CN114945378A - 用于分层上皮干细胞的基于饲养层和无饲养层干细胞培养系统及其相关用途 - Google Patents

用于分层上皮干细胞的基于饲养层和无饲养层干细胞培养系统及其相关用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及可用于在培养中分离正常干细胞并使其表观遗传稳定地增殖的培养基系统，其中干细胞是来源于分层上皮组织的，以及来自上皮癌的癌症干细胞。在某些实施方案中，培养系统是无饲养层系统。

Description

用于分层上皮干细胞的基于饲养层和无饲养层干细胞培养系 统及其相关用途
优先权申明
本申请要求2020年10月10日提交的美国临时申请序列号62/913,226的优先权权益，其全部内容在此通过引用并入。
背景技术
分层上皮不同于简单上皮，因为它是多层的。因此，经常会发现身体衬里必须承受机械或化学损伤以使得层可在不暴露上皮下层的情况下磨损和丢失。随着细胞层变得更加顶端，细胞变平，但是在它们的最基底层中，细胞可以是鳞状的或立方形的。
分层上皮包括柱状、立方形和鳞状类型。鳞状上皮存在于衬里表面(例如皮肤和肺中的肺泡等)使简单的被动扩散成为可能，这也见于肺中的肺泡上皮。特化的鳞状上皮也形成腔衬里，例如在血管中(如内皮)和心包中(如间皮)和其他体腔中。
立方形上皮细胞具有立方体样形状，并且显示出截面呈正方形。细胞核大、呈球形，并位于细胞中心。立方形上皮通常存在于分泌组织(例如外分泌腺)、或吸收组织(例如胰腺)、肾小管衬里以及腺的管中。覆盖女性卵巢的生发上皮和排列在睾丸中生精小管壁上的生发上皮也是立方形的。立方形细胞提供保护，并且可以主动将材料泵入或泵出管腔，或者根据它们的位置和特化而被动进行。简单的立方形上皮通常分化形成腺体的分泌和导管部分。分层的立方形上皮保护例如汗腺、乳腺和唾液腺的导管等区域。
柱状上皮细胞是细长的且呈柱状，并且高度至少是其宽度的四倍。它们的细胞核是细长的，并且通常位于细胞基部附近。柱状上皮形成胃和肠的衬里。这里的细胞可能具有微绒毛以使用于吸收的表面积最大化，并且这些微绒毛可以形成刷状边界。其他细胞可能有纤毛以移动黏液，以起到黏液纤毛清除的功能。在输卵管、子宫和脊髓中央管中发现了其他纤毛细胞。一些柱状细胞特化用于感觉接收，例如在鼻、耳和味蕾中。内耳中的毛细胞具有类似于微绒毛的静纤毛。杯状细胞是经修饰的柱状细胞，并且存在于十二指肠的柱状上皮细胞之间。它们分泌黏液，黏液起到润滑剂的作用。单层无纤毛柱状上皮倾向于指示吸收功能。分层柱状上皮很少见，但存在于眼、咽部、性器官和唾液腺的叶管(lobar duct)中。这由位于至少一个其他上皮细胞层上的细胞层组成，这些上皮细胞可以是鳞状、立方形或柱状的。
原代细胞(特别是干/祖细胞群)的分离和长期扩增在多个生物学领域包括发育生物学和干细胞生物学以及医学科学中是基础且重要的基本技术。分层上皮组织中的细胞高度可再生，并且不成比例地导致许多人癌症和炎性疾病/自身免疫病；然而，克隆上皮干细胞受到难以将这些细胞维持在未成熟状态的限制。然而，体外无法维持干细胞群的不成熟，限制了多种类型的人上皮干细胞的长期扩增。
例如，大多数人癌症来源于上皮组织。自1990年代后期引入癌症干细胞(“cancerstem cell，CSC”)的概念以来，它已被接受为肿瘤启动、增殖和最终产生药物抗性的机制；这些干细胞影响了癌症研究和治疗的所有方法，因为它们有助于机械地解释从较良性到更具侵袭性形式的癌症的进展。大多数癌症药物在杀伤大部分肿瘤细胞的同时，最终无法诱导持久的临床响应，因为它们无法消除对现有癌症治疗(包括靶向药物、化学治疗和放射治疗)具有抗性的关键CSC。存活的CSC会产生新的肿瘤和转移，导致疾病复发。复发的肿瘤变得更加恶性，扩散快，并对放射治疗和先前使用的药物具有抗性，使癌症患者的预后不良。
更复杂的是，许多肿瘤被认为含有异质的CSC群，代表一系列肿瘤促进活性和一系列药物敏感性。因此，CSC或来自异质CSC群的CSC亚群的特定存活可以为许多治疗失败提供解释，并突出了增强癌症治疗的新方向。为了开发可产生持久临床响应的真正有效的治疗，开发可靶向并杀伤CSC的药物非常重要。由于技术进步有助于识别、分离和探询具有不同的形成并延续肿瘤能力的不同肿瘤细胞亚群，CSC直到最近才开始被精确识别。因此，需要用于分离和稳定传代和扩增分层上皮CSC的方法和试剂，以便可用于药物筛选中。
本发明的一个目的是提供用于在保留表观遗传记忆和准确保留干细胞体内特征的条件下快速分离/克隆分层上皮干细胞(特别是来自小活检)的系统和试剂，因为它们通过在培养中数轮扩增和传代而存在于组织活检中，从而可扩张、高效并最终足以负担得起在逐个患者的过程中完成，以实现患者特定的诊断和治疗策略目的(以炎性疾病和化生/肿瘤作为实例)或再生医学的目的。
发明内容
在一个方面中，本发明提供了用于从上皮组织，优选分层上皮组织(例如正常或病变组织)中分离干细胞的方法，所述方法包括：
(1)培养从分层上皮组织样品中解离的上皮细胞以形成干细胞集落，其中将解离的细胞和细胞集落在包含以下的培养基中培养：
(a)ROCK(Rho激酶)抑制剂；(c)促分裂生长因子(mitogenic growth factor)；(d)胰岛素或IGF；(e)TrkA抑制剂(GW441756)；和(h)Oct4激活剂；
其中所述培养基包含VEGF抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或FGF10或FGF10激动剂中的至少一种；
其中所述培养基任选地还包含TGFβ信号传导途径抑制剂(例如，TGFβ抑制剂或TGFβ受体抑制剂)；
其中所述培养基任选地还包含骨形态生成蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)拮抗剂；
其中所述培养基任选地还包含Wnt激动剂；
其中来自组织样品的细胞任选地与有丝分裂失活的饲养细胞流体接触或直接接触，但优选地在没有饲养细胞的情况下培养；
其中来自组织样品的细胞任选地与胞外基质(例如基底膜基质)或者其他生物基质或合成基质接触；
(2)从细胞集落中分离单个干细胞，以及
(3)单独培养来自步骤(2)的分离的单个干细胞以形成培养物纯化的干细胞克隆，(任选地)在培养基中与饲养细胞和/或基底膜基质接触；其中每个干细胞克隆代表存在于分层上皮组织样品中的上皮干细胞的克隆扩增，从而分离分层上皮干细胞。
在某些优选的实施方案中，培养基包含VEGF抑制剂，优选为小分子酪氨酸激酶抑制剂的VEGF抑制剂。在某些优选的实施方案中，培养基包含VEGF抑制剂并且缺乏FGF10或FGF10激动剂。在某些优选的实施方案中，培养基包含VEGF受体激酶抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂二者，它们可以是相同或不同的化合物。在某些优选的实施方案中，培养基包含VEGF受体激酶抑制剂和Pan-ABL1激酶抑制剂，它们可以是相同或不同的化合物。
在本发明的一些无饲养层(feeder-free)实施方案中，培养基还包含(i)SYK抑制剂；(j)LPA受体拮抗剂；(k)GSK3抑制剂；和(1)CK2抑制剂。
在某些实施方案中，来自患有疾病、障碍或异常病症的患者的上皮组织受到疾病、障碍或异常病症的折磨。在某些实施方案中，分层上皮干细胞是成体分层上皮干细胞。在某些实施方案中，分层上皮干细胞是胎儿分层上皮干细胞。
在某些实施方案中，培养基任选地还包含烟酰胺和/或包含Notch激动剂。
在某些其他实施方案中，培养基特别地缺乏烟酰胺中的一种或两种和/或包含Notch激动剂。
在某些实施方案中，在步骤(1)中，(上皮)细胞通过用酶进行酶消化而从组织中解离。例如，酶可以包含胶原酶、蛋白酶、分散酶、链霉蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、accutase或胰蛋白酶。
在某些实施方案中，在步骤(1)中，(上皮)细胞通过溶解围绕(上皮)细胞的胞外基质而从组织中解离。
在涉及与饲养细胞流体接触的某些实施方案中，有丝分裂失活的细胞是有丝分裂失活的成纤维细胞，优选人或鼠成纤维细胞，例如3T3-J2细胞。有丝分裂失活可以通过施用丝裂霉素C或其他基于化学的有丝分裂抑制剂、用γ射线辐照、用X射线辐照和/或用UV光辐照来完成。
在涉及与胞外基质接触的某些实施方案中，胞外基质是基底膜基质，例如含有层黏连蛋白的基底膜基质(例如，MATRIGELTM基底膜基质(BD Biosciences))并且优选是生长因子降低的。在另一些实施方案中，生物聚合物选自以下：胶原、壳聚糖；纤连蛋白、纤维蛋白及其混合。
在某些实施方案中，基底膜基质不支持3维生长或不形成支持3维生长所必需的3维基质。
在某些实施方案中，培养基还包含血清，优选FBS(并且甚至更优选不是经热灭活的FBS)，例如浓度为5％至15％，例如10％FBS。
在某些实施方案中，ROCK抑制剂包含Rho激酶抑制剂VI(Y-27632，(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺))、法舒地尔(Fasudil)或HA1077(5-(1，4-二氮杂环庚烷-1-基磺酰基)异喹啉)，或HI 152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1，4-二氮杂
Figure BPA0000322182560000051
二盐酸盐)。
在某些实施方案中，BMP拮抗剂包含头蛋白(Noggin)、DAN、包含DAN胱氨酸结结构域的DAN样蛋白(例如，Cerberus和Gremlin)、腱蛋白(Chordin)、包含腱蛋白结构域的腱蛋白样蛋白、卵泡抑制素、包含卵泡抑制素结构域的卵泡抑制素相关蛋白、骨硬化蛋白/SOST、饰胶蛋白聚糖或α-2大球蛋白。在某些优选的实施方案中，BMP拮抗剂是头蛋白。
在某些实施方案中，培养基包含Wnt激动剂，例如R-脊椎蛋白(spondin)1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3、R-脊椎蛋白4、R-脊椎蛋白模拟物、Wnt家族蛋白(例如Wnt-3a、Wnt 5、Wnt-6a)、Norrin或GSK抑制剂(例如CHIR99021)。
在某些实施方案中，促分裂生长因子包含EGF、角质细胞生长因子(KeratinocyteGrowth Factor，KGF)、TGFa、BDNF、HGF和/或FGF(例如，FGF7或FGF10)。
在某些实施方案中，TGF-β受体抑制剂包含SB431542(4-(4-(5-苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-基)-4-(吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)苯甲酰胺)、A83-01、SB505124、SB-525334、LY 364947、SD-208或SJN 2511。
在某些实施方案中，TGF-β(信号传导)抑制剂与选自ALK5、ALK4、TGF-β受体激酶1和ALK7的一种或更多种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结合并降低其活性。
在某些实施方案中，TGF-β(信号传导)抑制剂以1nM至100μM、10nM至100μM、100nM至10μM或约1μM的浓度添加。
在某些实施方案中，VEGF抑制剂选自阿柏西普(aflibercept)、哌加他尼(pegaptanib)、替沃扎尼(tivozanib)、3-(4-溴-2，6-二氟-苄氧基)-5-[3-(4-吡咯烷-1-基-丁基)-脲基]-异噻唑-4-羧酸酰胺盐酸盐、阿西替尼(axitinib)、N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基-)甲氧基]喹唑啉-4-胺、VEGF-R2和VEGF-R1的抑制剂、阿西替尼、N，2-二甲基-6-(2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)噻吩并[3，2-b]吡啶-7-基氧基)苯并[b]噻吩-3-甲酰胺、RET/PTC致癌激酶的酪氨酸激酶抑制剂、N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺、泛-VEGF-R-激酶抑制剂；蛋白激酶抑制剂、多靶标人表皮受体(human epidermal receptor，HER)1/2和血管内皮细胞生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)1/2受体家族酪氨酸激酶抑制剂、西地尼布(cediranib)、索拉非尼(sorafenib)、瓦他拉尼(vatalanib)、谷氨酰胺二钠(glufanide disodium)、VEGFR2选择性单克隆抗体、angiozyme、基于siRNA的VEGFR1抑制剂、5-((7-苄基氧基喹唑啉-4-基)氨基)-4-氟-2-甲基苯酚盐酸盐、其任何衍生物及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，VEGF抑制剂是VEGF受体抑制剂，并且甚至更优选地是VEGF受体激酶抑制剂，例如替沃扎尼(AV-951)、AZD2932、米哚妥林(Midostaurin)(pkc412)、BAW2881(NVP-BAW2881)、尼达尼布(Nintedanib)(BIBF 1120))、SU5402、SU1498、BFH772、索拉非尼、舒尼替尼(Sunitinib)、多韦替尼(Dovitinib)(TKI258)、司马沙尼(Semaxanib)(SU5416)、金丝桃素、瓦他拉尼、ZM306416、AAL993、SU4312、DMXAA或Foretinib。
在某些实施方案中，培养基包含酪氨酸激酶抑制剂，例如尼罗替尼(nilotinib)、帕纳替尼(ponatinib)和达沙替尼(dasatinib)(但不包括博舒替尼(bosutinib)或伊马替尼(imatinib))。在某些优选的实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂是泛-ABL1激酶抑制剂，例如帕纳替尼或达沙替尼。
在某些实施方案中，培养基包含VEGF受体激酶抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂二者，它们可以是相同或不同的化合物，例如帕纳替尼和替沃扎尼的组合。
在某些实施方案中，TrkA抑制剂选自：BMS-754807、GW441756、PF-06273340、司曲替尼(Sitravatinib)(MGCD516)、ANA-12、GNF-5837、Belizatinib(TSR-011)、拉罗替尼(Larotrectinib)(LOXO-101)硫酸盐、来他替尼(Lestaurtinib)、恩曲替尼(Entrectinib)(RXDX-101)、GNF 5837和AG-879。优选地，相对于TrkB或TrkC，TrkA抑制剂对TrkA具有选择性，例如GW441756和司曲替尼(MGCD516)。优选地，TrkA抑制剂是TrkA的有效的、选择性抑制剂且IC50为10nM或更小，抑制c-Raf1和CDK2的IC50为抑制TrkA的IC50的至少100倍高，例如GW441756。
在某些实施方案中，Oct4激活剂是可激活Oct4启动子驱动的报道基因(例如在Oct4启动子的转录控制下的萤光素酶基因)的试剂，并且更优选能够激活Oct4启动子驱动的报道基因和Nanog启动子驱动的报道基因二者。此外，当与四重重编程因子(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)一起添加至重编程混合物时，Oct4激活剂增强iPSC重编程效率并加速重编程过程。示例性的Oct4激活剂在例如以下中教导：美国专利申请20150191701和Li et al.(2012)“Identification of Oct4-activating compounds that enhance reprogrammingefficiency”.PNAS 109(51)：20853-8。
在某些实施方案中，Oct4激活剂以下式表示：
Figure BPA0000322182560000071
其中，
X1是C(R12)或N；
X2是C(R4)或N；
X3是C(R5)或N；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-CF3、-CCl3、-OH、-SH、-SO3H、-C(O)OH、-C(O)NH2、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环烷基、经取代或未经取代的芳基或者经取代或未经取代的杂芳基，其中R2和R3任选地连接以形成经取代或未经取代的杂环烷基或者经取代或未经取代的杂芳基。
特别是在那些无饲养层的实施方案中，培养基还可以包含SYK(脾酪氨酸激酶)抑制剂。代表性的SYK抑制剂可以选自：恩托替尼(Entospletinib)(GS-9973)、福他替尼(Fostamatinib)(R788)、R406、赛度替尼(cerdulatinib)(PRT062070)和TAK-659。
特别是在那些无饲养层的实施方案中，培养基还可以包含LPA受体拮抗剂，例如这样的拮抗剂，其抑制LPA1和LPA3诱导的磷酸肌醇的产生(每个的Ki为1000μM或更小)，并且对LPA2、LPA4、LPA5、LPA6的抑制显著较弱(即每个的Ki为5000μM或更小)。Ki16198是优选的LPA受体拮抗剂，并且是Ki16425的甲酯。
特别是在那些无饲养层的实施方案中，培养基还可以包含GSK3抑制剂。示例性GSK3抑制剂包括CHIR-99021(CT99021)HCl、SB216763、CHIR-98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、CHIR-99021(CT99021)、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、BIO-丙酮肟、IM-12、1-Azakenpaullone、靛玉红和6-BIO。
特别是在那些无饲养层的实施方案中，培养基还可以包含CK2抑制剂，例如CX-4945(Silmitasertib)、CX-8184、DMAT、鞣花酸或TTP22。
在另一方面中，本发明提供了上皮干细胞的单细胞克隆，或其体外培养物，例如包含主题培养基的培养物，其中上皮干细胞基本上缺乏与在其所来源的上皮组织中分化细胞类型相关的标志物的表达。
在另一方面中，本发明提供了非胚胎上皮干细胞的单细胞克隆，或其体外培养物，例如包含主题培养基的培养物，其中非胚胎上皮干细胞具有未成熟、未分化的形态，其特征在于具有高核质比的小圆形细胞形状。
在一个相关方面中，本发明还提供了主题单细胞克隆或其体外培养物(例如包含主题培养基的培养物)的文库或集合。在某些实施方案中，文库或集合可以包含来自相同组织/器官类型的单细胞克隆。在某些实施方案中，文库或集合可包含从相同类型的组织/器官类型但从群体的不同成员分离的单细胞克隆。在某些实施方案中，群体的一个或更多个(优选每个)成员在至少一个组织分型基因座(例如HLA-A、HLA-B和HLAD)上是纯合的。在某些实施方案中，通过例如TALEN或CRISPR技术(见下文)在克隆的干细胞中工程化至少一个组织分型基因座(例如，上述HLA基因座)以产生缺乏由组织分型基因座(例如，HLA-A、HLA-B和HLA-D等)编码的组织抗原的通用供体细胞系(例如，肝细胞)。参见Torikai et al.(Blood，122(8)：1341-1349，2013，通过引用并入)。在某些实施方案中，可以通过种族、年龄、性别、疾病状态或群体的任何共同特征来定义群体。文库或集合可具有至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、180、200、250、300或更多个成员。
在另一方面中，本发明提供了治疗患有疾病、障碍或异常病症并且需要治疗的对象的方法，其包括：(1)使用任何主题方法，从与受对象中疾病、障碍或异常病症影响的组织对应的组织中分离上皮干细胞；(2)任选地，改变上皮干细胞中至少一种基因的表达以产生改变的上皮干细胞；(3)将分离的上皮干细胞或改变的上皮干细胞或其克隆扩增重新引入对象，其中在对象中减轻疾病、障碍或异常病症的至少一种不良作用或症状。
在某些实施方案中，上皮干细胞中至少一种基因的表达被遗传、重组和/或表观遗传改变以产生改变的上皮干细胞。
在某些实施方案中，从中分离上皮干细胞的组织来自健康成人或胎儿(即非胚胎)对象。
在某些实施方案中，从中分离上皮干细胞的组织来自对象。在某些实施方案中，从中分离上皮干细胞的组织是受疾病、障碍或异常病症影响的受影响组织。
在某些实施方案中，从中分离上皮干细胞的组织与受疾病、障碍或异常病症影响的受影响组织相邻。
在某些实施方案中，所述至少一种基因在受对象中疾病、障碍或异常病症影响的组织中表达不足(under-express)，并且所述至少一种基因在经改变的上皮干细胞中的表达增强。
在某些实施方案中，所述至少一种基因在受对象中疾病、障碍或异常病症影响的组织中过表达，并且所述至少一种基因在经改变的上皮干细胞中的表达降低。
在某些实施方案中，步骤(2)通过将外源DNA或RNA引入上皮干细胞来实现。
在另一方面中，本发明提供了筛选化合物的方法，所述方法包括：(1)使用本发明的任何方法从对象中分离上皮干细胞；(2)通过单细胞克隆扩增来产生上皮干细胞的细胞系；(3)使来自细胞系的受试细胞与多种候选化合物接触；(4)识别在受试细胞中产生预定表型变化的一种或更多种化合物。
在权利要求书和/或说明书中，没有数量词修饰的名词当与术语“包含/包括”联合使用时可意指“一个/种”，但其也与“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。“约”一词意指所述数字的正负5％。
预期本文描述的任何方法或组合物可以相对于本文描述的任何其他方法或组合物来实施。本公开内容的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得显而易见。然而，应该理解的是，详细描述和具体实例虽然指示了本公开内容的一些具体实施方案，但仅以举例说明的方式给出，因为通过该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多种变化和修改对于本领域的技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一个或更多个并结合本文呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开内容。
图1.来源于表皮、上气道、远端气道、膀胱、食管、卵巢肿瘤的克隆人上皮干细胞的代表性图像。将人上皮组织消化并在存在SQM培养基的情况下接种在经辐照的3T3-J2饲养细胞上。
图2A.将人膀胱干细胞的单细胞来源的系谱(pedigree)接种在气-液界面系统中。单个膀胱干细胞可以分化成膀胱上皮中存在的所有细胞类型，包括基底细胞、变移上皮和基底细胞。
图2B.在存在SQM培养基的情况下，将一千个单个膀胱上皮干细胞接种在经辐照的3T3-J2饲养细胞的顶部，并形成超过500个集落。在7代、约100天培养和200次细胞分裂之后，克隆形成能力没有改变。
图2C.P1至P7系谱的CNV、BAF(B等位基因频率)和LRR(l0g R比率)谱显示传代期间的基因组稳定性。
图3A.第5代和第25代人远端气道干细胞的代表性图像。人DASC P5至P25系谱的CNV、BAF(B等位基因频率)和LRR(log R比率)谱显示了传代期间基因组的稳定性。
图3B.人DASC的单细胞来源的系谱接种在ALI培养物中并分化成棒状细胞(Clubcell)(CC10)、I型(AQP4)和II型(SEPTB)肺细胞。
图3C.通过本发明的方法来产生DASC产生了高度的克隆形成(clonogencity)(克隆形成能力)，其与观察到的这些干细胞克隆的遗传和表观遗传稳定性一样在多次传代中维持(比较第5至25代)。
图4A.将人上气道干细胞的单细胞来源的系谱接种在气-液界面用于体外分化。单细胞分化成纤毛细胞(微管蛋白)和杯状细胞(MUC5AC)。
图4B.左图，在存在SQM培养基的情况下，人上气道干细胞系谱在经辐照的3T3-J2饲养细胞的顶部生长的代表性图像。右图，将来自系谱的细胞移植到NSG小鼠中，并形成了包含纤毛细胞和杯状细胞的上气道上皮。
图5.将人皮肤的单细胞来源系谱的干细胞接种于气液界面分化系统中，并诱导其分化成类似人皮肤的鳞状上皮。
图6.来源于表皮、上气道、远端气道、膀胱、食管、卵巢肿瘤的克隆人上皮干细胞的代表性图像。将人上皮组织消化并在没有任何小鼠饲养细胞支持的情况下在SGM-63+培养基存在下接种。
图7.将人上气道上皮的单细胞来源系谱的干细胞移植到NSG小鼠中，并基于组织学产生类似于正常人上气道上皮的结构，并使用对纤毛细胞(微管蛋白)、杯状细胞(MUC5AC)和棒状细胞(CC10)具有特异性的标志物进行免疫染色。
图8A至E.使用B1培养基系统的来源于皮肤的克隆人上皮干细胞的代表性图像。将人皮肤组织消化并在存在专门培养基的情况下接种在经辐照的3T3-J2饲养细胞上。A.人皮肤上皮干细胞的明场像。B.干细胞集落用抗p63抗体染色呈阳性。C.干细胞集落用抗Krt5抗体染色呈阳性。D.干细胞集落用Ki67抗体染色呈阳性，表明细胞高度增殖。E.将单个人皮肤干细胞分选到384孔细胞培养皿的每个孔中。根据罗丹明染色，超过60％的细胞是克隆形成的。
图9A至E.来源于膀胱的克隆人上皮干细胞的代表性图像。将人膀胱组织消化并在存在专门培养基的情况下接种在经辐照的3T3-J2饲养细胞上。A.人膀胱上皮干细胞的明场像。B.干细胞集落用抗p63抗体染色呈阳性。C.干细胞集落用抗Krt5抗体染色呈阳性。D.干细胞集落用Ki67抗体染色呈阳性，表明细胞高度增殖。E.将单个人膀胱干细胞分选到384孔细胞培养皿的每个孔中。根据罗丹明染色，超过60％的细胞是克隆形成的。
图10A至E.来源于唾液腺的克隆人上皮干细胞的代表性图像。将人唾液腺组织消化并在存在专门培养基的情况下接种到经辐照的3T3-J2饲养细胞上。A.人唾液腺上皮干细胞的明场像。B.干细胞集落用抗p63抗体染色呈阳性。C.干细胞集落用抗Krt5抗体染色呈阳性。D.干细胞集落用Ki67抗体染色呈阳性，表明细胞高度增殖。E.将单个人唾液腺干细胞分选到384孔细胞培养皿的每个孔中。根据罗丹明染色，超过60％的细胞是克隆形成的。
图11A至D.来源于气道的克隆人上皮干细胞的代表性图像。将人气道组织消化并在存在专门培养基的情况下接种到经辐照的3T3-J2饲养细胞上。A.人气道上皮干细胞的明场像。B.干细胞集落用抗p63抗体染色呈阳性。C.干细胞集落用抗Krt5抗体染色呈阳性。D.将单个人气道干细胞分选到384孔细胞培养皿的每个孔中。根据罗丹明染色，超过70％的细胞是克隆形成的。
图12A至12B.将人上气道或远端气道干细胞的单细胞来源的系谱在气-液界面系统中诱导分化。12A.人上气道干细胞的单细胞来源系谱分化成纤毛细胞(微管蛋白)和杯状细胞(MUC5AC)。12B.人DASC的单细胞来源的系谱接种在ALI培养物中并分化成棒状细胞(CC10)、I型(AQP4)和II型(SEPTB)肺细胞。
具体实施方式
1.概述
本文所述的发明涉及从器官的分层上皮分离非胚胎(例如成人或胎儿)上皮干细胞和/或在培养中维持来自器官的分层上皮的非胚胎(例如成人或胎儿)上皮干细胞的方法。因此从多种组织或器官中分离的上皮干细胞可以自我更新或在体外无限增殖，是多能的并且可以分化成通常存在于从中分离干细胞的组织或器官中的多种分化细胞类型。包含如此分离的上皮干细胞的培养物(包括体外培养物)也在本发明的范围内。
另外，分离的上皮干细胞可以通过单个分离的干细胞的克隆扩增来增殖以产生这样的克隆(例如，作为体外培养物)，其中所述克隆中至少约40％、70％或90％或更多的细胞可以作为单细胞来源的克隆进一步传代。因此，使用本发明的方法分离的干细胞独特地能够通过标准分子生物学技术在体外进行操作，例如通过感染或转染引入外源遗传物质。
本文中使用的“上皮干细胞”包括从成人组织或器官中分离的成人干细胞，以及从产前组织或器官中分离的胎儿干细胞。
在一个相关实施方案中，本文所述的本发明方法从胎儿或产前组织或器官中分离胎儿干细胞。在某些实施方案中，当胎儿组织或器官是干细胞的来源时，本发明的方法不会损伤胎儿或以其他方式损害胎儿的正常发育，尤其是当胎儿是人胎儿时。在另一些实施方案中，胎儿组织的来源获自流产的胎儿、死胎、浸渍的胎儿材料，或者从中切除的细胞、组织或器官。
本发明的方法适用于含有上皮干细胞的任何动物分层上皮组织，包括来自以下的组织：人、非人哺乳动物、非人灵长类、啮齿动物(包括但不限于小鼠、大鼠、雪貂、仓鼠、豚鼠、兔)、家畜动物(包括但不限于猪、牛、绵羊、山羊、马、骆驼)、鸟、爬行动物、鱼、宠物或其他伴侣动物(例如猫、狗、鸟)或其他脊椎动物等。
分层上皮的分类基于浅层的细胞形状。例如，如果浅层由扁平细胞组成，则它是分层鳞状上皮的一部分。分层上皮分为三种不同的形式。
“分层、非角化的鳞状上皮”。分层、非角化鳞状上皮的细胞形状从基底向自由表面变化，并分为四个部分：
○基底层：棱柱形深色细胞，具有圆形核；
○副基底层(Stratum parabasale)：呈分层组织排列的多边形深色细胞；
○棘层：由桥粒连接的多面体、多边形细胞；
○浅表层(Stratum superficiale)：扁平细胞在最外层降解和脱落。
这种类型的上皮存在于口腔和食管的黏膜以及阴道和眼(角膜上皮)中。
“分层、角化的鳞状上皮”。上皮的最外细胞层由没有细胞核的扁平细胞组成，转化为鳞状物。它们被称为角质层，并且它们的目的是机械地保护下面的组织免于脱水。分层的角化鳞状上皮分为五个部分：
○基底层
○棘层
○颗粒层：具有透明角质颗粒的扁平细胞
○透明层：转化区
○角质层
“变移上皮(尿路上皮)”。尿路上皮由基底层、数个中间细胞层和伞形细胞层组成。伞形细胞(表层细胞)很大，并通常具有两个细胞核。壳(crusta)是非常致密的细胞质网络，位于其顶侧膜下方。质膜主要由含有尿路斑块蛋白(跨膜蛋白)的刚性斑块组成。变移上皮主要存在于传出尿道，即肾盂、输尿管、膀胱以及尿道的起始部分。
“假分层上皮”。这种上皮类型的重要特征是它们的细胞确实接触基底膜，但并非它们所有都到达自由表面。到达自由表面的细胞属于柱状类型。未到达自由表面的细胞位于基底层(basal lamina)并具有圆形细胞核。术语假分层来源于该上皮的外观。由于细胞核出现在不同的高度，它传达了细胞不止一层的错误印象。例如在附睾管和输精管中存在无纤毛的假分层上皮，并且在呼吸道(鼻腔和支气管)中存在具有动纤毛的纤毛假分层上皮。
在某些实施方案中，上皮组织分离自健康或正常个体。
在某些实施方案中，上皮组织分离自疾病组织(例如，受疾病影响的组织)、病症组织(例如，受病症影响的组织)或具有异常病症的组织。
本文中使用的术语“疾病”包括影响生物体的身体并且通常与特定症状和体征相关的异常或医学病症。疾病可由外部因素(例如感染性疾病，包括乳头瘤病毒感染或性传播疾病)或内部功能障碍(例如自身免疫病或癌症)引起。从广义上讲，“疾病”还可以包括导致受折磨的人疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡的任何病症，或者对与该人接触的人造成类似问题的任何病症。在这个更广泛的意义上，它可包括伤害、残疾、病症、综合征、感染、孤立的症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，同时在其他情况下和出于其他目的，这些可能被认为是可区分的类别。在某些优选的实施方案中，干细胞是从肿瘤活检中分离出来的。
在某些实施方案中，上皮组织分离自患有疾病、障碍或其他异常病症的个体，但是上皮组织自身可能未遭受疾病、障碍或异常病症。例如，上皮组织可以从患有炎性肠病或胃癌的患者中分离出来，但是来自尚未遭受炎性病症或癌症的健康的肠(在IBD的情况下)或胃(在肿瘤的情况下)部分。在某些实施方案中，上皮组织可以靠近或远离疾病、障碍或异常组织。
在某些实施方案中，上皮组织分离自易于发生疾病、障碍或其他异常病症，或者根据例如遗传组成、家族史、生活方式选择(例如，吸烟、饮食、运动习惯)、个体先前的病毒感染等处于发生所述疾病、障碍或其他异常病症的高风险之中的个体，尽管个体尚未发生所述疾病、障碍或其他异常病症或者表现出所述疾病、障碍或其他异常病症的可检测到的症状。
本发明的另一方面提供了根据本发明的任何一种方法分离的上皮干细胞，或其体外培养物。
在另一方面中，本发明还提供分离的上皮干细胞的单细胞克隆或其体外培养物，其中单细胞克隆中至少约40％、50％、60％、70％或约80％的细胞在分离成单细胞时能够增殖以产生单细胞克隆。
取决于生长阶段和其他生长条件，每个单细胞克隆可以包含至少约10、100、103、104、105、106个或更多个细胞。
在一个相关方面中，本发明提供分离的上皮干细胞的单细胞克隆，或其体外培养物，其中上皮干细胞在分离成单细胞时能够自我更新超过约50代、70代、100代、150代、200代、250代、300代、350代或约400代或更多代。
在某些实施方案中，体外培养物包含本发明的培养基(例如，如下所述的本发明的改良培养基)。参见下文描述本发明培养基的部分，其中描述的每种培养基通过引用并入本文。在某些实施方案中，上皮干细胞能够分化成其最初活检所来源的上皮组织的分化细胞类型，或者在癌症干细胞的情况下，可分化成该组织起源的肿瘤。例如，本发明的分离的上皮干细胞可以分化成通常存在于其所来源的活检的上皮组织中的一种或更多种细胞类型。
在某些实施方案中，上皮干细胞能够分化成有组织的结构，类似于在这样的上皮干细胞所来源的组织中存在的结构或亚结构。例如，本发明的分离的肝干细胞可以分化成类似于肝上皮的肝组织样结构，并且本发明的分离的胃肠干细胞可以分化成类似于胃肠上皮的GI组织样结构。
在某些实施方案中，上皮干细胞具有未成熟的、未分化的形态，其特征在于具有高核质比的小圆形细胞形状。
本发明的另一方面提供治疗患有疾病、障碍或异常病症并需要治疗的对象的方法，该方法包括：(1)使用本发明的任何方法从再生组织分离非胚胎(例如，成人)干细胞，所述再生组织对应于受对象中疾病、障碍或异常病症影响的组织；(2)改变上皮干细胞中至少一种基因的表达以产生改变的上皮干细胞；(3)将改变的上皮干细胞或者其克隆扩增或培养物来源的组织移植物重新引入对象，其中所述疾病、障碍或异常病症的至少一种不良作用或症状在对象中得到缓解，或作为再生/替代受损生殖组织的方法。在另一些情况下，可以对移植的细胞/组织进行遗传工程化以抵抗病毒感染，例如乳头瘤病毒感染。
例如，该方法的步骤(2)可以通过将提高或降低靶基因在分离的上皮干细胞中的表达的外源DNA或RNA引入上皮干细胞来实现。任何本领域公认的分子生物学技术可用于(例如，体外或离体)改变细胞中的基因表达。这样的方法可包括但不限于通过基于病毒或非病毒的载体转染或感染，所述载体可编码靶细胞中功能障碍或有缺陷的蛋白质或其功能片段的编码序列，或可编码破坏靶基因功能的RNA(反义RNA、siRNA、miRNA、shRNA、核酶等)。
在某些实施方案中，从中分离上皮干细胞的组织来自健康对象。优选地，健康对象是与需要治疗的对象相匹配的HLA型。
在某些实施方案中，从中分离上皮干细胞的组织来自对象，并且分离的上皮干细胞对于对象而言是自体的。
在某些实施方案中，从中分离上皮干细胞的组织是受疾病、障碍或异常病症影响的受影响组织。
在某些实施方案中，从中分离上皮干细胞的组织与受疾病、障碍或异常病症影响的受影响组织相邻。
在某些实施方案中，至少一种基因在受对象中疾病、障碍或异常病症影响的组织中表达不足，并且所述至少一种基因在经改变的上皮干细胞中的表达增强。
在某些实施方案中，至少一种基因在受对象中疾病、障碍或异常病症影响的组织中过表达，并且所述至少一种基因在经改变的上皮干细胞中的表达降低。
在另一方面中，本发明还提供了筛选改变细胞的“表型”(例如生殖组织干细胞的分化、表观遗传学、存活等)的试剂或条件的方法，所述细胞无论是正常的还是来自癌症/疾病状态的。在一个示例性实施方案中，所述方法包括：(1)使用本发明的任何方法从对象的生殖组织中分离上皮干细胞(包括癌症干细胞)；(2)通过单细胞克隆扩增从上皮干细胞产生一种或更多种干细胞系；(3)使来自细胞系的受试细胞与一种或更多种候选化合物接触；以及(4)识别在受试细胞中产生预定表型变化的化合物。本发明的这种筛选方法可用于靶标识别和验证。例如，从需要治疗的患者中分离出的上皮干细胞中的潜在靶基因可能功能异常(过度表达或表达不足)，从而导致与疾病、障碍或异常病症相关的表型。可对使用本发明的方法分离的上皮干细胞的克隆扩增实施本发明的筛选方法以测试一系列潜在的化合物(小分子化合物等)以识别可以纠正、减轻或逆转表型的一种或更多种化合物。
在另一个实施方案中，上皮干细胞可以从需要治疗的患者的再生组织中分离，例如从受疾病、障碍或异常病症影响的生殖组织中分离。可对使用本发明的方法分离的上皮干细胞的克隆扩增实施本发明的筛选方法以测试一系列潜在化合物(小分子化合物，或任何基于RNA的拮抗剂，例如siRNA文库等)以识别可以纠正、减轻或逆转表型的一种或更多种化合物。受有效化合物影响的靶基因可以通过例如微阵列、RNA-Seq或基于PCR的表达谱分析进一步识别。
使用本发明的方法分离的上皮干细胞及其克隆扩增还可用于毒理学筛选或研究，使得任何毒理学分析和测试都可以针对接受特定药物或医学干预的个体患者进行定制。
使用本发明的方法分离的上皮干细胞及其克隆扩增也可用于再生医学，其中可以诱导自体干细胞或从HLA型匹配的健康供体分离的干细胞体外、离体或体内分化成生殖组织或器官，以治疗现有病症或预防/延缓这样的病症的发生。可以对这样的干细胞在诱导分化之前进行遗传操作。
2.用于获得和/或培养干细胞的方法
本发明的一个方面涉及用于从上皮组织中分离上皮干细胞的方法，如以上一般性地描述的。
为了举例说明，所述方法的一个步骤包括培养从上皮组织解离的上皮细胞，(任选地)与第一有丝分裂失活的饲养细胞群和/或胞外基质(例如基底膜基质)接触，以形成上皮细胞克隆。
在某些实施方案中，通过用酶(包括但不限于胶原酶、蛋白酶、分散酶、链霉蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、Accutase和/或胰蛋白酶中的任何一种或更多种)酶消化将(上皮)细胞从组织中解离。
这些酶或功能等同物在本领域中是公知的，并且在几乎所有情况下都是可商购获得的。
在另一些实施方案中，(上皮)细胞可以通过溶解围绕(上皮)细胞的胞外基质而从组织样品中解离。适用于本发明该实施方案的一种试剂包括由BD Biosciences(San Jose，CA)作为BDTM细胞回收溶液(BD目录号354253)销售的非酶专有溶液，其允许回收在BDMATRIGELTM基底膜基质上培养的细胞以用于后续生化分析。
在某些实施方案中，饲养细胞可包含某些经致死辐照的成纤维细胞，例如鼠3T3-J2细胞。饲养细胞可以在基底膜基质的顶部形成饲养细胞层。
合适的3T3-J2细胞克隆是本领域公知的(参见，例如，Todaro and Green，″Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and theirdevelopment into established lines.″/.Cell Biol.17：299-313，1963)，并且可容易地供公众使用。例如，Waisman Biomanufacturing(Madison，Wisconsin)销售根据cGMP指南生产和测试的经辐照3T3-J2饲养细胞。这些细胞最初是根据材料转让协议从Dr.HowardGreen的实验室获得的，并且据供应商称，其品质足以支持例如皮肤基因治疗和伤口愈合临床试验。此外，据供应商称，每瓶3T3细胞含有至少3×106个细胞，这些细胞是在完全合规的洁净室中制造的，并且经过认证不含支原体且内毒素低。另外，细胞库已针对外来物质(adventitious agent)(包括鼠病毒)进行了全面测试。这些细胞已筛选用于角质细胞培养支持并且不含丝裂霉素C。
本发明的方法提供了饲养细胞，例如鼠成纤维细胞3T3J2克隆的用途。通常，不限于任何特定表型，饲养细胞层通常用于支持干细胞的培养和/或抑制它们的分化。饲养细胞层通常是与目的细胞共培养并提供适合该目的细胞生长的表面的单层细胞。饲养细胞层提供了目的细胞可以在其中生长的环境。饲养细胞通常经有丝分裂灭活(例如，通过(致死的)辐照或用丝裂霉素C处理)以阻止其增殖。
在某些实施方案中，饲养细胞是经过适当筛选并且是GMP级人饲养细胞，例如足以支持本发明的临床级干细胞的那些。对于在具有GMP品质FBS的培养基中生长的GMP级人饲养细胞，参见Crook et al(Cell Stem Cell 1(5)：490-494，2007，通过引用并入)。
在某些实施方案中，可以将饲养细胞用干细胞中缺乏的标志物进行标记，从而可以容易地将干细胞与饲养细胞区分开来并分离开。例如，可以将饲养细胞工程化以表达荧光标志物，例如GFP或其他类似的荧光标志物。可以使用例如FACS分选从干细胞中分离经荧光标记的饲养细胞。
本领域已知的多种物理分离方法中的任何一种可用于将本发明的干细胞与饲养细胞分离。除了FACS之外，这样的物理方法可以包括基于特异性表达的标志物的多种免疫亲和方法。例如，本发明的干细胞可以基于它们表达的特定干细胞标志物使用对这样的标志物具有特异性的抗体来分离。
在一个实施方案中，本发明的干细胞可以通过FACS利用例如针对这些标志物之一的抗体来分离。荧光激活细胞分选(Fluorescent-Activated Cell Sorting，FACS)可用于检测特定细胞类型或谱系特征性的标志物。如对本领域技术人员显而易见的，这可以通过经荧光标记的抗体或通过对一抗具有结合特异性的经荧光标记的二抗来实现。合适的荧光标记的实例包括但不限于FITC、Alexa
Figure BPA0000322182560000191
488、GFP、CFSE、CFDA-SE、DyLight 488、PE、PerCP、PE-Alexa
Figure BPA0000322182560000192
700、PE-Cy5(TRI-COLOIT)、PE-Cy5.5、PI、PE-Alexa Fluor*750和PE-Cy7。荧光标志物的列表仅作为示例提供，而并非旨在限制。
对本领域技术人员来说显而易见的是，使用例如对干细胞具有特异性的抗体的FACS分析将提供纯化的干细胞群。然而，在一些实施方案中，可能优选通过使用一种或更多种其他可识别标志物(例如针对饲养细胞选择的标志物)进行另一轮FACS分析来进一步纯化细胞群。
对于某些竞争方法，饲养细胞的使用被认为是不期望的，因为在那些竞争方法中饲养细胞的存在可使细胞的传代复杂化。例如，必须在每次传代时将细胞与饲养细胞分开，并且每次传代都需要新的饲养细胞。另外，饲养细胞的使用可能导致所期望细胞被饲养细胞污染。
然而，饲养层的使用不一定是本发明的缺点，因为本发明的分离的干细胞能够作为单细胞传代，并且实际上优选作为单细胞克隆传代。因此，传代过程中被饲养细胞污染的潜在风险即使没有被消除也被最小化。
在某些实施方案中，基底膜基质是含有层黏连蛋白的基底膜基质(例如，MATRIGELTM基底膜基质(BD Biosciences))，优选地是生长因子降低的。
在某些实施方案中，基底膜基质不支持3维生长，或不形成支持3维生长所必需的3维基质。因此，在对基底膜基质进行平板接种时，通常不需要将基底膜基质以特定的形状或形式沉积在支持物上，例如形成圆顶形状或形式并在固化之后维持这样的形状或形式，所述形状或形式可能是支持3维生长所需要的。在某些实施方案中，基底膜基质均匀分布或散布在平坦表面或支持结构(例如平底组织培养皿或孔)上。
在某些实施方案中，首先将基底膜基质解冻并在冷(例如，约0至4℃)饲养细胞生长培养基中稀释至适当浓度(例如，10％)，并在平坦表面上平板接种并固化，例如通过在具有适当CO2含量(例如，约5％)的组织培养箱中升温至37℃。然后将经致死辐照的饲养细胞以适当的密度平板接种在固化的基底膜基质的顶部，从而使固定的(settled)饲养细胞在基底膜基质的顶部过夜形成亚汇合或汇合的饲养细胞层。将饲养细胞在饲养细胞培养基中培养，例如包含以下的培养基(例如，3T3-J2生长培养基)：优选具有高葡萄糖(例如，约4.5g/L)、无L-谷氨酰胺并且无丙酮酸钠的基础组织培养基(例如，DMEM(Invitrogen目录号11960；高葡萄糖(4.5g/L)、无L-谷氨酰胺、无丙酮酸钠)，10％小牛血清(未经热灭活)，一种或更多种抗生素(例如，1％青霉素-链霉素)以及L-谷氨酰胺(例如，约1.5mM，或1至2mM，或0.5至5mM，或0.210mM，或0.1至20mM)。
根据本发明的方法，在主题干细胞培养基中培养来自源组织的解离细胞数天(例如，3至4天，或约10天)之后，上皮细胞集落变得可检测。
在某些实施方案中，可以通过例如酶消化从这些上皮细胞集落分离单细胞。用于此目的的合适酶包括胰蛋白酶，例如温热的0.25％胰蛋白酶(Invitrogen，目录号25200056)。在某些实施方案中，酶消化基本上完成，使得上皮细胞克隆中的基本上所有细胞都与其他细胞解离并变成单细胞。在某些实施方案中，所述方法包括在改良的生长培养基中培养分离的单细胞(优选在洗涤和重悬单细胞之后)，所述单细胞与改良的生长培养基中的第二基底膜基质和第二经致死辐照的饲养细胞群接触。任选地，在将单细胞平板接种在饲养细胞和基底膜基质上之前，可以使分离的单细胞通过适当尺寸(例如，40微米)的细胞过滤器。
在某些实施方案中，定期(例如，每天一次，每2、3或4天一次等)更换改良的生长培养基，直到形成单细胞克隆或分离的单个干细胞的克隆扩增。
在某些实施方案中，可以使用例如克隆环来分离干细胞的单个集落。可以扩增分离的干细胞克隆以开发系谱细胞系，即来源于单个干细胞的细胞系。
在某些实施方案中，单个干细胞可以从单个干细胞的克隆扩增中分离出来，并且可以作为单个干细胞再次传代。
3.培养基
本发明提供了用于主题干细胞的分离、培养和/或分化的多种细胞培养基，其包含基础培养基，其中添加了许多因子以产生用于生殖组织干细胞的干细胞培养基。下面首先描述可以添加至基础培养基或改良培养基中的因子。然后用进一步的细节描述本发明的数个示例性基础培养基和改良培养基以举例说明本发明的一些具体非限制性实施方案。
Rock(Rho-激酶)抑制剂。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但添加Rock抑制剂可以阻止失巢凋亡，尤其是在培养单个干细胞时。Rock抑制剂可以是(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺)二盐酸盐一水合物(Y-27632，SigmaAldrich)、5-(1，4-二氮杂环庚烷-1-基磺酰基)异喹啉(法舒地尔或HA1077，Cayman Chemical)、(1S，)-(+)-2-甲基-1-[(4甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1，4-二氮杂
Figure BPA0000322182560000211
二盐酸盐(Hl 152，Tocris Bioscience)和N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-2-甲基-6-氧代-4-(4-(三氟甲基)苯基)-1，4，5，6-四氢吡啶-3-甲酰胺(GSK429286A，Stemgent)。在某些实施方案中，Y27632的最终浓度为约1至5μM，或2.5μM。在培养干细胞的前7天期间，可以每1、2、3、4、5、6或7天向培养基中添加Rho激酶抑制剂，例如Y-21632。
Wnt激动剂.Wnt信号传导途径由当Wnt蛋白配体与Frizzled受体家族成员的细胞表面受体结合时发生的一系列事件定义。这导致散乱(Dsh)家族蛋白的激活，所述散乱(Dsh)家族蛋白抑制包含虫漆脂、GSK-3和蛋白APC的蛋白质复合物降解胞内β-连环蛋白。由此产生的富集的核β-连环蛋白增强了TCF/LEF转录因子家族的转录。本文中使用的“Wnt激动剂”包括直接或间接激活细胞中TCF/LEF介导的转录的试剂，例如通过调节Wnt信号传导级联中任何一种蛋白质/基因的活性(例如，增强Wnt信号传导途径的正调节剂的活性，或抑制Wnt信号传导途径的负调节剂的活性)。
Wnt激动剂选自结合并激活Frizzled受体家族成员的真正的Wnt激动剂，包括任何和所有Wnt家族蛋白、胞内β-连环蛋白降解抑制剂和TCF/LEF激活剂。相对于在不存在Wnt激动剂的情况下Wnt活性的水平，Wnt激动剂可刺激细胞中的Wnt活性至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、至少约90％、至少约100％、至少约2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍或1000倍或更高。如本领域技术人员已知的，Wnt活性可以通过测量Wnt的转录活性来确定，例如通过pTOPFLASH和pFOPFLASH Tcf萤光素酶报道构建体(参见Korinek et ah，Science 275：1784-1787，1997，通过引用并入本文)。
代表性Wnt激动剂可包含分泌糖蛋白，包括Wnt1/Int-1、Wnt-2/Irp(Int-1-相关蛋白)、Wnt-2b/13、Wnt-3/Int-4、Wnt-3a(R&D systems)、Wnt4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6(Kirikoshi et al，Biochem.Biophys.Res.Com.，283：798805，2001)、Wnt-7a(R&Dsystems)、Wnt-7b、Wnt-8a/8d、Wnt-8b、Wnt-9a/14、Wnt9b/14b/15、Wnt10a、Wnt10b/12、Wnt11和Wnt16。在″The Wnt Family of Secreted Proteins，″R&D Systems Catalog，2004(通过引用并入本文)中提供了人Wnt蛋白的概述。
其他Wnt激动剂包括分泌蛋白R-脊椎蛋白家族，其与Wnt信号传导途径的激活和调节有关，并且包含至少4个成员，即R-脊椎蛋白1(NU206，Nuvelo，San Carlos，CA)、R-脊椎蛋白2(R&D systems)、R-脊椎蛋白3和R-脊椎蛋白4。Wnt激动剂还包括Norrin(也称为诺里病蛋白或NDP)(R&D systems)，其是功能类似于Wnt蛋白的分泌调节蛋白，因为其以高亲和力与Frizzled-4受体结合并诱导Wnt信号传导途径的激活(Kestutis Planutis et ah，BMCCell Biol.8：12，2007)。
Wnt激动剂还包括Wnt信号传导途径的小分子激动剂，其为以下结构的氨基嘧啶衍生物(N4-[(2H-1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)甲基)-6-(3甲氧基苯基)嘧啶-2，4-二胺)，如Liu et al.(Angew Chem.Int.Ed.Engl.44 13)：1987-1990，2005，通过引用并入本文)所述。
Figure BPA0000322182560000221
GSK-抑制剂包含小干扰RNA(siRNA，Cell Signaling)、锂(Sigma)、肯帕罗酮(kenpaullone)(Biomol International，Leost et al.，Eur.J.Biochem.267：5983-5994，2000)、6-溴靛玉红-30-丙酮肟(Meyer et al.，Chem.Biol.10：1255-1266，2003)、SB216763和SB 415286(Sigma-Aldrich)，以及阻止GSK-3与虫漆脂相互作用的FRAT来源的肽和FRAT家族成员。Meijer et al.(Trends in Pharmacological Sciences 25：471-480，2004，通过引用并入本文)提供了概述。用于确定GSK-3抑制水平的方法和测定是本领域已知的，并且可以包括例如Liao et al.(Endocrinology 145(6)：2941-2949，2004，通过引用并入本文)中所述的方法和测定。
在某些实施方案中，Wnt激动剂选自：Wnt家族成员、R-脊椎蛋白1至4(例如R-脊椎蛋白1)、Norrin、Wnt3a、Wnt6和GSK-抑制剂中的一种或更多种。
在某些实施方案中，Wnt激动剂包含R-脊椎蛋白1或由其组成。可以将R脊椎蛋白1以至少约50ng/mL、至少约75ng/mL、至少约100ng/mL、至少约125ng/mL、至少约150ng/mL、至少约175ng/mL、至少约200ng/mL、至少约300ng/mL、至少约500ng/mL的浓度添加至主题培养基中。在某些实施方案中，R-脊椎蛋白1为约125ng/mL。
在某些实施方案中，本文提及的任何基于特定蛋白质的Wnt激动剂(例如R-脊椎蛋白1至R-脊椎蛋白4、任何Wnt家族成员等)可以被以下替代：天然的、合成的或重组产生的保留至少约80％、85％、90％、95％、99％的相应Wnt激动剂活性的其同源物或片段，和/或共有至少约60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％氨基酸序列同一性的其同源物或片段，如通过任何本领域认可的序列比对软件基于全局比对技术(例如内德勒曼-温施算法(Needleman-Wunsch algorithm))或局部比对技术(例如史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm))测量的。本文提及的代表性Wnt激动剂的序列在SEQ ID NO.1017中表示。
在培养主题干细胞期间，可以将Wnt家族成员每天、每两天、每三天添加至培养基中，同时更新培养基，例如每1、2、3、4、5天或更多天。
在某些实施方案中，Wnt激动剂选自：R脊椎蛋白、Wnt-3a和Wnt-6，或其组合。在某些实施方案中，R-脊椎蛋白和Wnt-3a一起用作Wnt激动剂。在某些实施方案中，R-脊椎蛋白浓度为约125ng/mL，并且Wnt3a的浓度为约100ng/mL。
促分裂生长因子。适用于本发明的促分裂生长因子可包括包含以下的生长因子家族：表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)(Peprotech)、转化生长因子α(TGFa，Peprotech)、碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF，Peprotech)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF，R&DSystems)和角质细胞生长因子(KGF，Peprotech)。
EGF是多种培养的外胚层和中胚层细胞的有效促分裂因子，并且对体内和体外特定细胞的分化以及细胞培养中一些成纤维细胞的分化具有深远的影响。EGF前体作为膜结合分子存在，其经蛋白水解切割以产生刺激细胞的53-氨基酸肽激素。可以将EGF以1至500ng/mL的浓度添加至主题培养基中。在某些实施方案中，培养基中的最终EGF浓度为至少约1、2、5、10、20、25、30、40、45或50ng/mL，并且不高于约500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、30、20ng/mL。在某些实施方案中，最终EGF浓度为约1至50ng/mL，或约2至50ng/mL，或约5至30ng/mL，或约5至20ng/mL，或约10ng/mL。
相同浓度可用于FGF，例如FGF10或FGF7。如果使用多于一种FGF，例如FGF7和FGF10，则上述FGF浓度可以指培养基中使用的所有FGF的总浓度。
在某些实施方案中，本文提及的任何特定促分裂生长因子(例如EGF、TGFa、bFGF、BDNF、KGF等)可以被以下替代：天然的、合成的或重组产生的保留至少约80％、85％、90％、95％、99％的相应促分裂生长因子活性的其同源物或片段，和/或共有至少约60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％氨基酸序列同一性的其同源物或片段，如通过任何本领域认可的序列比对软件基于全局比对技术(例如内德勒曼-温施算法)或局部比对技术(例如史密斯-沃特曼算法)测量的。
本文提及的代表性促分裂生长因子的序列在SEQ ID NO-18至27中表示。
在培养主题干细胞期间，可以每天、每2天将促分裂生长因子添加至培养基中，同时(例如每天)更新培养基。
可以使用bFGF家族的任何成员。在某些实施方案中，使用FGF7和/或FGF10。FGF7也称为KGF(角质细胞生长因子)。在某些实施方案中，将促分裂生长因子的组合(例如EGF和KGF，或EGF和BDNF)添加至主题培养基中。在某些实施方案中，将促分裂生长因子的组合(例如EGF和KGF，或EGF和FGF10)添加至主题培养基中。
BMP抑制剂。骨形态生成蛋白(BMP)作为二聚配体与由两种不同受体丝氨酸/苏氨酸激酶(I型和II型受体)组成的受体复合物结合。II型受体使I型受体磷酸化，导致该受体激酶的激活。I型受体随后使特定的受体底物(如SMAD)磷酸化，导致信号转导途径引起转录活性。
本文中使用的BMP抑制剂包括通过其受体抑制BMP信号传导的试剂。在一个实施方案中，BMP抑制剂与BMP分子结合以形成复合物，使得BMP活性被中和，例如通过阻止或抑制BMP分子与BMP受体的结合。这样的BMP抑制剂的实例可以包括对BMP配体具有特异性的抗体或其抗原结合部分。这样的BMP抑制剂的其他实例包括BMP受体的显性负突变体，例如结合BMP配体并阻止配体与细胞表面上的天然BMP受体结合的可溶性BMP受体。
或者，BMP抑制剂可包括用作拮抗剂或反向激动剂的试剂。这种类型的抑制剂与BMP受体结合并阻止BMP与受体结合。这样的试剂的一个实例是特异性结合BMP受体并阻止BMP与抗体结合BMP受体结合的抗体。
在某些实施方案中，相对于不存在抑制剂的情况下的BMP活性水平，BMP抑制剂将细胞中的BMP依赖性活性抑制至至多90％、至多80％、至多70％、至多50％、至多30％、至多10％或约0％(接近完全抑制)。如本领域技术人员已知的，BMP活性可以通过例如测量BMP的转录活性来确定，如Zilberberg et al.(″A rapid and sensitive bioassay to measurebone morphogenetic protein activity，″BMC Cell Biology 8：41，2007，通过引用并入本文)中所例示的。
已知数类天然BMP结合蛋白，包括头蛋白(Peprotech)、腱蛋白和包含腱蛋白结构域的包含腱蛋白结构域的腱蛋白样蛋白(R&D systems)、卵泡抑制素和包含卵泡抑制素结构域的包含卵泡抑制素结构域的卵泡抑制素相关蛋白(R&D systems)、DAN和包含DAN胱氨酸结结构域的DAN样蛋白(例如，Cerberus和Gremlin)(R&D systems)、骨硬化蛋白/SOST(R&D systems)、饰胶蛋白聚糖(R&D systems)和α-2巨球蛋白(R&D systems)或如US 8,383,349中所述。用于本发明方法的示例性BMP抑制剂选自头蛋白、DAN和DAN样蛋白(包括Cerberus和Gremlin)(R&D systems)。这些可扩散的蛋白质能够以不同程度的亲和力结合BMP配体，并抑制BMP接近其信号传导受体。
当期望时，任何上述BMP抑制剂可以单独或组合添加至主题培养基中。
在某些实施方案中，BMP抑制剂是头蛋白。可以将头蛋白以至少约10ng/mL、或至少约20ng/mL、或至少约50ng/mL、或至少约100ng/mL(例如，100ng/mL)的浓度添加至相应的培养基。
在某些实施方案中，本文提及的任何特定BMP抑制剂(例如头蛋白、腱蛋白、卵泡抑制素、DAN、Cerberus、Gremlin、骨硬化蛋白/SOST、饰胶蛋白聚糖和α-2巨球蛋白)可以被以下替代：天然的、合成的或重组产生的保留至少约80％、85％、90％、95％、99％的相应BMP抑制活性的其同源物或片段，和/或共有至少约60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％氨基酸序列同一性的其同源物或片段，如通过任何本领域认可的序列比对软件基于全局比对技术(例如内德勒曼-温施算法)或局部比对技术(例如史密斯-沃特曼算法)测量的。
本文提及的代表性BMP抑制剂的序列在SEQ ID NO.19中表示。
在培养主题干细胞期间，可以每天、每2天、每3天或每4天向培养基添加BMP抑制剂，同时每天、每2天、每3天或每四天更新培养基，视情况而定。
VEGF抑制剂。在某些实施方案中，VEGF抑制剂选自：阿柏西普、哌加他尼、替沃扎尼、3-(4-溴-2，6-二氟-苄基氧基)-5-[3-(4-吡咯烷-1-基-丁基)-脲基]-异噻唑-4-羧酸酰胺盐酸盐、阿西替尼、N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基-)甲氧基]喹唑啉-4-胺、VEGF-R2和VEGF-R1的抑制剂、阿西替尼、N，2-二甲基-6-(2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)噻吩并[3，2-b]吡啶-7-基氧基)苯并[b]噻吩-3-甲酰胺、RET/PTC致癌激酶的酪氨酸激酶抑制剂、N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺、泛-VEGF-R-激酶抑制剂；蛋白激酶抑制剂、多靶标人表皮受体(human epidermalreceptor，HER)1/2和血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factorreceptor，VEGFR)1/2受体家族酪氨酸激酶抑制剂、西地尼布(cediranib)、索拉非尼、瓦他拉尼、谷氨酰胺二钠(glufanide disodium)、VEGFR2选择性单克隆抗体、angiozyme、基于siRNA的VEGFR1抑制剂、5-((7-苄基氧基喹唑啉-4-基)氨基)-4-氟-2-甲基苯酚盐酸盐、其任何衍生物及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，VEGF抑制剂是VEGF受体抑制剂，并且甚至更优选地是VEGF受体激酶抑制剂，例如替沃扎尼(AV-951)、AZD2932、米哚妥林(pkc412)、BAW2881(NVP-BAW2881)、尼达尼布(BIBF 1120)、SU5402、SU1498、BFH772、索拉非尼、舒尼替尼、多韦替尼(TKI258)、司马沙尼(SU5416)、金丝桃素、瓦他拉尼、ZM306416、AAL993、SU4312、DMXAA或Foretinib。
在某些实施方案中，VEGF受体抑制剂是多酪氨酸激酶抑制剂，例如阿法替尼(afatinib)、伊马替尼、达克替尼(dacomitinib)、达沙替尼、帕纳替尼、KD-019、博舒替尼、二甲苯磺酸拉帕替尼、AZD9291、奈拉替尼、波齐替尼、S-222611、苏拉明六钠、AL-6802、BGB-102、PB357、吡咯替尼(Pyrotinib)、舒尼替尼、甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate)、帕唑帕尼(pazopanib)、瑞格菲尼(regorafenib)、阿帕替尼(apatinib)、阿西替尼、卡博替尼(carbozantinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布、凡德他尼(vandetanib)、替沃扎尼、安罗替尼(anlotinib)、米哚妥林、muparfostat、BMS-690514、ENMD-2076、golvatinib、德立替尼(lucitanib)、莫特塞尼(motesanib)、necuparinib、RAF265、法米替尼(famitinib)、特拉替尼(telatinib)、X82、ALNVSP、altiratinib、ABT348、MGCD516、OB318、ODM203、HHGV678、LY-3012207、CS2164、伊洛沙替布(ilorasertib)、radotinib、巴非替尼(bafetinib)、NRCAN-019、ABL001、氨基丁三醇咪替尼(metatinib tromethamine)、甲苯磺酸瑞巴替尼(rebastinib tosylate)或VX-15。
酪氨酸激酶抑制剂。在某些实施方案中，培养基包含酪氨酸激酶抑制剂，例如尼罗替尼、帕纳替尼、达沙替尼、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、舒尼替尼或卡博替尼(cabozantinib)。在某些优选的实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂是泛-ABL1激酶抑制剂，例如帕纳替尼或达沙替尼。
在某些实施方案中，培养基包含VEGF受体激酶抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂二者，它们可以是相同或不同的化合物，例如帕纳替尼和替沃扎尼的组合。
TGF-β或TGF-β受体抑制剂。TGF-β信号传导涉及许多细胞功能，包括细胞生长、细胞命运和细胞凋亡。信号传导通常始于TGF-β超家族配体与II型受体的结合，II型受体募集I型受体并使其磷酸化。然后1型受体使SMAD磷酸化，SMAD在细胞核中充当转录因子并调节靶基因表达。或者，TGF-β信号传导可以激活MAP激酶信号传导途径，例如，通过p38MAP激酶。
TGF-β超家族配体包含骨形态生成蛋白(BMP)、生长和分化因子(GDF)、抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone，AMH)、活化素、节(nodal)和TGF-β。
本文中使用的TGF-β抑制剂包含降低TGF-β信号传导途径活性的试剂。本领域已知有许多不同的破坏TGF-β信号传导途径的方法，其中任何一种都可以与主题发明结合使用。例如，TGF-β信号传导可能会被以下破坏：通过小干扰RNA策略抑制TGF-β表达；抑制弗林蛋白酶(TGF-β激活蛋白酶)；通过生理抑制剂抑制该途径，例如通过头蛋白、DAN或DAN样蛋白抑制BMP；用单克隆抗体中和TGF-β；用TGF-β受体激酶1(也称为活化素受体样激酶，ALK5)、ALK4、ALK6、ALK7或其他TGF^相关受体激酶的小分子抑制剂进行抑制；通过过表达其生理抑制剂Smad7或通过使用硫氧还蛋白作为Smad锚使Smad无法激活来抑制Smad 2和Smad 3信号传导(Fuchs，Inhibition of TGF-β Signaling for the Treatment of TumorMetastasis and Fibrotic Diseases.Current Signal Transduction Therapy 6(1)：29-43(15)，2011)。
例如，TGF-β抑制剂可以靶向选自以下的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶：TGF-β受体激酶1、ALK4、ALK5、ALK7或p38。ALK4、ALK5和ALK7都是TGF-β超家族密切相关的受体。ALK4的GI编号为91；ALK5(也称为TGF-β受体激酶1)的GI编号为7046；并且ALK7的GI编号为658。这些激酶中的任何一种的抑制剂是引起这些激酶中的任何一种(或更多种)的酶活性降低的抑制剂。ALK和p38激酶的抑制先前已被证明与B细胞淋巴瘤有关(Bakkebo et ah，″TGF^-induced growth inhibition in B-cell lymphoma correlates with Smad 1/5signaling and constitutively active p38MAPK，″BMC Immunol.11：57，2010)。
在某些实施方案中，TGF-β抑制剂可以结合并抑制以下的活性：Smad蛋白，例如R-SMAD或SMAD1至5(即，SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4或SMAD5)。
在某些实施方案中，TGF-β抑制剂可以结合选自以下的Ser/Thr蛋白激酶并降低其活性：TGF-β受体激酶1、ALK4、ALK5、ALK7或p38。
在某些实施方案中，本发明的培养基包含ALK5抑制剂。
在某些实施方案中，TGF-β抑制剂或TGF-β受体抑制剂不包括BMP拮抗剂(即，是除BMP拮抗剂之外的试剂)。
用于确定物质是否为TGF-β抑制剂的多种方法是已知的。例如，可以使用细胞测定法，其中将细胞用包含人PAI-1启动子或Smad结合位点的报道构建体稳定转染，驱动萤光素酶报道基因。相对于对照组的萤光素酶活性的抑制可用作化合物活性的量度(De Gouvilleet ah，Br.J.Pharmacol.145(2)：166-177，2005，通过引用并入本文)。另一个实例是用于测量激酶活性的
Figure BPA0000322182560000281
磷传感器测定(Drew et ah，J.Biomol.Screen.16(2)：164-173，2011，通过引用并入本文)。
可用于本发明的TGF-β抑制剂可以是蛋白质、肽、小分子、小干扰RNA、反义寡核苷酸、适配体、抗体或其抗原结合部分。抑制剂可以是天然存在的或合成的。可用于本发明上下文的小分子TGF-β抑制剂的实例包括但不限于下表1中列出的小分子抑制剂：
表1：靶向受体激酶的小分子TGF抑制剂
Figure BPA0000322182560000291
上表1中列出的任何一种或更多种抑制剂或其组合可用作主题发明中的TGF-β抑制剂。在某些实施方案中，所述组合可以包括：SB-525334和SD-208和A83-01；SD-208和A83-01；或SD208和A83-01。
本领域技术人员将理解存在主要旨在靶向其他激酶但在高浓度时也抑制TGF-β受体激酶的许多其他小分子抑制剂。例如，SB-203580是p38 MAP激酶抑制剂，其在高浓度(例如，约10μM或更高)下可抑制ALK5。任何抑制TGF-β信号传导途径的这样的抑制剂也可用于本发明。在某些实施方案中，可以将A83-01以10nM至10μM、或20nM至5μM、或50nM至1μM的浓度添加至培养基中。在某些实施方案中，可以将A83-01以约500nM添加至培养基中。在某些实施方案中，可以将A83-01以350至650nM、450至550nM或约500nM的浓度添加至培养基中。在某些实施方案中，可以将A83-01以25至75nM、40至60nM或约50nM的浓度添加至培养基中。
可以将SB-431542以80nM至80μM、或100nM至40μM、或500nM至10μM、或1至5μM的浓度添加至培养基中。例如，可以将SB-431542以约2μM添加至培养基中。
可以将SB-505124以40nM至40μM、或80nM至20μM、或200nM至1μM的浓度添加至培养基中。例如，可以将SB505124以约500nM添加至培养基中。
可以将SB-525334以10nM至10μM、或20nM至5μM、或50nM至1μM的浓度添加至培养基中。例如，可以将SB525334以约100nM添加至培养基中。
可以将LY 364947以40nM至40μM、或80nM至20μM、或200nM至1μM的浓度添加至培养基中。例如，可以将LY 364947以约500nM添加至培养基中。
可以将SD-208以40nM至40μM、或80nM至20μM、或200nM至1μM的浓度添加至培养基中。例如，可以将SD-208以约500nM添加至培养基中。
可以将S JN 2511以20nM至20μM、或40nM至10μM、或100nM至1μM的浓度添加至培养基中。例如，可以将A83-01以约200nM添加至培养基中。
p38抑制剂。“p38抑制剂”可以包括直接或间接负调节p38信号传导的抑制剂，例如结合至少一种p38同种型并降低其活性的试剂。p38蛋白激酶(参见GI编号1432)是丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族的一部分。MAPK是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，其响应于胞外刺激(如环境应激和炎性细胞因子)，并调节多种细胞活动，如基因表达、分化、有丝分裂、增殖和细胞存活/凋亡。p38 MAPK以α、β、β2、γ和δ同种型存在。
用于确定物质是否为p38抑制剂的多种方法是已知的，例如：Thr180/Tyr182处的磷酸化的磷酸特异性抗体检测，这提供了对细胞p38活化或抑制的完善测量；生物化学重组激酶测定；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNFa)分泌测定；和用于p38抑制剂的DiscoverRx高通量筛选平台。还存在数种p38活性测定试剂盒(例如Millipore、SigmaAldrich)。
在某些实施方案中，高浓度(例如，超过100nM，或超过1μM，超过10μM，或超过100μM)的p38抑制剂可具有抑制TGF-β的作用。在另一些实施方案中，p38抑制剂不抑制TGF-β信号传导。
多种p38抑制剂是本领域已知的(例如，参见表1)。在一些实施方案中，直接或间接负调节p38信号传导的抑制剂选自：SB-202190、SB-203580、VX-702、VX-745、PD169316、RO-4402257和BIRB-796。
在某些实施方案中，培养基包含以下两者：a)与来自以下的任何一种或更多种激酶结合并降低其活性的抑制剂：ALK4、ALK5和ALK7；b)与p38结合并降低其活性的抑制剂。
在某些实施方案中，培养基包含与ALK5结合并降低其活性的抑制剂和与p38结合并降低其活性的抑制剂。
在一个实施方案中，与对照相比，抑制剂与其靶标(例如TGF-β和/或p38)结合并使其活性降低超过10％；超过30％；超过60％；超过80％；超过90％；超过95％；或超过99％，如通过细胞测定所评估。如上所述用于测量靶标抑制的细胞测定的实例在本领域中是公知的。
TGF-β和/或p38的抑制剂可以具有等于或小于2000nM；小于1000nM；小于100nM；小于50nM；小于30nM；小于20nM或小于10mM的IC50值。IC50值是指抑制剂抑制其靶标的生物或生物化学功能的有效性。IC50指示需要多少特定抑制剂才能将激酶抑制50％。IC50值可根据上述测定方法计算。TGF-β和/或p38的抑制剂可以以多种形式存在，包括天然或经修饰的底物、酶、受体、有机小分子(例如最高2000Da、优选800Da或更少的小的天然或合成有机小分子)、肽模拟物、无机分子、肽、多肽、反义寡核苷酸适配体，以及这些的结构或功能模拟物，包括小分子。
在某些实施方案中，TGF-β和/或p38的抑制剂也可以是适配体。本文中使用的术语“适配体”是指可以采用高特异性三维构象的寡核苷酸链(DNA或RNA)。适配体被设计成对某些靶分子(包括胞外和胞内蛋白)具有高结合亲和力和特异性。适配体可以使用例如指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)方法来产生(参见，例如，Tuerk and Gold，Systematic evolution of ligands byexponential enrichment：RNA ligands to bacteriophage T4 DNA Polymerase.Science249：505-510，1990，通过引用并入本文)。
在某些实施方案中，TGF-β和/或p38抑制剂可以是分子量为50至800Da、80至700Da、100至600Da或150至500Da的小合成分子。
在某些实施方案中，TGF-β和/或p38抑制剂包含吡啶基咪唑或2，4-二取代的teridine或喹唑啉，例如包含：
Figure BPA0000322182560000321
可根据本发明使用的TGF-β和/或p38抑制剂的具体实例包括但不限于：SB-202190、SB-203580、SB-206718、SB227931、VX-702、VX-745、PD-169316、RO-4402257、BIRB-796、A83-01SB-431542、SB505124、SB-525334、LY 364947、SD-208、SJ 2511(参见表2)。
例如，可以将SB-202190以50nM至100μM、或100nM至50μM、或1μM至50μM的浓度添加至培养基中。例如，可以将SB-202190以约10μM添加至培养基中。
可以将SB-203580以50nM至100μM、或100nM至50μM、或1μM至50μM的浓度添加至培养基中。例如，可以将SB-203580以约10μM添加至培养基中。
可以将VX-702以50nM至100μM、或100nM至50μM、或1μM至25μM的浓度添加至培养基中。例如，可以将VX-702以约5μM添加至培养基中。
可以将VX-745以10nM至50μM、或50nM至50μM、或250nM至10μM的浓度添加至培养基中。例如，可以将VX-745以约1μM添加至培养基中。
可以将PD-169316以100nM至200μM、或200nM至100μM、或1μM至50μM的浓度添加至培养基中。例如，可以将PD169316以约20μM添加至培养基中。
可以将RO-4402257以10nM至50μM、或50nM至50μM、或500nM至10μM的浓度添加至培养基中。例如，可以将RO-4402257以约1μM添加至培养基中。
可以将BIRB-796以10nM至50μM、或50nM至50μM、或500nM至10μM的浓度添加至培养基中。例如，可以将BIRB-796以约1μM添加至培养基中。
对于表2中其他因子的适用浓度，参见上面的表1和相关文本。
表2：示例性TGF-β和/或p38抑制剂
示例性TGF-β和/或p38抑制剂
Figure BPA0000322182560000341
Figure BPA0000322182560000351
因此，在一些实施方案中，将直接或间接负调节TGF-β和/或p38信号传导的抑制剂以1nM至100μM、10nM至100μM、100nM至10μM、或约1μM的浓度添加至培养基。例如，其中一种或更多种抑制剂的总浓度为10nM至100μM、100nM至10μM或约1μM。
Oct4激活剂。Oct4激活剂是可以激活Oct4启动子驱动的报道基因(例如在Oct4启动子的转录控制下的萤光素酶基因)的试剂，并且更优选能够激活Oct4启动子驱动的报道基因和Nanog启动子驱动的报道基因二者。此外，当与四重重编程因子(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)一起添加至重编程混合物时，Oct4激活剂增强iPSC重编程效率并加速重编程过程。示例性的Oct4激活剂在例如以下中教导：美国专利申请20150191701和Li et al.(2012)“Identification of Oct4-activating compounds that enhance reprogrammingefficiency”.PNAS 109(51)：20853-8。
在某些实施方案中，Oct4激活剂以下式表示：
Figure BPA0000322182560000361
其中，
X1是C(R12)或N；
X2是C(R4)或N；
X3是C(R5)或N；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-CF3、-CCl3、-OH、-SH、-SO3H、-C(O)OH、-C(O)NH2、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的杂烷基、经取代或未经取代的环烷基、经取代或未经取代的杂环烷基、经取代或未经取代的芳基或者经取代或未经取代的杂芳基，其中R2和R3任选地连接以形成经取代或未经取代的杂环烷基或者经取代或未经取代的杂芳基。
在某些优选的实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-CF3、-CCl3、-OH、-SH、-SO3H、-C(O)OH、-C(O)NH2、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的杂烷基，或经取代或未经取代的杂环烷基。
在某些优选的实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-CF3、-CCl3、-OH、-SH、-SO3H、-C(O)OH、-C(O)NH2、经取代或未经取代的烷基，或经取代或未经取代的杂烷基。
在某些优选的实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-CF3、-CCl3、-OH、-SH、-SO3H、-C(O)OH、-C(O)NH2、经取代或未经取代的C1至C10烷基、经取代或未经取代的2元至10元杂烷基，或经取代或未经取代的3元至8元杂环烷基。
在某些优选的实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-CF3、-CCl3、-OH、-SH、-SO3H、-C(O)OH、-C(O)NH2、经取代或未经取代的C1至C10烷基，或经取代或未经取代的2元至10元杂烷基。
在某些优选的实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-CF3、-CCl3、-OH、-SH、-SO3H、-C(O)OH、-C(O)NH2、未经取代的烷基、未取代的杂烷基或经取代的杂环烷基。
在某些优选的实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-CF3、-CCl3、-OH、-SH、-SO3H、-C(O)OH、-C(O)NH2、未经取代的烷基或未经取代的杂烷基。
在某些优选的实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-CF3、-CCl3、-OH、-SH、-SO3H、-C(O)OH、-C(O)NH2、未经取代的C1至C10烷基、未经取代的2元至10元杂烷基或经取代的3元至8元杂环烷基。
在某些优选的实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、卤素、-CN、-NO2、-NH2、-CF3、-CCl3、-OH、-SH、-SO3H、-C(O)OH、-C(O)NH2、未经取代的C1至C10烷基或未经取代的2元至10元杂烷基。
在某些优选的实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、卤素、未经取代的C1至C10烷基或未经取代的2元至10元杂烷基。
在某些优选的实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、卤素、-N(CH3)2、未经取代的C1至C5烷基或未经取代C1至C5烷氧基。
在某些优选的实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、卤素、-N(CH3)2、未经取代的C1至C5烷基、甲氧基、乙氧基或丙氧基。
在某些实施方案中，Oct4激活剂选自以下：
Figure BPA0000322182560000381
在某些实施方案中，Oct4激活剂是OAC1，其具有以下结构：
Figure BPA0000322182560000382
TrkA抑制剂。TrkA抑制剂的代表性实例包括BMS-754807、GW441756、PF-06273340、司曲替尼(MGCD516)、ANA-12、GNF-5837、Belizatinib(TSR-011)、拉罗替尼(LOXO-101)硫酸盐、来他替尼、恩曲替尼(RXDX-101)、GNF 5837和AG-879。
优选地，相对于TrkB或TrkC，TrkA抑制剂对TrkA具有选择性，例如GW441756和司曲替尼(MGCD516)。
优选地，TrkA抑制剂是TrkA的有效的、选择性抑制剂，且IC50为10nM或更小，抑制c-Raf1和CDK2的IC50为抑制TrkA的IC50的至少100倍高，例如GW441756。
其他代表性的Trk抑制剂可以是见于美国专利No.9,187,489中和国际公开No.WO2013/183578中的Trk抑制剂，其二者均通过引用整体并入本文。示例性Trk抑制剂包括PLX7486和DS-6051。
Trk抑制剂的非限制性实例可见于美国公开No.2015/0306086和国际公开No.WO2013/074518中，其二者均通过引用整体并入本文。示例性的Trk抑制剂包括TSR-011。
Trk抑制剂的其他实例可见于美国专利No.8,637,516、国际公开No.WO 2012/034091、美国专利No.9,102,671、国际公开No.WO 2012/116217、美国公开No.2010/0297115、国际公开No.WO 2009/053442、美国专利No.8,642,035、国际公开No.WO2009092049、美国专利No.8,691,221、国际公开No.WO2006131952，所有这些均通过引用整体并入本文。示例性的Trk抑制剂包括GNF-4256，其描述于CancerChemother.Pharmacol.75(1)：131-141，2015；和GNF-5837(N-[3-[[2，3-二氢-2-氧代-3-(1H-吡咯-2-基亚甲基)-1H-吲哚-6-基]氨基]-4-甲基苯基]-N′-[2-氟-5-(三氟甲基)苯基]-脲)，其描述于ACS Med.Chem.Lett.3(2)：140-145，2012，其各自均通过引用整体并入本文。
Trk抑制剂的另外实例包括在美国公开No.2010/0152219、美国专利No.8,114,989和国际公开No.WO 2006/123113中公开的那些，所有这些均通过引用整体并入本文。示例性Trk抑制剂包括AZ623，其描述于Cancer 117(6)：1321-1391，2011；AZD6918，其描述于Cancer Biol.Ther.16(3)：477-483，2015；AZ64，其描述于CancerChemother.Pharmacol.70：477-486，2012；AZ-23((S)-5-氯-N2-(1-(5-氟吡啶-2-基)乙基)-N4-(5-异丙氧基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-2，4-二胺)，其描述于Mol.Cancer Ther.8：1818-1827，2009；和AZD7451；其各自均通过引用整体并入。
Trk抑制剂可包括美国专利No.7,615,383；7,384,632；6,153,189；6,027,927；6,025,166；5,910,574；5,877,016；和5,844,092中描述的那些，其各自均通过引用整体并入。
Trk抑制剂的其他实例包括CEP-751，其描述于Int.J.Cancer 72：672-679，1997；CT327，其描述于Acta Derm.Venereol.95：542-548，2015；国际公开No.WO 2012/034095中描述的化合物；美国专利No.8,673,347和国际公开No.WO 2007/022999中描述的化合物；美国专利No.8,338,417中描述的化合物；国际公开No.WO 2016/027754中描述的化合物；美国专利No.9,242,977中描述的化合物；美国公开No.2016/0000783中描述的化合物；舒尼替尼(N-(2-二乙基氨基乙基)-5-[(Z)-(5-氟-2-氧代-1H-吲哚-3-亚基)甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺)，描述于PLoS One 9：e95628，2014；国际公开No.WO 2011/133637中描述的化合物；美国专利No.8,637,256中描述的化合物；Expert.Opin.Ther.Pat.24(7)：731-744，2014中描述的化合物；Expert Opin.Ther.Pat.19(3)：305-319，2009中描述的化合物；(R)-2-苯基吡咯烷取代的咪唑并哒嗪，例如(4-((5-氯-4-(甲基氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯基)(吗啉代)甲酮，如ACS Med.Chem.Lett.6(5)：562-567，2015中所描述；GTx-186和其他，如PLoS One 8(12)：e83380，2013中所描述；K252a((9S-(9α，10β，12α))-2，3，9，10，11，12-六氢-10-羟基-10-(甲氧基羰基)-9-甲基-9，12-环氧-1H-二吲哚并[1，2，3-fg：3′，2′，1′-kl]吡咯并[3，4-i][1，6]苯并二氮芳辛-1-酮)，如Mol.CellBiochem.339(1-2)：201-213，2010中所描述；4-氨基吡唑基嘧啶，例如AZ-23(((S)-5-氯-N2-(1-(5-氟吡啶-2-基)乙基)-N4-(5-异丙氧基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-2，4-二胺))，如J.Med.Chem.51(15)：4672-4684，2008中所描述；PHA-739358(达鲁舍替(danusertib))，如Mol.Cancer Ther.6：3158，2007中所描述；Go 6976(5，6，7，13-四氢-13-甲基-5-氧代-12H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4-c]咔唑-12-丙腈)，如J.Neurochem.72：919-924，1999中所描述；GW441756((3Z)-3-[(1-甲基吲哚-3-基)亚甲基]-1H-吡咯并[3，2-b]吡啶-2-酮)，如IJAE 115：117，2010中所描述；密西利(milciclib)(PHA-848125AC)，如J.Carcinog.12：22，2013中所描述；AG-879((2E)-3-[3，5-双(1，1-二甲基乙基)-4-羟基苯基]-2-氰基-2-丙烯硫代酰胺)；altiratinib(N-(4-((2-(环丙烷甲酰胺基)吡啶-4-基)氧基)-2，5-二氟苯基)-N-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺)；卡博替尼(N-(4-((6，7-二甲氧基喹啉-4-基)氧基)苯基)-N′-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺)；来他替尼((5S，6S，8R)-6-羟基-6-(羟基甲基)-5-甲基-7，8，14，15-四氢-5H-16-氧杂-4b，8a，14-三氮杂-5，8-甲烷二苯并[b，h]环辛[jkl]环戊[e]不对称引达省13(6H)-酮)；多韦替尼(4-氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮单2-羟基丙酸水合物)；司曲替尼(N-(3-氟-4-((2-(5-(((2-甲氧基乙基)氨基)甲基)吡啶-2-基)噻吩并[3，2-b]吡啶-7-基)氧基)苯基)-N-(4-氟苯基)环丙烷-1，1-二甲酰胺)；ONO-5390556；瑞格菲尼(4-[4-({[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基}氨基)-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-甲酰胺水合物)；VSR-902A；所有上述参考文献均通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，Trk抑制剂选自：(6R)-9-氟-2，11，15，19，20，23-六氮杂五环[15.5.2.17，11.02，6.020，24]二十五烷-1(23)，7，9，17(24)，18，21-己烯-16，25-二酮；(6R)-12-氧杂-2，16，20，21，24，26-六氮杂五环[16.5.2.17，11.02，6.021，25]二十六烷-1(24)，7(26)，8，10，18(25)，19，22-庚烷-17-酮；(6R)-9-氟-13-氧杂-2，11，17，21，22，25-六氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7，9，11，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(6R)-9-氟-15-羟基-13-氧杂-2，11，17，21，22，25-六氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7，9，11，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(6R，13S)-9-氟-13-羟基-2，11，15，19，20，23-六氮杂五环-[15.5.2.17，11.02，6.020，24]二十五烷-1(23)，7，9，17(24)，18，21-己烯-16，25-二酮；(6R，15R)-9-氟-15-羟基-13-氧杂-2，11，17，21，22，25-六氮杂五环-[17.5.2.02，6.07 ，12.022，26]二十六烷-1(25)，7，9，11，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(6R，13R)-9-氟-13-羟基-2，11，15，19，20，23-六氮杂五环-[15.5.2.17，11.02，6.020，24]二十五烷-1(23)，7，9，17(24)，18，21-己烯-16，25-二酮；(6R)-9-氟-13-氧杂-2，11，16，20，21，24-六氮杂五环[16.5.2.02 ，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷-17-酮；(6R)-9-氟-13-氧杂-2，11，18，22，23，26-六氮杂五环[18.5.2.02，6.07，12.023，27]二十七烷-1(26)，7，9，11，20(27)，21，24-庚烷-19-酮；(6R)-9-氟-2，11，16，20，21，24-六氮杂五环[16.5.2.17，11.02， 6.021，25]二十六烷-1(24)，7，9，18(25)，19，22-己烯-17，26-二酮；(6R)-9-氟-2，11，13，16，20，21，24-七氮杂五环[16.5.2.02，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷-17-酮；(6R)-9-氟-2，11，13，17，21，22，25-七氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7，9，11，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(6R)-9-氟-13，16-二氧杂-2，11，20，21，24-五氮杂五环[16.5.2.02，6.07，12.021，25]-二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷-17-酮；(6R)-9-氟-14-氧杂-2，11，18，19，22-五氮杂五环[14.5.2.17，11.02，6.019，23]二十四烷-1(22)，7，9，16(23)，17，20-己烯-15，24-二酮；(6R)-9-氟-13，16-二氧杂-2，11，17，21，22，25-六氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7，9，11，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(6R，13R)-9，13-二氟-2，11，15，19，20，23-六氮杂五环[15.5.2.17，11.02，6.020，24]二十五烷-1(23)，7，9，17(24)，18，21-己烯-16，25-二酮；(6R)-9-氟-17-甲基-13-氧杂-2，11，17，21，22，25-六氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7，9，11，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(6R)-9，15，15-三氟-13-氧杂-2，11，17，21，22，25-六氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7，9，11，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(6R)-9-氟-13-氧杂-2，17，21，22，25-五氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7，9，11，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(6R)-9-氟-13-氧杂-2，16，20，21，24-五氮杂五环[16.5.2.02，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷；1-[(6R)-9-氟-13-氧杂-2，16，20，21，24-五氮杂五环[16.5.2.02，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷-16-基]乙烷-1-酮；1-[(6R)-9-氟-13-氧杂-2，16，20，21，24-五氮杂五环[16.5.2.02，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷-16-基]-2-羟基乙烷-1-酮；(6R)-9-氟-13-氧杂-2，17，21，22，25-五氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7，9，11，19(26)，20，23-庚烷；(6R)-9-氟-16-甲磺酰基-13-氧杂-2，16，20，21，24-五氮杂五环[16.5.2.02，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷；2-[(6R)-9-氟-13-氧杂-2，16，20，21，24-五氮杂五环[16.5.2.02，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷-16-基]乙酸；(6R)-9-氟-17-甲磺酰基-13-氧杂-2，17，21，22，25-五氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7，9，11，19(26)，20，23-庚烷；(6R)-N-乙基-9-氟-13-氧杂-2，17，21，22，25-五氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022 ，26]二十六烷-1(25)，7，9，11，19(26)，20，23-庚烷-17-甲酰胺；(6R)-N-乙基-9-氟-13-氧杂-2，16，20，21，24-五氮杂五环-[16.5.2.02，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷-16-甲酰胺；(6S)-9-氟-4，13-二氧杂-2，11，17，21，22，25-六氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7(12)，8，10，19(26)，20，23-庚烷-3，18-二酮；(6S)-9-氟-4，13-二氧杂-2，11，16，20，21，24-六氮杂五环[16.5.2.02，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7(12)，8，10，18(25)，19，22-庚烷-3，17-二酮；(6R)-9-氟-2，11，16，20，21，24-六氮杂五环[16.5.2.02，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷-17-酮；(6R)-9-氟-15-甲基-2，11，16，20，21，24-六氮杂五环[16.5.2.02，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷-17-酮；(6R，13R)-9-氟-13-甲基-2，11，15，19，20，23-六氮杂五环[15.5.2.17，11.02，6.020，24]二十五烷-1(23)，7，9，17(24)，18，21-己烯-16，25-二酮；(6R，13S)-9-氟-13-甲基-2，11，15，19，20，23-六氮杂五环[15.5.2.17，11.02，6.020，24]二十五烷-1(23)，7，9，17(24)，18，21-己烯-16，25-二酮；(6R)-9-氟-15，15-二甲基-13-氧杂-2，11，17，21，22，25-六氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7，9，11，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(6R)-9-氟-15，15-二甲基-2，11，16，20，21，24-六氮杂五环[16.5.2.02，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷-17-酮；(6R)-9-氟-13-氧杂-2，11，16，17，21，25，26，29-八氮杂六环[21.5.2.02，6.07，12.016，20.026，30]三十烷-1(29)，7，9，11，17，19，23(30)，24，27-壬烷-22-酮；(6R)-9-氟-13-氧杂-2，11，19，21，25，26，29-七氮杂六环[21.5.2.02，6.07，12.015，20.026，30]三十烷-1(29)，7，9，11，15(20)，16，18，23(30)，24，27-癸烷-22-酮；(6R)-9-氟-13，13-二甲基-2，11，15，19，20，23-六氮杂五环[15.5.2.17，11.02，6.020，24]二十五烷-1(23)，7，9，17(24)，18，21-己烯-16，25-二酮；(4R，6R，15S)-9-氟-4，15-二羟基-13-氧杂-2，17，21，22，25-五氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7(12)，8，10，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(4R，6S，15S)-9-氟-4，15-二羟基-13-氧杂-2，17，21，22，25-五氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7(12)，8，10，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(4R，6R)-9-氟-4-羟基-13-氧杂-2，17，21，22，25-五氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7(12)，8，10，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(4R，6S)-9-氟-4-羟基-13-氧杂-2，17，21，22，25-五氮杂五环[17.5.2.02，6.07， 12.022，26]二十六烷-1(25)，7(12)，8，10，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(4R，6R)-9-氟-4-羟基-13-氧杂-2，16，20，21，24-五氮杂五环[16.5.2.02，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷-17-酮；(4R，6S)-9-氟-4-羟基-13-氧杂-2，16，20，21，24-五氮杂五环[16.5.2.02，6.07，12.021，25]二十五烷-1(24)，7，9，11，18(25)，19，22-庚烷-17-酮；(4R，6R，15R)-9-氟-4，15-二羟基-13-氧杂-2，17，21，22，25-五氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7(12)，8，10，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；(4R，6S，15R)-9-氟-4，15-二羟基-13-氧杂-2，17，21，22，25-五氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7(12)，8，10，19(26)，20，23-庚烷-18-酮；和(15S)-4，4，9-三氟-15-羟基-13-氧杂-2，17，21，22，25-五氮杂五环[17.5.2.02，6.07，12.022，26]二十六烷-1(25)，7(12)，8，10，19(26)，20，23-庚烷-18-酮，或其可药用盐。
在一些实施方案中，Trk抑制剂选自：(R)-N-叔丁基-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(吡啶-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(3-甲基吡啶-2-基)吡唑并[1，5-a]-嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-吗啉代乙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((5-甲基呋喃-2-基)甲基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((反式)-4-羟基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(1-羟基-2-甲基丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-甲基-1-吗啉代丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-1-(5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-羰基)哌啶-4-羧酸；(R)-2-(1-(5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-羰基)哌啶-4-基)乙酸；(R)-N-环丙基-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-环丁基-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-((2S)-双环[2.2.1]庚烷-2-基)-5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(1-(羟基甲基)环丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-羟基-2-甲基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)((S)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲酮；(5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲酮；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((1-甲基-1H-咪唑-4-基)甲基)吡唑[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)乙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-(2-氧代咪唑烷-1-基)乙基)吡唑[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(2-(1H-咪唑-4-基)乙基)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((R)-2，3-二羟基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N，N-二甲基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(2-(1H-咪唑-1-基)乙基)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-2，3-二羟基丙基)吡唑[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-(5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)甲酮；(R)-(5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)甲酮；反式-4-(5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰氨基)环己烷羧酸；5-((R)-2-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡咯烷-1-基)-N-((反式)-4-羟基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(3-氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((反式)-4-羟基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-叔丁基-5-(2-(3-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-环丙基-5-(2-(3-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(2-氰基丙烷-2-基)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(氰基甲基)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(1-氟-2-甲基丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-环丙基-5-((2R，4R)-2-(3-氟苯基)-4-羟基吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-叔丁基-5-((2R，4R)-2-(3-氟苯基)-4-羟基吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2R，4R)-2-(3-氟苯基)-4-羟基吡咯烷-1-基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(1-(甲基磺酰基)哌啶-4-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(1-氨磺酰基哌啶-4-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-(甲基磺酰胺基)乙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-氨磺酰基乙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-环丙基-5-(2-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-羟基-2-甲基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(4-羟基-4-甲基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺(非对映体1)；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(4-羟基-4-甲基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺(非对映体2)；(R)-N-环丙基-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-叔丁基-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-吗啉代乙基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-((S)-2，3-二羟基丙基)-5-((R)-2-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-((R)-2，3-二羟基丙基)-5-((R)-2-(5-氟-2-甲氧基苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-甲基-1-(甲基磺酰胺基)丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(2-氨基-2-甲基丙基)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-叔丁基-5-(4，4-二氟-2-(3-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(1，3-二羟基-2-甲基丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((3S，4R)-3-氟哌啶-4-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-((S)-2，3-二羟基丙基)-5-((R)-2-(5-氟-2-(三氟甲基)苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-((R)-2，3-二羟基丙基)-5-((R)-2-(5-氟-2-(三氟甲基)苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-(三氟甲基)苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-甲氧基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(5-(2，5-二氟苯基)-2，2-二甲基吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-环丙基-5-(5-(2，5-二氟苯基)-2，2-二甲基吡咯烷-1-基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(2-氰基丙烷-2-基)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-(甲基磺酰基)哌啶-4-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(1-氟-2-甲基丙烷-2-基)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(四氢-2H-吡喃-4基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-甲氧基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(3-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；((R)-5-(2-(3-氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-甲氧基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(3-氟-5-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-环丙基-5-(2-(3-氟-5-(2-甲氧基乙氧基)苯基)吡咯烷-1-基)吡唑[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(3-氟-5-(2-甲氧基乙氧基)苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-环丙基-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-叔丁基-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-氟-2-甲基丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-甲氧基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-1-(5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰氨基)-环丙烷羧酸；(R)-N-环丙基-5-(2-(3-氟-5-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-环丙基-5-(2-(5-氟-2-(2-吗啉代乙氧基)苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-2，3-二羟基丙氧基)吡唑并[1-，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-(2-甲氧基乙氧基)苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-环丙基-5-(2-(5-氟-2-(2-甲氧基乙氧基)苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-甲基环丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-(5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)甲酮；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-异丙基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-(5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)(吡咯烷-1-基)甲酮；(R)-N-(5-氟吡啶-2-基)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-(5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)甲酮；N-(3-氯-2-氟丙基)-5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-(三氟甲基)环丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((反式)-4-羟基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((顺式)-4-羟基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-环丁基-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-甲基环丁基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((1S，2S)-2-羟基环戊基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((1S，2R)-2-羟基环戊基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((1S，3S)-3-羟基环戊基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(环丙基甲基)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-(羟基甲基)环丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-(5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)甲酮；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-2-羟基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((R)-2-羟基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(2-羟基-2-甲基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(2-羟基乙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-(1-环丙基乙基)-5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((R)-1-羟基丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-羟基丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-甲氧基丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(2-羟基-3-甲氧基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((反式)-2-羟基环戊基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-羟基-3-甲基丁烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((R)-1-羟基-3-甲基丁烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-((R)-1-环丙基乙基)-5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-((S)-1-环丙基乙基)-5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(3-羟基-2，2-二甲基-丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-氮杂环丁烷-1-基(5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)甲酮；(R)-(5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-基)(3-(羟基甲基)氮杂环丁烷-1-基)甲酮；(5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)((S)-3-羟基吡咯烷-1-基)甲酮；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((R)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(2，2，2-三氟乙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-羟基-2-甲基丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((1R，2R)-2-羟基环戊基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(2，2-二氟乙基)-5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((1R，2S)-2-羟基环戊基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((1R，2R)-2-羟基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-(5-(2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)(哌啶-1-基)甲酮；5-((R)-2-(5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((2R，3S，4S)-3-(羟基甲基)双环[2.2.1]庚烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-(5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)甲酮；5-((R)-2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((反式)-4-羟基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-叔丁基3-(5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰氨基)丙基氨基甲酸酯；(R)-N-(3-氨基丙基)-5-(2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-((S)-2，3-二羟基丙基)-5-((R)-2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-((S)-3-氯-2-羟基丙基)-5-((R)-2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-((R)-3-氯-2-羟基丙基)-5-((R)-2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(2-氯乙氧基)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-(5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)甲酮；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(3-羟基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-(2，3-二羟基丙基)-5-((R)-2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-((R)-2，3-二羟基丙基)-5-((R)-2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(4-羟基丁基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(2-叔丁氧基乙氧基)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((1S，3S)-3-羟基环戊基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(2-羟基乙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-2-羟基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((R)-2-羟基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(2-羟基-2-甲基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(1，3-二羟基丙烷-2-基)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(6-氧代-1，6-二氢吡啶-3-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-(甲基磺酰基)哌啶-4-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(2-氯乙基)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(2-溴乙氧基)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-(2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-羟基乙基)吡唑并[1，5a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-羟基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-羟基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(3-羟基-2，2-二甲基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((1S，3S)-3-羟基环戊基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-(4-羟基哌啶-1-基)乙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(2-甲氧基乙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-(1，3-二羟基丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((2S，3R)-1，3-二羟基丁烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((2S，3S)-1，3-二羟基丁烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((2R，3S)-1，3-二羟基丁烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-羟基丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-羟基丁烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-羟基-3-甲基丁烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-羟基-3，3-二甲基丁烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-环丙基-5-(2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-环丙基-5-(2-(2-乙基-5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并-[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-叔丁基-5-(2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-异丙基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-环丁基-5-(2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-甲基吡唑并-[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(2-羟基乙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((R)-2-羟基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-甲基环丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(2-甲氧基乙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-(5-(2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)(3-羟基氮杂环丁烷-1-基)甲酮；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-(羟基甲基)环丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((反式)-4-羟基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((顺式)-4-羟基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((1S，3S)-3-羟基环戊基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((1R，2R)-2-羟基环戊基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟-2-甲基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((R)-奎宁环-3-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2-乙基-5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((反式)-4-羟基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(2-乙基-5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((1S，3S)-3-羟基环戊基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2-乙基-5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(2-羟基-2-甲基丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-叔丁基-5-(2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(2-氯乙基)-5-(2-(5-氟-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-环丙基-5-((2R)-2-(2-((2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2R)-2-(2-((2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-环丙基-5-((2R)-2-(3-((2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2R)-2-(3-((2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-环丙基-5-((2R)-2-(3-(2，3-二羟基丙氧基)-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2R)-2-(3-(2，3-二羟基丙氧基)-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-环丙基-5-((2R)-2-(2-(2，3-二羟基丙氧基)-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2R)-2-(2-(2，3-二羟基丙氧基)-5-氟苯基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2R，5S)-2-(5-氟吡啶-3-基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)-N-((R)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2R，5S)-2-(5-氟吡啶-3-基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2R，5S)-2-(5-氟吡啶-3-基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)-N-(1-甲基环丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2R，5S)-2-(5-氟吡啶-3-基)-5-(羟基甲基)吡咯烷-1-基)-N-异丙基-吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2R，4S)-2-(3-氟苯基)-4-羟基吡咯烷-1-基)-N-((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2R，4S)-2-(3-氟苯基)-4-羟基吡咯烷-1-基)-N-异丙基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2R，4S)-2-(3-氟苯基)-4-羟基吡咯烷-1-基)-N-甲基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2S，5R)-5-(5-氟吡啶-3-基)-2-(羟基甲基)-2-甲基吡咯烷-1-基)-N-异丙基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((2S，5R)-5-(5-氟吡啶-3-基)-2-(羟基甲基)-2-甲基吡咯烷-1-基)-N-((S)-1，1，1-三氟丙烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-(5-(2-(2-氨基-5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)(氮杂环丁烷-1-基)甲酮；(R)-叔丁基3-(5-(2-(2-氯-5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰氨基)丙基氨基甲酸酯；(R)-N-(3-氨基丙基)-5-(2-(2-氯-5-氟吡啶-3-基)吡咯烷基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(2-叔丁氧基乙氧基)-5-(2-(2-氯-5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(2-氯-5-氟吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(2-羟基乙氧基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-叔丁基-5-(2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-异丙基吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-环丙基-5-(2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(6-甲基吡啶-3-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-环丁基-5-(2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(吡啶-3-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(环丙基甲基)-5-(2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((S)-1-羟基-3，3-二甲基丁烷-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((1R，2R)-2-羟基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-((R)-1-环丙基乙基)-5-((R)-2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；N-((S)-1-环丙基乙基)-5-((R)-2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-甲基环丙基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；5-((R)-2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-((反式)-4-羟基环己基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(5-氟吡啶-2-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(3-甲基-1H-吡唑-5-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(3-环丙基-1H-吡唑-5-基)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；(R)-N-(3-乙基-1H-吡唑-5-基)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺；和(R)-5-(2-(5-氟-2-甲氧基吡啶-3-基)吡咯烷-1-基)-N-(1-异丙基-1H-吡唑-3-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-甲酰胺，或其可药用盐。
在一些实施方案中，Trk抑制剂选自：5-氟-2-[[(1S)-1-(5-氟-2-吡啶基)乙基]氨基]-6-[(5-异丙氧基-1H-吡唑-3-基)氨基]吡啶-3-氰基；((2E)-3-[3，5-双(1，1-二甲基乙基)-4-羟基苯基]-2-氰基-2-丙烯硫代酰胺)；2，2-二氯-N-[3-[(7-氯喹啉-4-基)氨基]丙基]-N-甲基乙酰胺；N-[3-[[2，3-二氢-2-氧代-3-(1H-吡咯-2-基亚甲基)-1H-吲哚-6-基]氨基]-4-甲基苯基]-N′-[2-氟-5-(三氟甲基)苯基]-脲；(S)-5-氯-N2-(1-(5-氟吡啶-2-基)乙基)-N4-(5-异丙氧基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-(S)-N-(1-(5-氟嘧啶-2-基)乙基)-3-(5-异丙氧基-1H-吡唑-3-基)-3H-咪唑并[4，5-b]吡啶-5-胺，4-二胺；5，6，7，13-四氢-13-甲基-5-氧代-12H-吲哚并[2，3-a]吡咯并[3，4-c]咔唑-12-丙腈；1，3-二氢-3-[(1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-2H-吡咯并[3，2-b]吡啶-2-酮；或其可药用盐。
在一些实施方案中，Trk抑制剂选自：(2R)-2-({4-[(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)氨基]-5-氟嘧啶-2-基}-氨基)-2-(4-氟苯基)乙醇；5-溴-N4-(3-环丙基-1H-吡唑-5-基)-N2-[(1S)-1-(4-氟苯基)乙基]嘧啶-2，4-二胺；(2R)-2-({5-氯-4-[(3-环丙基-1H-吡唑-5-基)氨基]嘧啶-2-基}-氨基)-2-(4-氟苯基)乙醇；(2R)-2-({5-氯-4-[(3-异丙氧基-1H-吡唑-5-基)氨基]嘧啶-2-基}氨基)-2-(4-氟苯基)乙醇；(3S)-3-({5-氯-4-[(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)氨基]嘧啶-2-基}-氨基)-3-(4-氟苯基)-N-甲基丙烷酰胺；2-({5-氯-2-{[(1S)-1-(4-氟苯基)乙基]氨基}-6-[(5-异丙氧基-1H-吡唑-3-基)氨基]-嘧啶-4-基}氨基)丙烷e-1，3-二醇；2-[(5-氯-6-[(3-环丙基-1H-吡唑-5-基)氨基]-2-{[(1S)-1-(4-氟苯基)乙基]氨基]嘧啶-4-基)氨基}丙烷-1，3-二醇；5-氯-N4-(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)-N2-[(1S)-(4-氟-苯基)-乙基]-6-(4-甲基-哌嗪-1-基)-嘧啶-2，4-二胺；(2R)-2-({4-[(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)氨基]-7-氟喹唑啉-2-基}氨基)-2-(4-氟苯基)乙醇；和2-[(5-氯-6-[(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-{[(1R)-1-(4-氟苯基)-2-羟基乙基]氨基}嘧啶-4-基)氨基]丙烷-1，3-二醇；或其可药用盐。
在一些实施方案中，Trk抑制剂选自：1-(3-叔丁基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-叔丁基-1-对甲苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)盐酸脲；反式-1-(4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；反式-1-(4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-异丙基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-叔丁基-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(1，3-二甲基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-叔丁基-1-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-叔丁基-1-(4-氟苯基)-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基-乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-环丙基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-异丙基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-叔丁基-1-(2-氟苯基)-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-叔丁基-1-(3-氟苯基)-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-(吡啶-3-基)-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)硫代脲；1-(2-(3-氟苯基)-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(2-(4-氟苯基)-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-环戊基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(1-乙基-3-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-4，5，6，7-四氢-2H-吲唑-3-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-甲基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(1，3-二甲基-4-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-叔丁基-1-邻甲苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-叔丁基-1-间甲苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-4-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(4-氰基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(3-叔丁基-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-(吡啶-2-基)-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(6，6-二甲基-2-苯基-2，4，5，6-四羟基氯戊(clopenta)[c]吡唑-3-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基-吡咯烷-3-基)脲；1-(7，7-二甲基-2-苯基-4，5，6，7-四氢-2H-吲唑-3-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-(吡啶-4-基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；反式-1-(4-(3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；反式-1-(-4-(3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-异丙基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；反式-1-(4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-异丙基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；反式-1-(4-(3-氯苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-异丙基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；反式-1-(4-(2-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-异丙基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；反式-1-(3-异丙基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(1-(2-甲氧基乙基)-4-(噻吩-2-基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3，4-反式)-4-(2，4-二甲基噻唑-5-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-(
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唑-5-基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(反式-4-(异
Figure BPA0000322182560000552
唑-5-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3，4-反式)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3-甲氧基苯基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(1-(2-甲氧基乙基)-4-(噻唑-2-基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(1-苯基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-(1，4-二甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-环丙基-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1，1′-二甲基-1H，1′H-3，4′-双吡唑-5-基)脲；1-(3-(3-氰基苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(4-氰基苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(咪唑并[1，2-a]吡啶-5-基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(4-氯-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1，3-二甲基-4-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(4-氰基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1-甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-1-甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氰基-3-(氰基甲基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(2-氰基丙烷-2-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-3，4′-双吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(氧杂环丁烷-3-基甲氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-((3-甲基氧杂环丁烷-3-基)甲氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(((S)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(((R)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；叔丁基3-(3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲基)-2-苯基-4，6-二氢吡咯并[3，4-c]吡唑-5(2H)-羧酸盐/酯；1-(3-异丙基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-4，6-二氢-2H-呋喃并[3，4-c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-4，6-二氢-2H-噻吩并[3，4-c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-异丙基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-4，6-二氢-2H-呋喃并[3，4-c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-4，6-二氢-2H-噻吩并[3，4-c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-4，6-二氢-2H-呋喃并[3，4-c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-4，6-二氢-2H-噻吩并[3，4-c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-(1-羟基-2-甲基丙烷-2-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(5-环氧-2-苯基-4，6-二氢-2H-噻吩并[3，4-c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-(吡啶-4-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-(吡啶-4-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-(噻吩-2-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(3-(甲氧基甲基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(3-(甲氧基甲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-对甲苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-间甲苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-邻甲苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(3-甲氧基苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-甲氧基苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(3-(4-甲氧基苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3-(三氟甲基)苯基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(2，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(4氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(3-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；
1-(3-(1-羟基-2-甲基丙烷-2-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(1-羟基-2-甲基丙烷-2-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-(4-氯苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(2，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲；甲基4-(5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-甲基-1H-吡唑-3-基)苯甲酸盐/酯；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-(2-羟基乙基)-3-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(甲氧基甲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(甲氧基甲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-(4-(甲基硫代)苯基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(3-甲氧基丙基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(3，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲氧基-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(羟基甲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-羟基乙基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-甲氧基乙基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-(苄基氧基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；反式-1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-甲氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-(氰基甲氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟-苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(4-甲氧基苄基氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-甲氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-氟乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-羟基-2-甲基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-羟基乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(2-环己基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-(吡啶-4-基)-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-(5-甲基吡嗪-2-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1，4-二甲基-3-(5-甲基吡嗪-2-基)-1H-吡唑-5-基)脲；乙基5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸盐/酯；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-(吡嗪-2-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-甲氧基-1-甲基-4-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-1-甲基-4-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基)脲二氢氯化物；1-(5-乙酰基-2-苯基-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-(羟基甲基)-3-(甲氧基甲基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；4-(5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-甲基-1H-吡唑-3-基)苯甲酸；4-(5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-甲基-1H-吡唑-3-基)苯甲酰胺；4-(5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-甲基-1H-吡唑-3-基)-N-甲基苯甲酰胺；4-(5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-甲基-1H-吡唑-3-基)-N，N-二甲基苯甲酰胺；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(4-(羟基甲基)苯基)-1-甲基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-(4-(甲基磺酰基)苯基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-氟-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-氟-1-甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-氟-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)脲；2-甲氧基乙基4-(5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-甲基-1H-吡唑-3-基)苯甲酸盐/酯；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(5，5-二环氧-2-苯基-4，6-二氢-2H-噻吩并[3，4-c]吡唑-3-基)脲；1-(5，5-二环氧-2-苯基-4，6-二氢-2H-噻吩并[3，4-c]吡唑-3-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(5，5-二环氧-2-苯基-4，6-二氢-2H-噻吩并[3，4-c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(2-(甲基磺酰基)乙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-(羟基甲基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((R)-2，3-二羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((S)-2，3-二羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-羟基乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)盐酸脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((S)-2-羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)盐酸脲；1-((3R，4S)-4-羟基-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3R，4S)-4-氟-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(反式-4-苯基-1-(2-(三氟甲氧基)乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(反式-1-(2-(甲基硫代)乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-((S)-2-甲氧基丙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3，4-反式)-4-苯基-1-(4，4，4-三氟丁基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(氰基甲基)-4-(3，4-二氟苯基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(氰基甲基)-4-(3，4-二氟苯基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3，4-反式)-1-(氰基甲基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(氰基甲基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；2-((3R，4S)-3-苯基-4-(3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲基)吡咯烷-1-基)乙酰胺；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-羟基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((反式)-1-(3，3，4，4，4-戊氟丁基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((反式)-1-乙基-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((反式)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(3，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((反式)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((反式)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((反式)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(3，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氟苯基)-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)-3(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(3，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3-氟苯基)-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氟苯基)-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)-3(3-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氟苯基)-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)-3(1-甲基-3-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3R，4S)-4-(3-氟苯基)-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3R，3S)-4-(3-氟苯基)-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((反式)-1-(1，3-二氟丙烷-2-基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；(反式)-叔丁基3-(3-甲氧基苯基)-4-(3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲基)吡咯烷-1-羧酸盐/酯；1-((反式)-4-(3-氯苯基)-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)-3(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)-3-((反式)-4-(吡啶-2-基)-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((反式)-4-(4-氟苯基)-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)-3(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((反式)-4-(4-氯苯基)-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)-3(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((反式)-4-(2-氯苯基)-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)-3(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)-3-((反式)-4-(吡啶-3-基)-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((反式)-4-(2-氟苯基)-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)-3(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((反式)-4-(4-氟苯基)-1-(2，2-二氟乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(1H-吡唑-4-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(1H-吡唑-4-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(1H-吡唑-3-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(3-甲基-1H-吡唑-4-基)吡咯烷3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(1H-吡唑-4-基)吡咯烷-3基)-3-(3-((S)-2-羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(1H-吡唑-4-基)吡咯烷-3基)-3-(3-((R)-2，3-二羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟-苯基)-1-(1H-吡唑-4-基)吡咯烷3-基)-3-(3，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(1H-吡唑-4-基)吡咯烷-3-基)-3-(3，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(1H-吡唑-4-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(3-甲氧基丙基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(1H-吡唑-4-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-甲氧基乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(1H-吡唑-4-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-羟基-2-甲基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3R，4S)-1-(1-甲基-1H吡唑-5-基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)吡咯烷3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3R，4S)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)吡咯烷3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-苯基吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基苯基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-氟苯基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(4-氟苯基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲基苯基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基苯基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-氯苯基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-苯基-1-(2-(三氟甲氧基)苯基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2，6-二氟苯基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基吡啶-4-基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基吡啶-3-基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-乙氧基吡啶-3-基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基吡啶-3-基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基吡啶-3-基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(4-溴-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基吡啶-3-基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基吡啶-3-基)-4-苯基吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-((1，2，3-噻二唑-4-基)甲基)-4-(3，4-二氟苯基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-((1，2，3-噻二唑-4-基)甲基)-4-(3，4-二氟苯基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-1-((1，2，3-噻二唑-4-基)甲基)-4-(3，4-二氟苯基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(氰基甲氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-1-((1，2，3-噻二唑-4-基)甲基)-4-(3，4-二氟苯基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，11′H-3，4′-双吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-1-((1，2，3-噻二唑-4-基)甲基)-4-(3，4-二氟苯基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-((1-甲基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(1，3-二甲氧基丙烷-2-基)吡咯烷3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(1-甲氧基丙烷-2-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((反式)-4-(4-氟苯基)-1-(2-(甲基氨基)乙基)吡咯烷-3-基)-3(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((反式)-1-((1H-咪唑-2-基)甲基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；甲基3-甲氧基-2-((反式)-3-苯基-4-(3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲基)吡咯烷-1-基)丙酸酯/盐；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(1-甲氧基丙烷-2-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(1-羟基-3-甲氧基丙烷-2-基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(3-羟基-1-甲氧基-3-甲基丁烷-2-基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；2-((3R，4S)-3-(3，4-二氟苯基)-4-(3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基丙酸盐酸盐；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(1-羟基-3-甲氧基丙烷-2-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(4-氯-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-3，4′-双吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(1-羟基-3-甲氧基丙烷-2-基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3基)-3-(3-甲氧基-1-苯基-4-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-(2-氟乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3R，4S)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3R，4S)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(氰基甲氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3R，4S)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-3，4′-双吡唑-5-基)-3-((3R，4S)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-3，4′-双吡唑-5-基)-3-((3R，4S)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(((S)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3R，4S)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-((R)-2，3-二羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3R，4S)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；(R，S)1-((2.α.，3.β.，4.α.)-2-甲基-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；(R，S)-1-((3(3，4.α.，5.α.)-5-甲基-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-((S)-1，1，1-三氟-3-羟基丙烷-2-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-((S)-1，1，1-三氟-3-甲氧基丙烷-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-((S)-1，1，1-三氟-3-甲氧基丙烷-2-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((S)-2-羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(4-氯-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-3，4′-双吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-((R)-1，1，1-三氟-3-甲氧基丙烷-2-基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-((R)-1，1，1-三氟-3-甲氧基丙烷2-基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((S)-2-羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-甲基-4-(甲基硫代)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3基)-3-(3-(3-甲氧基丙基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-(1，1-二氟-2-羟基乙基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(1，1-二氟-2-羟基乙基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5基)-3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(1，1-二氟-2-羟基乙基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(1，1-二氟-2-羟基乙基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-羟基乙基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2羟基乙基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-羟基-2-甲基丙基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((S)-2-羟基丙基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((R)-2-羟基丙基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；乙基5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-羧酸盐/酯；5-(3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-N，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-甲酰胺；1-(反式-4-(3-氯-4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-(反式-4-(4-氯-3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-(反式-4-(3-氯-5-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-(反式-4-(3-氯苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(5-甲基-1，3，4-
Figure BPA0000322182560000651
二唑-2-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(3-甲基-1，2，4-
Figure BPA0000322182560000661
二唑-5-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-(3-(三氟甲基)-1，2，4-
Figure BPA0000322182560000662
二唑-5-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-(3-(三氟甲基)-1，2，4-
Figure BPA0000322182560000663
二唑-5-基)-1H-吡唑-5-基)脲；5-(3-(反式-4-(3-氯-4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-N，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-甲酰胺；5-(3-(反式-4-(4-氯-3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-N，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-甲酰胺；1-(反式-4-(4-氯-3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-4-基)-1-苯基-1H-吡唑5-基)脲；1-(反式-4-(3-氯-4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-4-基)-1-苯基-1H-吡唑5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4，5′-三甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，3′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4，5′-三甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，3′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4，5′-三甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，3′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2′，4，5′-三甲基-1-苯基-1H，2′H-[3，3′-双吡唑]-5-基)脲；1-(4-环丙基-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-异丙基-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑1-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-乙基-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-(4-氟苯基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-(3-氟苯基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-(2-氟苯基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-(3-氯苯基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-(1-(3-氯-4-氟苯基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(1-(3-氯-2-氟苯基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑1-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-(4-氟苯基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-(3-氟苯基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-(2-氟苯基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-(3-氯苯基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-(1-(3-氯-4-氟苯基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(1-(3-氯-2-氟苯基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(2，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氰基苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氰基苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(对甲苯基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4，5-三氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(4-溴-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-反式-1-(2-甲氧基乙基)4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡咯烷-3-基)脲；1-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡咯烷-3-基)脲；1-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-(1，2，3-噻二唑-4-基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3-(三氟甲基)苯基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3-(三氟甲基)苯基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(5-氟吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-((3R，4S)-4-(5-氟吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(3-(2-氟乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(5氟吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(2-氟乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3R，4S)-4-(5氟吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(反式-4-(5-氟吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；1-(反式-4-(5-氯吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(反式-4-(5-氯吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(反式-4-(5-氟吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑1-5-基)-3-(反式-4-(5-氟吡啶-2-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3-氟吡啶-4-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(1-甲基-1H-1，2，4-三唑-3-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′-(2-甲氧基乙基)-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-(3-氰基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′-(2-羟基乙基)-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(2-甲基-2H-1，2，3-三唑-4-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-溴-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(5-甲基-6-氧代-2-苯基-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(5-甲基-6-氧代-2-苯基-2，4，5，6-四氢吡咯并[3，4-c]吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-((5-甲基-1，3，4-
Figure BPA0000322182560000681
二唑-2-基)甲氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(4-氯-3-乙氧基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-氟-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(4-溴-3-(2-羟基-2-甲基丙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-(2-羟基-2-甲基丙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((S)-2-羟基丁氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；乙基2-((5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-基)氧基)乙酸盐/酯；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2羟基-2-甲基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-羟基-2-甲基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((R)-2-羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((R)-2-羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((R)-2-羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-((R)-3，3，3-三氟-2-羟基丙氧基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((S)-2-羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-((S)-3，3，3-三氟-2-羟基丙氧基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-(4-氯-3-(2-羟基-2-甲基丙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-(2-羟基-2-甲基丙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-((R)-2-羟基丙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-((R)-2-羟基丙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-((R)-2-羟基丙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-3-((R)-2-羟基丙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-3-((R)-2-羟基丙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-3-((R)-2-羟基丙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((R)-2-羟基丁氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((R)-2-羟基丁氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((R)-2-羟基丁氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；乙基4-溴-5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-苯基-1H-吡唑-3-羧酸盐/酯；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′-(2-甲氧基乙基)-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑1-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′-(2-甲氧基乙基)-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(2-甲基-2H-1，2，3-三唑-4-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(2-甲基-2H-1，2，3-三唑-4-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(2-吗啉代乙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-(1，3-二氧代异吲哚啉-2-基)乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑5-基)脲；叔丁基4-(2-((5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷3-基)脲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-基)氧基)乙基)哌嗪-1-羧酸盐/酯；反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2H-吲唑3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基-2H-吲唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-((1-甲基-1H-1，2，4-三唑-3-基)甲氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((R)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(((S)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-(吡嗪-2-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-(哒嗪-4-基)-2，4，5，6-四氢环戊[c]吡唑-3-基)脲；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-基二甲基氨基甲酸酯；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-基吗啉-4-羧酸盐/酯；1-(3-(((S)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3，4，5-三氟苯基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(((R)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)甲氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3，4，5-三氟苯基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-((S)-2-(叔丁基二甲基硅氧基)丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3，4，5-三氟苯基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(2-羟基-2-甲基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3，4，5-三氟苯基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-((S)-2-(叔丁基二甲基硅氧基)-3-甲氧基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-(甲氧基-甲基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-3-(甲氧基-甲基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-(甲氧基-甲基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-3-(甲氧基-甲基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-(甲氧基-甲基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-3-(甲氧基-甲基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-(1，1-二氟-2-羟基乙基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-(1，1-二氟-2-羟基乙基)-1-苯基-1H-吡唑-5基)-3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-(1，1-二氟-2-羟基乙基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-((S)-2-羟基丙基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-((R)-2-羟基丙基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-3-((R)-2-羟基丙基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-(2-羟基-2-甲基丙基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-(3-甲基-1，2，4-
Figure BPA0000322182560000711
二唑-5-基)-1-苯基-1H-吡唑5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-3-(2-氰基丙烷-2-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-(2-氰基丙烷-2-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3-4-(4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-苯基-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(5-氟吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氟-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(5-氟吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-反式-4-(5-氟吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-反式-4-(5-氟吡啶3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-4-(5-氟吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1，3-二苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-4-(5-氟吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(反式-4-(5-氟吡啶-2-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-氟-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-氟-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-(4-溴-1′-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4(5-氟吡啶-3-基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4，5-三氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′-(4-甲氧基苄基)-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′-(4-甲氧基苄基)-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲三氟乙酸盐/酯；2-(4-氯-5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-苯基-1H-吡唑-3-基)乙酸乙酯；1-(4-氯-3-(2-羟基乙基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(顺式-3-羟基环丁基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(反式-3-羟基环丁基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(4-氯-3-(顺式-3-羟基环丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-((1r，3S)-3-羟基环丁基)-1-苯基-1H-吡唑-5基)-3-(反式-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)3-(3-(顺式-3-羟基环丁基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(反式-3-羟基环丁基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(顺式-3-羟基环丁基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(反式-3-羟基环丁基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-羧酸；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-N，4-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-甲酰胺；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-N，N，4-三甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-甲酰胺；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-N-乙基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-甲酰胺；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-N-异丙基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-甲酰胺；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-甲酰胺；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-(羟基甲基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氯-4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-3，4′-双吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氯-3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-3，4′-双吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氯-5-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-3，4′-双吡唑-5-基)脲；2-((3R，4S)-3-(3，4-二氟苯基)-4-(3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲基)吡咯烷-1-基)乙酸盐/酯；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(3，3，3-三氟-2-羟基丙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-羟基丙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-氰基乙基)-4-(3，4-二氟苯基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；2-((3R，4S)-3-(3，4-二氟苯基)-4-(3-(3-乙氧基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲基)吡咯烷-1-基)-N-甲基乙酰胺；1-(1-环己基-3，4-二甲基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(3-羟基-2-(羟基甲基)丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-(2，2，2-三氟乙氧基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-(2，2，2-三氟乙氧基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-(2，2，2-三氟乙氧基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-(2，2-二氟乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1-苯基-3-(2，2，2-三氟乙氧基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1-苯基-3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1-苯基-3-(吡啶-4-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1-苯基-3-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-1-苯基-3-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-1-苯基-3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-苯基-1-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-(吡啶-4-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(5-氟吡啶-3-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(5-氟吡啶-3-基)-4-甲基-1-(吡啶-3-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，3′-双吡唑]-5-基)脲；1-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，3′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，3′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2′，4-二甲基-1-苯基-1H，2′H-[3，3′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-(5-氟吡啶-3-基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-(5-甲基吡啶-3-基)-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-(1-(5-氯吡啶-3-基)-1′，4-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-1′-(2，2，2-三氟-1-(2，2，2-三氟乙氧基)乙基)-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-1′-(2，2，2-三氟乙基)-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-(1′-(环丙基甲基)-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷3-基)脲；1-(1′-(环丙烷羰基)-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1′-(甲基磺酰基)-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′-异丙基-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-(嘧啶-5-基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-4-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(1-甲基-6-氧代-1，6-二氢吡啶-3-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4，5′-三甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，3′，4-三甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-(1′-环丙基-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(2-甲基噻唑-5-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(2-甲基嘧啶-5-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-(2-氨基嘧啶-5-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2，4-二甲基噻唑-5-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2，6-二甲基吡啶-4-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-(6-氨基吡啶-3-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-溴-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(6-氧代-1-(2，2，2-三氟乙基)-1，6-二氢吡啶-3-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′-异丙基-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(1-甲基-6-氧代-1，6-二氢吡啶-3-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-溴-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3R，4S)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-甲基-3-(1-甲基-6-氧代-1，6-二氢吡啶-3-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3R，4S)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(2-氨基嘧啶-5-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3((3R，4S)-4-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)吡咯烷-3-基)脲双(2，2，2-三氟乙酸盐/酯；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′-乙基-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)脲；1-(1′-乙基-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-基三氟甲磺酸盐/酯；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-甲氧基嘧啶-5-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-(二甲基氨基)嘧啶-5-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(2-甲氧基嘧啶-5-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-(2-(二甲基氨基)嘧啶-5-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(1′-乙基-4-甲基-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4(3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-4-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-4-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-环丙基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-环丙基-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(1-异丙基-6-氧代-1，6-二氢吡啶-3-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(1异丙基-6-氧代-1，6-二氢吡啶-3-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((S)-2-羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲二氢氯化物；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-(2-(哌嗪-1-基)乙氧基)-1H-吡唑-5-基)脲三盐酸化物；1-(3-(苄基氧基)-4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；2-((5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-基)氧基)乙酸；2-((5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-基)氧基)-N-乙基乙酰胺；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-乙基-3-(2-羟基-2-甲基丙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-(2-氨基乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；N-(2-((5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷3-基)脲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-基)氧基)乙基)甲烷磺酰胺；N-(2-((5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-基)氧基)乙基)乙酰胺；1-(3-(2-(4-乙酰基哌嗪-1-基)乙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷3-基)脲；2-((5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-基)氧基)乙酰胺；N-(5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-3-乙氧基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)-2，2，2-三氟乙酰胺；1-(4-氨基-3-乙氧基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-乙氧基-4-(2-羟基乙基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲三盐酸化物；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(2-吗啉代-2-氧代乙氧基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；4-溴-5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-苯基-1H-吡唑-3-羧酸；4-溴-5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-N-甲基-1-苯基-1H-吡唑-3-甲酰胺；4-溴-5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-N-甲氧基-1-苯基-1H-吡唑-3-甲酰胺；1-(4-氯-1′-(2-甲氧基乙基)-1-苯基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((S)-2，3-二羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((R)-2，3-二羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-((R)-2，3-二羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3，4，5-三氟苯基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-((S)-2，3-二羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3，4，5-三氟苯基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-((S)-2-羟基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3，4，5-三氟苯基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((S)-2-羟基-3-甲氧基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-((R)-2-羟基-3-甲氧基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-((S)-2-羟基-3-甲氧基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3，4，5-三氟苯基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-((R)-2-羟基-3-甲氧基丙氧基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3，4，5-三氟苯基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-1，1′-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1，1′-二甲基-1H，1′H-[3，4′-双吡唑]-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1-苯基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；叔丁基4-(4-氯-5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1苯基-1H-吡唑-3-基)哌啶-1-羧酸盐/酯；1-(4-氯-1-苯基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-3-(3，5-二甲基异
Figure BPA0000322182560000781
唑-4-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；(R)-叔丁基2-(4-氯-5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1苯基-1H-吡唑-3-基)吡咯烷e-1-羧酸盐/酯；(S)-叔丁基2-(4-氯-5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1苯基-1H-吡唑-3-基)吡咯烷e-1-羧酸盐/酯；1-(4-溴-1-苯基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；叔丁基4-(4-溴-5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1苯基-1H-吡唑-3-基)哌啶-1-羧酸盐/酯；1-(4-溴-1-苯基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-溴-3-(3，5-二甲基异
Figure BPA0000322182560000791
唑-4-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；(R)-叔丁基2-(4-溴-5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-苯基-1H-吡唑-3-基)吡咯烷e-1-羧酸盐/酯；叔丁基4-((4-溴-5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1苯基-1H-吡唑-3-基)甲氧基)哌啶-1-羧酸盐/酯；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-苯基-3-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-5-基)脲二氢氯化物；1-(4-氯-1-苯基-3-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲二氢氯化物；1-(4-溴-1-苯基-3-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲二氢氯化物；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-((R)-吡咯烷-2-基)-1H-吡唑-5-基)脲二氢氯化物；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-((S)-吡咯烷-2-基)-1H-吡唑-5-基)脲二氢氯化物；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-氯-1-苯基-3-((R)-吡咯烷-2-基)-1H-吡唑-5-基)脲二氢氯化物；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-((S)-吡咯烷-2-基)-1H-吡唑-5-基)脲二氢氯化物；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-氯-1-苯基-3-((S)-吡咯烷-2-基)-1H-吡唑-5-基)脲二氢氯化物；1-(4-溴-1-苯基-3-((R)-吡咯烷-2-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲二氢氯化物；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-苯基-3-((哌啶-4-基氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)脲二氢氯化物；1-(4-氯-1-苯基-3-((哌啶-4-基氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲二氢氯化物；1-(4-溴-1-苯基-3-((哌啶-4-基氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲二氢氯化物；1-(4-溴-3-(1-(甲基磺酰基)哌啶-4-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-(1-乙酰基哌啶-4-基)-4-溴-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氯-1-苯基-3-(1-(三氟甲基磺酰基)哌啶-4-基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)盐酸脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-((R)-1-(甲基磺酰基)吡咯烷-2-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-(3-((R)-1-乙酰基吡咯烷-2-基)-4-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-((R)-1-甲基吡咯烷-2-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲二氢氯化物；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-((S)-1-甲基吡咯烷-2-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲二氢氯化物；1-(4-溴-3-((1-(甲基磺酰基)哌啶-4-基氧基)甲基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(3-((1-乙酰基哌啶-4-基氧基)甲基)-4-溴-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-(4-异丙基-5-氧代-4，5-二氢-1，3，4-
Figure BPA0000322182560000801
二唑-2-基)-4-甲基-1苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(4-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1，3，4-
Figure BPA0000322182560000802
二唑-2-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-1-苯基-3-(吡嗪-2-基氧基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3，4，5-三氟苯基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(1-甲基-6-氧代-1，6-二氢吡啶-3-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-甲氧基-1-苯基-4-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-甲氧基-1-苯基-4-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-甲氧基-1-苯基-4-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-甲氧基-1-苯基-4-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基)脲；1-((反式)-4-(4-氯-3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-5-氧代-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡唑-3-基)脲；1-((反式)-4-(3-氯-4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-5-氧代-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-5-氧代-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-1-(2-甲氧基乙基)-4-(3，4，5-三氟苯基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-5-氧代-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡唑-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-5-氧代-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡唑-3-基)脲；1-((反式)-4-(3-氯-5-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-5-氧代-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡唑-3-基)脲；1-(4-氰基-3-甲氧基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3-氯-5-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-5-氧代-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡唑-3-基)脲；1-(4-氰基-1-苯基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；1-(4-氰基-5-氧代-2-苯基-2，5-二氢-1H-吡唑-3-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-3-甲氧基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟-苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-3-乙基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-苯基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-甲酰胺；5-(3-((反式)-4-(3-氯-4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3基)脲基)-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺；5-(3-((反式)-4-(4-氯-3-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3基)脲基)-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺；5-(3-((反式)-4-(3-氯-5-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3基)脲基)-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺；5-(3-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺；5-(3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)脲基)-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酰胺；1-(4-溴-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)胍二氢氯化物；1-(4-溴-3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)硫代脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(4-甲基-3-(1-甲基-6-氧代-1，6-二氢吡啶-3-基)-1-苯基-1H-吡唑-5-基)硫代脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4-二甲基-1-苯基-1H，1′H-3，4′-双吡唑-5-基)硫代脲；1-((3S，4R)-4-(4-氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1′，4二甲基-1-苯基-1H，1′H-3，4′-双吡唑-5-基)硫代脲；反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基吡唑并[1，5-a]吡啶-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(2-苯基吡唑并[1，5-a1吡啶-3-基)脲；反式-1-(2-甲氧基乙基)-4-苯基吡咯烷-3-基)-3-(吡唑并[1，5-a]吡啶-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(吡唑并[1，5-a]吡啶-3-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(5-甲基-3-苯基-1-(吡嗪-2-基)-1H-吡唑-4-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1，5-二甲基-3-苯基-1H-吡唑-4-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1，5-二甲基-3-苯基-1H-吡唑-4-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-异丙基-5-甲基-3-苯基-1H-吡唑-4-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，5-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-异丙基-5-甲基-3-苯基-1H-吡唑-4-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(5-甲基-3-苯基-1-(2，2，2-三氟乙基)-1H-吡唑-4-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-乙基-5-甲基-3-苯基-1H-吡唑-4-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-乙基-3-甲基-5-苯基-1H-吡唑-4-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-5-苯基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-甲基-3-苯基-5-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(3-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基)脲；1-((3S，4R)-4-(3，4-二氟苯基)-1-(2-甲氧基乙基)吡咯烷-3-基)-3-(1-苯基-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-4-基)脲；或其可药用盐。
在一些实施方案中，Trk抑制剂选自：5-氯-N4-(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)-N2-(1-苯基乙基)嘧啶-2，4-二胺；5-溴-N4-(3-乙基-1H-吡唑-5-基)-N2-(1-苯基乙基)嘧啶-2，4-二胺；N4-(3-叔丁基-1H-吡唑-5-基)-5-氯-N2-(1-苯基乙基)嘧啶-2，4-二胺；N4-(3-环丙基-1H-吡唑-5-基)-N2-(1-苯基乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2，4-二胺；5-溴-N4-(3-环丙基-1H-吡唑-5-基)-N2-[(1S)-1-(4-氟苯基)乙基]嘧啶-2，4-二胺；5-溴-N4-(3-环丙基-1H-吡唑-5-基)-N2-[(1S)-1-苯基丙基]嘧啶-2，4-二胺；5-溴-N4-(3-环丙基-1H-吡唑-5-基)-N2-[(1S)-1-(4-硝基苯基)乙基]嘧啶-2，4-二胺；(2R)-2-({5-溴-4-[(3-环丙基-1H-吡唑-5-基)氨基]嘧啶-2基}氨基)-2-苯基乙醇；5-溴-N4-(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)-N2-(1-苯基乙基)嘧啶-2，4-二胺；5-氯-N4-(5-环丙基-1H-吡唑-3-基)-N2-(1-苯基丙基)嘧啶-2，4-二胺。
Syk抑制剂。特别是在那些无饲养层的实施方案中，培养基还可以包含SYK(脾酪氨酸激酶)抑制剂。代表性的SYK抑制剂可以选自：恩托替尼(GS-9973)、福他替尼(R788)、R406、赛度替尼(PRT062070)和TAK-659。
在一些实施方案中，Syk抑制剂是恩托替尼，其具有以下结构：
Figure BPA0000322182560000831
恩托替尼的化学名称为6-(1H-吲唑-6-基)-N-(4-吗啉代苯基)咪唑并[1，2-a]吡嗪-8-胺。恩托替尼或其可药用盐、溶剂合物或多晶型物可根据美国专利No.8,748,607和8,450,321，以及美国专利申请公开No.2015/0038505中描述的操作制备。
在一些实施方案中，Syk抑制剂是下式化合物或其酯、立体异构体或互变异构体：
Figure BPA0000322182560000832
其中，R1是：
Figure BPA0000322182560000841
其中
Figure BPA0000322182560000842
表示与式的化合物的其余部分的连接点，
R2是H或2-羟基乙氧基，R3是H或甲基，以及R4是H或甲基。
在一个实施方案中，R2、R3和R4中的每一个是H，并且R1如上所定义。在一个实施方案中，R2是H，R3是甲基，并且R4是H，并且R1如上所限定。在一个实施方案中，R2是H，R3是H，并且R4是甲基，并且R1如上所限定。在一个实施方案中，R2是2-羟基乙氧基，R3是甲基，并且R4是H，并且R1如上所限定。在一个实施方案中，R2是2-羟基乙氧基，R3是甲基，并且R4是H，并且R1如上所限定。在一个实施方案中，R2是2-羟基乙氧基，R3是H，并且R4是甲基，并且R1如上所限定。
在一个实施方案中，SYK抑制剂选自：
Figure BPA0000322182560000843
Figure BPA0000322182560000851
Figure BPA0000322182560000861
合适的Syk抑制剂描述于美国专利No.9,290,050中。
如在本发明中使用的，Syk抑制剂包括在美国专利No.9,290,050和6,432,963以及美国专利申请公开No.US2004/0029902 A1中公开的那些化合物，它们各自通过引用在此整体并入。来自这些参考文献的示例性Syk抑制剂包括但不限于：
2-(2-氨基乙基氨基)-4-(3-甲基苯胺基)嘧啶-5-甲酰胺，
2-(2-氨基乙基氨基)-4-(3-三氟甲基苯胺基)嘧啶-5-甲酰胺，
2-(4-氨基丁基氨基)-4-(3-三氟甲基苯胺基)嘧啶-5-甲酰胺，
2-(2-氨基乙基氨基)-4-(3-溴苯胺基)嘧啶-5-甲酰胺，
2-(2-氨基乙基氨基)-4-(3-硝基苯胺基)嘧啶-5-甲酰胺，
2-(2-氨基乙基氨基)-4-(3，5-二甲基苯胺基)嘧啶-5-甲酰胺，
2-(2-氨基乙基氨基)-4-(2-萘基氨基)嘧啶-5-甲酰胺，
2-(顺式-2-氨基环己基氨基)-4-(3-甲基苯胺基)嘧啶-5-甲酰胺，
2-(顺式-2-氨基环己基氨基)-4-(3-溴-苯胺基)嘧啶-5-甲酰胺，
2-(顺式-2-氨基环己基氨基)-4-(3，5-二氯苯胺基)嘧啶-5-甲酰胺和2-(顺式-2-氨基环己基氨基)-4-(3，4，5-三甲氧基苯胺基)嘧啶-5-甲酰胺，
N2，N4-[(2，2-二甲基-4H-苯并[1，4]
Figure BPA0000322182560000862
嗪-3-酮)-6-基]-5-氟-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，4-二氯苯基)-5-氟-N2-(吲唑啉-6-基)-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-N2-(1-甲基-吲唑啉-5-基)-2，4-嘧啶二胺，
N2，N4-双(3-羟基苯基)-5-氟-2，4-嘧啶二胺，
N2，N4-双(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-2，4-嘧啶二胺，
N4-(1，4-苯并
Figure BPA0000322182560000871
嗪-6-基)-5-氟-N2-[3-(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N2，N4-双(3-氨基苯基)-5-氟-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-N2-[3-(N-甲基氨基)-羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N4-(3-羟基苯基)-N2-[3-(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3-羟基苯基)-5-三氟甲基-N2-[3-(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N4-[(1H)-吲哚-6-基]-N2-[3-(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N4-(3-羟基苯基)-N2-[3-(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N2-(3-甲基氨基羰基亚甲基氧基苯基)-N4-[2-H-吡啶并[3，2-b]-1，4-
Figure BPA0000322182560000872
嗪-3(4H)-酮-6-基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-N2-[3-(2-羟基乙基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N4-(3-羟基苯基)-N2-[3-(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶-二胺，
N2，N4-双(吲哚-6-基)-5-氟-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N2-[2-(2-羟基-1，1-二甲基乙基氨基)羰基苯并呋喃-5-基]-N4-(3-羟基苯基)-2，4-嘧啶二胺，
N2-[3-(N2，3-二羟基丙基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-N4-(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-2，4-嘧啶二胺，
N2-(3，5-二甲氧基苯基)-N4-(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-N2-[3-(1，3-
Figure BPA0000322182560000873
唑-5-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-N2-[3-(N-甲基氨基)-羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N2-(3-羟基苯基)-N4-[4-(3-苯基-1，2-4-
Figure BPA0000322182560000874
二唑-5-基)亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-N2-(吲唑啉-6-基)-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N4-(3-羟基苯基)-N2-(吲唑啉-6-基)-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-N2-(1-甲基-吲唑啉-5-基)-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N4-(3-羟基苯基)-N2-(1-甲基-吲唑啉-5-基)-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-N2-[4-(3-苯基-1，2，4-
Figure BPA0000322182560000881
二唑-5-基)亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，5-二甲基-4-羟基苯基)-5-氟-N2-[3-[2-(N-吗啉代)亚乙基氧基]苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，5-二甲基-4-羟基苯基)-5-氟-N2-[3-[2-(N-吗啉代)乙基氧基]苯基]-2，4-嘧啶-二胺，
N4-(3-氯-4-羟基-5-甲基苯基)-5-氟-N2-[3-[2-(N-吗啉代)乙基氧基]苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N2-(3-叔丁基羰基氨基苯基)-N4-(3-羟基苯基)-5-氟-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3-叔丁基苯基)-N2-[3-(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-5-氟-2，4-嘧啶-二胺，
N4-(3-叔丁基苯基)-N2-[3-(N2，3-二羟基丙基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-5-氟-2，4-嘧啶二胺，
N2-[3-(N2，3-二羟基丙基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-5-氟-N4-(3-异丙基苯基)-2，4-嘧啶二胺，
N4-[4-(氰基亚甲基氧基)苯基]-5-氟-N2-(3-羟基苯基)-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，5-二甲基-4-羟基苯基)-5-氟-N2-[3-(N-哌嗪基)羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，5-二甲基-4-羟基苯基)-5-氟-N2-[3-[2-(N-哌嗪基)乙氧基]苯基]-2，4-嘧啶-二胺双盐酸盐，
N4-(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-N2-[4-(2-羟基乙基氧基)苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-(1，4-苯并
Figure BPA0000322182560000882
嗪-3-酮-6-基)-5-氟-N2-(3-羟基苯基)-2，4-嘧啶二胺，(+/-)-5-氟-N2-[(N-甲基乙酰胺基-2)-3-苯氧基]-N4-(2-甲基-1，4-苯并
Figure BPA0000322182560000884
嗪-6-基)-2，4-嘧啶二胺，
N2-(1，4-苯并
Figure BPA0000322182560000883
嗪-3-酮-6-基)-5-氟-N4-(3-羟基苯基)-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3-氯-4-三氟甲氧基苯基)-5-氟-N2-[3-(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N4-(3-羟基-4-甲基苯基)-N2-[3-[(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基]苯基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N4-(3-羟基苯基)-N2-[4-甲基-3-[(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基]苯基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N4-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-N2-[3-(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3-氯-4-甲基苯基)-5-氟-N2-[3-(N-甲基氨基)-羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3-氯-4-甲氧基苯基)-5-氟-N2-[3-[(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基]苯基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N4-1(1H)-吲哚-5-基]-N2-[3-[(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基]苯基]-2，4-嘧啶-二胺，
5-氟-N4-(3-羟基苯基)-N2-[1-(甲氧基羰基)甲基-吲唑啉-5-基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N4-(3-羟基苯基)-N2-[1-(3-羟基丙基)吲唑啉-6-基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-N2-[1-(3-羟基丙基)吲唑啉-5-基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N4-(3-羟基苯基)-N2-[1-(3-羟基丙基)吲唑啉-5-基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N2-[1-(3-羟基丙基)吲唑啉-5-基]-N4-(4-异丙氧基苯基)-2，4-嘧啶二胺，N4-(3，4-亚乙二氧基苯基)-5-氟-N2-[1-[2(N-甲基氨基羰基)乙基]-吲唑啉-5-基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N4-(4-异丙氧基苯基)-N2-[1-[2(N-甲基氨基羰基)乙基]-吲唑啉-5-基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-[(2，2-二甲基-4H-苯并[1，4]
Figure BPA0000322182560000891
嗪-3-酮)-6-基]-5-氟-N2-[3-(甲基氨基羰基亚甲基-氧基)苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-[(2，2-二甲基-4H-苯并[1，4]
Figure BPA0000322182560000892
嗪-3-酮)-6-基]-5-氟-N2-(1-甲基吲唑啉-5-基)-2，4-嘧啶二胺，
N4-[(2，2-二氟-4H-苯并[1，4]
Figure BPA0000322182560000893
嗪-3-酮)-6-基]-5-氟-N2-[3-(甲基氨基羰基亚甲基氧基)苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-1(2，2-二甲基-4H-5-吡啶酚-1，4]
Figure BPA0000322182560000894
嗪-3-酮)-6-基]-5-氟-N2-[3-(甲基氨基羰基亚甲基氧基)苯基]-2，4-嘧啶二胺，
5-氟-N2-(3-甲基氨基羰基亚甲基氧基苯基)-N4-[2H-吡啶并[3，2-b]-1，4-
Figure BPA0000322182560000895
嗪-3(4H)-酮-6-基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-(4-氨基-3，4-二氢-2H-1-苯并吡喃-6-基)-5-氟-N2-[3-(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
N4-(3-氯-4-羟基-5-甲基苯基)-5-氟-N2-[3-[2-(N-哌嗪基)乙氧基]苯基]-2，4-嘧啶二胺，和
N4-(3-甲基羰基肟苯基)-5-氟-N2-[3-(N-甲基氨基)羰基亚甲基氧基苯基]-2，4-嘧啶二胺，
或其盐。
LPA受体拮抗剂。特别是在那些无饲养层的实施方案中，培养基还可以包含LPA受体拮抗剂，例如这样的拮抗剂，其抑制LPA1和LPA3诱导的磷酸肌醇的产生(每个的Ki为1000μM或更小)，并且对LPA2、LPA4、LPA5、LPA6的抑制显著较弱(即每个的Ki为5000μM或更小)。Ki16198是优选的LPA受体拮抗剂，并且是Ki16425的甲酯。
其他LPA受体拮抗剂包括H2L5765834、H2L5186303、Ki 16425、Ro 6842262和CLPA5 4。
在一方面中，本文提供了具有US20170042915A1中所示的结构的LPA受体抑制剂或其盐、溶剂合物、多晶型物、前药、代谢物、N-氧化物、立体异构体或同分异构体，所述结构例如以下结构之一：
Figure BPA0000322182560000901
Figure BPA0000322182560000911
GSK3 抑制剂。特别是在那些无饲养层的实施方案中，培养基还可以包含GSK3抑制剂。示例性GSK3抑制剂包括CHIR-99021(CT99021)HCl、SB216763、CHIR-98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、CHIR-99021(CT99021)、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、BIO-丙酮肟、IM-12、1-Azakenpaullone、靛玉红和6-BIO。
合适的GSK-3抑制剂、用于其合成的方法和GSK抑制的测定也描述于例如WO 03/004472、WO 03/055492、WO 03/082853、WO 2004/018455、WO 2004/037791、06/001754、WO07/040436、WO 07/040438、WO 07/040439、WO 07/040440、WO08/002244、WO08/002245和Coghlan et al.Chemistry&Biology 2000、7(10)：793-803。例如，GSK-3抑制剂也综述于以下：例如Cohen et al.Nature Reviews Drug Discovery 2004，3：479-487；Kramer etal.International Journal of Alzheimer′s Disease Volume 2012，Article ID381029，32pages；和Eldar-Finkelman et al.，Front Mol Neurosci.2011；4∶32。在一个实施方案中，GSK-3抑制剂是锂，例如锂盐，例如碳酸锂、柠檬酸锂、氯化锂、乳清酸锂、溴化锂或氯化锂。在另一个实施方案中，GSK-3抑制剂是3-(2，4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3基)-1H-吡咯-2，5-二酮(SB216763)或3-(3-氯-4-羟基苯基氨基)-4-(2硝基苯基)-1H-吡咯-2，5-二酮(SB-415286)，其结构如下式所示：
Figure BPA0000322182560000921
(在文献中定名为SB216763和SB-415286)。
其他GSK3抑制剂包括6-BIO、海门地塞(hymenialdisine)、二溴卡他琳(dibromocantharelline)、CT98014、CT98023、CT99021、TWS119、AR-A014418、AZD-1080、肯帕罗酮(kenpaullone)、alsterpaullone、扎来普隆(cazpaulllone)、aloisine A、manzamine A、palinurine、tricantine、TDZD-8、NP00111、P031115、P031112(tideglusib)、HMK-32和L803-mts，其化学结构和合成在Eldar-Finkelman et al.，Front MolNeurosci.2011；4∶32中有所描述或提及。
CK2抑制剂。特别是在那些无饲养层的实施方案中，培养基还可以包含CK2抑制剂，例如CX-4945(Silmitasertib)、CX-8184、DMAT、鞣花酸或TTP22。
另一些示例性CK2抑制剂是PCT公开WO 2017/070137 A1中教导的CK2抑制剂，例如下式化合物：
Figure BPA0000322182560000931
包括其对映体、非对映体、互变异构体、可接受盐、前药、水合物或溶剂合物，其中
R4选自：经1至3个Re取代的C1-4烷基、C3-6环烷基、和经1至3个Re取代的杂环基；
两个R7基团和与它们二者都连接的氮原子一起形成4元至7元单环或7元至12元双环杂环，其含有碳原子和选自NR8a、O和S(O)2的另外1至3个杂原子并经1至4个Rs取代；
R8在每次出现时独立地选自H、F、Cl、Br、经1至4个Re取代的C1-4烷基、＝O(酮)、经1至5个Re取代的C2-4烯基、
-(CHRg)rORb，-CHRg)rS(0)pRc，-(CHRg)rC(＝O)(CHRg)rRd，-(CHRg)rNRaRa，-(CHRg)rC(＝O)NRaRa，-(CHRg)rC(＝O)NRaS(O)pRc，-(CHRg)rNRa(CRgRg)rC(＝O)Rd，-(CHRg)rNRaC(＝O)ORb，-(CHRg)rOC(＝O)(CHRg)rRd，-(CHRg)rOC(＝O)(CHRg)rC(＝O)ORd，-(CHRg)rOC(＝O)(CHRg)rC(＝O)NRaRa，-(CHRg)rOC(＝O)(CHRg)rNRaC(＝O)Rb，-(CHRg)rOC(＝O)(CHRg)rNRaRa，-(CHRg)rNRaC(＝O)NRaRa，-(CHRg)rC(＝O)(CH2)rORb，-(CHRg)rC(＝O)(CHRg)rOC(＝O)Rb，-(CHRg)rS(0)2NRaRa，-(CHRg)rNRaS(0)pNRaRa，-(CHRg)rNRaS(0)pRc，-OPO3H，
经1至5个Re取代的-(CHRg)r-C3-6环烷基、经1至4个Re取代的-(CHRg)r-芳基和经1至4个Re取代的-(CHRg)r-杂环基；
R8a选自H、经1至5个Re取代的C1-4烷基、经1至5个Re取代的C2-4烯基、
-(CHRg)rORb，-(CHRg)rS(0)pRc，-(CHRg)rC(＝O)(CHRg)rRd，-CHRg)rNRaRa，(CHRg)rC(＝O)NRaRa，-(CHRg)rC(＝O)NRaS(O)pRc，-(CHRg)rNRa(CRgRg)rC(＝O)Rd，-(CHRg)rNHC(＝O)ORb，-(CHRg)rOC(＝O)(CHRg)rRd，-(CHRg)rOC(＝O)(CHRg)rC(＝O)ORd，-(CHRg)rOC(＝O)(CHRg)rC(＝O)NRaRa，-(CHRg)rOC(＝O)(CHRg)rNRaC(＝O)Rb，-(CHRg)rOC(＝O)(CHRg)rNRaRa，-(CHRg)rNRa(CHRg)rC(＝O)NRaRa，-(CHRg)rC(＝O)ORb，-(CHRg)rC(＝O)(CHRg)rOC(＝O)Rb，-(CHRg)rS(O)2NRaRa，-(CHRg)rNRaS(O)pNRaRa，-(CHRgrNRaS(O)pRc，-OPO3H，
经1至5个Re取代的-(CHRg)r-C3-6环烷基、经1至4个Re取代的-(CHRg)r-芳基和经1至4个Re取代的-(CHRg)r-杂环基；
Ra在每次出现时独立地选自H、CN、经1至5个Re取代的C1-6烷基、经1至5个Re取代的C2-6烯基、经1至5个Re取代的C2-6炔基、经1至5个Re取代的-(CH2)r-C3-异碳环基(iocarbocyclyl)、和经1至5个Re取代的-(CH2)r-杂环基；或Ra和Ra和与它们二者都连接的氮原子一起形成经1至5个Re取代的杂环；
Rb在每次出现时独立地选自H、经1至5个Re取代的C1-6烷基、经1至5个Re取代的C2-6烯基、经1至5个Re取代的C2-6炔基、经1至5个Re取代的-(CH2)r-C3-异碳环基，和经1至5个Re取代的-(CH2)r-杂环基；
Rc在每次出现时独立地选自经1至5个Re取代的C1-6烷基、经1至5个Re取代的C2-6烯基、经1至5个Re取代的C2-6炔基、C3-6碳环基和杂环基；
Rd在每次出现时独立地选自H、OH、经1至5个Re取代的C1-6烷基、经1至5个Re取代的C2-6烯基、经1至5个Re取代的C2-6炔基、经1至5个Re取代-(CH2)r-C3-异碳环基、和经1至5个Re取代的-(CH2)r-杂环基；
Re在每次出现时独立地选自H、N3、经1至5个Rf取代的C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、-(CH2)r-C3-6环烷基、(CH2)r-杂环基、F、Cl、Br、-(CH2)rCN、NO2、＝O、-OPO3H、-OSi(C1-4烷基)3、(CH2)rOC1-5烷基、-(CH2)rO(CH2)rOC1-5烷基、-(CH2)rOH、-(CH2)rS(O)2C1-5烷基、-(CH2)rS(O)2Rf、-(CH2)rNHS(O)2C1-5烷基、-S(O)2NH2、-SH、-(CH2)rNRfRf、-(CH2)rNHC(＝O)ORf、-(CH2)rNHC(＝O)Rf、-(CH2)rNHC(＝NH)NRfRf、-(CH2)rC(＝O)(CH2)rRf、和-(CH2)rC(＝O)ORf；
Rf在每次出现时独立地选自H、-CH2OH、-(CH2)rOC1-5烷基、C1-5烷基(任选地经F、Cl、OH、NH2取代)、任选地经NH2取代的C3-6环烷基、-(CH2)rS(O)PC1-4烷基、-NHC(＝O)C1-4烷基、-C(＝O)NH2、-C(＝O)OC1-4烷基、-C(＝O)C1-4烷基、-(CH2)r-苯基、任选地经烷基和CN取代的-(CH2)r-杂环基、或Rf和Rf和与它们二者都连接的氮原子一起形成任选地经C1-4烷基取代的杂环；
Rg在每次出现时独立地选自H、F、OH和C1-5烷基；
p在每次出现时独立地选自0、1和2；以及
r在每次出现时独立地选自0、1、2、3、4和5。
Notch激动剂。本发明的培养基可以另外包含Notch激动剂。Notch信号传导已被证明在细胞命运决定以及细胞存活和增殖中起重要作用。Notch受体蛋白可以与许多表面结合的或分泌的配体，包括但不限于Jagged-1、Jagged-2、Δ-1或Δ-样1、Δ-样3、Δ-样4等相互作用。在配体结合之后，Notch受体由涉及ADAM蛋白酶家族成员的系列切割事件以及由γ分泌酶presinilin调节的膜内切割激活。结果是Notch的胞内结构域易位到细胞核，在那里它转录激活下游基因。
本文中使用的“Notch激动剂”包含这样的分子，相对于不存在Notch激动剂时的Notch活性水平，所述分子在细胞中刺激Notch活性至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约70％、至少约90％、至少约100％、至少约3倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或更高。如本领域已知的，Notch活性可以通过例如测量Notch的转录活性，通过Hsieh et al.(Mol.Cell.Biol.16：952-959，1996，通过引用并入本文)描述的4xwtCBF1-萤光素酶报道构建体来确定。
在某些实施方案中，Notch激动剂选自：Jagged-1、Δ-1和Δ-样4，或其活性片段或衍生物。在某些实施方案中，Notch激动剂是DSL肽(Dontu et al.，Breast Cancer Res.，6：R605-R615，2004)，其具有氨基酸序列CDDYYYGFGCNKFCRPR(SEQ ID NO：36)。DSL肽(ANA规格(ANA spec))可以以10.mu.M至100nM，或至少10μM并且不高于100nM的浓度使用。在某些实施方案中，Jagged-1的终浓度为约0.1至10μM；或约0.2至5μM；或约0.5至2μM；或约1μM。
在某些实施方案中，本文提及的任何特定Notch激动剂，例如Jagged-1、Jagged-2、Δ-1和Δ-样4可以被以下替代：天然的、合成的或重组产生的保留至少约80％、85％、90％、95％、99％的相应Notch激动剂活性的其同源物或片段，和/或共有至少约60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％氨基酸序列同一性的其同源物或片段，如通过任何本领域认可的序列比对软件基于全局比对技术(例如内德勒曼-温施算法)或局部比对技术(例如史密斯-沃特曼算法)测量的。
本文提及的代表性Notch激动剂的序列在SEQ ID NO.28至35中表示。
在培养干细胞的前1至2周期间，可以每1、2、3或4天将Notch激动剂添加至培养基中。
烟酰胺。本发明的培养基可以另外补充有烟酰胺或其类似物、前体或模拟物，例如甲基烟酰胺、benazamid、吡嗪酰胺、胸腺嘧啶或烟酸。可将烟酰胺添加至培养基中至最终浓度为1至100mM、5至50mM、或优选地5至20mM。例如，可以将烟酰胺添加至培养基中至约10mM的最终浓度。类似浓度的烟酰胺类似物、前体或模拟物也可以单独或组合使用。
胞外基质(ECM)。胞外基质(ECM)在本文中可与“基底膜基质”互换使用，其由结缔组织细胞分泌并包含多种多糖、水、弹性蛋白和蛋白质，所述蛋白质可包含蛋白聚糖、胶原蛋白、巢蛋白(entactin)(巢蛋白(nidogen))、纤连蛋白、纤维蛋白原、原纤维蛋白、层黏连蛋白和透明质酸。ECM可以为选择和培养主题干细胞提供合适的基质和微环境传导(conductive)。
在某些实施方案中，主题干细胞附着于ECM或与ECM接触。不同类型的ECM在本领域中是已知的，并且可以包含不同的组合物，包括不同类型的蛋白聚糖和/或不同的蛋白聚糖组合。ECM可以通过培养产生ECM的细胞(例如某些成纤维细胞)来提供。产生胞外基质的细胞的实例包括主要产生胶原蛋白和蛋白聚糖的软骨细胞；主要产生IV型胶原蛋白、层黏连蛋白、间质性前胶原蛋白和纤连蛋白的成纤维细胞；以及主要产生胶原蛋白(I、III和V型)、硫酸软骨素蛋白聚糖、透明质酸、纤连蛋白和生腱蛋白-C的结肠成肌纤维细胞。
在某些实施方案中，至少一些ECM由鼠3T3-J2克隆产生，其可以生长在MATRIGELTM基底膜基质(BD Biosciences)的顶部作为饲养细胞层。
或者，ECM可以是商业提供的。可商购获得的胞外基质的实例是胞外基质蛋白(Invitrogen)和MATRIGELTM基底膜基质(BD Biosciences)。使用ECM培养干细胞可以增强干细胞的长期存活和/或未分化干细胞的持续存在。替代物可以是纤维蛋白底物或纤维蛋白凝胶或支架，例如从原始细胞中耗竭的甘油化同种异体移植物。
在某些实施方案中，用于本发明方法的ECM包含至少两种不同的糖蛋白，例如两种不同类型的胶原蛋白或者胶原蛋白和层黏连蛋白。ECM可以是合成水凝胶胞外基质，或天然存在的ECM。在某些实施方案中，ECM由MATRIGELTM基底膜基质(BD Biosciences)提供，其包含层黏连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV。
培养基。在本发明的方法中使用的细胞培养基可以包含任何细胞培养基，例如用基于碳酸盐的缓冲液在约pH 7.4(例如，约pH 7.2至7.6)下缓冲的培养基。许多可商购获得的组织培养基可能适合用于本发明的方法，包括但不限于Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，例如不含L-谷氨酰胺但含高葡萄糖的DMEM)、最小必需培养基(Minimal EssentialMedium，MEM)、Knockout-DMEM(KO-DMEM)、格拉斯哥最小必需培养基(Glasgow MinimalEssential Medium，G-MEM)、基础培养基Eagle(Basal Medium Eagle，BME)、DMEM/Ham’sF12、Advanced DMEM/Ham’s F12、Iscove改良Dulbecco培养基和最小必需培养基(MinimalEssential Media，MEM)、Ham’s F10、Ham’s F-12、Medium 199和RPMI 1640培养基。
细胞可以在包含5％至10％CO2(例如，至少约5％但不超过10％CO2，或约5％CO2)的气氛中培养。在某些实施方案中，细胞培养基是补充有L-谷氨酰胺、胰岛素、青霉素/链霉素和/或转铁蛋白的DMEM/F12(例如3∶1混合物)或RPMI 1640。在某些实施方案中，使用Advanced DMEM/F12或Advanced RPMI，其针对无血清培养进行了优化并且已经包含胰岛素。Advanced DMEM/F12或Advanced RPMI培养基可以进一步补充L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。在某些实施方案中，细胞培养基补充有一种或更多种本文所述的纯化的、天然的、半合成的和/或合成的因子。在某些实施方案中，细胞培养基补充有使用之前未热灭活的约10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)。也可以将另外的补充剂添加至培养基中，所述补充剂例如如
Figure BPA0000322182560000971
无血清补充剂(Invitrogen)、N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和/或N2无血清补充剂(Invitrogen)或Neurobasal(Gibco)、TeSR(StemGent)。
在某些实施方案中，培养基可以含有一种或更多种抗生素以防止污染(例如青霉素/链霉素)。在某些实施方案中，培养基可以具有小于0.1个内毒素单位/mL的内毒素含量，或者可以具有小于0.05个内毒素单位/mL的内毒素含量。用于确定培养基的内毒素含量的方法是本领域已知的。
根据本发明的细胞培养基允许上皮干细胞在胞外基质上存活和/或增殖和/或分化。本文中使用的术语“细胞培养基”与“培养基”、“培养基”或“细胞培养基”同义。
本发明的改良(生长)培养基在基础培养基中包含(a)ROCK(Rho激酶)抑制剂；(b)Wnt激动剂；(c)促分裂生长因子；(d)TGF-β信号传导途径抑制剂，例如TGF-β抑制剂，或TGF-β受体抑制剂)；和(e)胰岛素或IGF；并且所述培养基任选地还包含骨形态生成蛋白(BMP)拮抗剂。
因此，在一个方面中，本发明提供了基础培养基(Base Medium)，其包含：胰岛素或胰岛素样生长因子；T3(3，3′，5-三碘-L甲状腺原氨酸)；氢化可的松；腺嘌呤；EGF；和10％胎牛血清(未经热灭活)，在补充有L-谷氨酰胺的DMEM∶F12 3∶1培养基中。
在某些实施方案中，基础培养基包含约：5μg/mL胰岛素；2x10″9M T3(3，3′，5-三碘-L甲状腺原氨酸)；400ng/mL氢化可的松；24.3μg/mL腺嘌呤；10ng/mL EGF；和10％胎牛血清(未经热灭活)，在补充有1.35mM L-谷氨酰胺的DMEM∶F12 3∶1培养基中。
在某些实施方案中，前一段中提及的每种培养基组分的浓度独立地比相应列举值高或低2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％，或为相应列举值的2倍、3倍、5倍、10倍、20倍高。例如，在举例说明性培养基中，胰岛素浓度可以是6μg/mL(比列举的5μg/mL高20％)，EGF浓度可以是5ng/mL(比列举的10ng/mL低50％)，而其余组分各自具有以上列举的相同浓度。
在一个相关方面中，本发明提供了含有霍乱肠毒素的基础培养基。在另一些实施方案中，基础培养基不含霍乱肠毒素。
基础培养基还可包含一种或更多种抗生素，例如Pen/Strep和/或庆大霉素。
通过添加一种或更多种上述因子，基础培养基可用于产生改良生长培养基(或简称改良培养基)。
4.代表性培养基因子的蛋白质序列
下面提供了在本发明的培养基和方法中使用的数种代表性(非限制性)蛋白因子。对于每个列出的因子，许多同源物或功能等同物是本领域已知的，并且可以容易地从公共数据库(例如GenBank、EMBL和/或NCBI RefSeq，仅举数例)中检索。另外的蛋白质或其肽片段，或编码其的多核苷酸，包括来自人或非人哺乳动物的功能同源物，可以通过例如基于序列的检索(例如NCBI BLASTp或BLASTn或两者)容易地从公共来源检索。
BMP抑制剂
头蛋白：(GenBank：AAA83259.1)，智人(Homo sapiens)：
Figure BPA0000322182560000991
腱蛋白(GenBank：AAG35767.1)，智人：
Figure BPA0000322182560000992
卵泡抑制素(GenBank：AAH04107.1)，智人：
Figure BPA0000322182560000993
DAN(GenBank：BAA92265.1)，智人：
Figure BPA0000322182560001001
Cerberus(NCBI参考序列：NP_005445.1)，智人
Figure BPA0000322182560001002
Gremlin(GenBank：AAF06677.1)，智人
Figure BPA0000322182560001003
骨硬化蛋白/SOST(GenBank：AAK13451.1)，智人：
Figure BPA0000322182560001004
饰胶蛋白聚糖(GenBank：AAB60901.1)，智人：
Figure BPA0000322182560001005
α-2巨球蛋白(GenBank：EAW88590.1)，智人：
Figure BPA0000322182560001011
Wnt激动剂
R-脊椎蛋白1(GenBank：ABC54570.1)，智人：
Figure BPA0000322182560001012
R-脊椎蛋白2(NCBI参考序列：NP_848660.3)，智人：
Figure BPA0000322182560001013
R-脊椎蛋白3(NCBI参考序列：NP_116173.2)，智人：
Figure BPA0000322182560001021
R-脊椎蛋白4(NCBI参考序列：NP_001025042.2)，智人：同种型1
Figure BPA0000322182560001022
R-脊椎蛋白4(NCBI参考序列：NP_001035096.1)，智人：同种型2
Figure BPA0000322182560001023
Norrin
Norrin前体[智人]
NCBI参考序列：NP_000257.1
Figure BPA0000322182560001031
促分裂因子
Figure BPA0000322182560001041
TGFa智人：前转化生长因子α同种型1前蛋白质原[智人]NCBI参考序列：NP_003227.1
Figure BPA0000322182560001051
前转化生长因子α同种型2前蛋白质原[智人]NCBI参考序列：NP_001093161.1
Figure BPA0000322182560001052
转化生长因子α[合成构建体]
GenBank：AAX43291.1
Figure BPA0000322182560001053
TGFα，其包含：
Figure BPA0000322182560001054
5.用于分化干细胞的方法
可以诱导分离的干细胞(例如，上皮干细胞)分化成分化的细胞，所述细胞通常存在于干细胞从其来源或分离的组织或器官中。其他组织包括输卵管、子宫内膜(子宫)、男性输出小管、男性附睾、男性输精管、男性射精管、男性尿道球腺和精囊腺。分化细胞可以表达分化细胞特征性的标志物，并且可以容易地与不表达这样的分化细胞标志物的干细胞区分开来。
6.标志物
通常，可以在RNA水平上测量所有下述标志物的基因表达。另外，某些标志物的表达也可以通过蛋白质表达使用例如对由标志物基因编码的蛋白质具有特异性的抗体来检测。
7.使用方法
在另一方面中，本发明提供了从多种培养物中分离的主题干细胞在药物发现筛选、毒性测定、基于动物的疾病模型或医学(例如再生医学)中的用途。
克隆干细胞的遗传操作。例如，通过本发明的方法分离的干细胞适用于多种类型的遗传操作，包括引入可以调节一种或更多种目的靶基因表达的外源遗传物质。例如，这样种类的基因治疗可以用于例如针对修复受损或病变组织的方法中。简而言之，任何合适的载体，包括腺病毒、慢病毒(elntiviral)或逆转录病毒基因递送载剂(见下文)，可用于将遗传信息如DNA和/或RNA递送至任何主题干细胞。技术人员可以替代或修复基因治疗中靶向的特定基因。例如，可以将正常基因插入病变细胞基因组内的非特异性位置以替代非功能基因。在另一个实例中，异常基因序列可以通过同源重组被替代为正常基因序列。或者，选择性回复突变可以使基因恢复其正常功能。另一个实例是改变特定基因的调节(基因开启或关闭的程度)。优选地，将干细胞通过基因治疗方法离体处理并且随后转移至哺乳动物，优选需要治疗的人。
任何本领域公认的遗传操作方法都可以应用于如此分离的干细胞，包括通过多种类型的核酸构建体感染和转染(例如，通过病毒载体)。
例如，可以将异源核酸(例如，DNA)通过物理处理(例如，电穿孔、声孔效应(sonoporation)、光学转染、原生质体融合、穿刺转染(impalefection)、水动力递送、纳米颗粒、磁转染)、使用化学材料或生物载体(病毒)引入到主题干细胞中。基于化学的转染可以基于磷酸钙、环糊精、聚合物(例如阳离子聚合物，例如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺)、高度支化的有机化合物例如树状聚合物、脂质体(例如阳离子脂质体、脂质体转染例如使用脂质转染胺的脂质体转染等)，或纳米颗粒(有或没有化学或病毒官能化)。
核酸构建体包含目的核酸分子，并且通常能够指导目的核酸分子在其已被引入的细胞中的表达。
在某些实施方案中，核酸构建体是表达载体，其中编码基因产物例如多肽的核酸分子或拮抗多肽表达的核酸(例如，siRNA、miRNA、shRNA、反义序列、适配体、核酶(rybozyme)等))与能够指导核酸分子在靶细胞(例如，分离的干细胞)中表达的启动子可操作地连接。
术语“表达载体”通常是指这样的核酸分子，其能够影响其在与这样的序列相容的细胞中含有的基因/核酸分子的表达。这些表达载体通常包括至少合适的启动子序列和任选地转录终止信号。将编码多肽的核酸或DNA或核苷酸序列并入DNA/核酸构建体，其能够引入如本发明方法中识别的体外细胞培养物中并在其中表达。
用于引入特定细胞而制备的DNA构建体通常包含细胞识别的复制系统、编码所期望多肽的预期DNA区段、以及与编码多肽的区段可操作地连接的转录和翻译起始和终止调节序列。DNA区段当与另一个DNA区段有功能关系时是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或增强子刺激序列的转录，则它与编码序列可操作地连接。如果信号序列的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与编码多肽的DNA可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在信号序列的情况下，既是连续的又处于读取阶段。但是，增强子不需要与它们控制其转录的编码序列连续。连接是通过在方便的限制性位点或在代替其插入的衔接子或接头处连接来完成的。
适当启动子序列的选择通常取决于选择用于表达DNA区段的宿主细胞。合适的启动子序列的实例包括本领域公知的真核启动子(参见，例如，Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Edition，2001)。转录调节序列通常包括细胞识别的异源增强子或启动子。合适的启动子包括CMV启动子。可以使用包括复制系统和转录和翻译调节序列以及用于多肽编码区段的插入位点的表达载体。细胞系和表达载体的可行组合的实例描述于Sambrook and Russell(2001，同上)和Metzger et al.(1988)Nature 334：31-36中。
本发明的一些方面涉及包含如上定义的核苷酸序列的表达载体或核酸构建体的用途，其中所述载体是适用于基因治疗的载体。适用于基因治疗的载体是本领域已知的，例如在以下中描述的那些：Anderson(Nature 392：25-30，1998)；Walther and Stein(Drugs60：249-71，2000)；Kay et al.(Nat.Med.7：33-40，2001)；Russell(J.Gen.Virol.81：2573-604，2000)；Amado and Chen(Science 285：674-6，1999)；Federico(Curr.Opin.Biotechnol.10：448-53，1999)；Vigna and Naldini(J.Gene Med.2：308-16，2000)；Marin et al.(Mol.Med.Today 3：396-403，1997)；Peng and Russell(Curr.Opin.Biotechnol.10：454-7，1999)；Sommerfelt(J.Gen.Virol.80：3049-64，1999)；Reiser(Gene Ther.7：910-3，2000)；和其中引用的参考文献(全部通过引用并入)。实例包括整合和非整合载体，例如基于逆转录病毒、腺病毒(AdV)、腺相关病毒(AAV)、慢病毒、痘病毒、甲病毒和疱疹病毒的那些。
特别合适的基因治疗载体包括腺病毒(Ad)和腺相关病毒(AAV)载体。这些载体感染大量分裂和非分裂细胞类型。另外，腺病毒载体能够进行高水平的转基因表达。然而，由于腺病毒和AAV载体在细胞进入之后的游离(episomal)性质，这些病毒载体最适合用于仅需要转基因瞬时表达的治疗应用(Russell，J.Gen.Virol.81：2573-2604，2000；Goncalves，Virol J.2(1)：43，2005)，如上所述。如Russell(2000，同上)所综述的，优选的腺病毒载体经修饰以降低宿主应答。AAV基因转移的安全性和有效性已在人中进行了广泛研究，并在肝、肌肉、CNS和视网膜中取得了令人鼓舞的结果(Manno et ah，Nat.Medicine 2006；Stroes etαI.，ATYB 2008；Kaplitt，Feigin，Lancet 2009；Maguire，Simonelli etal.NEJM 2008；Bainbridge et al.，NEJM 2008)。
AAV2是人和实验模型二者中基因转移研究的最具特征血清型。AAV2表现出对骨骼肌、神经元、血管平滑肌细胞和肝细胞的天然趋向性。基于腺相关病毒的非整合载体的其他实例包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和假型AAV。使用非人血清型(如AAV8和AAV9)可能可用于克服对象中的这些免疫应答，并且临床试验刚刚开始(ClinicalTrials dot gov Identifier：NCT00979238)。对于将基因转移到肝细胞中，腺病毒血清型5或AAV血清型2、7或8已被证明是有效的载体，并因此是优选的Ad或AAV血清型(Gao，Molecular Therapy 13：77-87，2006)。
用于本发明中应用的示例性逆转录病毒载体是基于慢病毒的表达构建体。慢病毒载体具有感染非分裂细胞的独特能力(Amado and Chen，Science 285：674-676，1999)。用于构建和使用基于慢病毒的表达构建体的方法在以下中描述：美国专利No.6,165,782、6,207,455、6,218,181、6,277,633、和6,323,031以及Federico(Curr.Opin.Biotechnol.10：448-53，1999)和Vigna et al.(J.Gene Med.2：308-16，2000)。通常，基因治疗载体将与上述表达载体一样，因为它们包含编码要表达的本发明的基因产物(例如多肽)的核苷酸序列，由此核苷酸序列与适当的调节序列可操作地连接，如上所述。这样的调节序列将至少包含启动子序列。来自基因治疗载体的用于表达编码多肽的核苷酸序列的合适启动子包括例如巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子、病毒长末端重复启动子(LTR)(例如来自鼠莫洛尼白血病病毒(murine Moloney leukaemia virus，MMLV)劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus)的启动子)，或HTLV-1、猿猴病毒40(SV 40)早期启动子和单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子。下面描述了另外的合适的启动子。
已经描述了可通过施用小的有机或无机化合物诱导的数种诱导型启动子系统。这样的诱导型启动子包括受重金属控制的那些启动子，例如金属硫蛋白启动子(metallothionine promoter)(Brinster et al，Nature 296：39-42，1982；Mayo et al，Cell 29：99-108，1982)、RU-486(孕酮拮抗剂))(Wang et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：8180-8184，1994)、类固醇(Mader and White，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5603-5607，1993)、四环素(Gossen and Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551，1992；美国专利No.5,464,758；Furth et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9302-9306，1994；Howe et al，J.Biol.Chem.270：1416814174，1995；Resnitzky et al，Mol.Cell.Biol.14：1669-1679，1994；Shockett et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6522-6526，1995)和基于由tetR多肽构成的多嵌合反式激活剂的tTAER系统，作为VP16的激活结构域，以及雌激素受体的配体结合结构域(Yee et al，2002，US 6,432,705)。
除了上述聚合酶II启动子之外，用于通过RNA干扰敲低特定基因(见下文)的编码小RNA的核苷酸序列的合适启动子还包括聚合酶III启动子。RNA聚合酶III(pol III)负责合成多种小的核和细胞质非编码RNA，其包括5S、U6、腺病毒VA1、穹窿(Vault)、端粒酶RNA和tRNA。已经确定了编码这些RNA的大量基因的启动子结构，并且发现RNA pol III启动子分为三种类型的结构(综述参见Geiduschek and TocchiniValentini，Annu.Rev.Biochem.57：873-914，1988；Willis，Eur.J.Biochem.212：1-11，1993；Hernandez，J.Biol.Chem.276：26733-36，2001)。特别适合用于表达siRNA的是3型RNA polIII启动子，其中转录由仅在5′-侧翼区域(即转录起始位点上游)中存在的顺式作用元件驱动。上游序列元件包括传统的TATA盒(Mattaj et al.，Cell 55：435-442，1988)、近端序列元件和远端序列元件(DSE；Gupta and Reddy，Nucleic Acids Res.19：2073-2075，1991)。
受3型pol III启动子控制的基因的实例是U6小核RNA(U6snRNA)、7SK、Y、MRP、HI和端粒酶RNA基因(参见，例如，Myslinski et al，Nucl.Acids Res.21：2502-09，2001)。
基因治疗载体可以任选地包含编码第二或另外的多肽的第二或者一个或更多个另外的核苷酸序列。第二或另外的多肽可以是允许识别、选择和/或筛选含有表达构建体的细胞的(选择)标志物多肽。用于此目的合适标志物蛋白是，例如荧光蛋白GFP、和选择标志物基因HSV胸苷激酶(用于在HAT培养基上选择)、细菌潮霉素B磷酸转移酶(用于在潮霉素B上选择)、Tn5氨基糖苷磷酸转移酶(用于在G418上选择)、和二氢叶酸还原酶(DHFR)(用于在氨甲蝶呤上选择)、CD20、低亲和力神经生长因子基因。用于获得这些标志物基因的来源及其使用方法在以下中提供：Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，2001。
或者，如果认为有必要，第二或另外的核苷酸序列可以编码提供故障安全机制(fail-safe mechanism)的多肽，所述机制允许来自转基因细胞的对象被治愈。这样的核苷酸序列(通常称为自杀基因)编码能够将前药转化为能够杀伤在其中表达多肽的转基因细胞的有毒物质的多肽。这样的自杀基因的合适实例包括例如大肠杆菌(E.coli)胞嘧啶脱氨酶基因或来自单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和水痘-带状疱疹病毒的胸苷激酶基因之一，在这种情况下，更昔洛韦(ganciclovir)可用作前药以杀伤对象中的IL-10转基因细胞(参见，例如Clair et al.，Antimicrob.Agents Chemother.31：844-849，1987)。
为了敲低特定多肽的表达，将基因治疗载体或其他表达构建体用于表达优选编码RNAi剂的所期望的核苷酸序列，该RNAi剂即为能够进行RNA干扰的RNA分子或是能够进行RNA干扰的RNA分子的一部分。这样的RNA分子称为siRNA(短干扰RNA，包括例如短发夹RNA)。所期望的核苷酸序列包含编码针对靶基因mRNA区域的反义RNA的反义密码DNA，和/或编码针对靶基因mRNA相同区域的有义RNA的有义密码DNA。在本发明的DNA构建体中，反义和有义密码DNA与如上文定义的能够分别表达反义和有义RNA的一个或更多个启动子可操作地连接。“siRNA”包括小干扰RNA，其是在哺乳动物细胞中无毒的短长度双链RNA(Elbashir etah，Nature 411：494-98，2001；Caplen et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9742-47，2001)。长度不一定限于21至23个核苷酸。只要不显示毒性，siRNA的长度没有特别限制。“siRNA”可以是，例如至少约15、18或21个核苷酸并且多至25、30、35或49个核苷酸。或者，待表达的siRNA的最终转录产物的双链RNA部分可以是例如至少约15、18或21个核苷酸，并且多至25、30、35或49个核苷酸。
“反义RNA”优选地是具有与靶基因mRNA互补的序列的RNA链，并且被认为通过与靶基因mRNA结合来诱导RNAi。
“有义RNA”具有与反义RNA互补的序列，并与其互补的反义RNA退火以形成siRNA。
在该上下文中，术语“靶基因”包括其表达将由于待由本系统表达的siRNA而被沉默的基因，并且可以任意选择。作为该靶基因，优选地选择例如其序列已知但其功能仍有待阐明的基因，以及其表达被认为是疾病病因的基因。已确定靶基因可以是其基因组序列尚未完全阐明的基因，只要所述基因的mRNA的部分序列具有至少15个核苷酸或更多个核苷酸(其是能够与siRNA的一条链(反义RNA链)结合的长度)即可。因此，即使基因、表达序列标签(EST)和mRNA部分(其中一些序列(优选至少15个核苷酸)已被阐明)的全长序列尚未确定，它们也可以被选为“靶基因”。
其中两条RNA链配对的siRNA的双链RNA部分不限于完全配对的部分，并且可含有由于错配(对应的核苷酸不互补)、凸起(bulge)(一条链缺少对应的互补核苷酸)等导致的非配对部分。可以含有非配对部分至其不干扰siRNA形成的程度。本文中使用的“凸起”可以包含1至2个非配对核苷酸，并且其中两条RNA链配对的siRNA的双链RNA区优选含有1至7个，更优选含有1至5个凸起。
本文中使用的术语“错配”可包含在其中两条RNA链配对的siRNA的双链RNA区中，在数量上优选1至7个，更优选1至5个。在某些错配中，一个核苷酸是鸟嘌呤并且另一个是尿嘧啶。这样的错配是由于编码有义RNA的DNA中从C至T、G至A或其混合的突变，但不特别限于它们。此外，在本发明中，其中两条RNA链配对的siRNA的双链RNA区可以含有凸起和错配二者，在数量上总计优选为1至7个，更优选为1至5个。这样的非配对部分(错配或凸起等)可以抑制下述反义和有义密码DNA之间的重组，并使下述siRNA表达系统稳定。此外，虽然难以对其中两条RNA链配对的siRNA的双链RNA区中不含有非配对部分的茎环DNA进行测序，但通过引入如上所述的错配或凸起使得能够进行测序。此外，在配对双链RNA区中含有错配或凸起的siRNA具有在大肠杆菌或动物细胞中稳定的优点。
只要siRNA由于其RNAi效应而能够使靶基因的表达沉默，siRNA的末端结构可以是钝的或黏性的(突出)。黏性(突出)末端结构不仅限于3′突出，并且也可以包括5′突出结构，只要它能够诱导RNAi效应。另外，突出核苷酸的数目不限于已经报道的2个或3个，只要突出能够诱导RNAi效应，其可以是任意数目。例如，突出由1至8个，优选2至4个核苷酸组成。在此，具有黏性末端结构的siRNA的总长度表示为配对的双链部分的长度和在两端均包含突出单链的对的长度的总和。例如，在19bp双链RNA部分且两端有4个核苷酸突出的情况下，总长度表示为23bp。此外，由于该突出序列对靶基因的特异性低，它不一定与靶基因序列互补(反义)或相同(有义)。此外，只要siRNA能够维持其对靶基因的基因沉默作用，siRNA可(例如在其一端的突出部分中)含有低分子量的RNA(其可以是天然RNA分子，例如tRNA、rRNA或病毒RNA，或人工RNA分子)。
另外，如上所述，“siRNA”的末端结构必然是两端的切断结构(cut offstructure)，并且可以具有其中双链RNA的一侧的末端通过接头RNA(“shRNA”)连接的茎环结构。双链RNA区(茎环部分)的长度可以是，例如至少15、18或21个核苷酸和至多25、30、35或49个核苷酸长。或者，作为待表达的siRNA的最终转录产物的双链RNA区的长度是例如至少15、18或21个核苷酸并且多至25、30、35或49个核苷酸长。
此外，对接头的长度没有特别限制，只要其长度不妨碍茎部分的配对即可。例如，为了茎部分的稳定配对和编码所述部分的DNA之间的重组的抑制，接头部分可以具有三叶草-叶(clover-leaf)tRNA结构。即使接头长度阻碍茎部分的配对，可以例如构建接头部分以包括内含子，以便在前体RNA加工成成熟RNA期间切除内含子，从而允许茎部分配对。在茎环siRNA的情况下，没有环结构的RNA的任一端(头部或尾部)可能具有低分子量RNA。如上所述，该低分子量RNA可以是天然RNA分子，例如tRNA、rRNA、snRNA或病毒RNA，或人工RNA分子。
为了分别从反义和有义密码DNA表达反义和有义RNA，本发明的DNA构建体包含如上定义的启动子。构建体中启动子的数目和位置原则上可以任意选择，只要它能够表达反义和有义密码DNA即可。作为本发明DNA构建体的简单实例，可以形成串联表达系统，其中启动子位于反义和有义密码DNA的上游。该串联表达系统能够产生在两端具有上述切断结构的siRNA。在茎环siRNA表达系统(茎表达系统)中，反义和有义密码DNA以相反的方向排列，并且这些DNA通过接头DNA连接起来以构建单元。启动子连接到该单元的一侧以构建茎环siRNA表达系统。在此，接头DNA的长度和序列没有特别限制，其可以具有任意长度和序列，只要其序列不是终止序列并且其长度和序列在成熟RNA产生过程中不妨碍茎部分的配对(如上所述)即可。例如，编码上述tRNA等的DNA可以用作接头DNA。
在串联和茎环表达系统两种情况下，5′端可具有能够促进从启动子转录的序列。更具体地，在串联siRNA的情况下，可以通过在反义和有义密码DNA的5′端添加能够促进从启动子转录的序列来提高siRNA产生的效率。在茎环siRNA的情况下，可以在上述单元的5′端添加这样的序列。只要不妨碍siRNA对靶基因的沉默，来自这样的序列的转录物可以在与siRNA连接的状态下使用。如果该状态阻碍基因沉默，则优选使用修整(trimming)工具(例如，本领域已知的核酶)进行转录物的修整。技术人员将清楚反义和有义RNA可以在相同载体或不同载体中表达。为避免在有义和反义RNA下游添加过多序列，优选在各链(编码反义和有义RNA的链)的3′端放置转录终止子。终止子可以是四个或更多个连续腺嘌呤(A)核苷酸的序列。
基因组编辑。基因组编辑可用于通过引入异源转基因或通过抑制靶内源基因的表达来改变主题克隆干细胞(包括克隆的癌症(或其他疾病)干细胞)的基因组序列。这样的遗传工程化干细胞可用于再生医学(见下文)或伤口愈合。因此，在某些实施方案中，再生医学(见下文)的主题方法包括使用其基因组序列已通过基因组编辑进行修饰的主题干细胞。
基因组编辑可以使用任何本领域公认的技术进行，例如ZFN/TALEN或CRISPR技术(参见综述Gaj et ah，Trends in Biotech.31(7)：397-405，2013，其全文和其中的所有引用的参考文献通过引用并入本文)。这样的技术使人们能够操作多种细胞类型和生物体中的几乎任何基因，从而使得能够通过诱导刺激容易出错的非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(homology-directed repair，HDR)(在特定基因组位置处)的DNA双链(DSB)断裂来实现广泛的遗传修饰。
锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease，ZFN)和转录激活剂样效应核酸酶(TALEN)是嵌合核酸酶，其由与非特异性DNA切割结构域连接的可编程、序列特异性DNA结合模块构成。它们是通过将锌指或TAL效应DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制性内切酶(RE)。锌指(ZF)或转录激活剂样效应物(TALE)可经工程化以结合任何期望的靶DNA序列，并与RE的DNA切割结构域融合，从而产生对所期望的靶DNA序列具有特异性的工程化限制性内切酶(ZFN或TALEN)。当ZFN/TALEN导入细胞之后，其可用于基因组原位编辑。事实上，ZFN和TALEN的多功能性可以扩展到核酸酶以外的效应结构域，例如转录激活剂和阻遏物、重组酶、转座酶、DNA和组蛋白甲基转移酶以及组蛋白乙酰转移酶，以影响基因组结构和功能。
Cys2-His2锌指结构域是存在于真核生物中的最常见的DNA结合基序类型之一，并且代表了人基因组中第二最常编码的蛋白质结构域。单个锌指具有约30个为保守ββα构型的氨基酸。将锌指蛋白应用于特异性DNA识别的关键是开发含有超过三个锌指结构域的非天然阵列。高度保守的接头序列的基于结构的发现促进了这一进展，所述接头序列使得能够构建识别长度为9至18bp的DNA序列的合成锌指蛋白。该设计已被证明是用于构建锌指蛋白的最佳策略，所述锌指蛋白蛋白识别在复杂基因组中特异的连续DNA序列。合适的锌指可通过模块化组装方法(例如，使用通过选择大的组合文库或通过合理设计而产生的锌指模块的预选文库)获得。已开发这样的锌指结构域，其识别几乎所有的64种可能的核苷酸三联体，预先选择的锌指模块可以与含有一系列这些DNA三联体的靶DNA序列串联连接在一起。或者，基于选择的方法(例如寡聚体库工程(oligomerized pool engineering，OPEN))可用于从随机文库中选择新的锌指阵列，所述随机文库考虑到相邻指之间的邻近依赖性相互作用(context-dependent interaction)。还使用了这两种方法的组合。
工程化锌指可商购获得。Sangamo Biosciences(Richmond，CA，USA)已与SigmaAldrich(St.Louis，MO，USA)合作开发了用于锌指构建的适当(propriety)平台(CompoZr)，该平台允许研究人员完全绕过锌指构建和验证，并且已经有数千种蛋白质可供使用。从广义上讲，锌指蛋白技术使得能够靶向几乎任何序列。
TAL效应物是由植物致病性黄单胞菌属(context-dependent interaction)细菌分泌的蛋白质，其DNA结合结构域含有重复的高度保守的33至34个氨基酸序列，而第12和第13位氨基酸除外。这两个位置是高度可变的(重复可变二残基(repeat variablediresidue)，或RVD)，并显示出与特定核苷酸识别的强相关性。氨基酸序列和DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复区段组合来工程化特定的DNA结合域。像锌指一样，模块化的TALE重复连接在一起以识别连续的DNA序列。许多效应结构域可用于融合TALE重复以进行靶向遗传修饰，包括核酸酶、转录激活剂和位点特异性重组酶。定制的TALE阵列的快速组装可以通过使用包括以下在内的策略来实现：“金门(Golden Gate)”分子克隆、高通量固相组装和不依赖连接的克隆技术，所有这些都可以用于本发明中用于克隆干细胞的基因组编辑。
TALE重复可以使用本领域可用的许多工具，例如靶向18,740个人蛋白质编码基因的TALEN文库(Kim et al.，Nat.Biotechnol.31，251-258，2013)来容易地组装。定制设计的TALE阵列也可通过以下商购获得：例如Cellectis Bioresearch(Paris，France)、Transposagen Biopharmaceuticals(Lexington，KY，USA)和Life Technologies(GrandIsland，NY，USA)。
来自RE末端的非特异性DNA切割结构域(例如Fokl核酸内切酶(或Fokl切割结构域变体，例如Sharkey，其具有旨在提高切割特异性和/或切割活性的突变))可用于构建在酵母测定中具有活性(在植物细胞和动物细胞中也具有活性)的杂化核酸酶。为了提高ZFN活性，可以使用瞬时低温培养条件来提高核酸酶表达水平；也可以使用位点特异性核酸酶与DNA末端加工酶的共同递送，以及使用允许富集ZFN和TALEN修饰细胞的荧光替代报道载体。ZFN介导的基因组编辑的特异性也可以通过使用锌指切口酶(ZFNickases)来改进，其利用了这样的发现：切口DNA的诱导刺激HDR而不激活容易出错的NHEJ修复途径。
TALE结合结构域的氨基酸序列和DNA识别之间的简单关系允许可识别蛋白质(designable protein)。公开可用的软件程序(DNAWorks)可用于计算适合在两步PCR中组装的寡核苷酸。用于产生工程化TALE构建体的许多模块化组装方案也已在本领域中报道并已知。这两种方法都提供了系统的方法来工程化DNA结合结构域，其在概念上类似于用于产生锌指DNA识别结构域的模块化组装方法。
一旦已组装好TALEN基因，就将它们在载体上使用任何本领域公认的方法(例如电穿孔或转染，使用基于阳离子脂质的试剂，使用质粒载体、多种病毒载体(例如腺病毒、AAV和整合酶缺陷型慢病毒载体(IDLV)))引入到靶细胞中。或者，可以将TALEN作为mRNA递送到细胞中，这消除了表达TALEN的蛋白质基因组整合的可能性。它还可以显著提高同源定向修复(HDR)的水平和基因编辑过程中渐渗的成功率。最后，也可以使用将纯化的ZFN/TALEN蛋白直接递送到细胞中。这种方法不会带来插入诱变的风险，并且使得与依赖于从核酸表达的递送系统相比脱靶效应更少，并因此可以最佳地用于需要在细胞(例如即时干细胞)中进行精确基因组工程化的研究。
TALEN可用于通过诱导双链断裂(DSB)来编辑基因组，细胞用修复机制对其作出应答。非同源末端连接(NHEJ)从双链断裂的任一侧重新连接DNA，其中退火的序列重叠非常少或没有。可以运行简单的异源双链切割测定，其检测通过PCR扩增的两个等位基因之间的任何差异。切割产物可以在简单的琼脂糖凝胶或平板凝胶系统上观察到。或者，可以在存在外源双链DNA片段的情况下通过NHEJ将DNA引入基因组。
同源定向修复也可以在DSB处引入外源DNA，因为转染的双链序列用作用于修复酶的模板。已将TALEN用于产生经稳定修饰的人胚胎干细胞和诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell，iPSC)克隆，以产生敲除的秀丽隐杆线虫(C.elegans)、大鼠和斑马鱼。
对于基于干细胞的治疗，ZFN和TALEN能够纠正疾病的根本原因，因此通过精确的基因组修饰永久消除症状。例如，ZFN诱导的HDR已被用于通过修复有缺陷的靶基因或通过敲除靶基因直接纠正与以下相关的致病突变：X连锁严重联合免疫缺陷病(SCJD)、血友病B、镰状细胞病、al-抗胰蛋白酶缺乏和许多其他遗传疾病。另外，这些位点特异性核酸酶还可用于将治疗性转基因在人基因组中的特定“安全港(safe harbor)”位置安全地插入主题干细胞中。这样的技术与本发明的干细胞组合可用于基因治疗，包括基于自体干细胞移植的治疗，其中操作克隆的(病变或正常)干细胞的一种或更多种基因以提高或降低/消除靶基因的表达。
或者，CRISPR/Cas系统也可用于将靶向遗传改变有效地诱导到主题干细胞中。CRISPR/Cas(CRISPR相关)系统或“成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered RegulatoryInterspaced Short Palindromic Repeat)”是含有多个短直接重复的基因座，并提供对细菌和古核生物的获得性免疫。CRISPR系统依靠crRNA和tracrRNA对入侵的外源DNA进行序列特异性沉默。术语“tracrRNA”代表反式激活嵌合RNA，其是促进crRNA加工的非编码RNA，并且是激活通过Cas9的RNA指导的切割所必需的。CRISPR RNA或crRNA与tracrRNA碱基配对以形成双RNA结构，其指导Cas9核酸内切酶到达互补DNA位点进行切割。
存在三种类型的CRISPR/Cas系统：在II型系统中，Cas9用作RNA指导的DNA核酸内切酶，其在crRNA-tracrRNA靶标识别之后切割DNA。在细菌中，CRISPR系统通过RNA指导的DNA切割提供针对入侵外源DNA的获得性免疫。通过重新设计crRNA，可以重新靶向CRISPR/Cas系统以切割几乎任何DNA序列。事实上，CRISPR/Cas系统已被证明通过共同递送表达Cas9核酸内切酶的质粒和必要的crRNA组分直接移植到人细胞中。这些可编程的RNA指导的DNA核酸内切酶已经证明了iPS细胞中的靶向整合和多重基因破坏能力，并因此可以类似地用于主题干细胞中。
癌症干细胞。本发明的方法和试剂也能够从上皮组织样品/活检或从其他分层再生组织中培养和分离癌症来源的癌症干细胞(CSC)，这继而可以用于先前的不可能或不切实际实施的许多应用，其部分由于无法以单细胞克隆的形式且大量获得这样的CSC。
例如，使用本发明的方法从单个患者建立的CSC文库能够比较患者匹配的敏感和抗性克隆以进行定向药物发现工作。与敏感克隆相比，抗性克隆中的某些基因可能上调或下调。用于上调的基因的抑制剂可以作为药物靶基因进一步验证，例如通过测试抗性克隆中靶基因的下调能力，并确定其对药物抗性的影响。相反，在抗性克隆中恢复或过表达下调的基因也可以克服药物抗性。
因此，在一方面中，本发明提供了药物发现方法，所述方法用使用主题方法和培养基分离的CSC来识别在药物抗性CSC克隆中上调或下调的基因，所述方法包括：(1)使用本发明的方法，从癌组织(例如来自癌症患者的组织)中获得多个细胞克隆；(2)使所述多个细胞克隆与一种或更多种化合物(例如癌症药物)在其中小百分比(例如，不超过1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％或更少)的药物抗性克隆存活的条件下接触；(3)比较药物抗性克隆和敏感克隆(例如，一个或更多个在步骤(2)之前随机挑选的多个细胞克隆，其可能对药物治疗敏感)的基因表达谱，从而识别出在存活的药物抗性克隆中上调或下调的基因。
在某些实施方案中，所述方法还包括抑制在存活的药物抗性克隆中上调的基因的表达。例如，上调的基因通常可在来自同一患者或来自不同患者、来自相同类型的肿瘤或不同类型的肿瘤的两个或更多个存活的药物抗性克隆中上调。在某些实施方案中，上调的基因对于从中分离出CSC的患者可以是特异性的。这有助于为患者设计个性化的药物或治疗方案。
在某些实施方案中，所述方法还包括恢复或提高在存活的药物抗性克隆中下调的基因的表达。例如，下调的基因通常可在来自同一患者或来自不同患者、来自相同类型的肿瘤或不同类型的肿瘤的两个或更多个存活的药物抗性克隆中下调。在某些实施方案中，下调的基因对于从中分离出CSC的患者可以是特异性的。这也有助于为患者设计个性化的药物或治疗方案。
在一个相关方面中，本发明提供了药物发现方法，所述方法用使用主题方法和培养基分离的CSC来识别抑制药物抗性CSC的生长或促进对药物抗性CSC的杀伤的候选化合物，所述方法包括：(1)使用本发明的方法，从癌组织(例如来自癌症患者的组织)中获得多个细胞克隆；(2)使所述多个细胞克隆与一种或更多种化合物(例如癌症药物)在其中小百分比(例如，不超过1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％或更少)的药物抗性克隆存活的条件下接触；(3)使存活的药物抗性克隆与多种候选化合物接触，以及(4)识别抑制存活的药物抗性克隆的生长或促进对存活的药物抗性克隆的杀伤的一种或更多种候选化合物。在某些实施方案中，所述方法使用针对靶向抗性细胞的候选药物的高通量筛选形式进行。
在某些实施方案中，所述方法还包括测试所识别的候选化合物对匹配的敏感克隆(例如，一个或更多个在步骤(2)之前随机挑选的多个细胞克隆，其可能对药物治疗敏感)和/或对来自从中分离出CSC的同一患者的匹配健康细胞的一般毒性。优选地，与匹配的敏感克隆和/或匹配的健康细胞相比，任何识别的候选化合物特异性地或优先地抑制药物抗性CSC的生长或促进对药物抗性CSC的杀伤。
在某些实施方案中，健康细胞是使用本发明的方法和试剂类似地分离的患者匹配的正常干细胞。
上述实施方案部分基于以下发现：在许多情况下，药物抗性CSC与药物敏感克隆相比生长更慢。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但本申请人认为缓慢生长可能是药物抗性CSC中用于逃避化学治疗的基因表达改变的结果。因此，预期某些试剂可能会优先抑制药物抗性细胞的生长或杀伤药物抗性细胞，同时毒性低于最初用于治疗癌症的标准化学治疗药物(如顺铂或紫杉醇)。
在另一方面中，本发明提供了用于为需要治疗疾病的患者确定合适或有效治疗的方法，所述方法包括：(1)使用本发明的方法，从来自患者的疾病组织(例如癌组织)中获得多个干细胞克隆；(2)对多个细胞克隆进行一种或更多种候选处理；(3)确定所述一种或更多种候选治疗中的每一种的有效性；从而为需要治疗所述疾病的患者确定合适或有效的治疗。这可能是有用的，例如，当患者有数种可能的治疗选择时，每一种可能或可能不适合患者或者可能对或可能不对患者有效。
在一个相关方面中，本发明提供了用于在多种候选治疗中筛选最合适或最有效的治疗以治疗需要治疗疾病的患者的方法，所述方法包括：(1)使用本发明的方法，从来自患者的疾病组织(例如癌组织)中获得多个干细胞克隆；(2)对多个细胞克隆进行所述候选处理；(3)比较所述一种或更多种候选治疗的相对有效性；从而确定对患者最适合或最有效的治疗。这可能很有用，例如当患者有数种替代治疗选择，每种治疗选择可能对特定患者群体有效但对其他患者不一定有效。
在某些实施方案中，所述疾病是癌症，例如可以从中分离出癌症干细胞的任何癌症。
在某些实施方案中，治疗是化学治疗方案，例如使用一种或更多种化学治疗剂的方案。在某些实施方案中，治疗是放射治疗。在某些实施方案中，治疗是免疫治疗，例如使用特异性结合癌细胞表面配体(例如表面抗原)的细胞结合剂(例如抗体)的免疫治疗。在某些实施方案中，治疗是手术、化学治疗、放射治疗和/或免疫治疗的组合治疗。
在某些实施方案中，所述疾病是炎性疾病、可从中分离出疾病相关干细胞的疾病或本文提及的任何疾病。
在某些实施方案中，所述方法还包括使用一种或更多种确定的适合或有效的疾病治疗来治疗患者。
在某些实施方案中，所述方法还包括产生提供每种所述候选治疗的有效性的报告，例如单独或组合(包括顺序或同时)测试的每种候选化学治疗剂的有效性。
在某些实施方案中，所述方法还包括提供对最有效治疗的建议。
在一个相关方面中，本发明提供了用于实施本发明方法的试剂盒和试剂。
在某些实施方案中，本发明的一般筛选方法(不一定限于癌症干细胞)以高通量/自动方式进行。为了高通量目的，扩增的干细胞群可以在多孔板，例如96孔板或384孔板中培养。分子文库用于识别影响平板接种干细胞的分子。优选的文库包括(但不限于)抗体片段文库、肽噬菌体展示文库、肽文库(例如，LOPAPTM，SigmaAldrich)、脂质文库(BioMol)、合成化合物文库(例如，LOP ACTM，Sigma Aldrich)或天然化合物文库(Specs，TimTec)。此外，可以使用诱导或抑制干细胞后代中一种或更多种基因的表达的遗传文库。这些遗传文库包括cDNA文库、反义文库以及siRNA或其他非编码RNA文库。
干细胞优选暴露于多种浓度的测试/候选试剂一定的时间段。在暴露期结束时，评价培养物的预定作用，例如细胞中的任何变化，包括但不限于增殖的降低或丧失、形态变化和细胞死亡。
扩增的干细胞群也可用于识别特异性靶向上皮癌细胞或从中分离的干细胞而不是扩增的干细胞群本身的药物。
癌症干细胞的现成克隆(ready cloning)也使免疫学方法能够破坏肿瘤。本文描述的技术能够高效克隆CSC，并因此可能提供有助于通过免疫激活根除这些细胞的方法的信息。
例如，在分离CSC(药物敏感或药物抗性)之后，这样的CSC的一个或更多个表位，优选与健康对照相比的CSC特异性表位(例如，CSC的分泌组或细胞表面上的表位)可用于接种抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)以引导淋巴细胞靶向这些CSC。免疫学方法可能包括，就像对黑素瘤所做的那样，识别和靶向抑制免疫监视的CSC的分泌组或细胞表面上的分子。
再生医学
主题干细胞还可用于再生医学，例如用于多种受损生殖组织或器官的创伤后、放射后和/或手术后修复。
在又一个实施方案中，可以从成年供体获取小活检或组织样品，并且可以分离和扩增以及任选地分化其中的干细胞，以产生用于再生目的的可移植上皮。主题干细胞可以冷冻和解冻并放回培养中而不会失去干细胞特征并且没有显著的细胞死亡的这一事实进一步增加了主题干细胞用于移植目的的适用性。
因此，本发明提供了干细胞或其扩增克隆或其分化产物(或在再生医学用途的情况下统称为“干细胞”)，其用于移植到哺乳动物中，优选移植到人中。还提供了治疗需要移植的患者的方法，包括将本发明的干细胞群移植到患者体内，其中患者是哺乳动物，优选是人。
因此，本发明的另一方面提供了通过细胞治疗来治疗人或非人动物患者的方法。这样的细胞治疗包括通过任何合适的方式将本发明的干细胞(例如本发明的组织匹配的干细胞)应用或施用于患者。具体而言，这样的治疗方法涉及受损组织的再生或伤口愈合。根据本发明，可以用同种异体或自体干细胞或其克隆扩增来治疗患者。“自体”细胞是源自它们被重新引入其中以进行细胞治疗(例如为了允许组织再生)的同一生物体的细胞。然而，细胞不一定是从与它们被引入的组织相同的组织中分离出来的。自体细胞不需要与患者匹配来克服排斥问题。“同种异体”细胞是源自这样的个体的细胞，该个体虽然与细胞被引入其中以进行细胞治疗(例如为了允许组织再生)的个体不同但属于同一物种。可能仍需要一定程度的患者匹配以防止排斥问题。
通常，本发明的干细胞通过注射或植入引入到患者体内。通常，细胞将直接注射到它们意欲作用的组织中。或者，细胞将通过门静脉注射。含有本发明的细胞和可药用载体的注射器包括在本发明的范围内。连接至含有本发明细胞和可药用载体的注射器的导管也包括在本发明的范围内。
本发明的干细胞也可用于组织再生。为了实现该功能，根据细胞在体内的位置和/或归巢到它们的来源组织之后，可以将它们直接注射或植入到受损组织中，在那里它们可以增殖并最终分化成所需的细胞类型。
或者，可以将主题干细胞直接注射或植入受损组织中。对治疗易感的组织包括所有受损组织，尤其包括那些可能因疾病、损伤、创伤、自身免疫反应或者病毒或细菌感染而受损的组织。在本发明的一些实施方案中，本发明的干细胞用于再生肺、食管、胃、小肠、结肠、肠化生、输卵管、肾、胰、膀胱、肝或胃系统，或其部分/段。
在某些实施方案中，患者是人，但作为替代地可以是非人哺乳动物，例如猫、狗、马、牛、猪、羊、兔或小鼠。
在某些实施方案中，使用注射器(例如汉密尔顿氏注射器(Hamilton syringe))将本发明的干细胞注射到患者体内。本领域技术人员将了解对于待治疗的特定病症本发明干细胞的合适剂量是多少。
在某些实施方案中，将在溶液中、在微球中或在多种组合物的微粒中的本发明的干细胞施用至灌注需要再生的组织或受损器官部分的动脉中。
通常，这样的施用将使用导管进行。导管可以是用于血管成形术和/或细胞递送的多种球囊导管中的一种，或者是设计成用于将细胞递送到身体的特定部位的特定目的的导管。
对于某些用途，可以将干细胞封装在由多种不同的可生物降解化合物制成且直径为约15μm的微球中。该方法可以使血管内施用的干细胞留在损伤部位，而不是通过毛细血管网络并进入第一通道(first passage)中的体循环。毛细血管网络动脉侧的滞留也可有助于它们易位到血管外空间。
在某些实施方案中，干细胞可以逆行注射到血管树中，通过静脉将它们递送到全身或者局部递送到特定静脉中，所述特定静脉引流到干细胞所指向的组织或身体部位。
在另一个实施方案中，可以将本发明的干细胞植入到黏附于生物相容性植入物的受损组织中。在该实施方案中，可以将细胞在体外黏附到生物相容性植入物上，然后植入患者体内。如本领域技术人员将清楚的，可以使用多种黏附剂(adherent)中的任何一种来将细胞黏附到植入物上，然后植入。仅举例来说，这样的黏附剂可包括纤维蛋白、整合素家族的一种或更多种成员、钙黏素家族的一种或更多种成员、选择素家族的一种或更多种成员、一种或更多种细胞黏附分子(cell adhesion molecule，CAM)、免疫球蛋白家族中的一种或更多种以及一种或更多种人工黏附剂。该列表仅以举例说明的方式提供，并非旨在限制。本领域技术人员将清楚，可以使用一种或更多种黏附剂的任何组合。
在另一个实施方案中，可以将本发明的干细胞嵌入基质中，然后将基质植入患者。通常，基质将被植入患者的受损组织中。基质的实例包括基于胶原蛋白的基质、基于纤维蛋白的基质、基于层黏连蛋白的基质、基于纤连蛋白的基质和人工基质。该列表仅以举例说明的方式提供，并非旨在限制。在另一个实施方案中，本发明的干细胞可以与基质形成组分一起植入或注射到患者体内。这可以使细胞在注射或植入之后形成基质，确保干细胞维持在患者体内的适当位置。基质形成组分的实例包括纤维蛋白胶液体烷基、氰基丙烯酸酯单体、增塑剂、多糖(如葡聚糖)、含环氧乙烷的寡聚体、嵌段共聚物(如泊洛沙姆(poloxamer)和普兰尼克(Pluronic))、非离子表面活性剂如吐温和Triton 8以及人工基质形成组分。该列表仅以举例说明的方式提供，并非旨在限制。本领域技术人员将清楚，可以使用一种或更多种基质形成组分的任何组合。
在另一个实施方案中，本发明的干细胞可以包含在微球中。在该实施方案中，细胞可以被封装在微球的中心内。同样在该实施方案中，细胞可以嵌入微球的基质材料中。基质材料可包括任何合适的可生物降解聚合物，包括但不限于藻酸盐、聚乙二醇(PLGA)和聚氨酯。该列表仅作为示例提供，并非旨在限制。
在另一个实施方案中，本发明的干细胞可以黏附于用于植入的医疗装置上。这样的医疗装置的实例包括支架、针、缝线、劈开器(split)、起搏器、假体关节、人造皮肤和棒。该列表仅以举例说明的方式提供，并非旨在限制。本领域技术人员将清楚，可以通过多种方法将细胞黏附到医疗装置上。例如，可以使用以下将干细胞黏附到医疗装置上：纤维蛋白、整合素家族的一种或更多种成员、钙黏素家族的一种或更多种成员、选择素家族的一种或更多种成员、一种或更多种细胞黏附分子(CAM)、免疫球蛋白家族中的一种或更多种以及一种或更多种人工黏附剂。该列表仅以举例说明的方式提供，并非旨在限制。本领域技术人员将清楚，可以使用一种或更多种黏附剂的任何组合。
因此，包括在本发明范围内的是通过细胞治疗来治疗人或动物患者的方法。术语“动物”在此表示所有哺乳动物，优选人患者。它还包括处于所有发育阶段，包括胚胎和胎儿阶段的个体动物。例如，患者可以是成人，或者治疗可以用于儿科用途(例如，新生儿、儿童或青少年)。这样的细胞治疗包括通过任何合适的方式将根据本发明产生的干细胞施用于患者。具体而言，这样的治疗方法涉及受损组织的再生或伤口愈合。本文中使用的术语“施用”指公知的施用形式，例如静脉内或注射以及通过移植施用，例如通过手术移植、移植术或移植来源于根据本发明的干细胞的组织工程化肝。在细胞的情况下，可以对个体进行全身施用，例如通过经由胸导管输注到肠系膜上动脉、腹腔动脉、锁骨下静脉中，经由上腔静脉输注到心脏中，或者输注进入腹膜腔，随后细胞通过膈下淋巴管迁移，或经由输注到肝动脉血供应或门静脉中直接进入肝部位。
每次输注每100kg人可施用104至1013个细胞。优选地，每100kg人可以静脉内输注约1至5×104至1至5×107个细胞。更优选地，每100kg人可以静脉内输注约1×104至1×106个细胞。在一些实施方案中，提供了主题干细胞的单次施用。在另一些实施方案中，使用多次施用。可以在例如连续3至7天的初次治疗方案中提供多次施用，然后在其他时间重复。
技术人员将清楚，基因治疗可以另外用于旨在修复受损或病变组织的方法中。例如，可以使用腺病毒或逆转录病毒基因递送载剂来向干细胞递送遗传信息，如DNA和/或RNA。技术人员可以替代或修复基因治疗中靶向的特定基因。例如，可以将正常基因插入基因组内的非特异性位置以替代非功能基因。在另一个实例中，异常基因序列可以通过同源重组被替代为正常基因序列。或者，选择性回复突变可以使基因恢复其正常功能。另一个实例是改变特定基因的调节(基因开启或关闭的程度)。优选地，将干细胞通过基因治疗方法离体处理并且随后转移至哺乳动物，优选需要治疗的人。例如，干细胞来源的细胞可以在移植到患者体内之前在培养中进行遗传修饰。
毒性测定。扩增的干细胞群还可以替代细胞系(如Caco-2细胞)在潜在新的药物或者已知或新的食品补充剂的毒性测定中的用途。这样的毒性测定可以使用患者匹配的干细胞或组织/器官匹配的干细胞进行，这可能在个性化医疗中有用。将基于细胞的毒性测试用于确定器官特异性细胞毒性。
可以测试的化合物包括癌症化学预防剂、环境化学品、食品补充剂和潜在毒物。将细胞暴露于多种浓度的测试剂一定的时间段。测定中测试试剂的浓度范围在初步测定中使用五天暴露和从最高可溶性浓度的对数稀释来确定。在暴露期结束时，评价培养物的生长抑制。分析数据以确定抑制终点50％的浓度(TC50)。
为了高通量目的，将上皮干细胞在多孔板，例如96孔板或384孔板中培养。将分子文库用于识别影响干细胞的分子。优选的文库包括抗体片段文库、肽噬菌体展示文库、肽文库(例如，LOPAPTM，Sigma Aldrich)、脂质文库(BioMol)、合成化合物文库(例如，LOPACTM，Sigma Aldrich)或天然化合物文库(Specs，TimTec)。此外，可以使用诱导或抑制腺瘤细胞后代中一种或更多种基因的表达的遗传文库。这些遗传文库包括cDNA文库、反义文库以及siRNA或其他非编码RNA文库。优选将细胞暴露于多种浓度的测试试剂一定的时间段。在暴露期结束时，评价培养物。术语“影响”用于涵盖细胞中的任何变化，包括但不限于增殖的降低或丧失、形态变化和细胞死亡。
动物模型。本发明的另一个方面提供了动物模型，其包含主题干细胞，例如主题癌症干细胞。
在某些实施方案中，动物是免疫缺陷的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)，因为这样的动物不太可能引起排斥反应。作为免疫缺陷动物，优选使用功能性T细胞缺陷的非人动物(例如裸鼠和大鼠)，以及功能性T细胞和B细胞缺陷的非人动物(例如SCID小鼠和NOD-SCID小鼠)。特别是，优选使用表现优异可移植性的T、B和NK细胞缺陷的小鼠(例如，通过将SCID、RAG2KO或RAG1KO小鼠与IL-2Rgnu11小鼠杂交获得的严重免疫缺陷小鼠，其包括NOD/SCID/gammacnu11小鼠、NOD-scid、IL-2Rgnu11小鼠和BALB/cRag2nu11、IL-2Rgnu11小鼠)。
关于非人动物的年龄，当使用无胸腺裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠或NOG小鼠时，优选使用4100周龄的那些。
NOG小鼠可以例如通过WO 2002/043477(通过引用并入)中描述的方法产生，或者可获自中央实验动物研究所(Central Institute for Experimental Animal)或杰克逊实验室(Jackson Laboratory)(NSG小鼠)。
待移植的细胞可以是任何类型的细胞，包括干细胞团块/克隆、从主题干细胞分化的组织切片、单独分散的干细胞、分离或冷冻/解冻之后培养的干细胞、以及移植到另一动物并再次从该动物分离的干细胞。待移植的细胞数目可以为106个或更少，也可以移植更大数目的细胞。在某些实施方案中，由于其简单的移植技术，皮下移植是优选的。然而，移植部位并不特别受限，并优选地根据所使用的动物适当地选择。移植NOG建立的癌细胞系的操作没有特别限制，并且可以使用任何常规的移植操作。
这样的动物模型可用于例如寻找药物靶分子和评估药物。药物的评估方法包括药物筛选和抗癌剂筛选。寻找靶分子的方法包括但不限于用于使用基因芯片分析识别在癌症干细胞中高度表达的基因如DNA和RNA(例如癌症干细胞标志物)的方法，以及用于使用蛋白质组学识别在癌症干细胞中高度表达的蛋白质、肽或代谢物的方法。
用于寻找靶分子的筛选方法包括其中使用细胞生长抑制测定从小分子文库、抗体文库、微RNA文库或RNAi文库等中筛选出抑制癌症干细胞生长的物质的方法。获得抑制剂之后，可以揭示其靶标。
因此，本发明也提供了鉴定药物靶分子的方法，所述方法包括：(1)通过将本发明的癌症干细胞移植到非人动物(例如免疫受损的小鼠或大鼠)来产生非人动物模型；(2)在施用药物之前和之后，采集显示出所述癌症干细胞群的癌症发展过程的组织结构特征或显示出其生物学特性的组织切片；(3)检查/比较(2)中收集的组织切片(之前与之后)的DNA、RNA、蛋白质、肽或代谢物的表达；以及(4)识别组织切片中根据由癌症干细胞形成的结构、源自癌症干细胞的癌症发展过程或癌症干细胞的生物学特性而变化的DNA、RNA、蛋白质、肽或代谢物。
本发明还提供了评估药物的方法，所述方法包括：(1)通过将本发明的癌症干细胞移植到非人动物(例如，免疫受损小鼠或大鼠)来产生非人动物模型；(2)向(1)的非人动物模型施用受试物质；(3)收集显示出源自癌症干细胞的癌症发展过程的组织结构特征或显示出其生物学特性的组织切片；(4)在组织切片中观察癌症干细胞随时间的变化、癌症发展过程或其生物学特性；以及(5)识别受到受试物质抑制的癌症干细胞的生物学特性、源自癌症干细胞的癌症发展过程或由癌症干细胞形成的结构的形成。
本发明还提供了筛选药物的方法，所述方法包括：(1)通过将本发明的癌症干细胞移植到非人动物(例如免疫受损小鼠或大鼠)产生非人动物模型；(2)向(1)的非人动物模型施用受试物质；(3)采集显示出源自癌症干细胞的癌症发展过程的组织结构特征或显示出其生物学特性的组织切片；(4)在组织切片中观察癌症干细胞随时间的变化、癌症发展过程或其生物学特性；以及(5)识别抑制以下的受试物质：癌症干细胞的生物学特性、源自癌症干细胞的癌症发展过程或由特定癌症干细胞形成的结构的形成。
8.实施例
包括以下实例以演示一些优选的实施方案。本领域技术人员应当理解，在下面的实例中公开的技术代表了本发明人发现的在实施方案的实践中很好地发挥作用的技术，并因此可以被认为是构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，可在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，对所公开的具体实施方案作出许多变化而仍然获得相同或相似的结果。
举例说明性实施例
本文所述的培养基已经过测试并经证明可支持来源于来自人和其他哺乳动物的分层上皮组织的上皮干细胞的稳健生长。例如，已经克隆了肺干细胞、膀胱干细胞和食管干细胞(见图1和图2)。
一个举例说明性系统是称为SQM的培养基。SQM培养基已经过测试并经证明在存在小鼠成纤维细胞(3T3-J2)的辐照饲养细胞的情况下，支持来源于人组织或其他哺乳动物的上皮干细胞的稳健生长。例如，肺干细胞、食管干细胞、膀胱干细胞和卵巢癌干细胞都可以在包含SQM培养基与举例说明的实例中的经辐照3T3-J2饲养细胞的该培养系统中稳健生长。
基础培养基包含DMEM、F12、FBS、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、Pen/Strep、胰岛素、T3、氢化可的松、EGF，并进一步添加Rock抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP4抑制剂、VEGF抑制剂、TrkA抑制剂、帕纳替尼和FGF10。观察到在培养基中包含jagged1和烟酰胺会诱导一些上皮干细胞(肺、食管等)自我更新的中止(abortion)，并因此那两种组分未用于本培养基或本发明培养基的其他实施方案。发现不需要R-脊椎蛋白来支持分层上皮干细胞的自我更新和多能性。来自多种不同组织(包括肺和食管)的上皮干细胞已在本培养基中传代超过25代，并在体外和使用NSG小鼠的异种移植模型二者中维持自我更新能力和多能分化能力。
另一个举例说明性系统是称为SGM-63+的培养基。SGM-63+培养基已经过测试并经证明在没有小鼠成纤维细胞(3T3-J2)的辐照饲养细胞的情况下，支持来源于人组织或其他哺乳动物的上皮干细胞的稳健生长。例如，肺干细胞、食管干细胞、膀胱干细胞和卵巢癌干细胞都可以在包含SGM-63+培养基的该培养系统中稳健生长，而无需举例说明的实例中的经辐照3T3-J2饲养细胞。
基础培养基包含DMEM、F12、FBS、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、Pen/Strep、胰岛素、T3、氢化可的松、EGF，并进一步添加Rock抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP4抑制剂、VEGF抑制剂、TrkA抑制剂、帕纳替尼、CK2抑制剂、Syk抑制剂、LPA受体拮抗剂、Oct4激活化合物1、GSK3抑制剂和FGF10。观察到在培养基中包含jagged1和烟酰胺会诱导一些上皮干细胞(肺、食管等)自我更新的中止，并因此那两种组分未用于本培养基或本发明培养基的其他实施方案。发现不需要R-脊椎蛋白来支持分层上皮干细胞的自我更新和多能性。来自多种不同组织(包括肺和食管)的上皮干细胞已在本培养基中传代超过25代，并在体外和使用NSG小鼠的异种移植模型二者中维持自我更新能力和多能分化能力。
SQM培养基(1升)
Figure BPA0000322182560001281
过滤并储存在4℃下。
组分
DMEM
(Invitrogen 11960)
高葡萄糖(4.5g/L)，不含L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠
F-12营养混合物(HAM)
(Invitrogen 11765)
含有L-谷氨酰胺
腺嘌呤
(Calbiochem 1152 10g)
将243mg腺嘌呤添加至100ml的0.05M HCl中(在100ml蒸馏水中稀释0.4ml的浓缩HCl)
在RT下搅拌约一小时以溶解
过滤除菌
分成10.0ml等分试样
最终浓度：1.8×10-4M
储存在-20℃下。
FBS
(Hyclone SH30910.03 500mL)
不热灭活血清
将血清解冻并等分成50ml/管，并在-20℃下储存
L-谷氨酰胺
(GIBCO 25030-081 100ml)
解冻并分成10.0ml等分试样
储存在-20℃下。
青霉素/链霉素
(GIBCO 15140-122 100mL)
两性霉素B
(GIBCO，15290-018)仅适用于原代培养
庆大霉素
(GIBCO，15710-064)仅适用于原代培养
胰岛素
(Sigma I-5500 50mg)
将50mg溶解在10ml 0.005N HCl中(储液5mg/ml)
以1ml等分试样分装并储存在-20℃下
最终浓度5ug/ml
T3(3，3′，5-三碘-L-甲状腺原氨酸)
(Sigma T-2752 100mg)
将13.6mg溶解在15ml的0.02N NaOH中
用PBS使体积达到100ml(浓缩储液2×10-4M)
以10ml等分试样分装并储存在-20℃下
取0.1ml浓缩储液，用PBS使体积达到10ml
以1ml等分试样分装并储存在-20℃下(储液2×10-6M)
最终浓度2×10-9M
氢化可的松
(Sigma H-0888 1g或Calbiochem/EMD 386698)
将25mg溶解在5ml 95％ETOH中(浓缩储液5mg/ml)
储存于-20℃下
取0.4ml浓缩储液，用无血清SBM培养基使达到10ml
以1ml等分试样分装并储存在-20℃下(储液200μg/ml)
最终浓度0.4ug/ml
EGF
(Upstate Biotechnology 01-107)
0μ1％BSA的制备：
100mg BSA(Sigma A-2058；不含IgG，经细胞培养测试5g)
溶解在100ml蒸馏水中
通过0.22μNalgene无菌过滤器
根据使用频率，在4℃下或-20℃下储存
EGF的制备：
将1mg EGF溶解在1ml 0.1％BSA中
以100μl等分试样分装并储存在-80℃下(浓缩储液100μg/100μl)
用0.1％BSA将100μg浓缩储液加至10ml
使用0.22μMillipore Millex-GV的无菌过滤器
以1ml等分试样分装并储存在-20℃下(储液10μg/ml)
最终浓度10ng/ml
人头蛋白
(目录号6057-NG，R&D systems；最终浓度：100ng/ml，储液：100ug/ml)
(将10mg溶解在100ml无菌PBS中作为储液，等分试样1ml/小瓶)
Y-27632
(目录号688000，Calbiochem；最终浓度：2.5uM，储液：2.5mM)
(将5mg溶解在5.912ml无菌水中作为储液，等分试样1ml/小瓶)
SB431542
(目录号13031，Cayman chemical company；最终浓度：2uM，储液：2mM)
(将5mg溶解在6.5ml DMSO中作为储液，等分试样1ml/小瓶)
FGF10
(目录号345-FG，R&D systems；最终浓度：100ng/ml，储液：100ug/ml)
(将1mg溶解在10ml无菌PBS中作为储液，等分试样1ml/小瓶)
替沃扎尼(AV-951)
(目录号S1207，Selleckchem；最终浓度：500nM，储液：10mM)
Potatinib(AP24534)
(目录号S1490，Selleckchem；最终浓度：500nM，储液：10mM)
GW441756(目录号S2891，Selleckchem；最终浓度：500nM，储液：10mM)
SGM-63+培养基(1升)
DMEM： 645ml
F12： 215ml
FBS： 100ml
L-谷氨酰胺： 10ml
腺嘌呤： 10ml
Pen/Strep： 10ml
胰岛素： 1ml
T3： 1ml
氢化可的松： 2ml
EGF： 1ml
头蛋白： 1ml
Y-27632： 1ml
SB431542： 1ml
hFGF10： 1ml
替沃扎尼(AV-951) 最终浓度：500nM
Potatinib(AP24534) 最终浓度：500nM
GW441756 最终浓度：500nM
Silmitasertib(CX-4945) 最终浓度：1μM
R406 最终浓度：1μM
Ki16198 最终浓度：1μM
OAC1 最终浓度：1μM
AZD1080 最终浓度：1μM
过滤并储存在4℃下。
组分
DMEM(Invitrogen 11960)
高葡萄糖(4.5g/L)，不含L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠
F-12营养混合物(HAM)(Invitrogen 11765)
含有L-谷氨酰胺
腺嘌呤(Calbiochem 1152 10g)
将243mg腺嘌呤添加至100ml的0.05M HCl中(在100ml蒸馏水中稀释0.4ml浓缩HCl)
在RT下搅拌约一小时以溶解
过滤除菌
分成10.0ml等分试样
最终浓度：1.8×10-4M
储存在-20℃下。
FBS(Hyclone SH30910.03 500mL)
不热灭活血清
将血清解冻并等分成50ml/管，并在-20℃下储存
L-谷氨酰胺(GIBCO 25030-081 100ml)
解冻并分成10.0ml等分试样
储存在-20℃下。
青霉素/链霉素(GIBCO 15140-122 100mL)
两性霉素B(Gibco，15290-018)仅适用于原代培养
庆大霉素(Gibco，15710-064)仅适用于原代培养
胰岛素(Sigma I-5500 50mg)
将50mg溶解在10ml的0.005N HCl中(储液5mg/ml)
以1ml等分试样分装并储存在-20℃下
最终浓度5ug/ml
T3(3，3′，5-三碘-L-甲状腺原氨酸)(Sigma T-2752 100mg)
将13.6mg溶解在15ml的0.02N NaOH中
使用PBS使体积达到100ml(浓缩储液2×10-4M)
以10ml等分试样分装并储存在-20℃下
取0.1ml浓缩储液，用PBS使体积达到10ml
以1ml等分试样分装并储存在-20℃下(储液2×10-6M)
最终浓度2×10-9M
氢化可的松(Sigma H-0888或Calbioehem/EMD 386698)
将25mg溶解在5ml的95％ETOH中(浓缩储液5mg/ml)
储存在-20℃下
取0.4ml浓缩储液，用无血清SBM培养基使达到10ml
以1ml等分试样分装并储存在-20℃下(储液200μg/ml)
最终浓度0.4ug/ml
EGF(Upstate Biotechnology 01-107)
0.1％BSA的制备：
100mg BSA(SigmaA-2058；不含IgG，经细胞培养测试5g)
溶解在100ml蒸馏水中
通过0.22μNalgene无菌过滤器
根据使用频率，储存在4℃或-20℃下
EGF的制备：
将1mg EGF溶解在1ml 0.1％BSA中
将100μl等分试样分装并储存在-80℃下(浓缩储液100μg/100μl)
用0.1％BSA使100μg浓缩储液达到10ml
使用0.22μMillipore Millex-GV的无菌过滤器
以1ml等分试样分装并储存在-20℃下(储液10μg/ml)
最终浓度10ng/ml
人头蛋白(目录号6057-NG，R&D systems；最终浓度：100ng/ml，储液：100ug/ml)
(将10mg溶解在100ml无菌PBS中作为储液，等分试样1ml/小瓶)
Y-27632(目录号688000，Calbiochem；最终浓度：2.5uM，储液：2.5mM)
(将5mg溶解在5.912ml无菌水中作为储液，等分试样1ml/小瓶)
SB431542(目录号13031，Cayman chemical company；最终浓度：2uM，储液：2mM)
(将5mg溶解在6.5ml DMSO中作为储液，等分试样1ml/小瓶)
FGF10(目录号345-FG，R&D systems；最终浓度：100ng/ml，储液：100ug/ml)
(将1mg溶解在10ml无菌PBS中作为储液，等分试样1ml/小瓶)
替沃扎尼(AV-951)(目录号S1207，Selleckchem；最终浓度：500nM，储液：10mM)
Potatinib(AP24534)(目录号S1490，最终浓度：500nM，储液：10mM)
GW441756(目录号S2891，Selleckchem；最终浓度：500nM，储液：10mM)
Silmitasertib(CX-4945)(目录号S2248，Selleckchem；最终浓度：1μM，储液：10mM)
R406(目录号S2194，Selleckchem；最终浓度：1μM，储液：10mM)
Ki16198(目录号S2906，Selleckchem；最终浓度：1μM，储液：10mM)
OAC1(目录号S7217，Selleckchem；最终浓度：1μM，储液：10mM)
AZD1080(目录号S7145，Selleckchem；最终浓度：1μM，储液：10mM)
B1培养基(饲养层依赖的)
用于1L
Figure BPA0000322182560001361
Figure BPA0000322182560001371
Y-27632
工作浓度：2.5uM
储液浓度：在水中的25mM
分子量：320.26
要制备25mM，
1.249ml水中的10mg
1∶10,000所以100ul用于1L培养基
SB431542
M.W.：384
最终浓度：2uM
储液浓度：20mM
1.3008ml DMSO中10mg
1∶10,000所以100ul用于1L培养基
AV-951
工作浓度：500nM
储备溶液：10mM
1∶20,000所以50ul用于1L培养基
帕纳替尼
工作浓度：500nM
储备溶液：10mM
1∶20,000所以50ul用于1L培养基
GW441756
工作浓度：500nM
储备溶液：10mM
1∶20,000所以50ul用于1L培养基
ClonoVisionTM B1F培养基(无饲养层)
用于1L
Figure BPA0000322182560001381
Y-27632
工作浓度：2.5uM
储液浓度：在水中25mM
分子量：320.26
要制备25mM，
1.249ml水中的10mg
1∶10,000所以100ul用于1L培养基
SB431542
M.W.：384
最终浓度：2uM
储液浓度：20mM
在1.3008ml DMSO中10mg
1∶10,000所以100ul用于1L培养基
AV-951
工作浓度：500nM
储备溶液：10mM
1∶20,000所以50ul用于1L培养基
帕纳替尼
工作浓度：500nM
储备溶液：10mM
1∶20,000所以50ul用于1L培养基
GW441756
工作浓度：500nM
储备溶液：10mM
1∶20,000所以50ul用于1L培养基
Silmitasertib(CX-4945)
工作浓度：1uM
储备溶液：10mM
1∶10,000所以100ul用于1L培养基
R406
工作浓度：1uM
储备溶液：10mM
1∶10,000所以100ul用于1L培养基
Ki16198
工作浓度：1uM
储备溶液：10mM
1∶10,000所以100ul用于1L培养基
OAC1
工作浓度：1uM
储备溶液：10mM
1∶10,000所以100ul用于1L培养基
AZD1080
工作浓度：1uM
储备溶液：10mM
1∶10,000所以100ul用于1L培养基
*****************
根据本公开内容，可以在无需过度实验的情况下制造并实现本文中所公开并要求保护的所有组合物和方法。虽然就优选的实施方案而言，已经描述了本公开内容的组合物和方法，但是对本领域技术人员而言将明显的是，在不脱离本公开内容的概念、精神和范围的情况下，可以对本文中描述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤的顺序施加变化。更具体地，将明显的是，可以用在化学和生理学两方面均相关的某些试剂替换本文中描述的试剂而将实现相同或相似的结果。认为对于本领域技术人员显而易见的所有这样的类似替代和修改均在由所附权利要求书限定的本公开内容的精神、范围和概念内。
Figure IPA0000322182480000011
Figure IPA0000322182480000021
Figure IPA0000322182480000031
Figure IPA0000322182480000041
Figure IPA0000322182480000051
Figure IPA0000322182480000061
Figure IPA0000322182480000071
Figure IPA0000322182480000081
Figure IPA0000322182480000091
Figure IPA0000322182480000101
Figure IPA0000322182480000111
Figure IPA0000322182480000121
Figure IPA0000322182480000131
Figure IPA0000322182480000141
Figure IPA0000322182480000151
Figure IPA0000322182480000161
Figure IPA0000322182480000171
Figure IPA0000322182480000181
Figure IPA0000322182480000191
Figure IPA0000322182480000201
Figure IPA0000322182480000211
Figure IPA0000322182480000221
Figure IPA0000322182480000231
Figure IPA0000322182480000241
Figure IPA0000322182480000251
Figure IPA0000322182480000261
Figure IPA0000322182480000271
Figure IPA0000322182480000281
Figure IPA0000322182480000291
Figure IPA0000322182480000301
Figure IPA0000322182480000311
Figure IPA0000322182480000321
Figure IPA0000322182480000331
Figure IPA0000322182480000341
Figure IPA0000322182480000351
Figure IPA0000322182480000361
Figure IPA0000322182480000371
Figure IPA0000322182480000381
Figure IPA0000322182480000391
Figure IPA0000322182480000401
Figure IPA0000322182480000411
Figure IPA0000322182480000421
Figure IPA0000322182480000431
Figure IPA0000322182480000441
Figure IPA0000322182480000451

Claims (7)

1.用于对分层上皮干细胞进行分离并使其表观遗传学在培养的多次传代中稳定维持的成分确定培养基，所述培养基包含：基础培养基；以及ROCK(Rho激酶)抑制剂、促分裂生长因子、胰岛素或IGF、TrkA抑制剂和Oct4激活剂中的每一种，所述培养基包含VEGF抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或FGF10或FGF10激动剂中的至少一种，并且所述培养基任选地还包含TGFβ信号传导途径抑制剂和/或骨形态生成蛋白(BMP)拮抗剂，其中所述培养基在培养中支持分层上皮组织来源的干细胞的表观遗传稳定地生长和增殖。
2.权利要求1所述的成分确定培养基，其允许所述细胞以无饲养层方式传代并且还包含SYK抑制剂、LPA受体拮抗剂、GSK3抑制剂和CK2抑制剂。
3.权利要求1或2所述的成分确定培养基，其中所述上皮干细胞与胞外基质或另外的生物基质接触。
4.权利要求1至3中任一项所述的成分确定培养基，其中所述干细胞分离自从正常上皮组织获取的组织样品。
5.权利要求1至4中任一项所述的成分确定培养基，其中所述干细胞分离自从病变上皮组织获取的组织样品，例如所述病变上皮组织来自炎性或自身免疫患者。
6.权利要求1至3中任一项所述的成分确定培养基，其中所述干细胞分离自从肿瘤获取的组织样品。
7.使用前述权利要求中任一项所述的成分确定培养基分离的克隆分层上皮干细胞。
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