되는데, 여기에 소요되는 배양 시간을 최소화하고 업무를 자동화하기 위한 제품이 많이 개발되고 있다.
배양 시간을 최소화하기 위해서는 우선 배양 환경의 소형화가 기본적인 조건이며, 이러한 소형화와 자동화를 위해 미세 유체를 분주하고 원하는 형상과 시퀀스로 조정할 수 있는 마이크로 단위의 구조물을 가지는 일회용 플라스틱 플레이트를 도입하는 사례가 급증하는 추세이다.
한편 본 출원인은 이러한 미세유체 플레이트를 도입하여 현미경 이미징 방식으로 균의 성장 여부를 판단하는 항생제 감수성 검사 시스템을 개발하였는데, 본 시스템을 이용하면 수 시간 내에 항생제 감수성 검사를 마칠 수 있는 장점이 있으나, 유체의 이동 및 정착 과정에서 유체의 순차적인 주입에 따른 기 주입된 유체의 이탈이 발생하여 항생제 감수성 검사 결과가 왜곡되는 문제가 발생할 수 있어 이를 개선한 새로운 안이 필요하다.
전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 유체 분주시 칩의 웰 내에서 이탈을 막을 수 있어 정확한 관찰이 용이한 세포배양검사 장치를 제공하고자 한다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치로서, 상기 웰 유닛은 제1 유체 및 제2 유체를 주입하기 위한 입구부; 및 상기 제1 유체를 수용하기 위한 제1유체 수용부를 포함하는 제1 서브웰이 형성된 바닥부를 포함하되, 상기 제1 유체 수용부는; 하단부 외주면을 따라 상기 제1 유체의 일부를 수용할 수 있는 테두리 홈이 형성되어 있는 것; 또는 상단부에서 하단부 방향으로 직경이 증가하는 것인 세포배양검사 장치를 제공한다.
일 구현 예에 있어서, 상기 제1 유체 수용부는 고형화된 제1 유체가 제2 유체의 공급에 의하여 이동 또는 탈락되는 것을 방지할 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 테두리 홈은 두께 1~2000um 폭 300~2000um으로 형성될 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 세포배양검사 장치는 후면부에 제1 유체의 누출을 방지하기 위한 후면 본딩 수단을 포함할 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 후면 본딩 수단은 광학적으로 투명한 필름일 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 후면 본딩 수단은 상기 제1 유체 수용부 및 상기 테두리 홈에 제1 유체의 주입을 용이하도록 하는 압력제어 채널을 포함할 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 바닥부는 상기 제2 유체를 수용할 수 있으며 특정 위치에 항생제를 적재하기 위한 제2 서브웰을 포함할 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 웰 유닛의 내벽의 둘레를 따라 상기 웰 유닛의 중심방향으로 돌출된 단차부가 존재함으로써, 상기 웰 유닛이 상기 입구부 쪽의 상단부보다 좁은 내부 너비를 갖는 하단부를 가질 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 단차부는 상기 제2 유체의 주입시 상기 바닥부로부터 수직방향 전진을 막을 수 있도록 상기 제2 유체의 전진방향에 대해 90도 이상의 각도를 가질 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 단차부는 상기 내벽의 둘레를 따라 연결된 모서리의 형상을 가질 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 단차부의 높이는 상기 바닥부의 내부 모서리로부터 상기 바닥부 중심까지의 거리 이하일 수 있다.
일 구현 예에 있어서, 상기 바닥부와 유닛 내벽이 형성하는 바닥부의 내부모서리는 바닥부를 기준으로 70~120°의 각도를 가질 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 다른 측면에 의하면, 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치를 이용한 세포의 분석방법으로서, 상기 웰 유닛은 제1 유체 및 제2 유체를 주입하기 위한 입구부; 및 상기 제1 유체를 수용하기 위한 제1유체 수용부를 포함하는 제1 서브웰 및 제2 유체를 수용할 수 있으며 항생제를 적재하기 위한 제2 서브웰이 형성된 바닥부를 포함하되, 상기 제1 유체 수용부는 하단부 외주면을 따라 상기 제1 유체의 일부를 수용할 수 있는 테두리 홈이 형성되어 있는 것; 또는 상단부에서 하단부 방향으로 직경이 증가하는 것이며, (a) 상기 제1 유체를 상기 제1 서브웰에 주입하고, 상기 혼합용액을 고화하여 고체 박막을 형성하는 단계; (b) 상기 제2 유체를 제2 서브웰에 투입하여 항생제를 분산 또는 용해하며, 제2 유체를 제2 서브웰 상부의 웰 유닛까지 투입하여 상기 제1 서브웰 내부의 제1 유체의 고체 박막과 접촉시키는 것으로 상기 항생제를 상기 고체 박막으로 확산시키는 단계; 및 (c) 상기 제1 유체의 고체 박막과 상기 제2 유체가 서로 만나 형성된 계면에서 일어나는 생물학적 물질의 변화를 단일세포 단위로 관찰하는 단계;를 포함하는 세포의 분석 방법을 제공한다.
일 구현 예에 있어서, (d) 상기 항생제에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치는 유체의 주입이후 고형화된 고체 박막의 이탈을 최대한 방지할 수 있어 기존의 항생제 검사장치에 비하여 정확한 검사를 수행할 수 있으며, 고체박막 내에 고정된 세포를 이용하여 항생제의 거동을 관찰하고 있어 기존의 장치에 비하여 신속한 항생제 감수성 검사가 가능하다.
또한 본 발명에 의한 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치는 일반적으로 단일 세포(single bacteria)의 성장변화는 수십 분(보통 30분) 이내에 관찰이 가능하고, 단일 세포 군집(single colony of bacteria)의 변화에는 보통 4~6시간 이내에 관찰이 가능하기 때문에 생물학적 물질에 대한 생리활성물질의 영향을 기존 방식에 비해 정확하고 빠르게 확인할 수 있다.
또한 본 발명에 의한 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치는 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 군집 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정할 수 있음에 따라, 항생제 감수성 시험 뿐 아니라 바이오필름 어세이(biofilm assay)에도 매우 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 세포배양검사 장치의 일 구현 예를 나타낸다.
도 2는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현 예에 따른 세포배양검사 장치의 웰 유닛의 단면을 나타낸 것이다.
도 3은 기존의 웰에서 사용되는 고체박막을 나타낸 것으로 (a)는 정위치에 존재하는 고체박막의 단면과 사진, (b)는 외력에 의하여 이탈된 고체박막의 단면과 사진을 각각 나타낸 것이다.
도 4는 제1 유체 및 제2 유체를 웰 유닛에 도입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 나타낸다.
도 5는 웰 유닛의 제조 시 금형의 이동을 도시한 것으로 (a)는 기존의 방식과 같은 금형을 사용한 경우 (b)는 언더컷 형상에 따라 수정된 금형을 사용하는 경우를 각각 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 희생홈의 구조를 도시한 것이다.
도 7은 (a) 표면장력에 의하여 내벽의 일부에 고르게 퍼지지 못한 유체를 도시한 것이며, (b)는 그 단면을 각기 나타낸 것이다.
도 8은 구조물의 두 표면이 만나는 모서리에서의 접촉각을 각기 나타낸 것이다.
도 9는 구조물의 한 표면에서의 이동거리와 두 표면이 만나는 모서리에서의 이동거리를 각기 나타낸 것이다.
도 10은 단차부에서의 유체이동양상을 간략히 도시한 것이다.
도 11은 유체가 웰 유닛에 주입될 때의 거동을 간략히 나타낸 것이다.
도 12는 유체가 웰 유닛에 주입될 때 단차부의 유무에 따른 유체의 거동을 간략히 나타낸 것이다.
이하 본 명세서에 개시된 기술에 대해 도면을 참조하여 보다 상세히 설명하고자 한다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 명세서에 개시된 기술의 구현 예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 명세서에 개시된 기술은 여기서 설명되는 구현 예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현 예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 기술의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명 시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고, 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
한편, 본 명세서에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다. "제1 " 또는 "제2 " 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
또, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함하다" 또는 "가지다"등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 일 측면에 의하면, 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치가 제공된다. 도 1은 세포배양검사 장치의 일 구현 예를 나타낸다. 도 1의 (a)는 세포배양검사 장치의 전체적인 구성을 나타낸 도면이고, (b)는 세포배양검사 장치의 일부를 확대한 것이고 (c)는 웰 유닛의 단면을 나타낸 것이다. 이 때 상기 웰 유닛(110)이 다수 정렬되어 전체적으로 상용 멀티-웰 플레이트와 유사한 규격을 가질 수 있다. 바람직하게는 웰 유닛(110)의 중심이 상용 멀티-웰의 중심과 일치할 수 있다. 웰 유닛(110)은 제1 유체 및 제2 유체를 투입하기 위한 입구부(120)와 제1 서브웰(132)과 제2 서브웰(134)를 갖는 바닥부(130)를 포함한다. 또한 제1 서브웰(132)은 제1 유체를 수용하기 위한 제1 유체 수용부를 포함하며, 제1 유체 수용부의 하단부 외주면을 따라 상기 제1 유체의 일부를 수용할 수 있는 테두리 홈(150)이 존재한다.
화학적, 생화학적, 및/또는 생물학적 분석에 있어서 멀티-웰 플레이트는 다수의 샘플을 처리하고 분석하기 위한 표준 도구이다. 멀티-웰 플레이트는 다양한 형태, 크기 및 모양을 취할 수 있는데, 일반적으로 표준 크기 및 모양으로 만들어지고, 웰들의 표준 배열을 가진다. 상기 멀티-웰 플레이트와의 호환성을 위하여 상기 복수의 웰 유닛은 96-웰 플레이트(12x8의 웰 배열), 384-웰 플레이트(24x16의 웰 배열), 및 1536-웰 플레이트(48x32의 웰 배열)의 표준 웰배열을 가질 수 있으며, 기타 다양한 방식의 상용 멀티-웰 플레이트와 동일 또는 유사한 배열을 가질 수 있다. 세포배양검사 장치(100)이 상용 멀티-웰 플레이트와 동일 또는 유사한 규격을 가짐으로써 종래의 다양한 생물학적 분석 기술과 용이하게 호환될 수 있다. 따라서 본 발명에서 복수의 웰 유닛은 1x1, 1x2, 1x4, 2x4, 4x6, 12x8, 24x16 또는 48x32의 웰 배열을 갖는 것일 수 있다.
입구부(120)는 통상 웰 유닛(110)의 상부에 위치하며 전면이 개방된 형태 또는 부분적으로 개방된 형태일 수 있다. 입구부(120)는 단일 또는 복수의 개구부를 구비할 수 있다. 피펫팅이나 인젝션 등에 의해 상기 제1 유체 및 상기 제2 유체가 입구부(120)을 통해 웰 유닛(110) 내부에 도입될 수 있다.
바닥부(130)는 깊이 방향으로 움푹 들어간 제1 서브웰(132)을 구비하며, 제1 서브웰(132)은 입구부(120)를 통해 도입된 상기 제1 유체를 수용하기 위한 제1 유체 수용부(135)를 포함할 수 있다. 또한 상기 제2 유체를 상기 입구부(120)에 직접 주입하는 것도 가능하지만 바람직하게는 상기 바닥부에 제2 서브웰(134)을 설치하여 입구부(120)를 통해 도입된 상기 제2 유체의 적어도 일부를 수용할 수 있다.
이때 상기 제1 서브웰(132)를 통하여 박테리아의 성장 변화를 관찰하게 되므로 상기 제1 서브웰(132)의 단면적을 최대한 크게 하는 것이 바람직하다. 이를 위하여 상기 제1서브웰(132)은 횡단면이 원형 또는 타원형으로 제작될 수 있으며, 제2 서브웰(134)이 설치되는 경우 제2 서브웰(134)의 횡단면은 타원형 또는 초승달형으로 제작될 수 있다. 상기 제1 서브웰(132) 및 제2 서브웰(134)이 각각 원형의 횡단면을 가지도록 제작되는 경우 상기 제1 서브웰과 제2서브웰의 직경의 합은 상기 바닥부(130)의 직경을 초과할 수 없다. 특히 제2 서브웰(134)에 일정량의 항생제 또는 제2 유체가 주입되어야 하므로 실질적으로는 상기 제1 서브웰(132)의 직경은 상기 바닥부(130) 직경의 2/3까지로 제한된다. 하지만 상기 제1서브웰(132)을 타원형의 횡단면을 가지도록 제작하는 경우 제2 서브웰(134)의 크기 변화 없이 더욱 넓은 시야를 확보할 수 있으며, 제2 서브웰(134)을 타원형 또는 초승달형의 횡단면을 가지도록 제작하는 경우 제2 서브웰(134)의 수용량을 유지하면서도 상기 제1 서브웰(132)의 직경을 더욱 크게 제작할 수 있다.
또한 상기 제1 서브웰(132)과 제2 서브웰(134)은 분리격벽(142)를 통하여 물리적으로 구분될 수 있다. 상기 분리격벽(142)은 제1 서브웰(132) 및 제2 서브웰(134)을 수평방향으로 분리시켜주는 역할을 수행하지만 수직방향으로는 물리적인 분리가 되지 않아 제2 유체가 공급되는 경우 상기 분리격벽의 상부를 통하여 제2 유체가 제1 서브웰로 공급될 수 있도록 할 수 있다. 특히 본 발명에서는 상기 제2 유체에 의하여 분산 또는 용해된 항생제가 상기 제1 유체의 고체 박막과 접촉하여야 하므로 상기 분리격벽의 높이는 상기 제1 서브웰(132) 및 제2 서브웰(134)의 측면벽과 유사한 높이를 가지는 것이 바람직하다.
상기 제1 유체 및 상기 제2 유체는 통상적으로 물을 70~99중량% 바람직하게는 85~99중량%, 가장 바람직하게는 93~99중량%의 분산매 또는 용매로서 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 유체는 고형화제(gelling agent)를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질(biological agent)의 혼합용액일 수 있다. 상기 범위 내에서 물은 분산매로서 최적의 성능을 발휘할 수 있다.
상기 액상 매질(제1유체 및 제2유체)은 물을 포함할 수 있으며 고형화제의 존재에 의해 고체화될 수 있다. 고형화제의 예로 한천(agar), 아가로즈(agarose), 젤라틴(gelatin), 알기네이트(alginate), 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 한천 또는 아가로즈가 사용될 수 있다. 일 예로 액상 매질 내에는 한천이 0.3 내지 4 중량%가 사용될 수 있다. 통상적으로 액상 매질은 영양성분을 필요로 하지 않지만, 몇몇 예에 있어 영양성분을 포함할 수도 있고, 특정 세포의 분열을 촉진시키는 배지를 포함한 용액일 수 있다. 상기 한천이 0.3중량% 미만으로 포함되는 경우 고형화가 이루어지지 않을 수 있으며, 4중량%를 초과하는 경우 과도한 고형화로 인하여 생물학적 물질의 확산이 용이하지 않을 수 있다.
상기 생물학적 물질은 바이러스, 박테리아, 균류, 조류, 원생동물, 기생 병원균, 사람 또는 포유류의 세포 및 바이오필름 등을 포함한다. 또한 상기 생물학적 물질은 박테리아, 바이러스, 균류 등과 같이 감염성을 나타내는 생물학적 물질과 혈구 세포의 혼합 상태일 수 있다. 예를 들어, 박테리아에 감염된 사람으로부터 채취한 혈액일 수 있는데, 이런 경우 혈구 세포와 박테리아 세포를 구별할 수 있도록 박테리아 세포의 분열만 촉진시키는 배지를 사용하여 혈구 세포와의 크기 변화 차이로 구별할 수 있다. 상기 생물학적 물질은 액상 또는 고상의 배지 내에서 성장할 수 있고 외부 생리활성물질의 종류 및 농도에 따라 성장에 영향을 받을 수 있다. 상기 혼합 용액 내에서의 상기 생물학적 물질의 밀도는 10 2 내지 10 10 cells/ml, 바람직하게는 10 4 내지 10 9 cells/ml, 더 바람직하게는 10 5 내지 10 8 cells/ml 일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 생물학적 물질의 위치를 파악하기 어려울 수 있고 상기 범위 초과에서는 개별적인 생물학적 물질의 상태를 파악하기 어려울 수 있다.
바닥부(130) 또는 제1 서브웰(132)이 고체 형태의 항생제를 포함하고 있는 경우, 상기 항생제는 건조된 상태일 수 있다. 건조된 항생제를 용해하는 용매로는 물, 세포배양용 배지, Dimethylformamide(DMF), Dimethyl sulfoxide (DMSO) 가 사용될 수 있다. 상기 항생제를 용해하는 용매는 고체 형태의 항생제를 완전히 용해시키고, 용해된 후 용액의 균일한 농도를 갖도록 하기 위해 피펫팅하면서 도입될 수 있다. 아울러 상기 항생제는 효능을 떨어트리지 않는 건조법이라면 제한없이 사용하여 건조할 수 있지만 바람직하게는 가열건조, 동결건조 또는 감압건조를 이용하여 건조될 수 있고 가장 바람직하게는 가열건조를 통하여 건조될 수 있다. 또한 상기 항생제는 상기와 같은 건조법을 이용하여 건조된 다음, 상기 바닥부 또는 제1 서브웰에 주입될 수 있으며, 바닥부 또는 제1 서브웰에 항생제 용액을 주입한 다음, 상기 건조법을 이용하여 건조시키는 것도 가능하다.
다만 상기 제2 서브웰(134)이 있는 형태의 세포배양검사 장치를 사용하는 경우 상기 항생제는 제2 서브웰에 건조되어 있는 것이 바람직하다. 이때 제2 유체는 제2 서브웰에 주입되어 제2 서브웰 내에 존재하는 항생제를 용해시키며 웰 바닥부(130)와 웰 하단부(112)를 채우는 것이 바람직하다.
상기 제2 유체는 항생제를 함유한 용액일 수 있고, 항생제를 용해시키는 용매일 수 있다. 그 결과 제2 서브웰(134)에는 항생제가 함유된 제2 유체가 적재될 수 있다. 제2 서브웰(134)의 부피는 목표로 하는 시스템의 스케일에 따라 달라질 수 있으나 구현 가능한 범위인 1㎕ 내지 50㎕ 일 수 있다. 제2 서브웰의 부피가 1㎕ 미만인 경우 웰의 크기가 감소하여 원활한 피펫팅 및 건조가 어려울 수 있으며, 50㎕를 초과하는 경우 필요한 샘플 및 시약의 양이 늘어남에 따라 효율이 감소될 수 있다.
도 2는 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치의 웰 유닛의 단면을 나타낸 것이다. 도 2를 참조하면, 도 2의 (a)는 세포배양검사 장치의 웰 유닛(110)을 위에서 내려다 본 모습이고, 도 2의 (b)는 (a)의 A-A' 단면의 모습을 나타낸 것이다. 제1 서브웰(132)은 상기 제1 유체를 수용하기 위한 것으로, 충분한 크기의 공간을 가지는 웰 형태일 수 있다. 제1 서브웰(132)의 부피는 특별히 제한되지 않지만 제1 유체를 주입한 후 장시간 동안 반응을 관찰하기 위해 충분한 크기를 가질 수 있으며, 예를 들어 1 ㎕ 내지 50 ㎕일 수 있다. 제1 서브웰의 부피가 1㎕ 미만인 경우 웰의 크기가 감소하여 원활한 관찰이 어려울 수 있으며, 50㎕를 초과하는 경우 필요한 샘플 및 시약의 양이 늘어남에 따라 효율이 감소될 수 있다.
본 명세서에 개시된 기술의 가장 큰 특징은 제1 서브웰(132)은 제1 유체를 수용하기 위한 제1 유체 수용부(135)를 포함하고, 상기 제1유체 수용부의 하단부 외주면을 따라 상기 제1 유체의 일부를 수용할 수 있는 테두리 홈(150)을 가지거나 상기 제1유체 수용부(135)가 상단부에서 하단부 방향으로 직경이 증가하도록 설치된 것이라는 점이다.
상기 테두리 홈(150)은 도 2에 나타난 바와 같이 상부에서 서브웰을 내려다볼 때 관측되지 않는 부분에 위치해 있지만, 제1 서브웰(132)에 공급되는 제1 유체의 일부를 수용할 수 있다. 기존의 일회용 플라스틱 칩(멀티웰 플레이트)의 경우 일반적으로 사출성형 방식으로 제작됨에 따라 상단부가 하단부보다 넓은 언더컷의 형상을 가지지 않도록 웰의 형상을 구성하고 있다. 이러한 언더컷 형상을 가지지 않는 단일바디 제품의 경우 사출 성형 이후 금형에서 제거하기 쉬우며 제거시의 파손을 최소화 할 수 있다는 장점을 가진다. 하지만 단일바디 제품의 특성상 본원 발명과 같이 제1 유체를 공급하여 고체박막을 형성하는 경우 외력에 의한 상기 고체 박막의 이동이나 탈락 역시 쉽다는 단점을 가진다. 이러한 고체 박막의 이동 또는 탈락은 일정한 위치를 검사하도록 설계된 시스템 상에서 적절한 검사의 신뢰성을 방해하는 요소로 작용할 수 있다. 특히 현미경을 사용하는 이미지 획득 및 처리의 경우 이러한 이동이나 탈락이 발생하여 부정확한 이미지가 획득 되거나 이미지 획득에 실패할 수 있다. 도 3의 (a)에 나타난 바와 같이 고체박막이 정상적으로 결합되어 있는 경우 원활한 관찰이 가능하지만 도 3의 (b)에 나타난 바와 같이 제2유체의 분주에 의하여 고체박막이 이동하거나 탈락될 수 있으며, 이 경우 실험결과의 관찰이 용이하지 않을 수 있다.
기존의 멀티 웰 플레이트의 경우 이러한 이동이나 탈락 현상을 방지하기 위하여 바닥면에 화학적 처리를 하거나 바닥면과 벽면에 돌기 등을 성형하여 마찰에 의한 탈락 방지를 수행하고 있다. 하지만 화학적 처리를 하는 방법은 검사대상인 세포에 영향을 줄 수 있으며, 그 효과도 그리 크지 못한 것으로 알려져 있으며, 돌기 등을 성형하는 경우 현미경을 통한 이미지 획득 시 돌기에 의한 왜곡 현상이 발생하여 부정확한 이미지가 나타날 수 있다.
본 발명에서는 도 4에 나타난 바와 같이, 제1 서브웰(132)의 제1 유체 수용부에 공급된 제1 유체의 일부는 상기 테두리 홈(150)으로 수용될 수 있으며, 이후 제1 유체가 고화되어 고체박막을 형성할 때 상기 테두리 홈(150)의 내부에 있는 제1 유체도 같이 고화될 수 있다. 이후 제2 유체가 공급되면 외력에 의한 압력이 발생하지만, 본원 발명의 고체 박막은 상기 테두리 홈(150) 내부에 위치하는 고형체에 의하여 고정되어 있으므로, 이동 및 탈락이 최소화 될 수 있다. 이를 위하여 상기 테두리 홈(150)은 두께 1~2000um 폭 300~2000um 의 크기로 형성될 수 있다. 상기 범위 이내의 수치에서는 상기 테두리 홈(150)에 유입된 제1 유체에 의하여 고체박막의 이동이 방지되는 효과를 가지고 있지만 상기 범위 미만으로 테두리 홈(150)이 제작되는 경우 이러한 이동 및 탈락방지 효과가 떨어지며, 상기 범위를 초과하는 크기로 테두리 홈(150)이 제작되는 경우 테두리 홈(150)에 유입되는 제1 유체의 양이 늘어남에 따라 검사에 필요한 시료의 양이 늘게 되어 비효율적이다.
또한 상기 제1 유체 수용부의 경우 상단부에서 하단부 방향으로 직경이 증가하도록 제작될 수 있다. 상기 제1 유체 수용부(135)는 제1 서브웰(132)에 공급되는 제1 유체를 수용하기 위한 공간으로, 도 2 및 도 3 에 나타난 바와 같이 상단부에 비하여 하단부의 직경이 크도록 제작되어 제1 유체가 고형화된 고체 박막이 상측으로 이동 또는 이탈하지 못하도록 막는 역할을 수행한다. 이때 상기 제1 유체 수용부(135)는 제1 서브웰(132)과 동일하게 원형 또는 타원형으로 제작될 수 있다. 특히 타원형으로 제작되는 경우 상기 와 같이 고체 박막의 이탈을 방지하기 위하여 장축 또는 단축 중 하나 이상이 상단부에 비하여 하단부가 크도록 제작될 수 있다. 또한 상기 제1 유체 수용부의 벽면은 수직선을 기준으로 1~80°의 역경사를 가지도록 제작할 수 있다. 상기 제1 유체 수용부의 벽면이 1°미만의 역경사를 가지는 경우 고체 박막의 이탈방지 효과가 없으며, 80°를 초과하는 역경사 각도를 가지는 경우 제1 유체 수용부의 높이가 낮아져 고체박막의 두께가 관찰에 용이하지 않을 수 있다.
다만 본 발명의 경우 상기와 같은 제1유체 수용부(135) 및 테두리 홈(150)을 형성함에 있어서 제1 유체 수용부(135)의 하단 및 테두리 홈의 직경이 제1 유체 수용부의 상단 보다 크기 때문에 언더컷 형상을 가지게 되어 사출성형만으로는 제작이 어렵다는 단점을 가지고 있지만 웰 플레이트 제작용 하부 금형에 상기 제1유체 수용부(135) 및 테두리 홈(150)의 형상을 성형하여 제작하는 경우 사출 성형으로 제작이 가능하다. 도 5에 나타난 바와 같이, 기존의 방식으로 하부금형을 제작하는 경우(도 5의 (a)), 제1 유체 수용부 및 테두리 홈 부분의 금형이 상부보다 커지게 되는 언더컷에 의하여 금형의 분리가 어렵지만 도 5의 (b)에 나타난 바와 같이 제1 유체 수용부 및 테두리 홈 부분을 하부금형에 성형하여 제작하는 경우 언더컷 부분이 없이 금형의 분리가 가능하다.
이렇게 제작된 세포배양검사 장치는 제1 유체 수용부(135) 및 테두리 홈(150)의 하단부가 외부에 노출되어 제1 유체를 수용할 수 없는 형상이지만 상기 세포배양검사 장치의 후면부에 제1 유체의 누출을 방지하기 위한 후면 본딩 수단(160)을 부착하여 상기 제1 유체 수용부(135) 및 테두리 홈(150)이 제1 유체를 수용할 수 있도록 제작할 수 있다. 이때 상기 본딩 수단(160)은 상기 웰 플레이트의 후면 부위와 동일한 크기로 제작되어 각 웰 유닛의 후면을 한 번에 본딩하도록 제작될 수 있으며 각각의 웰 유닛의 크기에 맞게 제작되어 각각의 웰 유닛을 따로따로 본딩하도록 제작되어 사용하는 것도 가능하다. 아울러 본원 발명의 경우 상기 웰 플레이트 후면에서 상기 제1 서브웰(132) 하부의 고체 박막을 관찰하므로, 상기 본딩 수단은 광학적으로 투명한 필름을 사용하는 것이 바람직하다.
또한 상기 후면 본딩 수단에는 압력제어 채널이 포함될 수 있다. 상기 압력제어 채널은 상기 제1 유체 주입시 제1 유체 수용부 및 테두리 홈에 존재하는 기체의 통로로서 사용되는 것으로, 상기 압력제어 채널은 상기 제1 유체 수용부 또는 테두리 홈과 연통되어 대기에 노출됨으로써, 상기 제1 유체가 제1 유체 수용부 및 테두리 홈을 채움에 따라, 내부의 공기를 외부로 배출할 수 있다. 특히 상기 제1 유체는 상기 제1유체 수용부에 우선 주입된 다음, 모세관 현상을 이용하여 상기 테두리 홈으로 주입됨에 따라, 상기 압력제어 채널은 상기 테두리 홈과 연통되는 것이 더욱 바람직하다.
아울러 상기 압력제어 채널과 제1 유체 수용부 또는 테두리 홈은 모세관 밸브에 의하여 연결되는 것이 바람직하다. 상기 압력제어 채널이 상기 제1 유체 수용부 또는 테두리 홈과 직접적으로 연통되어 있는 경우 제1 유체의 주입시 제1 유체의 일부가 상기 압력제어 채널로 주입될 수 있다. 특히 본원 발명의 제1 유체 주입부의 경우 구조상 유체의 양이 변화하면 제1 유체가 고화되어 생성되는 고체 박막의 두께가 달라질 수 있으며, 이 경우 분석에 영향을 줄 수 있다. 따라서 상기 제1 유체 주입부에 항상 동일한 양의 제1 유체가 존재하도록 압력제어 채널과 제1 유체 수용부 또는 테두리 홈 사이에 모세관 밸브를 형성하여 압력제어 채널과 제1 유체 수용부 또는 테두리 홈에 포함된 공기를 배출하면서도 제1 유체가 압력제어 채널로 유입되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 즉 모세관 밸브(160)의 두께와 너비는 모세관 현상을 유지하도록 제어되며, 통상 1㎛ 내지 500㎛의 두께, 200㎛ 내지 2mm의 너비를 가질 수 있다. 상기 모세관 밸브가 상기 범위 이내인 경우 상기 제1 유체는 상기 압력제어 채널로 유입되지 않으며 공기만 배출될 수 있지만 상기 범위 미만인 경우 공기의 배출이 원활하지 않고, 상기 범위를 초과하는 경우 제1유체가 압력제어 채널로 유입될 수 있다.
도 4는 제1 유체 및 제2 유체를 웰 유닛에 도입하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 나타낸다.
고형화제(gelling agent)를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질(biological agent)의 혼합용액인 제1 유체가 제1 서브웰(132)의 하부에 위치하는 제1 유체 수용부에 도입된 후 고화됨으로써 생물학적 물질, 예를 들어 박테리아가 겔 매트릭스 내에 고정될 수 있다. 이후 제2 유체가 입구부(120)를 통해 도입되어 항생제를 녹이고, 제2 유체의 부피가 점점 늘어남에 따라 웰 유닛(110)의 하단부를 채우면서 제1 서브웰(132)에 채워진 겔 매트릭스와 계면을 형성하게 된다. 그리하여 항생제가 계면을 통하여 겔 매트릭스 내로 확산되고 겔 매트릭스 내에 고정된 박테리아의 성장 변화를 관찰함으로써 항생제에 대한 감수성을 현미경으로 관찰할 수 있다.
공급된 제1 유체는 위와 같은 고화과정을 거쳐 고체 박막을 형성하는데 이때 상기 테두리 홈에 수용된 제1 유체의 일부는 테두리 홈 내부에서 고화됨에 따라 제1 유체 수용부에서 고화된 제1 유체와 더불어 외력에 의하여 상기 고체 박막이 탈출하지 못하도록 하는 고정대로서의 역할을 수행할 수 있다.
이를 상세히 살펴보면 제1 서브웰에 공급된 유체는 제1 서브웰의 하단부에 위치한 제1 유체 수용부 및 외주면에 형성된 테두리 홈으로 공급된다. 이때 상기 제1 유체 수용부는 위에서 살펴본 바와 같이 상단부에 비하여 하단부의 직경이 크도록 제작됨에 따라, 주입구 방향으로는 상기와 같이 고화된 고체 박막이 탈출할 수 없도록 할 수 있다. 또한 상기 제1 유체는 모세관 현상 및 표면 장력을 이용하여 상기 테두리 홈을 채우게 된다.
상기와 같이 제1 서브웰 및 테두리 홈에 공급된 제1 유체는 이후 고화되어 고체 박막을 형성한다. 이때 상기 테두리 홈에 주입된 제1 유체로 같이 고화되며, 상기 고체 박막을 고정하는 역할을 수행한다. 또한 기존의 언더컷 형상으로 제작된 웰 플레이트의 경우 제2 유체의 공급시 유체의 주입방향과 고체박막 및 웰 유닛의 벽면의 경계면 방향이 일치하여 제2 유체에 의한 고체 박막의 이동 및 탈락 현상이 많이 있었으며, 고체 박막의 하부까지 제2 유체가 유입되어 정확한 이미지 획득이 어려운 경우도 있었다. 하지만 본원 발명의 경우 제1 유체의 주입시 고체박막 및 웰 유닛의 벽면의 경계면으로 제2 유체가 유입되더라도 상기 테두리 홈 내부에서 고화된 제1 유체에 의하여 이동 및 탈락이 방지되며, 제2 유체가 고체박막의 하부까지 침투하기 위해서는 상기 테두리 홈 내부의 고형화된 제1 유체의 외면을 따라 이동해야 하므로 제2 유체의 유입에 따른 이미지 저하를 최소화 할 수 있다.
현미경 관찰을 위해 제1 서브웰(132)이 위치한 곳의 바닥면을 통해 상기 제1 유체 내의 대상을 관찰할 수 있도록 웰 유닛의 바닥면의 적어도 일부가 광학적으로 투명한 재질로 이루어질 수 있다. 본 발명에서는 상기 본딩 수단이 제1 서브웰의 바닥을 이루고 있으므로, 상기 본딩수단을 투명재질로 제작하는 경우 용이하게 광학적인 관찰이 가능하다. 이때 상기 본딩수단은 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리카보네이트와 같은 고분자 수지일 수 있다. 아울러 부착의 용이성 및 부착이후 부피감소 등을 목적으로 상기 본딩수단은 광학적으로 투명한 필름일 수 있다. 상기 필름은 폴리에틸렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리스티렌 등과 같은 광학적으로 투명한 필름일 수 있다. 세포배양검사 장치의 웰 유닛부는 고분자 수지를 사출하는 방식으로 제조될 수 있다.
아울러 상기 본딩수단을 이용하여 바닥면을 제작하는 경우 상기 본딩수단과 웰 플레이트를 접착하기 위한 접착제가 사용될 수 있다. 다만 상기 접착제의 경우 제1 유체와 접촉하게 되면 실험결과에 영향을 줄 수 있으므로, 이를 최소화하기 위하여 테두리 홈(150)의 외주면에 희생홈(Sacrificial groove)을 설치하는 것이 바람직하다. 상기 희생홈은 상기 테두리 홈(150)보다 높게 제작되어, 테두리 홈을 채운 제1 유체가 빠져나오기 어렵도록 capillary valve를 형성한다. 따라서 제1 유체와 접착제가 직접적으로 접촉하는 경우를 차단하고 안정적인 로딩이 가능하다(도 6 참조).
또한 본 발명은 웰 유닛(110)의 내벽의 둘레를 따라 웰 유닛(110)의 중심방향으로 돌출된 단차부(140)가 존재한다. 웰 유닛(110)의 단면 형상으로부터 알 수 있듯이 단차부(140)의 존재로 인해, 웰 유닛(110)이 입구부(120) 쪽의 상단부(114)보다 좁은 내부 너비를 갖는 하단부(112)를 갖게 된다. 이때 단차부(140)는 상기 내벽의 둘레를 따라 연결된 모서리의 형상을 갖는다. 단차부(140)가 상기 형상을 가짐에 따라 웰 유닛(110) 내 유체의 거동이 제어됨으로써 전체 웰 유닛(110) 내부에 유체가 고르게 퍼질 수 있다. 단차부(140)의 기능은 구체적으로 아래와 같이 서술될 수 있다.
고정된 구조물에 유체가 유입될 때, 유체의 유입 시 관성력 외에 유체의 거동에 가장 큰 영향을 미치는 요소는 유체와 구조물 표면에 작용하는 표면장력과 유체에 작용하는 중력이다. 그러나 부피가 작아질수록 유체의 질량에 비해 표면 면적에 의해 영향을 받는 표면장력이 점점 주도적인 힘으로 작용하게 되고, 중력은 상대적으로 미미한 효과를 가지게 된다. 따라서 본 세포배양검사 장치에서 주로 다루는 수~수백 uL 스케일의 부피 범위에서는 물에 대해 중력이 거의 영향을 끼치지 못하거나 약한 영향을 끼치는 수준으로 이러한 범위에서는 유체의 거동에 주로 표면장력이 중요한 영향을 끼칠 수 있다.
도 7의 (a)는 표면장력에 의하여 내벽의 일부에 고르게 퍼지지 못한 유체를 도시한 것이며, (b)는 그 단면을 나타낸 것이다.
먼저 제2 유체가 목적하는 바와 상반되는 형태로 구조물의 일부분에 갇혀 고르게 퍼지지 못하는 경우, 유체는 가로에 비해 세로의 비율이 더 높은 형태를 가지며, 중력의 영향으로 상단보다는 하단으로 쏠린 형태를 지닌다. 또한 유체와 구조물 간의 경계면은 낮은 접촉각으로 인해 뾰족한 형태를 가지는 형태로 볼 수 있으나(도 7의 (a)), 유체의 볼륨에 비해 적은 면적에 분포하여 그 단면은 볼록한 형태감을 가진다(도 7의 (b)).
이러한 환경에서 유입된 유체가 위 기술한 바와 같이 목적한 구조물 내를 완전히 채우기 위해서는 우선 유체에 대한 구조물 표면의 접촉각이 90도 이내를 유지하는 것이 좋으며, 유체의 표면장력은 일부 유체를 제외하고 가장 강한 물의 표면장력보다 낮거나 같은 경우를 유지하는 경우를 가지는 것이 바람직하다. 더 자세하게는 10도 이상, 90도 이하의 접촉각을 가지는 것이 바람직하다. 또한 밀도는 0.1g/mL 이상, 10g/mL 이하이고 점도는 0.1mPa/s 이상, 10mPa/s 이하이며 부피는 10㎕ 이상, 200㎕ 이하인 것이 바람직하다. 상기 밀도 및 점도 범위에서 유체는 상기 구조물에 완전히 퍼지도록 작용할 수 있으며, 상기 범위를 초과하는 유체의 경우 상기 구조물에 고르게 퍼지지 못할 수 있다. 여기서는 유체의 표면장력과 밀도, 점도가 물과 유사(72dyne/cm, 1g/mL, 1mPa/s)하며, 접촉각이 50도, 볼륨은 대략 100㎕ 인 경우를 가정하여 기술한다.
접촉각이 50도 가량 되는 경우 기본적으로 유체는 웰 유닛 구조물 표면에 살짝 퍼지다 말고 둥근 형태로 뭉치게 되나, 구조물의 두 표면이 만나는 상기 바닥부의 내부모서리에서는 보다 멀리까지 이동할 수 있다. 도 8에 나타난 바와 같이, 구조물의 두 표면이 만나는 모서리에서는 유체와 구조물의 표면간의 접촉각이 낮아지는 효과가 발생하여, 이에 따라 더욱 먼 거리까지 유체가 퍼져나갈 수 있다.
이를 더욱 상세히 살펴보면 유체와 한 표면 사이의 접촉각 θ가 Concus-Finn 범위 내에 있는 경우(예를 들어 두 표면이 90도의 각을 이룰 때 유체와 한 표면 사이의 접촉각은 45도 이내), 이론적으로 유체는 모서리를 따라 무제한의 거리를 이동하게 된다. 하지만 유체와 한 표면 사이의 접촉각 θ가 Concus-Finn범위보다 크고 90도 보다 작은 경우 모서리에서 유체가 두 표면과 동시에 이루는 접촉각 θ`은 하기의 식 1에 따라 계산될 수 있다.
[식 1]
Figure PCTKR2020013587-appb-img-000001
위 식 1에서 접촉각 θ`은 항상 접촉각 θ보다 작은 값을 가지며 이는 하기의 식 2에서 확인할 수 있다.
[식 2]
Figure PCTKR2020013587-appb-img-000002
또한 구조물의 한 표면에서의 유체이동거리(a)와 두 표면이 만나는 모서리에서의 유체의 이동거리(a`)는 하기의 식 3으로 표현될 수 있다(도 9 참조).
[식 3]
Figure PCTKR2020013587-appb-img-000003
따라서 상기 바닥부와 유닛 내벽이 형성하는 바닥부의 내부모서리는 바닥부를 기준으로 70~120°의 각도를 가지는 것이 바람직하다. 상기 내부모서리의 각도가 70°미만인 경우 입구우의 크기가 작아져 유체의 주입이 어려울 뿐만 아니라 웰 유닛의 크기가 작아져 원활한 검사가 어려울 수 있으며, 내부모서리의 각도가 120°를 초과하는 경우 모서리를 따라 이동하는 유체의 이동거리가 짧아져 유체의 주입이 원활하지 않을 수 있다.
이와는 반대로 유체의 전진 방향에 수직한 단차를 만나면 90도의 추가 접촉각을 가지도록 부피가 증가하기 전까지 전진을 중단하고 멈춘다(도 10 참조). 위의 조건을 바탕으로 유체의 고른 분포를 달성하기 위해 본 구조물에서는 목표 공간 바닥면의 이어진 모서리 구조물과 목표 공간 상단부의 단차를 이용하였다(도 10).
이를 더욱 상세히 살펴보면 웰 유닛(110)에 주입된 유체는 표면장력으로 인하여 벽면을 타고 올라가는데, 그 높이는 유체의 중력과 균형을 이루어 결정된다(도 9). 유체가 벽면과 바닥면에 형성하는 구간의 길이(도 11의 a, b)는 유체의 부피에 따라 증가함과 더불어 중력의 영향을 받게 된다. 따라서 유체가 벽면과 바닥면에 형성하는 구간의 길이는 a≥b의 관계를 형성한다.
이때 제1 단차부의 역할은 유체의 수직 방향 전진을 방해하여 유체가 차지하는 표면 면적을 줄이고 중력의 영향을 증대시켜 유체의 수평 방향으로 힘을 가하고 보다 전진시키는 것이며, 도 12에 나타난 바와 같이, 단차가 없는 경우에 비하여 유체가 추가되는 형상이 수평방향으로 쏠릴 수 있다. 또한 단차가 존재하는 경우 용액의 전진방향은 단차의 반대방향으로 제한되므로, 제1 단차부의 높이(b`)이 바닥면의 반지름의 길이(a`)보다 작은 경우에 위 디자인을 적용하는데에 바람직하다. 즉 0<b`<a`의 관계가 성립된다.
또한 중력에 의하여 유체가 균일한 표면을 가질 수 있는 높이는 하기의 식 4와 같으므로,
[식 4]
Figure PCTKR2020013587-appb-img-000004
상기 h높이 이상의 웰유닛에서는 단차 없이도 유체가 충분히 퍼질 수 있으며 이에 따라 제1 단차부의 높이(b`)는 상기 식 4의 h보다 낮은 것이 바람직하다(즉 b`<h). 이때 상기 h는 각 유체에 따라 다른 값을 가질 수 있지만 물의 경우 약 4mm이므로 물과 유사하거나 낮은 h값을 가지는 제1유체를 사용하는 본 발명에서는 상기 제1 단차부의 높이(b`)는 4mm 이하인 것이 바람직하다.
제 2 유체의 부피에 따라 제1 단차부의 높이는 달라질 수 있지만, 제2 유체의 부피가 100㎕ 이며 96웰 플레이트를 구성하기 위해 한 웰의 바닥면의 직경이 대략 8mm 라고 가정할 때, 제1 단차부의 높이는 최소 0.5mm 임을 알 수 있다. 제 2 유체의 부피가 10㎕ 이며 384웰 플레이트를 구성하기 위해 한 웰의 바닥면의 직경이 4mm 라고 가정한다면 제1 단차부의 높이는 0.2mm 임을 알 수 있다. 따라서 제1 단차부의 높이(b`)는 0.2mm 이상인 것이 바람직하다.
즉 상기 단차부의 높이는 0.2~4mm인 것이 바람직하다. 단차부가 0.2mm미만의 높이를 가지는 경우 제2유체가 단차부의 윗부분까지 채우게 되므로 단차부를 사용하는 이점이 없으며, 4mm를 초과하는 높이는 가지는 경우 단차 없이도 유체가 충분히 퍼질 수 있어 이 역시 단차부를 사용하는 이점이 없을 수 있다.
상기 기술에 따라 상기 단차부와 바닥부 내부모서리를 가지는 본 발명의 경우 단차부에 의하여 일정 높이 이상으로의 유체이동이 차단됨과 동시에 바닥부 내부모서리를 통하여 상기 유체의 이동을 빠르게 하는 것으로 웰의 내부에 유체가 고르고 신속하게 분주될 수 있다.
상기 고체 박막의 두께와 너비는 상기 제1 서브웰의 너비와 주입되는 제1 유체의 양에 따라 정해진다. 본 명세서에서 "박막"이라 함은 상기 생물학적 물질을 고정하여 단일 세포 단위로 관찰할 수 있을 정도면 두께가 특별히 제한되지 않으나, 대체로 1㎛ 내지 5mm, 또는 1㎛ 내지 3mm, 또는 1㎛ 내지 2mm, 또는 1㎛ 내지 1.5mm, 또는 1㎛ 내지 1mm, 또는 1㎛ 내지 800㎛, 또는 1㎛ 내지 500㎛, 1㎛ 내지 100㎛, 또는 10㎛ 내지 3mm, 또는 100㎛ 내지 500㎛ 또는 10㎛ 내지 1mm, 또는 100㎛ 내지 1mm, 또는 200㎛ 내지 1mm, 또는 500㎛ 내지 1mm 중 어느 하나의 범위를 갖는 얇은 층을 의미한다. 여기서 고체 박막의 두께는 관찰하고자 하는 고체 박막 면에 대한 수직방향의 크기에 해당할 수 있다. 고체 박막은 상술한 범위의 두께를 가지므로 내부에 고정된 생물학적 물질을 개별 세포(single cell) 단위로 관찰할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 명세서에 개시된 기술의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 사용하면 유체를 분주할 때 제1 유체가 테두리 홈으로 주입된 다음 고화됨에 따라 제1 유체에 의하여 형성되는 고체 박막의 이동 또는 탈락을 최소화 할 수 있으며, 광학 현미경을 이용한 항생제 감수성 검사 시 대상 생물학적 물질의 성장변화를 정확하게 이미징할 수 있다.
또한 상기 제1유체 수용부의 경우 도 1에 나타난 바와 같이 제2 서브웰과는 일정한 단차를 가지게 되며, 분리격벽을 통하여 물리적으로 분리될 수 있다. 하지만 이러한 단차로 인하여 제2 유체가 제2 서브웰에 주입된 다음, 제1 서브웰의 상부로 공급될 때 바닥면 테두리 부분에 기포가 발생할 수 있다. 이러한 기포 형성의 방지를 위하여 상기 제1 서브웰을 벽면은 일정한 경사를 가지는 곡면으로 제작될 수 있다. 특히 분리격벽 쪽의 벽면을 곡면으로 제작하여 제2 유체가 제1 서브웰로 공급될 때 분리격벽의 하단부에서 기포가 발생하는 것을 막음과 동시에 제2 유체가 제1 서브웰을 내부로 균일하게 주입될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명에 따른 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치는 체결 구조를 통해 개폐 가능한 방식으로 제공하거나 혹은 실리콘, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리스티렌(PS), 폴리카보네이트(PC), 테프론 또는 폴리비닐클로라이드(PVC)를 포함하는 재질의 커버 필름으로 처리하여 제공할 수 있다. 상기 커버 필름의 하부 제1 서브웰(120)에 대응하는 위치에 십자 혹은 X자 형태의 타발이 형성되어, 미소량의 제1 유체 투입을 용이하게 하는 제1 유체 투입구로서 작용할 수 있다. 상기 필름의 하부 제2 서브웰(130)에 대응하는 위치에도 십자 혹은 X자 형태의 타발이 형성되어 제2 유체의 투입을 용이하게 하는 제2 유체 투입구로서 작용할 수 있다. 사용상 편의를 고려하여, 제1 유체 투입구의 형태와 제2 유체 투입구의 형태를 달리 하는 것이 바람직하다.
상기 제1 서브웰의 바닥면은 관찰 대상의 위치 정보를 제공하는 포커싱 표지를 포함할 수 있다. 포커싱 표지는 세포배양검사 장치의 관찰 영역을 자동적으로 추적(tracking)할 수 있도록 제1 서브웰 바닥면에 표지될 수 있다. 바닥면에 구비된 포커싱 표지는 사출 몰딩(injection molding)의 방법을 통해서 마이크로채널(microchannel)의 형태로 바닥면에 제작된다. 고체 박막 내 생물학적 물질은 고정되어 있으므로 포커싱 표지를 이용하여 촬영하면, 촬영 시간마다 같은 영역을 촬영할 수 있다. 포커싱 표지는 관찰 영역의 자동 추적에 있어서 x축, y축, z축 3가지 축 방향으로의 위치를 보정하는 역할을 한다.
이하 본 발명을 세포 분석방법을 통하여 상세히 설명한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치를 이용한 세포의 분석방법으로서, 상기 웰 유닛은 제1 유체 및 제2 유체를 주입하기 위한 입구부; 및 상기 제1 유체를 수용하기 위한 제1유체 수용부를 포함하는 제1 서브웰 및 제2 유체를 수용할 수 있으며 항생제를 적재하기 위한 제2 서브웰이 형성된 바닥부를 포함하되, 상기 제1 유체 수용부는 하단부 외주면을 따라 상기 제1 유체의 일부를 수용할 수 있는 테두리 홈이 형성되어 있는 것; 또는 상단부에서 하단부 방향으로 직경이 증가하는 것이며, (a) 상기 제1 유체를 상기 제1 서브웰에 주입하고, 상기 혼합용액을 고화하여 고체 박막을 형성하는 단계; (b) 상기 제2 유체를 제2 서브웰에 투입하여 항생제를 분산 또는 용해하며, 제2 유체를 제2 서브웰 상부의 웰 유닛까지 투입하여 상기 제1 서브웰 내부의 제1 유체의 고체 박막과 접촉시키는 것으로 상기 항생제를 상기 고체 박막으로 확산시키는 단계; 및 (c) 상기 제1 유체의 고체 박막과 상기 제2 유체가 서로 만나 형성된 계면에서 일어나는 생물학적 물질의 변화를 단일세포 단위로 관찰하는 단계;를 포함하는 세포의 분석 방법에 관한 것이다.
먼저 고형화제(gelling agent)를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질(biological agent)의 혼합 용액(제1 유체)을 만든다.
상기 액상 매질은 약 95% 이상의 물을 포함할 수 있으며 고형화제의 존재에 의해 고체화될 수 있다. 고형화제의 예로 한천(agar), 아가로즈(agarose), 젤라틴(gelatin), 알기네이트(alginate), 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 한천 또는 아가로즈가 사용될 수 있다. 일 예로 액상 매질 내에는 한천이 0.3 내지 4 중량%가 사용될 수 있다. 통상적으로 액상 매질은 영양성분을 필요로 하지 않지만, 몇몇 예에 있어 영양성분을 포함할 수도 있다.
상기 생물학적 물질은 바이러스, 박테리아, 균류, 조류, 원생동물, 기생 병원균, 사람 또는 포유류의 세포 및 바이오필름 등을 포함한다. 상기 생물학적 물질은 액상 또는 고상의 배지 내에서 성장할 수 있고 외부 생리활성물질의 종류 및 농도에 따라 성장에 영향을 받을 수 있다. 상기 혼합용액 내에서의 상기 생물학적 물질의 밀도는 10 2내지 10 10cells/ml, 바람직하게는 10 4내지 10 9cells/ml, 더 바람직하게는 10 5내지 10 8cells/ml 일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 생물학적 물질의 위치를 파악하기 어려울 수 있고 상기 범위 초과에서는 개별적인 생물학적 물질의 상태를 파악하기 어려울 수 있다.
이후 상기 제1 서브웰에 제1 유체를 공급한다. 공급된 제1 유체는 위에서 살펴본 바와 같이 제1 유체 수용부에 형성된 테두리 홈에 주입되며 이에 따라 고체 박막 형성시 탈락이 방지될 수 있다. 아울러 테두리 홈을 대신하여 상기 제1 유체 수용부의 벽면을 상단부에서 하단부 방향으로 직경이 증가하도록 설치하여 탈락을 방지할 수도 있다. 이때 제1 유체는 1㎕ 이상, 50㎕ 이하가 공급될 수 있으며, 주입이 완료된 이후 상기 제1 유체를 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체박막을 형성할 수 있다. 높은 온도에서 액상 매질의 온도가 내려감에 따라 매질이 고화됨으로써 상기 생물학적 물질의 움직임이 저하된다. 상기 고정에 의하여 운동성이 있는 상기 생물학적 물질을 계속해서 용이하게 관찰할 수 있다
상기 고체 박막의 두께와 너비는 상기 제1 서브웰의 너비와 주입되는 제1 유체의 양에 따라 정해진다. 본 명세서에서 "박막"이라 함은 상기 생물학적 물질을 고정하여 단일 세포 단위로 관찰할 수 있을 정도면 두께가 특별히 제한되지 않으나, 대체로 1㎛ 내지 5mm, 또는 1㎛ 내지 3mm, 또는 1㎛ 내지 2mm, 또는 1㎛ 내지 1.5mm, 또는 1㎛ 내지 1mm, 또는 1㎛ 내지 800㎛, 또는 1㎛ 내지 500㎛, 1㎛ 내지 100㎛, 또는 10㎛ 내지 3mm, 또는 100㎛ 내지 500㎛ 또는 10㎛ 내지 1mm, 또는 100㎛ 내지 1mm, 또는 200㎛ 내지 1mm, 또는 500㎛ 내지 1mm 중 어느 하나의 범위를 갖는 얇은 층을 의미한다. 여기서 고체 박막의 두께는 관찰하고자 하는 고체 박막 면에 대한 수직방향의 크기에 해당할 수 있다. 고체 박막은 상술한 범위의 두께를 가지므로 내부에 고정된 생물학적 물질을 개별 세포(single cell) 단위로 관찰할 수 있다.
다음으로 상기 웰 유닛(110)에 물, 세포배양용 배지, Dimethylformamide(DMF) 또는 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 포함하는 용매인 제2 유체를 공급한다. 상기 제 2 유체는 웰 유닛(110) 내에 적재되어 있는 항생제를 분산 또는 용해하여 공급하는 역할을 한다. 이때 상기 제2 유체는 바닥부(130)와 하단부(112)를 완전히 채운 이후 계속적으로 공급되어 상기 웰 유닛을 채우게 된다.
아울러 상기와 같이 웰 유닛을 채운 제2 유체는 상기 제1 서브웰까지 공급되어 상기 제1 유체의 고체 박막과 접촉하게 된다. 이에 따라 상기 제2 유체에 분산 또는 용해된 항생제는 상기 고체 박막의 내부로 확산될 수 있다. 또한 이때 위에서 살펴본 바와 같이 테두리 홈 또는 제1유체 수용부의 벽면 형상으로 인하여 상기 제2 유체의 주입에 따른 고체 박막의 탈락이나 이동을 방지할 수 있다.
다음으로, 상기 항생제에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰한다. 상기 생물학적 물질이 상기 고체 박막에 고정됨으로써 2차원적으로 분포하게 되어 결과적으로 단일 세포 단위로 관찰이 가능하다. 일반적으로 개별세포의 성장변화는 수십 분(보통 30분) 이내에 관찰이 가능하기 때문에 생물학적 물질에 대한 항생제의 영향을 기존 방식에 비해 정확하고 빠르게 확인할 수 있다. 예를 들어 박테리아 세포에 대해서 생리활성 검사를 수행할 경우 3~4시간 이내에 검사를 끝낼 수 있다. 본 명세서에서 이러한 빠른 생리활성 검사 방법을 단일 세포 모폴로지 분석(single-cell morphological analysis, SCMA)라고 칭하기로 한다. 상술한 어레이 구조를 가지는 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치를 이용하면 다양한 항생제 조건 하에서 단일 세포 모폴로지의 변화를 시간 경과 이미징(time-lapse imaging)으로 관찰할 수 있다.
관찰을 위해 광학 측정 장치가 사용될 수 있다. 상기 광학 측정 장치는 CCD 또는 CMOS 카메라와 같은 이미지화 시스템을 포함할 수 있다. 상기 광학 측정 장치는 또한 초점을 맞추고 빛을 이미지화하는 데 필요한 렌즈, 조명 및 빛 가이드 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 광학 측정 장치는 카메라에 의해 관찰된 이미지 데이터를 가공 및 분석하기 위한 이미지 처리 시스템을 포함할 수 있다. 상기 광학 측정 장치는 검사 과정에 나타난 생물학적 물질의 성장변화를 빠른 속도로 기록하고 분석하여 검사 결과를 얻는다. 상기 제1 유체의 고체 박막과 상기 제2 유체가 접하는 계면 주위가 이미징 영역이 되는데 상기 이미징 영역은 약 100㎛*100㎛ 내지 4000㎛*4000㎛의 크기를 가질 수 있다. 적어도 상기 제1 서브웰의 횡단면은 상기 이미징 영역보다 큰 너비를 가지는 것이 바람직하다.
결국, 생물학적 물질의 고정과 항생제의 확산방식을 이용하는 상술한 검사 방법을 이용하면 약물 검사에 필요한 약물 및 세포의 양이 종래 기술에 비해 대폭 저감될 수 있고, 단일 세포의 성장변화를 빠른 속도로 추적할 수 있어 빠르면 2 시간 이내에 보통 3~4 시간에 빠른 약물 검사 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다. 이는 현재까지 알려진 최고의 검사 속도이다
일 구현 예에 있어서, (d) 상기 항생제에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
바이오필름은 미생물이 감염되거나 부착된 부분에서 나타나며, 폴리머 기질로 감싸인 미생물에 의해 형성된 점액질의 미생물 복합체를 이루는 막이다. 바이오필름의 형성은 사람의 건강에도 중대한 영향을 끼칠 수 있다. 바이오필름에 의한 감염증으로 폐 감염증, 중이염, 치주염 등이 있다 그런데 바이오필름 내의 세균은 부유 상태보다 항생물질에 대한 내성이 1000배 이상이 되어 문제가 된다. 종래 바이오필름을 연구하기 위한 방법으로 플로우 셀 시스템(flow cell system)이나 웰 기반의 시스템(well based system) 등을 이용한 방법들이 있었으나 이들 어세이 시스템들은 바이오필름 형성을 위해 수 일 간의 장시간이 요구되며, 관찰을 위해서는 염색을 해야 하고, 컨포칼 현미경(confocal microscope)을 이용해야 하는 등의 어려운 면들이 있었다. 또한 최소 억제농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)나 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정할 경우 추가적인 실험이 필요하다. 또한 이러한 시스템들은 크기가 매우 클 뿐 아니라, 바이오필름 형성 단계들(biofilm formation stages)을 분명하게 보여주지 못하고 박테리아 감염에 있어 체내(in vivo) 바이오필름 형성을 대표하지 못한다.
바이오필름의 형성과정과 항생제에 대한 반응성을 연구하기 위한 효율적인 시스템이 요구되며 본 발명의 일 구현 예에 따른 어레이 구조를 가지는 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치는 훌륭한 대안이 될 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.
실시예 1
열가소성 플라스틱 수지(폴리스티렌)를 도 1 및 도 2에 도시된 구조로 사출성형하여 12 x 8개의 정렬된 웰 유닛의 어레이를 갖는 항생제 감수성 검사용 칩을 준비하였다. 이후 후면에 폴리프로필렌 필름을 부착하여 항생제 감수성 검사용 칩을 완성하였다. 이때 상기 제1 유체 수용부의 벽면은 수직으로 제작하였으며, 테두리 홈은 두께 100um, 폭 500um의 크기로 제작하였다.
준비된 웰 유닛에 제1 유체로서 아가로오즈와 균액의 혼합물 10uL를 제1 서브웰의 제1 유체 수용부에 분주하였다. 제1유체 수용부, 테두리홈 및 희생홈에 상기 제1유체가 정상적으로 주입된 것을 확인할 수 있었으며, 제1 유체의 주입이 완료된 다음, 제1유체를 고형화 하고 제2유체(배양액)를 제1 유체와 동일한 방법으로 제2 서브웰에 주입하였으며, 이때 제2 유체는 상기 제1 단차부까지 동일한 양(100uL)을 주입하였다.
실시예 2
상기 실시예 1에서 제1 유체 수용부의 벽면을 수직면을 기준으로 30°의 역경사를 가지도록 제작한 것으로 제외하고 동일하게 실시하였다.
실시예 3
상기 실시예 2에서 테두리홈이 없이 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
비교예 1
상기 실시예 1에서 제1 유체 수용부의 벽면을 수직면 기준으로 85°의 역경사를 가지도록 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
비교예 2
상기 실시예 1에서 상기 테두리 홈을 두께 0.5um, 폭 200um로 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
비교예 3
상기 실시예1 에서 상기 테두리홈의 두께를 2500um, 폭 2500um로 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
비교예 4
상기 실시예 1에서 테두리 홈이 없이 제작한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.
시험예
상기 실시예1~3 및 비교예 1~5의 항생제 감수성 검사용 칩을 각각 20개 제작한 다음(각각 1920 웰), 제1유체 및 제2유체의 주입 불량 여부를 확인하였다. 주입불량은 고체박막 이탈, 고체박막 생성 불량, 생물학적 물질 관찰 불량을 기준으로 판단하였으며, 그 결과는 하기의 표 1과 같다.
고체박막 이탈 고체박막 생성 불량 관찰 불량
실시예 1 0 3 0
실시예 2 0 12 0
실시예 3 0 13 0
비교예 1 0 508 1920
비교예 2 44 2 0
비교예 3 0 1920 0
비교예 4 82 4 0
표 1에 나타난 바와 같이 본 발명의 실시예 1 및 2의 경우 고체박막의 이탈이 최소화되었으며, 생성 불량 및 관찰 불량도 적게 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 비교예 1의 경우 제1 유체 수용부의 높이가 낮아짐에 따라 제1유체가 제1유체 수용부의 외부인 제1 서브웰의 내부에서 박막을 형성하는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 고체 박막의 생성불량 및 관찰 불량이 늘어나는 것을 확인하였다. 제1유체 수용부의 벽면을 수직으로 제작하고 테두리 홈의 크기가 작아진 비교예 2의 경우 많은 웰에서 고체박막의 이탈이 나타난 것으로 확인되었다. 테두리홈의 크기를 크게 제작한 비교예 3의 경우 제1유체의 대부분이 테두리홈으로 주입되어 제1유체 수용부에는 박막이 형성되지 않는 경우가 발생하였으며, 이에 따라 고체박막의 생성 불량 및 관찰 불량이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다. 제1유체 수용부의 벽면을 수직으로 제작하고 테두리홈을 제작하지 않은 비교예 4의 경우 가장 많은 박막 이탈이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.즉 본원 발명의 실시예 1 및 2와 같이 테두리 홈을 설치하는 경우 고체박막의 이탈을 방지할 수 있었으며, 실시예 3과 같이 단순히 제1유체 수용부의 벽면을 일정각도로 경사지게 제작하는 경우에도 이러한 이탈방지효과가 최대화되는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치로서,
    상기 웰 유닛은 제1 유체 및 제2 유체를 주입하기 위한 입구부; 및
    상기 제1 유체를 수용하기 위한 제1유체 수용부를 포함하는 제1 서브웰이 형성된 바닥부를 포함하되,
    상기 제1 유체 수용부는;
    하단부 외주면을 따라 상기 제1 유체의 일부를 수용할 수 있는 테두리 홈이 형성되어 있는 것; 또는
    상단부에서 하단부 방향으로 직경이 증가하는 것인 세포배양검사 장치.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 제1유체 수용부는 고형화된 제1 유체가 제2 유체의 공급에 의하여 이동 또는 탈락되는 것을 방지하는 세포배양검사 장치.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 테두리 홈은 두께 1~2000um 폭 300~2000um으로 형성되는 세포배양검사 장치.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 세포배양검사 장치는 후면부에 제1 유체의 누출을 방지하기 위한 후면 본딩 수단을 포함하는 세포배양검사 장치.
  5. 제4 항에 있어서,
    상기 후면 본딩 수단은 광학적으로 투명한 필름인 세포배양검사 장치.
  6. 제4 항에 있어서,
    상기 후면 본딩 수단은 상기 제1 유체 수용부 및 상기 테두리 홈에 제1 유체의 주입을 용이하도록 하는 압력제어 채널을 포함하는 세포배양검사 장치.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 바닥부는 상기 제2 유체를 수용할 수 있으며 항생제를 특정 위치에 적재하기 위한 제2 서브웰을 포함하는 세포배양검사 장치.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 웰 유닛의 내벽의 둘레를 따라 상기 웰 유닛의 중심방향으로 돌출된 단차부가 존재함으로써, 상기 웰 유닛이 상기 입구부 쪽의 상단부보다 좁은 내부 너비를 갖는 하단부를 갖는 세포배양검사 장치.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 단차부는 상기 제2 유체의 주입시 상기 바닥부로부터 수직방향 전진을 막을 수 있도록 상기 제2 유체의 전진방향에 대해 90도 이상의 각도를 갖는 것인 세포배양검사 장치.
  10. 제8 항에 있어서,
    상기 단차부는 상기 내벽의 둘레를 따라 연결된 모서리의 형상을 갖는 것인 세포배양검사 장치.
  11. 복수의 웰 유닛들을 구비한 세포배양검사 장치를 이용한 세포의 분석방법으로서,
    상기 웰 유닛은 제1 유체 및 제2 유체를 주입하기 위한 입구부; 및 상기 제1 유체를 수용하기 위한 제1유체 수용부를 포함하는 제1 서브웰 및 제2 유체를 수용할 수 있으며 항생제를 적재하기 위한 제2 서브웰이 형성된 바닥부를 포함하되, 상기 제1 유체 수용부는 하단부 외주면을 따라 상기 제1 유체의 일부를 수용할 수 있는 테두리 홈이 형성되어 있는 것; 또는 상단부에서 하단부 방향으로 직경이 증가하는 것이며,
    (a) 상기 제1 유체를 상기 제1 서브웰에 주입하고, 상기 혼합용액을 고화하여 고체 박막을 형성하는 단계;
    (b) 상기 제2 유체를 제2 서브웰에 투입하여 항생제를 분산 또는 용해하며, 제2 유체를 제2 서브웰 상부의 웰 유닛까지 투입하여 상기 제1 서브웰 내부의 제1 유체의 고체 박막과 접촉시키는 것으로 상기 항생제를 상기 고체 박막으로 확산시키는 단계; 및
    (c) 상기 제1 유체의 고체 박막과 상기 제2 유체가 서로 만나 형성된 계면에서 일어나는 생물학적 물질의 변화를 단일세포 단위로 관찰하는 단계;를 포함하는 세포의 분석 방법.
  12. 제11 항에 있어서,
    (d) 상기 항생제에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정하는 단계를 더 포함하는 세포의 분석 방법.
PCT/KR2020/013587 2020-03-06 2020-10-06 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치 WO2021177531A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20923237.0A EP4006137A4 (en) 2020-03-06 2020-10-06 RAPID CELL CULTURE TESTING DEVICE CAPABLE OF PREVENTING SEPARATION OF SOLIDIFIED FLUID

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200028512A KR102127765B1 (ko) 2020-03-06 2020-03-06 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치
KR10-2020-0028512 2020-03-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021177531A1 true WO2021177531A1 (ko) 2021-09-10

Family

ID=71400920

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2020/013587 WO2021177531A1 (ko) 2020-03-06 2020-10-06 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4006137A4 (ko)
KR (1) KR102127765B1 (ko)
WO (1) WO2021177531A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102127765B1 (ko) * 2020-03-06 2020-06-29 주식회사 퀀타매트릭스 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치
CN116783276A (zh) * 2020-12-28 2023-09-19 分子装置(奥地利)有限公司 用于细胞培养的微孔板孔
USD1028280S1 (en) 2021-12-27 2024-05-21 Molecular Devices (Austria) GmbH Organoid microplate

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011167101A (ja) * 2010-02-17 2011-09-01 Stem Biomethod Corp 細胞収容装置
JP3191179U (ja) * 2014-03-25 2014-06-12 株式会社精工技研 培養容器
JP2016129495A (ja) * 2015-01-13 2016-07-21 大日本印刷株式会社 細胞培養容器
KR101711105B1 (ko) * 2016-04-21 2017-03-06 주식회사 퀀타매트릭스 신속한 항생제 감수성 검사를 위한 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치
KR102127765B1 (ko) * 2020-03-06 2020-06-29 주식회사 퀀타매트릭스 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3957583A (en) * 1974-12-02 1976-05-18 Mcdonnell Douglas Corporation Apparatus and process for determining the susceptibility of microorganisms to antibiotics
NZ709321A (en) * 2013-01-11 2018-02-23 Regeneron Pharma Systems and devices for sample handling
WO2015078884A1 (en) * 2013-11-26 2015-06-04 Alleati Ag Method and microfluidic assembly for antibiotic susceptibility testing
WO2016161022A2 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Accerlate Diagnostics, Inc. Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing
KR101718920B1 (ko) 2015-06-30 2017-03-23 (주) 마이크로핏 다각형 마이크로 플레이트, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법
US20170191020A1 (en) * 2015-12-30 2017-07-06 Palo Alto Research Center Incorporated Thermochromic sensing devices, systems, and methods

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011167101A (ja) * 2010-02-17 2011-09-01 Stem Biomethod Corp 細胞収容装置
JP3191179U (ja) * 2014-03-25 2014-06-12 株式会社精工技研 培養容器
JP2016129495A (ja) * 2015-01-13 2016-07-21 大日本印刷株式会社 細胞培養容器
KR101711105B1 (ko) * 2016-04-21 2017-03-06 주식회사 퀀타매트릭스 신속한 항생제 감수성 검사를 위한 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치
KR102127765B1 (ko) * 2020-03-06 2020-06-29 주식회사 퀀타매트릭스 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP4006137A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4006137A4 (en) 2023-11-01
EP4006137A1 (en) 2022-06-01
KR102127765B1 (ko) 2020-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021177531A1 (ko) 고형화된 유체의 이탈을 방지할 수 있는 신속한 세포배양검사 장치
WO2014178692A1 (ko) 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치
WO2017183875A1 (ko) 신속한 항생제 감수성 검사를 위한 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치
KR101290648B1 (ko) 고형화제를 이용한 세균 고정, 약물 확산, 세균 단일 세포 추적과 이를 기반으로 한 빠른 약물 검사 시스템
JP6666313B2 (ja) 微小流体システムにおける空気装置用コネクタ
EP1886177B1 (en) Counting, viability assessment, analysis and manipulation chamber
WO2022098065A1 (ko) 현장진단용 다중 초고속 핵산 추출 및 증폭이 가능한 통합칩
WO2021177530A1 (ko) 정확한 관찰이 용이한 신속한 세포배양검사 장치
WO2021187702A1 (ko) 섬 구조물을 포함하는 신속한 세포배양검사 장치
WO2022154332A1 (ko) 애널라이트 검사 장치 및 이를 이용한 애널라이트 검사 방법
WO2022267247A9 (zh) 培养装置
WO2021075806A1 (ko) 세포배양장치
WO2021187703A1 (ko) 유체막 두께가 일정한 신속한 세포배양검사 장치
WO2023033224A1 (ko) 핵산 추출 모듈 및 이를 구비하는 핵산 검사 시스템
WO2024019204A1 (ko) 세포 이미징 시 왜곡현상 및 결로현상의 발생을 방지하여 깨끗한 이미지를 얻을 수 있는 세포 배양 용기 및 그 제조 방법
WO2024143738A1 (ko) 조직 또는 세포배양용 직립형 배양슬라이드 장치
WO2019172634A1 (ko) 약물 반응성 검사 장치

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20923237

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020923237

Country of ref document: EP

Effective date: 20220225

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE