CN117143799B - 深海海笔体细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及深海海笔体细胞的培养方法。本发明提供了深海海笔体细胞的培养方法及其培养基，其特征在于所述培养基含有FBS和扇贝提取液。本发明提供的深海海笔体细胞的培养方法，实现了深海海笔体细胞的培养，促进深海动物的科学研究。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及深海海笔体细胞的培养方法。
背景技术
细胞系具有供体来源完整的遗传物种，在一定程度上可被用来替代动物的整体来开展实验研究。而且，一般来说，细胞系培养是在特定条件下开展的，实验条件已知，可控。因此，开发细胞系对开展供体动物的研究具有重要的作用和意义。近年来，随着我国深潜技术的发展，研发了一批专用于深海探索的设备装置，加快了我们对深海资源的探索。在深海生物方面，许多深海动物被陆续发现和报道，然而，深海动物在取样过程，由于压力的急剧变化往往会很快死亡，非常不利于开展后续的研究工作。为应对压力变化导致动物死亡的问题，一些公司和科研院所开发了原位采集装置，保压取样设备等，甚至开发了原位实验装置，以期获得原位保真样品，这无疑增加了深海动物研究的成本和难度。在实际工作中，我们观测到虽然深海动物在取样的过程由于压力急剧变化而死亡，但经过染色发现一些深海动物的部分体细胞在解剖取样过程仍然能够存活一段时间。针对这些特点，若能开展深海动物的细胞培养方法，建立深海动物细胞系，不仅能节约深海动物研究的成本，还能为深海动物的可持续研究提供试验材料。目前，有关深海动物的细胞培养方法还未见报道。
深海海笔是珊瑚虫纲海鳃目动物，是常见的深海底栖物种，根据现有需要，开发深海海笔体细胞的培养方法无疑可为深海生物特别是宏生物方面的研究提供极大的便利。然而深海海笔是一种常见的深海底栖物种，由于深海采样难度大，高度依赖大型深潜设备和取样设施，目前，还未见深海动物细胞培养的有关的方法和报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了深海海笔体细胞的培养方法，实现深海海笔的体细胞离体培养，因此，本发明可为深海生物特别是宏生物的研究提供重要的实验材料。又因为细胞的培养条件可控，简单，因此，本发明可减少深海生物研究中对深海动物样品的依赖。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了深海海笔细胞培养基，其制备方法包括：取FBS、扇贝提取液与溶剂为无菌海水的L15培养基混合，获得所述深海海笔细胞培养基；
所述扇贝提取液的制备方法包括：收集华贵栀孔扇贝的扇贝柱组织，匀浆，离心，收集上清液，过滤，获得所述扇贝提取液。
在本发明的一些具体实施方案中，上述深海海笔细胞培养基中：
所述无菌海水包括盐度为30‰无菌海水；和/或
所述FBS在所述深海海笔细胞培养基中的含量为5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%或15% (v/v)；和/或
所述扇贝提取液在所述深海海笔细胞培养基中的含量为2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%或5% (v/v)。
在本发明的一些具体实施方案中，上述深海海笔细胞培养基中，所述扇贝提取液的制备方法还包括：收集华贵栀孔扇贝的扇贝柱组织，每1g组织加入5 mL缓冲液匀浆，第一次离心，收集上清液1，第二次离心，收集上清液2，过滤所述上清液2，获得所述扇贝提取液。
在本发明的一些具体实施方案中，上述深海海笔细胞培养基中：
所述缓冲液包括含PMSF的DPBS；和/或
所述缓冲液的pH为8.2；和/或
所述第一次离心的温度包括4℃；和/或
所述第一次离心的转速包括3500 rpm；和/或
所述第一次离心的时间包括10 min；和/或
所述第二次离心的温度包括4℃；和/或
所述第二次离心的转速包括10000 rpm；和/或
所述第二次离心的转速包括10 min；和/或
所述过滤包括用孔径为0.22 μm的滤器过滤。
本发明还提供了深海海笔细胞的培养方法，其基于上述深海海笔细胞培养基培养。
在本发明的一些具体实施方案中，上述培养方法包括：剪取深海海笔的触手组织，灭菌，分解成组织块，静置收集活细胞，接入含有抗生素的上述深海海笔细胞培养基，培养所述深海海笔细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，上述培养方法包括如下步骤：
步骤（1）：采集深海海笔；
步骤（2）：剪取步骤（1）所述的深海海笔的触手组织，蘸取3次预冷的75%酒精，放入预冷的无菌海水中，清洗表面杂质，转移至含有2×抗生素的无菌海水中吹打，取出所述触手组织，剪碎，用含有1×抗生素的无菌海水重悬，静置，吸取底层海水；
步骤（3）：取台盼蓝与步骤（2）所述底层海水混合，镜检若有活细胞，去除所述底层海水中的大组织块，并将剩下的细胞接入上述深海海笔细胞培养基培养，获得深海海笔细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，上述培养方法中，步骤（1）中采集深海海笔后还包括将深海海笔置于4℃中。
在本发明的一些具体实施方案中，上述培养方法中，所述抗生素包括100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素和0.50 mg/mL庆大霉素。
在本发明的一些具体实施方案中，上述培养方法中，步骤（3）后还包括细胞传代的步骤；
所述细胞传代包括：重悬所述深海海笔细胞，静置沉淀，移去上层培养基，剩余的细胞接入新的深海海笔细胞培养基，完成传代。
本发明的深海海笔体细胞的培养方法有如下效果：
实验表明，培养基中添加5% FBS可以显著促进海笔细胞的生长，提高FBS浓度至10%不再提高细胞的生长速度，更高浓度的FBS如15%对海笔细胞的生长显示抑制作用（如图1所示）。
实验表明，扇贝提取液≤5%浓度范围内能显著促进海笔细胞，更高浓度的扇贝提取液能显著抑制细胞的生长（如图1所示）。
实验表明，在组合培养中，在培养基加入5%FBS，扇贝提取液在2.5%～5%范围内能显著促进海笔细胞的增殖，其中5%扇贝提取液组获得了效果最佳（如图1所示）。
综上所述，海笔细胞培养中，FBS浓度在5～15%，扇贝提取液浓度在≤5%均可以促进海笔细胞增殖，其中5% FBS+5%扇贝提取获得效果最佳。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示FBS和扇贝提取液对海笔细胞培养的影响；具体方法为：在6孔板中种100000个海笔细胞，培养21天后，对每种处理方法获得的细胞进行计数；ns:表示不显著P>0.05，*表示显著P<0.05，**表示极显著P<0.01，FBS表示胎牛血清；AE表示扇贝提取液AdductorExtraction，AE）；
图2示本发明分解示意图；
图3示深海海笔细胞培养，分别是培养10天、30天、65天和90天的海笔细胞；其中，第一行左图示培养10天；第一行右图示培养30天；第二行左图示培养65天；第二行右图为左图放大后的展示；第三行左图示培养90天；第三行右图为左图放大后的展示。
具体实施方式
本发明公开了深海海笔体细胞的培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的目的在于解决上述已有技术存在的不足之处，提供一种深海海笔体细胞的培养方法，实现深海海笔体细胞的培养，促进深海动物的科学研究。
本发明的首要目的在于提供一种深海海笔体细胞的培养方法，其特殊之处在于包括以下步骤：
深海海笔样品采集→无菌处理→组织低温镜检→细胞收集培养→细胞传代培养。具体为：
1）深海海笔样品采集：借助潜器（如“奋斗者”号）设备，搜寻深海海笔，取样后放入可保温的生物箱中；潜器在上升过程中盖好生物箱，避免生物箱水体和外界交换造成箱内水体温度过高。在生物箱到达甲板后迅速转移到4℃冷库中。
2）无菌处理：剪取部分触手组织，用预冷的75%酒精蘸取3次，放入预冷的无菌海水中，用1 mL移液器吹打，去除表面附着的清洗泥沙等杂质。洗净后无菌镊子夹取放入新的EP管中，加入含有2×抗生素的无菌海水中，用1 mL枪头进行吹打清洗3次，转入新的无菌离心管中，剪碎成约1 mm3大小，加入含有1×抗生素的无菌海水，轻轻吹打重悬。转入25 mL培养瓶中。4℃暂时存放。
3）组织低温镜检：若海笔组织有活细胞存在，会从组织块中移动出来，海笔细胞在静置的状态下会沉到底部。约3h，轻轻吸取底层组织周围可能还有细胞的海水，加入预冷的台盼蓝染色，显微镜下观察细胞的形态，死细胞会被染成蓝色。
4）细胞收集培养：镜检后若含有活细胞，用剪口的枪头轻轻吸取底层的细胞，经过细胞栅去除大组织块，转入新的培养瓶中，加入含有1×抗生素的完全培养基中，4oC静置培养。在第3周时，能够观察到有分裂的细胞。
5）细胞传代培养：海笔细胞会沉底但不贴壁，因此，在传代时，可用1 mL移液器吹打培养瓶壁，将细胞重悬，然后直立培养瓶，静置一段时间（约1h）后待细胞沉淀后，轻轻移去上层培养基，底层含有细胞的部分可以移入新的培养瓶中，加入新鲜完全培养基进行培养。
根据本发明的实施例，步骤2）所述抗生素为青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液，浓度分别为100 U/mL，0.1 mg/mL，和0.50 mg/mL。
根据本发明的实施例，步骤2）无菌海水为海水素（青岛海之盐水族科技有限公司）＋去离子水配置，盐度为30‰。
根据本发明的实施例，步骤3）中台盼蓝，为25‰海水进行配置。
根据本发明的实施例，步骤4）中完全培养基，配置方法为L15培养基（41300-070，ThermoFisher），加入盐度为30‰无菌海水，5%FBS（#FB55011，CLARK），5%扇贝提取液（自制）。
本发明涉及的扇贝提取液的制备方法包括：选取健康的华贵栀孔扇贝，解剖收集扇贝柱组织，用预冷无菌海水清洗，每1g组织加入5 mL含PMSF的DPBS（1mM，pH 8.2）匀浆，4℃ 3500 rpm离心10 min去除沉淀，收集上清液，4℃ 10000 rpm离心10 min，上清液0.22 μm过滤，分装后，-80℃冻存备用。
如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：深海海笔体细胞的培养方法
包括以下步骤：
1、深海海笔样品采集：借助“奋斗者”号潜器，在FDZ178潜次，采集了深海海笔一枝，采集深度为5668 m，放入保温生物箱中，随潜器回收至甲板后，剪取部分组织样品迅速转入4oC冷库中。
2、无菌处理：剪取部分触手组织，放入无菌海水中进行多次清洗去除泥沙，用预冷的75%酒精蘸取3次，放入预冷的无菌海水中，用1 mL移液器吹打，去除表面附着的清洗泥沙等杂质。洗净后无菌镊子夹取放入新的EP管中，加入含有2×抗生素的无菌海水中，用1 mL枪头进行吹打清洗3次，转入新的无菌离心管中，剪碎成约1 mm3大小，加入含有1×抗生素（青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液，浓度分别为100 U/mL，0.1 mg/mL，和0.50 mg/mL）的无菌海水（海水素＋去离子水配置，盐度为30‰），轻轻吹打重悬。转入25 mL培养瓶中。4℃暂时存放。
3、组织低温镜检：若海笔组织有活细胞存在，会从组织块中移动出来，海笔细胞在静置的状态下会沉到底部。约3h，轻轻吸取底层组织周围可能还有细胞的海水，加入预冷的台盼蓝染色，显微镜下观察细胞的形态，死细胞会被染成蓝色。
4、细胞收集培养：镜检后若含有活细胞，用剪口的枪头轻轻吸取底层的细胞，经过细胞栅去除大组织块，转入新的培养瓶中，加入含有1×抗生素的完全培养基（制备方法为：L15培养基粉末，加入盐度为30‰无菌海水，5%FBS，5%扇贝提取液）中，静置培养。图3示培养10天，30天，65天和90天的海笔细胞。
5、细胞传代培养：海笔细胞会沉底但不贴壁，因此，在传代时，可用1 mL移液器吹打培养瓶壁，将细胞重悬，然后直立培养瓶，静置一段时间（约1 h）后待细胞沉淀后，轻轻移去上层培养基，底层含有细胞的部分可以移入新的培养瓶中，加入新鲜完全培养基进行培养。
实施例2：FBS和扇贝提取液对海笔细胞培养的影响
深海海笔样品采集、无菌处理、组织低温镜检、同实施例1，镜检后若含有活细胞，用剪口的枪头轻轻吸取底层的细胞，经过细胞栅去除大组织块，转入6孔板，单孔种100,000个海笔细胞，培养21天后，对每种处理方法获得的细胞进行计数。所述处理方法为使用不同的完全培养基对海笔细胞进行培养，所述不同的完全培养基含有L15培养基、盐度为30‰无菌海水以及：
（a）、2.5% FBS；或
（b）、5% FBS；或
（c）、10% FBS；或
（d）、15% FBS；或
（e）、2.5% AE；或
（f）、5% AE；或
（g）、10% AE；或
（h）、5% FBS和2.5% AE；或
（i）、5% FBS和5% AE；或
（j）、5% FBS和10% AE。
所述完全培养基的制备方法为：L15培养基粉末，加入盐度为30‰无菌海水、FBS、扇贝提取液。
结果如图1、表1所示，表明：
（1）、培养基中添加5% FBS可以显著促进海笔细胞的生长，提高FBS浓度至10%不再提高细胞的生长速度，更高浓度的FBS如15%对海笔细胞的生长显示抑制作用；
（2）扇贝提取液≤5%浓度范围内能显著促进海笔细胞，更高浓度的扇贝提取液能显著抑制细胞的生长；
（3）在组合培养中，在培养基加入5%FBS，扇贝提取液在2.5%～5%范围内能显著促进海笔细胞的增殖，其中5%扇贝提取液组获得了效果最佳。
表1：不同FBS和AE组合对海笔细胞的影响
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.深海海笔细胞培养基，其特征在于，取FBS、扇贝提取液与溶剂为无菌海水的L15培养基混合，获得所述深海海笔细胞培养基；
所述无菌海水为盐度为30‰无菌海水；
所述FBS在所述深海海笔细胞培养基中的含量为5%～15% (v/v)；
所述扇贝提取液在所述深海海笔细胞培养基中的含量为2.5%～5%(v/v)；
所述扇贝提取液的制备方法为：收集华贵栀孔扇贝的扇贝柱组织，每1g组织加入5 mL缓冲液匀浆，第一次离心，收集上清液1，第二次离心，收集上清液2，过滤所述上清液2，获得所述扇贝提取液；
所述缓冲液为含1mMPMSF的DPBS；
所述缓冲液的pH为8.2；
所述第一次离心的温度为4℃；
所述第一次离心的转速为3500rpm；
所述第一次离心的时间为10min；
所述第二次离心的温度为4℃；
所述第二次离心的转速为10000rpm；
所述第二次离心的转速为10min；
所述过滤包括用孔径为0.22μm的滤器过滤。
2.深海海笔细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1）：采集深海海笔；
步骤（2）：剪取步骤（1）所述的深海海笔的触手组织，蘸取3次预冷的75%酒精，放入预冷的无菌海水中，清洗表面杂质，转移至含有2×抗生素的无菌海水中吹打，取出所述触手组织，剪碎，用含有1×抗生素的无菌海水重悬，静置，吸取底层海水；
步骤（3）：取台盼蓝与步骤（2）所述底层海水混合，镜检若有活细胞，去除所述底层海水中的大组织块，并将剩下的细胞接入如权利要求1所述的深海海笔细胞培养基培养，获得深海海笔细胞；
步骤（4）：细胞传代：重悬所述深海海笔细胞，静置沉淀，移去上层培养基，剩余的细胞接入新的深海海笔细胞培养基，完成传代。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中采集深海海笔后还包括将深海海笔置于4℃中的步骤。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述抗生素包括100 U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和0.50 mg/mL庆大霉素。
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