KR102034121B1 - 간 오르가노이드, 그의 용도 및 이를 수득하기 위한 배양 방법 - Google Patents

간 오르가노이드, 그의 용도 및 이를 수득하기 위한 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간 오르가노이드, 그의 용도 및 이를 수득하는 방법에 관한 것이다.

Description

간 오르가노이드, 그의 용도 및 이를 수득하기 위한 배양 방법{LIVER ORGANOID, USES THEREOF AND CULTURE METHOD FOR OBTAINING THEM}
본 발명은 간 오르가노이드, 그의 용도 및 이를 수득하기 위한 방법에 관한 것이다.
간의 기본적인 구조 단위는 간소엽이다. 각각의 간소엽은 수출성 중심 정맥을 향해 방사상으로 퍼지는 동모양모세혈관이 열을 지어 늘어선 간세포들의 판으로 이루어진다. 간소엽은 대략 육각형이며 각각의 6 개의 꼭지점은 간삼조(간문맥, 담관, 및 간동맥)의 존재에 의해 구분된다. 간세포는 상기 간의 주요 실질 세포 유형이지만, 담관 세포(담관 내피 세포), 내피 세포, 동모양 내피 세포, 쿠퍼 세포, 천연 살해 세포 및 간 성상 세포가 협력하여 작용한다. 이러한 복잡한 구조는 간 기능에 중요하다.
간 줄기 세포의 존재는 논쟁의 여지가 있다. 한편으로, 몇몇 유형의 손상 시 상기 간의 조직 유지 및 간 재생은 줄기 세포에 의해 구동되지 않고 오히려 성숙 세포(간 세포 또는 담관 세포)의 분열에 의해 구동된다. 그러나, 간세포 증식이 억제된 간 손상 모델은 또한 상기 기관이 손상에 반응하여 재생하는 능력을 나타내었다. 이는 상기 간을 조건적(facultative) 줄기 세포를 갖는 기관으로서 간주할 수 있음을 암시한다.
지금까지, 간 배양물은 간세포로부터 유도되었거나 또는 배아 줄기 세포(ES) 또는 유도 만능 줄기 세포의 분화에 의해 유도되었으며, 보다 긴 기간 동안 확대 및 자가분열하지 않는다.
최근에, 소장에서, 파네스 세포 사이에 산재한 작은 세포들인 순환하는 소낭 기재 원주(CBC) 세포에서 특이적으로 발현하는 유전자 Lgr5가 동정되었다(문헌[Barker et al., 2007. Nature 449:1003-1007]). GFP/타목시펜-유도성 Cre 리콤비나제 카세트가 상기 Lgr5 유전자 좌에 통합된 마우스를 사용하여, 계통 추적에 의해 상기 Lgr5+ CBC 세포가, Cre 유도 후 14 개월째에 평가할 때조차도 상피의 모든 세포 유형을 생성시키는 다능 줄기 세포를 구성함을 입증하였다.
최근에, 또한 Lgr5 외에, Lgr4가 아닌 Lgr6이 또한 성체 줄기 세포에 대한 독특한 마커임이 발견되었다. Lgr5가 뇌, 신장, 간, 망막, 위, 장, 췌장, 유방, 모낭, 난소, 부신수질 및 피부의 줄기 세포에서 발현되는 반면, Lgr6은 뇌, 폐, 유방, 모낭 및 피부의 줄기 세포에서 발현된다.
본 발명에서 우리는 성체 간 선조세포를 배양하고, 보다 영속하여 유지되고 간세포 및 담관 세포 계통 모두로 분화할 수 있으며 단리된 간 단편의 기본적인 생리기능을 보존하는 간 오르가노이드를 수득하는 방법을 개발하였다.
본 발명에서 우리는 성체 간 선조세포를 배양하고, 보다 영속하여 유지되고 간세포 및 담관 세포 계통 모두로 분화할 수 있으며 단리된 간 단편의 기본적인 생리기능을 보존하는 간 오르가노이드를 수득하는 방법을 제공한다.
본 발명은 간 단편 또는 간 오르가노이드를 수득 및/또는 배양하기 위한 방법으로,
상피 줄기 세포, 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편을 배지의 존재 하에서 세포외 기질과 접촉시켜 배양함을 포함하며, 상기 배지가 유사분열 촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자(EGF), FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF, 바람직하게는 FGF10, 니코틴아미드, 및 바람직하게는 Wnt 작용물질, 바람직하게는 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 또는 R-스폰딘 4가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하는 방법을 제공한다.
발명의 요약
본 발명은 세포를 제 1 "확대" 배양 배지(또한 본 발명에서 EM이라 칭한다)에서 배양하고, 바람직하게는 이어서 상기 세포를 제 2 "분화" 배양 배지(또한 본 발명에서 DM이라 칭한다)에서 배양함을 포함하는, 간 오르가노이드의 수득 방법을 제공한다.
상기 간 오르가노이드를, 단일 Lgr5+ 줄기 세포, 하나 이상의 Lgr5+ 줄기 세포를 포함하는 세포 집단, 및/또는 간 단편을 배양함으로서 수득할 수 있다. 본 발명에서, "배양 배지 중/의 세포"를 언급하는 경우, 그 의미는 단일 Lgr5+ 줄기 세포, 하나 이상의 Lgr5+ 줄기 세포를 포함하는 세포 집단, 및/또는 간 단편을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 확대 배지는 EGF, Wnt 작용물질, FGF, 및 니코틴아미드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 Wnt 작용물질은 R-스폰딘 1이며 따라서 상기 확대 배지를 "ERFNic"라 칭한다. 특히 바람직한 확대 배지는 HGF를 추가로 포함하며 "ERFHNic"라 칭한다.
하나의 실시태양에서, 상기 분화 배지는 EGF, TGF-베타 억제제, FGF 및 노치(Notch) 억제제를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 TGF-베타 억제제는 A83-01이고/이거나 상기 노치 억제제는 DAPT이다. 상기 분화 배지를 본 발명에서 "EAFD"라 칭하며 이는 본 발명의 바람직한 분화 배지이다. FGF를 HGF로 임의로 대체하거나 또는 한편으로 FGF 및 HGF가 모두 상기 분화 배지 중에 존재하거나 존재하지 않을 수도 있다. 덱사메타손을 또한 첨가할 수도 있다.
바람직한 실시태양에서, 상기 세포를 처음에 Wnt 및 노긴(Noggin)을 추가로 함유하는 확대 배지, 예를 들어 EGF, 노긴, R-스폰딘 및 Wnt, 및 임의로 FGF, HGF 및 니코틴아미드를 함유하는 "ENRW" 배지에서 배양할 수 있다. 본 발명자들은 상기 배지가 처음 몇 일간 세포의 초기 확대를 자극하기에 최적임을 발견하였다. 따라서, 상기 제 1 확대 배지를 때때로 본 발명에서 EM1이라 칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 Wnt 및 노긴을 대략 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 이상, 예를 들어 2주, 1 개월, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 이상, 14 개월 이상 후에 제거한다. 이어서 상기 세포를 상술한 바와 같이 Wnt 또는 노긴을 함유하지 않는 본 발명의 확대 배지에서 확대시킬 수 있다. 이러한 제 2 확대 배지를 때때로 본 발명에서 EM2라 칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포를 대략 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 이상의 기간, 예를 들어 3, 4, 5, 10, 20 주 이상 동안 EM2에서 배양한다. 이어서 상기 배양 배지를 상술한 바와 같이 TGF-베타 억제제 및 노치 억제제를 함유하는 최적화된 분화 배지로 교환할 수 있다. 전형적으로, 상기 분화 배지는 Wnt 작용물질, R-스폰딘 또는 니코틴아미드를 함유하지 않는다. 이는 성숙한 간세포 및 담관 세포로의 상기 세포의 분화를 촉진한다. 이들 세포는 인간 또는 동물에의 이식에 적합하다.
본 발명은 또한 간 오르가노이드를 제공한다. 본 출원은 간 오르가노이드가 생체 외에서 증식되었음을 처음으로 개시한다.
도 1은 간 오르가노이드 성장 인자 요건을 나타낸다.
도 2는 간 오르가노이드의 형태를 나타낸다.
도 3은 간 배양물 중의 Wnt 신호전달을 나타낸다.
도 4는 간 분화 마커의 발현을 나타낸다.
도 5는 간 단세포 배양물을 나타낸다.
도 6은 간 배양물의 미세배열 분석을 나타낸다.
도 7은 마우스 간 오르가노이드 배양물이 장기간 배양 후 안정한 염색체 분석을 보임을 나타낸다.
도 8은 보충 인자 FGF10, HGF 및 니코틴아미드; 성장 및 분화에 대한 영향을 나타낸다.
도 9는 3 개의 상이한 간 배양 조건으로부터의 세포 및 성체 간 조직에서 상이한 간세포 및 담관세포 특이적 전사 인자의 정량분석을 나타내는 표를 나타낸다.
도 10은 분화 프로토콜을 나타낸다.
도 11은 ERFHNic 배양 조건 하에서 인간-유래한 간 배양물을 나타낸다.
도 12는 생리학적 조건 하에서 또는 손상 후 재생 중 Wnt 신호전달 자극에 대한 간 반응을 나타낸다.
도 13은 간 손상-재생 모델에 따른 Lgr5 상향조절을 나타낸다.
도 14는 K19의 단리된 도관 염색을 나타낸다.
도 15는 성장 인자 요건을 나타낸다.
도 16은 분화 조건 하에서 마우스 간 오르가노이드의 유전자 발현 프로파일이 성체 및 신생 간 프로파일을 닮음을 나타낸다.
도 17은 간 질환 마우스 모델 내로의 세포 이식을 나타낸다.
도 18은 마우스 간 특징 유전자를 나타낸다.
도 19는 인간 간 특징 유전자를 나타낸다.
첫 번째 태양에서, 본 발명은 간 단편 또는 간 오르가노이드를 수득 및/또는 배양하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
상피 줄기 세포, 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편을 배지의 존재 하에서 세포외 기질과 접촉시켜 배양함을 포함하며, 상기 배지는 유사분열 촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF, 바람직하게는 FGF10, 니코틴아미드, 및 바람직하게는 Wnt 작용물질, 바람직하게는 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 또는 R-스폰딘 4 및/또는 Wnt-3a가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함한다. 바람직하게는, HGF를 또한 첨가한다.
예를 들어, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 간 단편 또는 간 오르가노이드를 수득 및/또는 배양하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은
상피 줄기 세포, 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편을 배지의 존재 하에서 세포외 기질과 접촉시켜 배양함을 포함하며, 상기 배지는 BMP 억제제, Wnt 작용물질, 유사분열 촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF, 바람직하게는 FGF10 및 HGF, 가스트린, 니코틴아미드, B27, N2 및 N-아세틸시스테인이 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명의 방법이 분화되지 않은 표현형 및 자기유지 능력을 유지하는 줄기 세포의 존재를 보존하면서, 상피 줄기 세포, 및/또는 상기 줄기 세포를 포함하는 간으로부터 단리된 단편의 배양을 허용함을 발견하였다. 훨씬 더 놀랍게도 본 발명의 방법은 줄기 세포 니치의 부재 하에서 단일의 단리된 상피 줄기 세포의 간 오르가노이드로의 성장을 허용함이 관찰되었다.
줄기 세포는 성인 인간 및 마우스의 많은 기관들에서 발견된다. 개별적인 조직 중 성체 줄기 세포의 정확한 특징에 있어서 큰 변동이 있을 수도 있지만, 성체 줄기 세포는 적어도 하기의 특징들을 공유한다: 상기 세포는 분화되지 않은 표현형을 유지하고; 상기 세포의 자손은 적절한 조직 중에 존재하는 모든 계통을 향해 분화할 수 있으며; 상기 세포는 생애 전체를 통해 자기유지 능력을 유지하고; 상기 세포는 손상 후 적절한 조직을 재생시킬 수 있다. 줄기 세포는 상기 줄기 세포 집단의 유지에 적합한 세포-세포 접촉 및 신호를 공급하는 분화된 위치인 줄기 세포 니치 중에 존재한다.
상피 줄기 세포는 상피를 구성하는 독특한 세포 유형들을 형성할 수 있다. 일부 상피, 예를 들어 피부 또는 장은 빠른 세포 턴오버를 보이며, 이는 거주하는 줄기 세포가 연속적으로 증식함에 틀림없음을 나타낸다. 다른 상피, 예를 들어 간 또는 췌장은 통상적인 조건 하에서 매우 느린 턴오버를 나타낸다.
간 상피 줄기 세포의 단리를 다수의 상이한 프로토콜에 의해 수행할 수 있다. 본 발명자들은 임의의 특정한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발명에서는 조직 손상 시 간 재생에 기여하는 줄기 세포의 집단이 간 내에 존재함을 가정한다. 상기 손상-반응성 재생에 기여하는 세포 집단은 활성화 시 마커 Lgr5를 발현하는 것으로 생각된다.
Lgr5-LacZ 녹-인(knock-in) 마우스에게 간독성 화합물 CCl4를 주사하여 간 손상을 시뮬레이션함으로써, 본 발명자들은 간 손상이 활성 재생 부위에서 상기 간의 Lgr5 발현을 유도함을 처음으로 입증하였다(실시예 4 참조). 본 발명자들은 또한 Wnt 작용물질 R-스폰딘의 주사가 간 담관에서 Wnt 신호전달 발현의 상향조절을 유발함을 입증하였다. 본 발명자들은 임의의 특정한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발명에서 재생 줄기 세포/선조세포를 간 손상 후 Wnt 신호전달에 의해 활성화시킬 수 있음을 가정한다. 이어서 상기 Lgr5 양성 세포를 필요한 경우, 본 발명에 개시된 바와 같이, 상기 간/간 단편으로부터 단리할 수 있다. 따라서 본 발명은, 간 손상을 유도하거나 또는 예를 들어 R-스폰딘에 의해 Wnt 신호전달을 자극함을 포함하는, 간으로부터 Lgr5+ 세포를 수득/단리하는 방법을 제공한다. 이는 일부 실시태양에서 Lgr5+ 세포가 시험관 내에서 간 오르가노이드를 수득하기 위한 출발 점이기 때문에 유용하다(본 발명의 배양 배지의 사용이 R-스폰딘과 같은 Wnt 작용물질의 첨가에 의해 Lgr5+ 세포의 생성을 허용하고 따라서 본 발명을 실시하기 위해서 간으로부터 Lgr5+ 세포를 수득하는 것이 필수적이지 않지만). 상기 방법에 의해 수득된 Lgr5+ 세포가 또한 제공된다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 세포는 바람직하게는 성상 세포의 마커, 예를 들어 SMA를 발현하지 않는다. 대신에, 상기와 같은 세포는 바람직하게는 하나 이상의 간 선조세포 마커 또는 줄기 세포 마커, 예를 들어 Sox9를 발현한다. 바람직하게는, 하나 이상의 간 선조세포 마커 또는 줄기 세포 마커, 예를 들어 Sox9의 발현은 성체 간에 비해 상기 세포에서 상향조절된다.
본 발명은 또한 Wnt 신호전달을 자극함을 포함하는, 간의 재생 방법을 제공한다. 상기와 같은 방법은 간 질환의 치료에 유용할 수 있다. 손상에 의해 또는 Wnt 신호전달을 자극함으로써 간 세포에서 Lgr5 발현을 유도하는 것을 생체 내에서, 단리된 간에서 생체 외에서, 또는 간 단편 또는 간 세포 집단에서 시험관 내에서 수행할 수 있다. Lgr5 발현의 유도를 생체 외 또는 시험관 내에서 수행하는 실시태양에서, 상기 Lgr5 양성 세포를 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어 주사 또는 이식에 의해 상기 세포가 필요한 환자에게 투여할 수도 있다. 일부 실시태양에서, 이식된 세포는 생체적합성 기질 중에 함유된다. 일부 실시태양에서, 상기 세포를 치료에 사용하기 전에 생체 외에서 확대시킨다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 상기 상피 줄기 세포를 간 단편 또는 간 담도, 보다 바람직하게는 담도 조직으로부터 단리한다.
담관 조직의 단리 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 담도를 본 발명에 포함된 실시예에 개시된 바와 같이 간으로부터 단리할 수 있다. 간단히, 성체 간 조직을 저온(4 내지 10 ℃) 배양 배지, 바람직하게는 어드밴스드(Advanced)-DMEM/F12(인비트로젠(Invitrogen))에서 세척하고 이어서 상기 조직을 대략 5 ㎜의 조각으로 자르고 저온 해리 완충제(DMEM 배지 중의 콜라게나제, 디스파제, FBS)로 추가 세척할 수 있다. 상기 조직 단편을 바람직하게는 약 37 ℃에서 약 2 시간 동안 상기 해리 완충제와 함께 배양한다. 이어서, 상기 조직 단편을 10 ㎖ 피펫으로 10 ㎖의 저온(4 내지 10 ℃) 단리 완충제에 격렬히 현탁할 수 있다. 죽은 세포를 함유하는 첫 번째 상등액을 바람직하게는 버리고 침전물을 바람직하게는 해리 완충제(예를 들어 10 내지 15 ㎖)로 현탁한다. 상기 조직 단편을 추가로 격렬히 현탁한 후에, 상등액에는 담도가 풍부하다. 담도를 함유하는 현탁액을 이렇게 하여 수득할 수 있으며 담도를 현미경 하에 수거하여 저온 배지(DMEM + 5 내지 10% FBS)에서 유지시킨다. 이러한 과정을 적어도 10 내지 20 담도/웰이 수거될 때까지 반복할 수 있다. 이어서, 상기 단리된 담도는 침전될 수도 있다. 단리된 담관을 바람직하게는 20 담도/웰의 대략적인 비로 50 ul의 매트리젤에 시딩한다.
짧은 기간 동안 합류로 증식하는 성숙한 간세포와 대조적으로, 본 발명에 따라 단리된 간 상피 줄기 세포는 죽기 전에 자가분열되고 무한 증식한다. 상기 세포의 자기분열 집단은 표면상에서 Lgr5를 발현할 수 있는 것들로 밝혀졌다. Lgr5 음성 세포는 자가분열하지 않는다. "자가분열"이란 용어는 본 발명의 세포의 원래 증식 및 분화 성질을 유지하면서 상기 세포가 자신을 번식하는 능력을 나타내는 것으로 이해해야 한다. 상기와 같은 세포는 분할에 의해 증식하여 클론을 형성하며, 상기 클론은 클론으로 추가로 분할되고, 따라서 외부 중재의 필요 없이, 보다 제한된 분화 능력을 갖는 세포로 진화하지 않고서, 상기 세포 집단의 크기를 확대시킨다.
바람직한 방법은 본 발명에 따른 간 줄기 세포가 그의 표면상에서 Lgr5 및/또는 Lgr6을 발현한다는 사실을 기본으로 하며; 이들 단백질은 큰 G 단백질-결합된 수용체(GPCR) 상과에 속한다(예를 들어 내용 전체가 본 발명에 인용된 WO2009/022907을 참조하시오). 상기 Lgr 상과는 리간드 결합에 중요한 큰 류신-풍부 엑토도메인을 갖는다는 것이 특이하다. 따라서 바람직한 방법은 상술한 바와 같이 상기 상피 조직으로부터 세포 현탁액을 제조하고, 상기 세포 현탁액을 Lgr5 및/또는 6 결합 화합물(예를 들어 항체)과 접촉시키고, 상기 Lgr5 및/또는 6 결합 화합물을 단리하고, 상기 결합 화합물로부터 줄기 세포를 단리함을 포함한다.
상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단일 세포 현탁액을 상기 단리된 담도로부터 기계적으로 생성시키는 것이 바람직하다. 이렇게 하여 기계적 파괴에 의해 생성된 작은 오르가노이드 단편을 바람직하게는 대략 1:6의 비로 분할한다. 필요한 경우, 상기와 같은 단편을 단시간 동안(단지 2 또는 3 분) 트립신 중에서 대략 1:2의 희석비로 배양할 수 있다. 이 단계에서 트립신으로 처리된 상피 줄기 세포는 다소 낮은 생존율을 제공하는 것으로 밝혀졌다, 즉 상기 세포를 개별적인 세포로 분할하는 경우, 오직 Lgr5를 발현하는 것들만이 생존한다. 이 분획은 다소 작다(전체 세포 집단의 대략 12%).
바람직한 Lgr5 및/또는 6 결합 화합물은 항체, 예를 들어 Lgr5 또는 Lgr6의 세포외 도메인을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 단클론 항체, 예를 들어 마우스 및 래트 단클론 항체를 포함한다(예를 들어 내용 전체가 본 발명에 인용된 WO2010/016766을 참조하시오). 상기와 같은 항체를 사용하여, Lgr5 및/또는 Lgr6-발현 줄기 세포를, 숙련가에게 명백한 바와 같이, 자기 비드의 도움으로 또는 형광-활성화된 세포 분류를 통해 단리할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여, 하나의 단일 Lgr5 및/또는 Lgr6 발현 세포를 단리하고 여기에 본 발명의 방법을 적용하는 것이 가능하다. 따라서 간 오르가노이드가 하나의 단일 세포로부터 유도될 수 있다.
줄기 세포 니치
단리된 줄기 세포를 바람직하게는 상기 줄기 세포가 천연으로 존재하는 세포 니치를 적어도 부분적으로 모방하는 미세 환경에서 배양한다. 이러한 세포 니치를, 생물물질, 예를 들어 줄기 세포 운명을 조절하는 핵심 조절 신호를 나타내는 기질, 스캐폴드, 및 배양 기질의 존재 하에서 상기 줄기 세포를 배양함으로써 모방할 수 있다. 상기와 같은 생물물질은 천연, 반-합성 및 합성 생물물질, 및/또는 이들의 혼합물을 포함한다. 스캐폴드는 2-차원 또는 3차원 네트워크를 제공한다. 상기와 같은 스캐폴드에 적합한 합성 물질은 다공성 고체, 나노섬유, 및 하이드로젤, 예를 들어 자립 펩타이드를 포함한 펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜 포스페이트, 폴리에틸렌 글리콜 퓨마레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리하이드록시에틸 메트아크릴레이트, 폴리셀룰로스 아세테이트, 및/또는 이들의 공-중합체로 구성된 하이드로젤 중에서 선택된 중합체를 포함한다(예를 들어 문헌[Saha et al., 2007. Curr Opin Chem Biol. 11(4):381-387]; [Saha et al., 2008. Biophysical Journal 95: 4426-4438]; [Little et al., 2008. Chem. Rev 108, 1787-1796]을 참조하시오). 숙련가에게 공지된 바와 같이, 상기 기계적 성질, 예를 들어 상기 스캐폴드의 탄성은 줄기 세포의 증식, 분화 및 이동에 영향을 미친다. 바람직한 스캐폴드는, 예를 들어 조직 재생 및/또는 상처 치유를 촉진하기 위해 환자에게 이식 후 천연 성분에 의해 대체되는 생분해성 (공)중합체를 포함한다. 더욱 또한 상기 스캐폴드가 환자에게 이식 후 면역원성 반응을 실질적으로 유발하지 않는 것이 바람직하다. 상기 스캐폴드에, 줄기 세포의 증식 및/또는 분화, 및/또는 이동에 필요한 신호를 제공하는 천연, 반-합성 또는 합성 리간드를 보충한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 리간드는 한정된 아미노산 단편을 포함한다. 상기 합성 중합체의 예는 플루로닉(Pluronic)(등록상표) F127 블록 공중합체 계면활성제(BASF), 및 에티소브(Ethisorb)(등록상표)(존슨 앤드 존슨(Johnson and Johnson))를 포함한다.
세포 니치는 상기 줄기 세포 및 주변 세포, 및 상기 니치 중의 세포에 의해 생성되는 세포외 기질(ECM)에 의해 부분적으로 결정된다. 본 발명의 바람직한 방법에서, 단리된 간 단편 또는 단리된 담도 또는 상피 줄기 세포를 ECM에 부착시킨다. ECM은 다양한 폴리사카라이드, 물, 엘라스틴 및 당단백질로 구성되며, 여기에서 상기 당단백질은 콜라겐, 엔탁틴(니도겐), 피브로넥틴, 및 라미닌을 포함한다. ECM은 결합 조직 세포에 의해 분비된다. 상이한 유형의 당단백질 및/또는 상이한 당단백질들의 조합을 포함하는 상이한 조성물을 포함하는 상이한 유형의 ECM이 공지되어 있다. 상기 ECM을, ECM-생산 세포, 예를 들어 섬유아세포를, 상기 세포의 제거 및 단리된 간 단편 또는 단리된 담도 또는 단리된 상피 줄기 세포의 첨가 전에, 용기에서 배양함으로써 제공할 수 있다. 세포외 기질-생산 세포의 예는 주로 콜라겐 및 프로테오글리칸을 생산하는 연골세포, 주로 IV형 콜라겐, 라미닌, 간질성 프로콜라겐, 및 피브로넥틴을 생산하는 섬유아세포, 및 주로 콜라겐(I, III 및 V형), 콘드로이친 설페이트 프로테오글리칸, 히아루론산, 피브로넥틴 및 테나신-C를 생산하는 결장 근섬유아세포이다. 한편으로, 상기 ECM을 상업적으로 제공한다. 상업적으로 입수할 수 있는 세포외 기질의 예는 세포외 기질 단백질(인비트로젠) 및 엔겔브레트-홀름-슈바름(Engelbreth-Holm-Swarm)(EHS) 마우스 육종 세포로부터의 기저막 제제(예를 들어 매트리젤(상표)(BD 바이오사이언스(Biosciences))이다. 합성 세포외 기질 물질, 예를 들어 프로넥틴(ProNectin)(시그마(Sigma) Z378666)을 사용할 수도 있다. 세포외 기질 물질들의 혼합물을 경우에 따라 사용할 수도 있다. 줄기 세포 배양을 위해 ECM을 사용하는 것은 줄기 세포의 장기 생존 및 분화되지 않은 줄기 세포의 연속된 존재를 증대시켰다. ECM의 부재 하에서, 줄기 세포 배양물은 더 오랜 기간 동안 배양될 수 없었으며 분화되지 않은 줄기 세포의 연속된 존재가 관찰되지 않았다. 또한, ECM의 존재는, ECM의 부재 하에서 배양될 수 없었던 3차원 조직 오르가노이드의 배양을 허용하였다. 상기 세포외 기질 물질을 통상적으로는 세포 배양 용기 상에 코팅할 것이나, (또한 또는 한편으로) 용액 중에서 공급할 수도 있다. 약 1 ㎎/㎖, 또는 약 1 ㎍/㎠ 내지 약 250 ㎍/㎠, 또는 약 1 ㎍/㎠ 내지 약 150 ㎍/㎠의 피브로넥틴 용액을 사용하여 세포 배양 용기를 코팅할 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포 배양 용기를 8 ㎍/㎠ 내지 125 ㎍/㎠의 피브로넥틴으로 코팅한다.
본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 ECM은 2 개 이상의 별개의 당단백질, 예를 들어 2 개의 상이한 유형의 콜라겐 또는 콜라겐과 라미닌을 포함한다. 상기 ECM은 합성 하이드로젤 세포외 기질 또는 천연 ECM일 수 있다. 더욱 바람직한 ECM은 라미닌, 엔탁틴 및 콜라겐 IV를 포함하는 매트리젤(상표)(BD 바이오사이언스)에 의해 제공된다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 다른 곳에 개시된 바와 같이, 혈청을 포함하거나, 또는 혈청이 없고/없거나 혈청-대체물이 없을 수도 있다. 배양 배지 및 세포 제조는 바람직하게는 생물학 제품에 대해 FDA에 의해 요구되고 제품 일관성을 보장하기 위한 기준과 일치하는 GMP 공정이다.
배양 배지
본 발명의 방법에 사용되는 세포 배양 배지는 본 발명에 제공된 제한이 가해진, 임의의 적합한 세포 배양 배지를 포함한다. 세포 배양 배지는 전형적으로는 배양된 세포의 유지를 지지하기 위해 필요한 다수의 성분들을 함유한다. 성분들의 적합한 조합은 하기의 명세를 고려하여 숙련가에 의해 쉽게 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 배양 배지는 일반적으로는 문헌 및 하기에 보다 상세히 개시되는 바와 같은 표준 세포 배양 성분, 예를 들어 아미노산, 비타민, 무기 염, 탄소 에너지원, 및 완충제를 포함하는 영양 용액일 것이다.
본 발명의 배양 배지는 통상적으로 탈이온화된 증류수 중에서 제형화될 것이다. 본 발명의 배양 배지를 전형적으로는 오염을 방지하기 위해, 예를 들어 자외선, 가열, 조사 또는 여과에 의해, 사용 전에 멸균시킬 것이다. 상기 배양 배지를 보관 또는 운반을 위해 동결시킬 수도 있다(예를 들어 -20 ℃ 또는 -80 ℃). 상기 배지는 오염을 방지하기 위해 하나 이상의 항생제를 함유할 수도 있다. 상기 배지는 ㎖당 0.1 내독소 단위 미만의 내독소 함량을 갖거나, 또는 ㎖당 0.05 내독소 단위 미만의 내독소 함량을 가질 수 있다. 상기 배양 배지의 내독소 함량을 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
바람직한 세포 배양 배지는, 세포를 5% 내지 10% CO2, 또는 5% 이상 10% 이하 CO2, 바람직하게는 5% CO2를 포함하는 분위기에서 배양하는 동안 카보네이트 기재 완충제에 의해 7.4의 pH(바람직하게는 pH 7.2 내지 7.6, 또는 7.2 이상 7.6 이하의 pH)로 완충되는 한정된 합성 배지이다.
숙련가는 통상적인 일반 지식으로부터 본 발명의 세포 배양 배지들 중 기본 배지로서 사용될 수 있는 배양 배지의 유형을 알 것이다. 잠재적으로 적합한 세포 배양 배지를 상업적으로 입수할 수 있으며, 여기에는 비제한적으로 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 녹아웃-DMEM(KO-DMEM), 글래스고우(Glasgow) 최소 필수 배지(G-MEM), 기본 배지 이글(BME), DMEM/햄스(Ham's) F12, 어드밴스드 DMEM/햄스 F12, 아이스코베(Iscove)의 변형된 둘베코 배지 및 최소 필수 배지(MEM), 햄스 F-10, 햄스 F-12, 배지 199 및 RPMI 1640 배지가 포함된다.
바람직한 세포 배양 배지는 글루타민, 인슐린, 페니실린/스트렙토마이신 및 트랜스페린이 보충된 DMEM/F12 및 RPMI 1640 중에서 선택된다. 추가의 바람직한 실시태양에서, 무 혈청 배양에 대해 최적화되고 인슐린을 이미 포함하는 어드밴스드 DMEM/F12 또는 어드밴스드 RPMI가 사용된다. 이 경우에, 상기 어드밴스드 DMEM/F12 또는 어드밴스드 RPMI 배지에 바람직하게는 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신을 보충한다.
일부 실시태양에서, 상기 기본 배지는 어드밴스드 DMEM F12, hepes, 페니실린/스트렙토마이신, 글루타민, N아세틸 시스테인, B27, N2 및 가스트린을 포함한다. 일부 실시태양에서, 배양을 N2 및 가스트린 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 기본 배지로 개시하지만, 이들은 나중에 회수된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, N2 및 가스트린 및 페니실린/스트렙토마이신이 본 발명의 EM1 배지 중에 존재하지만 EM2 또는 DM에는 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, N2 및 가스트린 및 페니실린/스트렙토마이신이 본 발명의 EM1 및 EM2 배지 중에 존재하지만 DM에는 존재하지 않는다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 기본 배지는 페니실린/스트렙토마이신, N2, B27, 글루타민 및 가스트린이 보충된 어드밴스드 DMEM/F12 또는 DMEM 변형 배지이다.
바람직한 실시태양에서, 상기 기본 배지는 가스트린을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 기본 배지는 NAc 및/또는 B27을 또한 포함한다.
더욱 또한 상기 세포 배양 배지에 정제된 천연, 반-합성 및/또는 합성 성장 인자를 보충하고 확실하지 않은 성분, 예를 들어 소 태아 혈청 또는 송아지 태아 혈청은 포함하지 않는 것이 바람직하다. 다양한 상이한 혈청 보충 제형들을 상업적으로 입수할 수 있으며 이는 숙련가에게 공지되어 있다. 혈청 교체를 사용하는 경우, 이를 통상적인 기법에 따라, 배지의 약 1 부피% 내지 약 30 부피%로 사용할 수 있다.
확대 배지(EM2):
본 발명의 하나의 태양에서, 유사분열 촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF, 바람직하게는 FGF10, 니코틴아미드, 및 바람직하게는 Wnt 작용물질, 바람직하게는 R-스폰딘 1이 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 또는 상기 배지로 이루어진 세포 배양 배지를 제공한다. 상기 배지를 EM2라 칭한다.
바람직하게는, 상기 Wnt 작용물질은 R-스폰딘 1이다. EGF, R-스폰딘 1, FGF 및 니코틴아미드를 포함하는 배지를 본 발명에서는 ERFNic라 칭한다.
일부 실시태양에서, 상기 EM2 배지는 노긴을 포함하지 않으며, 보다 바람직하게는 BMP-억제제를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 EM2 배지는 Wnt, 예를 들어 Wnt-3a를 포함하지 않는다.
일부 실시태양에서, FGF 이외에 HGF가 존재한다. FGF 이외에 HGF를 포함하는 바람직한 배지는 ERFHNic(EGF + R-스폰딘(바람직하게는 R-스폰딘 1) + FGF(바람직하게는 FGF10) + HGF + 니코틴아미드)이다. 본 발명자들은 상기 ERFHNic 배지가 세포의 장기간 확대에 최적의 배지임을 발견하였다. HGF의 부재 하에서, 세포는 3 개월이 넘는 기간 동안 배양물 중에서 생육 가능하게 남아있지 않았다. 더욱이, HGF의 부재 하에서, 10 회의 계대 배양 후에, 세포는 보다 낮은 증식 비율에 의해 입증되는 바와 같이 HGF의 존재 하에서 배양된 세포에 비해 성장 단점을 나타내었다. 특히, 15 회의 계대 배양 후에, 상기 세포는 HGF의 부재 하에서, HGF의 존재하에서와 동일한 속도의 비로 오르가노이드를 성장시키지 않았다. 따라서, HGF는 장기간 배양 동안 양호한 증식률을 유지하기 위해 필수적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 2 주 이상, 1 개월 이상, 2 개월 이상, 보다 바람직하게는 3 개월 이상, 4 개월 이상, 5 개월 이상, 6 개월 이상, 7 개월 이상, 8 개월 이상, 9 개월 이상, 10 개월 이상, 15 개월 이상, 20 개월 이상, 24 개월 이상, 25 개월 이상, 30 개월 이상, 예를 들어 3년 이상 동안 세포를 배양하기 위한 본 발명의 ERFHNic 배지의 용도를 제공한다. 실제로, 본 발명의 일부 실시태양은 세포의 대략 20 내지 30 회의 계대 배양을 위한 E2의 용도를 포함한다. 예를 들어 세포를 일반적으로는 1주일에 한 번, 20 내지 30 회 분할할 수 있다. 바람직하게는 상기 세포는 주당 약 4 배 또는 1 주일에 2 개 집단이 배가하는 속도로 확대될 것이다. 본 발명은 또한 10 회 이상, 예를 들어 11 회 이상, 12 회 이상, 15 회 이상, 20 회 이상, 25 회 이상, 30 회 이상, 40 회 이상, 50 회 이상, 60 회 이상, 또는 15 내지 35 회, 예를 들어 대략 20 내지 30 회의 계대 배양을 위해 세포를 배양하기 위한 본 발명의 ERFHNic 배지의 용도를 제공한다. 일부 실시태양에서, TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01이 상기 EM2 배지 중에 추가로 존재한다. 이는 인간 세포 또는 오르가노이드를 배양하는 경우 특히 유용하다. 일부 실시태양에서, 상기 A83-01은 400 내지 600 nM, 예를 들어 450 내지 550 nM, 470 내지 530 nM, 또는 대략 500 nM의 농도로 존재한다. TGF-베타 억제제가 EM2 중에 존재하는 실시태양에서, 노치 억제제가 바람직하게는 존재하지 않는다.
확대 배지(EM1):
하나의 태양에서, 본 발명은 EGF, BMP 억제제, R-스폰딘 및 Wnt가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 상기 배지로 이루어진 세포 배양 배지를 제공한다. 바람직하게는, 상기 BMP 억제제는 노긴이고 상기 EM1 배지를 "ENRW"(EGF, 노긴, R-스폰딘 및 Wnt)라 칭한다. 상기 배지를 EM1로서 칭한다. 본 발명자들은 Wnt 및 노긴을 함유하는 배지가 세포의 초기 확대를 자극하기에 이상적임을 발견하였다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 EM1 배지를 단지 1 회의 계대 배양 또는 1주일간 사용하지만 상기 배지가 세포에 유해하지 않으므로 대략 1 년 동안 사용할 수 있음이 또한 고려된다. 따라서, 일부 실시태양에서, EM1 배지를 0 내지 10일, 예를 들어 0 내지 7일, 0 내지 6일, 0 내지 5일, 0 내지 4일, 0 내지 3일, 0 내지 2일, 0 내지 1일간 세포를 배양하기 위해 사용하거나(여기에서 0일은 세포를 그의 기원 조직으로부터 단리한 날이고, 1일은 그 다음날이다) 또는 1 주일 이상, 예를 들어 2, 3, 4 주일 이상, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 이상에 사용한다. 일부 실시태양에서, 상기 EM1 배지를 오직 첫 번째 날 동안만 또는 배양의 처음 2일 동안만 사용한다. 일부 실시태양에서, EM1 배지를 1 회 이상의 계대 배양, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 회 이상의 계대 배양, 예를 들어 20 내지 30 회의 계대 배양에 사용한다. 일부 실시태양에서, 상기 EM1 배지를 최적의 성장을 겸비하지 않는 동결 단계 또는 배지 또는 온도 교환을 수반하는 임의의 다른 운반 단계에 후속으로 사용한다.
상기 EM1 배지에 FGF, HGF, 니코틴아미드, 가스트린, B27, N-아세틸시스테인 및 N2로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물들 중 하나 이상을 보충한다. 상기 배양을 동결된 모액 또는 단일 세포로부터 출발하는 경우에, 상기 EM1 배지에 바람직하게는 ROCK 억제제를 보충한다. Y27632는 본 발명에 사용하기에 바람직한 ROCK 억제제이다.
따라서, 하나의 실시태양에서, 유사분열 촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF, 바람직하게는 FGF10 및 HGF,
가스트린, 니코틴아미드, B27, N2 및 N-아세틸시스테인, 및 바람직하게는;
BMP 억제제, 바람직하게는 노긴; 및
Wnt 작용물질, 바람직하게는 R-스폰딘 1 및/또는 Wnt-3a
가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 상기 배지로 이루어지는 세포 배양 배지를 제공한다.
B27(인비트로젠), N-아세틸시스테인(시그마) 및 N2(인비트로젠), 가스트린(시그마) 및 니코틴아미드(시그마)를 또한 상기 정의한 배지에 첨가하며 이들은 상기 세포의 증식을 자극하는 것으로 여겨진다. 본 발명과 관련하여, 니코틴아미드를 또한 본 발명에서 "Nic"라 칭한다.
'N2 보충물'을 인비트로젠(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재); www.invitrogen.com; 카탈로그 번호 17502-048; 및 PAA 레보라토리즈 GmbH(오스트리아 Pasching 소재); www.paa.com; 카탈로그 번호 F005-004; 보텐스타인 & 사토(Bottenstein & Sato)(PNAS, 76(1):514-517, 1979)로부터 입수할 수 있다. N2 보충물은 PAA 레보라토리즈 GmbH에 의해, 500 ㎍/㎖의 인간 트랜스페린, 500 ㎍/㎖의 소 인슐린, 0.63 ㎍/㎖의 프로제스테론, 1611 ㎍/㎖의 푸트레신 및 0.52 ㎍/㎖의 나트륨 셀레나이트를 함유하는 100x 액체농축물로서 공급된다. N2 보충물을 농축물로서 배양 배지에 첨가하거나 또는 배양 배지에 첨가하기 전에 희석할 수도 있다. 상기 보충물을 1x 최종 농도로 또는 다른 최종 농도로 사용할 수도 있다. N2 보충물의 사용은 트랜스페린, 인슐린, 프로제스테론, 푸트레신 및 나트륨 셀레나이트를 본 발명의 배양 배지에 혼입시키는 편리한 방법이다.
'B27 보충물'(인비트로젠(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재); www.invitrogen.com; 현재 카탈로그 번호 17504-044; 및 PAA 레보라토리즈 GmbH(오스트리아 Pasching 소재); www.paa.com; 카탈로그 번호 F01-002; 문헌[Brewer et al., J Neurosci Res., 35(5):567-76, 1993]로부터 입수할 수 있다)을 사용하여 비오틴, 콜레스테롤, 리놀레산, 리놀렌산, 프로제스테론, 푸트레신, 레티놀, 레티닐 아세테이트, 나트륨 셀레나이트, 트라이-요오도티로닌(T3), DL-알파 토코페롤(비타민 E), 알부민, 인슐린 및 트랜스페린을 포함하는 배양 배지를 제형화할 수 있다. B27 보충물은 PAA 레보라토리즈 GmbH에 의해, 다른 성분들 중에서도 비오틴, 콜레스테롤, 리놀레산, 리놀렌산, 프로제스테론, 푸트레신, 레티놀, 레티닐 아세테이트, 나트륨 셀레나이트, 트라이-요오도티로닌(T3), DL-알파 토코페롤(비타민 E), 알부민, 인슐린 및 트랜스페린을 함유하는 액체 50x 농축물로서 공급된다. 이들 성분 중에서 적어도 리놀렌산, 레티놀, 레티닐 아세테이트 및 트라이-요오도티로닌(T3)은 핵 호르몬 수용체 작용물질이다. B27 보충물을 농축물로서 배양 배지에 첨가하거나 또는 배양 배지에 첨가하기 전에 희석할 수도 있다. 상기 보충물을 1x 최종 농도로 또는 다른 최종 농도로 사용할 수도 있다. B27 보충물의 사용은 비오틴, 콜레스테롤, 리놀레산, 리놀렌산, 프로제스테론, 푸트레신, 레티놀, 레티닐 아세테이트, 나트륨 셀레나이트, 트라이-요오도티로닌(T3), DL-알파 토코페롤(비타민 E), 알부민, 인슐린 및 트랜스페린을 본 발명의 배양 배지에 혼입시키는 편리한 방법이다.
BMP 억제제
상기 기본 배양 배지에 바람직하게 첨가되는 성분은 BMP 억제제이다. BMP는 이량체성 리간드로서 2 개의 상이한 수용체 세린/쓰레오닌 키나제, 유형 I 및 유형 II 수용체로 이루어지는 수용체 복합체에 결합한다. 상기 유형 II 수용체는 상기 유형 I 수용체를 인산화하여, 상기 수용체 키나제를 활성화시킨다. 상기 유형 I 수용체는 특이적인 수용체 기질(SMAD)을 후속으로 인산화하여, 신호 전달 경로를 생성시켜 전사 활성을 유도한다.
BMP 억제제를 BMP 분자에 결합하여 복합체를 형성하는 작용제로서 정의하며, 여기에서 상기 BMP 활성은 예를 들어 상기 BMP 분자의 BMP 수용체에의 결합을 방지하거나 억제함으로써 중화된다. 한편으로, 상기 억제제는 길항물질 또는 역 작용물질로서 작용하는 작용제이다. 이러한 유형의 억제제는 BMP 수용체와 결합하고 상기 수용체에 대한 BMP의 결합을 방지한다. 상기 후자 작용제의 예는, BMP 수용체와 결합하고 항체-결합된 수용체에의 BMP의 결합을 방지하는 항체이다.
BMP 억제제를 상기 배지에, 세포 중의 BMP-의존성 활성을, 동일한 세포 유형에서 평가 시, 상기 억제제 부재 하의 BMP 활성 수준에 비해 90% 이하, 보다 바람직하게는 80% 이하, 보다 바람직하게는 70% 이하, 보다 바람직하게는 50% 이하, 보다 바람직하게는 30% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 0% 까지 억제하기에 유효한 양으로 첨가할 수 있다. 숙련가에게 공지된 바와 같이, BMP 활성을, 예를 들어 문헌[Zilberberg et al., 2007. BMC Cell Biol. 8:41]에 예시된 바와 같이, BMP의 전사 활성을 측정함으로써 측정할 수 있다.
천연 BMP-결합 단백질의 여러 부류, 예를 들어 노긴(페프로테크(Peprotech)), 코르딘 및 코르딘 도메인을 포함하는 코르딘-유사 단백질(R&D 시스템스(systems)), 폴리스타틴 및 폴리스타틴 도메인을 포함하는 폴리스타틴-관련된 단백질(R&D 시스템스), DAN 및 DAN 시스테인-노트 도메인을 포함하는 DAN-유사 단백질(R&D 시스템스), 스클레로스틴/SOST(R&D 시스템스), 데코린(R&D 시스템스), 및 알파-2 마크로글로불린(R&D 시스템스)이 공지되어 있다.
본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 BMP 억제제는 노긴, DAN, 및 써베루스(Cerberus) 및 그렘린(Gremlin)을 포함하는 DAN-유사 단백질(R&D 시스템스) 중에서 선택된다. 이들 확산성 단백질은 다양한 정도의 친화성으로 BMP 리간드에 결합할 수 있으며 신호전달 수용체로의 그들의 접근을 억제할 수 있다. 이들 BMP 억제제들 중 어느 하나의 기본 배양 배지에의 첨가는 줄기 세포의 손실을 방지한다.
바람직한 BMP 억제제는 노긴이다. 본 발명의 배양 배지와 관련하여, 노긴을 또한 본 발명에서 "N"이라 칭한다. 노긴을 바람직하게는 상기 기본 배양 배지에 10 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 20 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 50 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 100 ng/㎖ 이상의 농도로 첨가한다. 훨씬 더 바람직한 농도는 대략 100 ng/㎖ 또는 정확히 100 ng/㎖이다. 줄기 세포의 배양 중에, 상기 BMP 억제제를 필요에 따라, 예를 들어 매일 또는 이틀마다 상기 배양 배지에 첨가할 수도 있다. 상기 BMP 억제제를 바람직하게는 상기 배양 배지에 이틀마다 첨가한다. 상기 배양 배지를 필요에 따라, 예를 들어 매일 또는 이틀마다 재보충할 수도 있지만, 바람직하게는 4일마다 재보충한다.
Wnt 작용물질
상기 기본 배양 배지에 첨가할 수 있는 추가의 성분은 Wnt 작용물질이다. 본 발명의 배양 배지와 관련하여, Wnt 작용물질을 또한 본 발명에서 "W"라 칭한다. 상기 Wnt 신호전달 경로는, Wnt 단백질이 곱슬곱슬한(Frizzled) 수용체 과 구성원의 세포-표면 수용체에 결합할 때 발생하는 일련의 사건들에 의해 정의된다. 이는 세포내 β-카테닌을 분해하는 액신, GSK-3 및 단백질 APC를 포함하는 단백질들의 복합체를 억제하는 부스스한(Dishevelled) 과의 단백질을 활성화시킨다. 상기 생성되는 농축된 핵 β-카테닌은 TCF/LEF 과 전사 인자들에 의해 전사를 증대시킨다.
Wnt 작용물질은 세포에서 TCF/LEF-매개된 전사를 활성화하는 작용제로서 정의된다. 따라서 Wnt 작용물질은 상기 Wnt 과 단백질을 모두 포함하는 곱슬곱슬한 수용체 과 구성원과 결합하여 상기 구성원을 활성화하는 진정한 Wnt 작용물질, 세포내 β-카테닌 분해의 억제제, 및 TCF/LEF의 활성화제 중에서 선택된다. 상기 Wnt 작용물질을 상기 배지에 세포에서의 Wnt 활성을, 동일한 세포 유형에서 평가 시, 상기 분자 부재 하의 Wnt 활성 수준에 비해 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 100% 이상까지 자극하기에 유효한 양으로 첨가한다. 숙련가에게 공지된 바와 같이, Wnt 활성을, 예를 들어 pTOPFLASH 및 pFOPFLASH Tcf 루시페라제 리포터 구조물(문헌[Korinek et al., 1997. Science 275:1784-1787])에 의해, Wnt의 전사 활성을 측정함으로써 측정할 수 있다.
Wnt 작용물질은 Wnt-1/Int-1; Wnt-2/Irp (Int-1-관련된 단백질); Wnt-2b/13; Wnt-3/Int-4; Wnt-3a (R&D 시스템스); Wnt-4; Wnt-5a; Wnt-5b; Wnt-6 (문헌[Kirikoshi H et al. 2001. Biochem Biophys Res Com 283: 798-805]; Wnt-7a (R&D 시스템스); Wnt-7b; Wnt-8a/8d; Wnt-8b; Wnt-9a/14; Wnt-9b/14b/15; Wnt-10a; Wnt-10b/12; Wnt-11; 및 Wnt-16을 포함한 분비된 당단백질을 포함할 수 있다. 인간 Wnt 단백질에 대한 개관은 문헌["THE WNT FAMILY OF SECRETED PROTEINS", R&D Systems Catalog, 2004]에 제공되어 있다.
추가의 Wnt 작용물질은 분비된 단백질의 R-스폰딘 과를 포함하며, 이는 Wnt 신호전달 경로의 활성화 및 조절에 관련되고 4 개의 구성원(R-스폰딘 1(NU206, 미국 캘리포니아주 산 카를로스 누벨로 소재), R-스폰딘 2(R&D 시스템스), R-스폰딘 3, 및 R-스폰딘 4); 및 노린(또한 노리병 단백질 또는 NDP라 칭한다)(R&D systems)으로 구성되며, 높은 친화성으로 상기 곱슬곱슬한-4 수용체에 결합하고 상기 Wnt 신호전달 경로의 활성화를 유도한다는 점에서 Wnt 단백질처럼 작용하는 분비된 조절 단백질이다(문헌[Kestutis Planutis et al. (2007) BMC Cell Biol. 8: 12]).
R-스폰딘의 활성을 모방하는 화합물들을 본 발명의 Wnt 작용물질로서 사용할 수 있다. 최근에 R-스폰딘이 Lgr5와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, Lgr5 작용물질, 예를 들어 작용성 항-Lgr5 항체가 본 발명에 사용될 수 있는 Wnt 작용물질의 예이다.
본 발명의 배양 배지와 관련하여, R-스폰딘을 또한 본 발명에서 "R"이라 칭한다.
상기 Wnt 신호전달 경로의 소-분자 작용물질인 아미노피리미딘 유도체가 최근에 동정되었으며, 이는 또한 Wnt 작용물질로서 명백히 포함된다(문헌[Liu et al. (2005) Angew Chem Int Ed Engl. 44, 1987-90]).
공지된 GSK-억제제는 작은-간섭 RNA(siRNA; 셀 시그널링(Cell Signaling)), 리튬(시그마), 켄파울론(문헌[Biomol International; Leost, M. et al. (2000) Eur. J. Biochem. 267, 5983-5994]), 6-브로모인디루빈-30-아세톡심(문헌[Meijer, L. et al. (2003) Chem. Biol. 10, 1255-1266]), SB 216763 및 SB 415286(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 및 FRAT-과 구성원, 및 GSK-3과 액신의 상호작용을 방지하는 FRAT-유도된 펩타이드를 포함한다. 개관이 문헌[Meijer et al., (2004) Trends in Pharmacological Sciences 25, 471-480](본 발명에 참고로 인용된다)에 의해 제공된다. GSK-3 억제 수준을 측정하기 위한 방법 및 분석은 숙련가에게 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Liao et al 2004, Endocrinology, 145(6): 2941-9]에 개시된 바와 같은 방법 및 분석을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 Wnt 작용물질은 Wnt 과 구성원, R-스폰딘 1 내지 4(예를 들어 R-스폰딘 1 또는 R-스폰딘 4), 노린, 및 GSK-억제제 중 하나 이상으로부터 선택된다. 본 발명자들에 의해 상기 기본 배양 배지에의 하나 이상의 Wnt 작용물질의 첨가가 간 상피 줄기 세포 또는 단리된 담도 또는 단리된 간 단편의 증식에 중요한 것으로 밝혀졌다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 Wnt 작용물질은 R-스폰딘 1을 포함하거나 상기로 이루어진다. R-스폰딘 1을 바람직하게는 200 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 300 ng/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 500 ng/㎖ 이상의 농도로 상기 기본 배양 배지에 첨가한다. R-스폰딘 1의 훨씬 더 바람직한 농도는 대략 500 ng/㎖ 또는 정확히 500 ng/㎖이다. 줄기 세포의 배양 중에, 상기 Wnt 과 구성원을 필요에 따라, 예를 들어 매일 또는 이틀마다 상기 배양 배지에 첨가할 수도 있다. 상기 Wnt 과 구성원을 바람직하게는 상기 배양 배지에 이틀마다 첨가한다. 상기 배양 배지를 필요에 따라, 예를 들어 매일 또는 이틀마다 재보충할 수도 있지만, 바람직하게는 4일마다 재보충한다.
바람직한 실시태양에서, Wnt 작용물질은 R-스폰딘, Wnt-3a 및 Wnt-6으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는, R-스폰딘 및 Wnt-3a를 모두 Wnt 작용물질로서 사용한다. 이러한 조합이 특히 바람직한데, 그 이유는 상기 조합이 놀랍게도 오르가노이드 형성에 상승효과를 갖기 때문이다. 바람직한 농도는 R-스폰딘의 경우 1 내지 500 ng/㎖, 예를 들어 1 내지 10 ng/㎖, 10 내지 100 ng/㎖, 1 내지 50 ng/㎖, 10 내지 200 ng/㎖, 200 내지 500 ng/㎖, 30 ng/㎖이고, Wnt3a의 경우 100 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖, 예를 들어 100 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖이다.
Wnt 작용물질은 바람직하게는 Wnt 리간드, 예를 들어 Wnt3a이고, 배양 배지에 새로 첨가할 수도 있다. 한편으로, Wnt 리간드를 형질감염에 의해 세포주에서 발현시키거나 또는 세포주를 상기 Wnt 리간드를 발현하는 적합한 발현 구조물로 감염시킨다. 상기 세포주를 배양하고 상기 분비된 Wnt 리간드를 포함하는 배양 배지를 적합한 시간 간격으로 수확한다. 예를 들어, 세포는 합류에 도달하자마자 Wnt3a를 생산하고 증식을 멈출 것이다. 형질감염되지 않거나 상기 발현 구조물로 감염되지 않은 세포로부터의 배양 배지를 대조용으로서 사용한다. 상기 처리된 배지를 수확하고 예를 들어 Wnt3a와 같은 Wnt 작용물질의 존재를 시험하기 위해 TCF 반응 요소에 의해 루시페라제 발현이 조절되는 분석에서 시험한다(문헌[Korinek et al., 1997. Science 275:1784-1787]). 상기 배지를 배양물에 사용시 희석하여 조직을 재생시킨다. 숙련가에게 공지된 바와 같이, Wnt 리간드의 과잉 첨가는 때때로 너무 적은 Wnt 리간드의 첨가만큼 배양물에 유해하다. 따라서, 상기 처리된 배지의 실제 희석은 상기 시험에서 측정되는 Wnt 리간드의 양에 따라 변할 것이다.
유사분열 촉진 성장 인자
상기 기본 배양 배지에 첨가되는 더욱 추가의 성분은 상피 성장 인자(EGF) (바람직하게는 페프로테크로부터), FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 섬유아세포 성장 인자(FGF), 및 간세포 성장 인자(HGF)(또한 바람직하게는 페프로테크로부터)의 그룹으로부터 선택된 유사분열 촉진 성장 인자들의 조합이다. FGFR2(FGF 수용체) 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF는 바람직하게는 FGF4, FGF7 또는 FGF10(바람직하게는 페프로테크로부터), 가장 바람직하게는 FGF10이다. 바람직하게는 EGF, FGF 및 HGF의 3 개 모두를 사용한다. 본 발명의 배양 배지와 관련하여, 본 발명에서 EGF를 또한 "E"로서 칭하며, FGF를 또한 "F"라 칭하고 HGF를 또한 "H"라 칭한다. EGF는 다양한 배양된 외배엽 및 중배엽 세포에 대한 효능 있는 유사분열 촉진 인자이며 생체 내 및 시험관 내에서 특정 종 및 세포 배양물 중의 일부 섬유아세포의 분화에 중대한 영향을 미친다. 상기 EGF 전구체가 단백질 분해에 의해 절단되어 세포를 자극하는 53-아미노산 펩타이드 호르몬을 생성시키는 막-결합된 분자로서 존재한다. EGF는 혈장막 위치한 EGF 수용체에 결합함으로써 표적 세포에서 그의 효과를 발휘한다. 상기 EGF 수용체는 막통과 단백질 타이로신 키나제이다. 상기 수용체에의 EGF의 결합은 상기 키나제의 활성화 및 후속으로 수용체 자동인산화를 야기한다. 상기 자동인산화는 상기 수용체와 그의 기질과의 상호작용에 필수적이다. EGF에 의해 활성화된 신호 전달 경로는 포스파티딜이노시톨 경로를 포함하여, 단백질 키나제 C의 활성화를 유도하고 세포내 Ca2+ 농도를 증가시키고, MAP 키나제 활성화에 이르게 하는 ras 경로를 유도한다. 이러한 경로는 세포 증식, 분화 및 생존의 조절에 관여한다(문헌[Herbst, 2004, Int Journal of radiation oncology, 59, 2, S21-S26]).
EGF를 바람직하게는 5 내지 500 ng/㎖ 또는 5 이상 500 ng/㎖ 이하의 농도로 상기 기본 배양 배지에 첨가한다. 바람직한 농도는 10, 20, 25, 30, 40, 45 또는 50 ng/㎖ 이상 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 또는 100 ng/㎖ 이하이다. 보다 바람직한 농도는 50 이상 100 ng/㎖ 이하이다. 훨씬 더 바람직한 농도는 약 50 ng/㎖ 또는 50 ng/㎖이다.
FGF10은 단백질의 섬유아세포 성장 인자(FGF) 과에 속하는 단백질이다. FGF 과 구성원은 광범위한 유사분열 촉진 및 세포 생존 활성을 가지며, 다양한 생물학적 과정들, 예를 들어 배 발생, 세포 성장, 형태발생, 조직 수복, 종양 성장 및 침습에 관여한다. FGF는 세포 표면 타이로신 키나제 수용체(FGFR)와 상호작용함으로써 세포를 자극한다. 4 개의 밀접하게 관련된 수용체들(FGFR1 내지 FGFR4)이 동정되었다. FGFR1 내지 FGFR3 유전자는 다수의 동형들을 암호화하는 것으로 나타났으며, 이들 동형은 리간드 특이성을 결정하는데 중요할 수 있다. 대부분의 FGF는 하나보다 많은 수용체에 결합한다(문헌[Ornitz J Biol Chem. 1998 Feb 27;273 (9):5349-57]). 그러나, FGF10 및 FGF7은 FGFR2의 특이적인 동형(FGFR2b로 나타냄)(상피 세포에 의해 독점적으로 발현된다)과만 상호작용한다는 점에서 FGF들 중에서도 독특하다(문헌[Igarashi, J Biol Chem. 1998 273(21):13230-5]). FGF10이 FGFR2 또는 FGFR4와 결합할 수 있는 바람직한 FGF이다.
간세포 성장 인자/산란 인자(HGF/SF)는 원발암유전자 c-Met 수용체에 결합한 후 타이로신 키나제 신호전달 캐스케이드를 활성화함으로써 형태발생, 세포 성장 및 세포 이동을 조절하는 형태발생 인자이다.
동일한 농도를 FGF10 및 HGF에 사용할 수도 있다. FGF10에 바람직한 농도는 20, 50, 100, 500 ng/㎖, 500 ng/㎖ 이하이다. HGF에 바람직한 농도는 1, 10, 20, 50 ng/㎖, 50 ng/㎖ 이하이다. 줄기 세포의 배양 중에, 바람직하게는 상기 유사분열촉진 성장 인자(즉 EGF, FGF10 및 HGF)의 조합을 필요에 따라, 예를 들어 매일 또는 이틀마다 상기 배양 배지에 첨가한다. 이틀마다 첨가하는 것이 바람직하다. 상기 배양 배지를 필요한 경우, 예를 들어 매일 또는 이틀마다 재보충할 수도 있지만, 바람직하게는 4일마다 재보충한다.
일부 실시태양에서, A83-10과 같은 TGF-베타 억제제가 EM1 배지 중에 추가로 존재한다. 이는 인간 세포 또는 오르가노이드가 배양되는 경우 특히 유용하다. 일부 실시태양에서, 상기 A83-01은 400 내지 600 nM, 예를 들어 450 내지 550 nM, 470 내지 530 nM 또는 대략 500 nM의 농도로 존재한다. TGF-베타 억제제가 EM1 중에 존재하는 실시태양에서 노치 억제제가 바람직하게는 존재하지 않는다.
본 발명의 바람직한 확대 배지
바람직한 배양 배지 및 이의 사용 방법을 실시예에 개시한다.
예를 들어, 세포 배양 배지는 FGF10, HGF 및 니코틴아미드가 보충된 EGF 및 R-스폰딘 1; 예를 들어 FGF10(100 ng/㎖), HGF(25 내지 50 ng/㎖) 및 니코틴아미드(1 내지 10 mM)가 보충된 EGF(50 ng/㎖) 및 R-스폰딘 1(1 ug/㎖)이 첨가된 기본 배지를 포함하거나 상기 배지로 이루어질 수 있다. 본 발명자들은 상기 배지가 세포의 장기간 확대에 바람직함을 발견하였다. 따라서, 상기 세포 배양 배지가 본 발명의 EM2로서 사용하기에 바람직하다. 상기 기본 배지에 바람직하게는 B27, N2 및 200 ng/㎖ N-아세틸시스테인을 보충한다. 일부 실시태양에서, 상기 기본 배지는 어드밴스드-DMEM/F12이다. 그러나, 임의의 다른 적합한 기본 배지를 사용할 수도 있다.
또 다른 바람직한 세포 배양 배지 및 상기 배지의 사용 방법을 실시예에 개시하며, 상기 배지는 바람직하게는 B27, N2, 200 ng/㎖ N-아세틸시스테인, 50 ng/㎖ EGF, 1 ㎍/㎖ R-스폰딘1, 10 nM 가스트린, 100 ng/㎖ FGF10, 10 mM 니코틴아미드 및 50 ng/㎖ HGF 및 50% Wnt 처리된 배지, 및 바람직하게는 10 내지 100 ng/㎖ 노긴이 보충된 어드밴스드-DMEM/F12를 포함하거나 이들로 이루어진다. Wnt 처리된 배지는 어드밴스드 DMEM, P/S, B27, N2 및 또한 FCS를 포함한다. Wnt3A 발현 플라스미드로 형질감염된 293T는 Wnt를 생산한다. 상기 전체 배지를 수일 후에 취하고(즉 분비된 Wnt를 갖는다) Wnt 공급원으로서 사용한다.
따라서 본 발명은
유사분열 촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF, 바람직하게는 FGF10 및 HGF,
가스트린, 니코틴아미드, B27, N2 및 N-아세틸시스테인, 및 바람직하게는
BMP 억제제, 보다 바람직하게는 노긴 및
Wnt 작용물질, 보다 바람직하게는 R-스폰딘 1 및/또는 Wnt-3a
가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 상기 배지로 이루어지는 세포 배양 배지를 제공한다.
따라서 본 발명은
유사분열 촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGF10 및 HGF,
가스트린, 니코틴아미드, B27, N2 및 N-아세틸시스테인,
BMP 억제제, 보다 바람직하게는 노긴 및
Wnt 작용물질, 보다 바람직하게는 R-스폰딘 1 및/또는 Wnt-3a
가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 상기 배지로 이루어지는 첫 번째 바람직한 세포 배양 배지를 포함한다.
상기 배지를 세포의 초기 확대를 자극하기 위한 본 발명의 EM1 세포 배양 배지로서 사용할 수 있다.
일부 실시태양에서, EM1 세포 배양 배지로서 사용되는 상기 배지는 본 발명의 EM2 배양 배지의 모든 성분들을 포함하고 Wnt-3a 및 노긴을 추가로 포함한다.
상기 기본 배지에 N-아세틸시스테인, B27 및 N2가 보충된 실시태양에서, 하기를 상기 배양 배지에 첨가하는 것이 바람직하다: EGF, R-스폰딘1, 가스트린, FGF10, 니코틴아미드 및 HGF 및 Wnt-처리된 배지. 바람직하게는, 상기 기본 배지에 본 발명에서 상술한 양에 따라 N-아세틸시스테인, EGF, R-스폰딘1, 가스트린, FGF10, 니코틴아미드 및 HGF 및 Wnt-처리된 배지를 보충한다.
예를 들어, 상기 기본 배지에 150 ng/㎖ 내지 250 ng/㎖의 N-아세틸시스테인이 보충될 수 있는 일부 실시태양에서; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 200 ng/㎖의 N-아세틸시스테인이 보충된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 상기 기본 배지에 40 ng/㎖ 내지 60 ng/㎖ EGF가 보충될 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 50 ng/㎖의 EGF가 보충된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 상기 기본 배지에 0.5 ㎍/㎖ 내지 1.5 ㎍/㎖의 R-스폰딘1이 보충될 수 있고; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 1 ㎍/㎖의 R-스폰딘1이 보충된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 상기 기본 배지에 5 nM 내지 15 nM의 가스트린이 보충될 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 10 nM의 가스트린이 보충된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 상기 기본 배지에 25 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖ FGF10, 예를 들어 70 ng/㎖ 내지 130 ng/㎖의 FGF10이 보충될 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 100 ng/㎖의 FGF10이 보충된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 상기 기본 배지에 5 mM 내지 15 mM의 니코틴아미드가 보충될 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 10 mM의 니코틴아미드가 보충된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 상기 기본 배지에 25 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖ HGF, 예를 들어 35 ng/㎖ 내지 65 ng/㎖의 HGF가 보충될 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 50 ng/㎖의 HGF가 보충된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서 상기 기본 배지에 35% 내지 65% Wnt-처리된 배지가 보충될 수 있으며; 바람직하게는 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 50% Wnt-처리된 배지가 보충된다.
일부 실시태양에서 가스트린 및 N2 중 하나 또는 모두가 세포 배양 배지 중에 존재하지 않는다.
바람직하게는 상기 기본 배지는 어드밴스드-DMEM/F12이다.
상기 제 1 배양 배지(예를 들어 EM1, EM2 또는 EM1과 EM2 모두)를 바람직하게는 본 발명의 배양 방법의 처음 2 주간 사용한다. 그러나, 이를 더 짧은 기간 동안, 예를 들어 1, 2, 3, 5, 7 또는 10일 이상의 기간 동안, 예를 들어 3, 4, 5, 10, 20 주 이상, 5 개월 이상, 예를 들어 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월 이상 동안 사용할 수도 있다.
분화 배지(DM):
또 다른 태양에서, EGF, TGF-베타 억제제 및 노치 억제제가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 상기 배지로 이루어지는 제 2 세포 배양 배지를 제공한다. 본 발명자들은 상기 배지가 세포 분화에 유용함을 발견하였다. 상기 세포의 분화에 사용되는 배지를 본 발명에서 DM이라 칭할 수도 있다.
바람직하게는, 상기 제 2 세포 배양 배지는 FGF 및/또는 HGF를 또한 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 제 2 배양 배지는
유사분열 촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGF10 및 HGF;
노치 억제제; 및
TGF-베타 억제제
가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 상기 배지로 이루어진다.
하나의 실시태양에서, 상기 TGF-베타 억제제는 A83-01이고/이거나 상기 노치 억제제는 DAPT이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 DM 세포 배양 배지는 덱사메타손을 추가로 포함한다.
바람직한 제 2 세포 배양 배지, 및 상기 배지의 사용 방법은 실시예에 개시되며, 상기 배지는 50 ng/㎖ EGF, 100 ng/㎖ FGF10, 50 nM A8301 및 10 uM DAPT가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 상기 배지로 이루어진다. 어드밴스드-DMEM/F12를 임의의 다른 적합한 기본 배지처럼 기본 배지로서 사용할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 제 2 세포 배양 배지는 R-스폰딘 또는 Wnt를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 제 2 세포 배양 배지는 Wnt 작용물질을 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 제 2 세포 배양 배지는 니코틴아미드를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 제 2 세포 배양 배지는 BMP 억제제를 포함하지 않는다.
본 발명자들은 R-스폰딘1 및 니코틴아미드가 모두 성숙한 간세포 마커 CYP3A11의 발현을 억제하고 간모세포 마커 알부민의 발현은 여전히 촉진함을 발견하였다. 따라서, 세포가 더욱 성숙한 간의 운명으로 분화하는 것을 증가시키기 위해서, 본 발명자들은 R-스폰딘 및 니코틴아미드를 상기 세포 배양물로부터 제거하였다. 본 발명자들은 또한 특정한 담즙 전사 인자의 발현이 R-스폰딘1을 함유하는 확대 배양물에서 고도로 상향조절됨을 발견하였으며, 이는 상기 배양 유전자 발현이 보다 답즙 세포 운명 쪽으로 기우는 것을 가리킨다. 노치 및 TGF-베타 신호전달 경로는 생체 내 담즙 세포 운명에 관련되었다. 실제로, Rbpj(활성 노치 신호전달을 성취하는데 필수적임)의 결실이 비정상적인 관강형성을 생성시키며(문헌[Zong Y. Development 2009]), 간 외식체에의 TGF-베타의 첨가는 시험관 내에서 담즙 분화를 촉진한다(문헌[Clotman F. Genes and Development 2005]). 노치 및 TGF-베타 신호전달 경로는 모두 간 배양물에서 고도로 상향조절되었기 때문에(도 9), 본 발명자들은 담도 세포-운명의 억제가 상기 세포의 분화를 보다 간세포 표현형 쪽으로 촉발시킬 수도 있음을 추론하였다. TGF-베타 억제제(예를 들어 A8301) 및 노치 억제제(예를 들어 DAPT)의, 바람직하게는 R-스폰딘 또는 Wnt를 함유하지 않는 분화 배지에의 첨가는 성숙한 간세포 마커의 발현을 증대시키고 간세포-유사 세포의 수를 증가시키는 것으로 밝혀졌다(예를 들어 실시예 2 참조).
노치는 다중 단백질분해 절단을 통해 활성화될 수 있는 막통과 표면 수용체이며, 상기 절단 중 하나는 감마-세크레타제라 칭하는, 프로테아제 활성을 갖는 단백질들의 복합체에 의한 절단이다. 감마-세크레타제는 막 내에서 그의 절단 활성을 수행하는 프로테아제이다. 감마-세크레타제는 다성분 효소이며 4 개 이상의 상이한 단백질들, 즉 프레세닐린(프레세닐린 1 또는 2), 니카스트린, PEN-2 및 APH-I로 구성된다. 프레세닐린은 감마-세크레타제의 촉매 중심이다. 리간드 결합 시 상기 노치 수용체는 형태적 변화를 겪어, 메탈로프로테아제인 ADAM 프로테아제의 작용을 통해 엑토도메인이 발산되게 한다. 이어서 바로 상기 노치 세포내 도메인(NICD)의 방출을 생성시키는 감마-세크레타제 복합체의 작용이 이어진다. NICD는 핵으로 전위하여 여기에서 CSL(C-프로모터-결합 인자/재조합 신호-서열 결합 단백질 Jκ/탈모 억제인자/Lagl)과 상호작용한다. NICD의 결합은 CSL을 전사 억제인자에서 활성인자로 전환시켜 노치 표적 유전자를 발현시킨다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 바람직한 노치 억제제의 예는 감마-세크레타제 억제제, 예를 들어 DAPT 또는 다이벤즈아제핀(DBZ) 또는 벤조다이아제핀(BZ) 또는 LY-411575, 노치의 리간드 매개된 활성을 감소시킬 수 있는 억제제(예를 들어 노치의 우세한 음성 리간드를 통해 또는 우세한 음성 노치를 통해 또는 노치 리간드와 노치 간의 상호작용을 적어도 부분적으로 차단할 수 있는 항체를 통해), 또는 ADAM 프로테아제의 억제제이다.
TGF-베타 신호전달은 세포 성장, 세포 운명 및 세포사멸을 포함한 다수의 세포 작용들에 관여한다. 신호전달은 전형적으로는, 유형 I 수용체를 모집하여 인산화하는 유형 II 수용체에 대한 TGF-베타 상과 리간드의 결합으로 시작한다. 이어서 상기 유형 1 수용체는 SMAD를 인산화하며, 상기 SMAD는 핵에서 전사 인자로서 작용하고 표적 유전자 발현을 조절한다. 한편으로, TGF-베타 신호전달은 예를 들어 p38 MAP 키나제를 통해 MAP 키나제 신호전달 경로를 활성화할 수 있다. 상기 TGF-베타 상과 리간드는 골 형태발생 단백질(BMP), 성장 및 분화 인자(GDF), 항-뮬러리안 호르몬(AMH), 액티빈, 결절 및 TGF-베타를 포함한다.
TGF-베타 억제제는 상기 TGF-베타 신호전달 경로의 활성을 감소시키는 작용제이다. 상기 TGF-베타 신호전달 경로의 다수의 중단 방법들이 존재하며, 이는 당해 분야에 공지되어 있고 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 TGF-베타 신호전달을, 작은-간섭 RNA 전략에 의한 TGF-베타 발현의 억제; 퓨린(TGF-베타 활성화 프로테아제)의 억제; 생리학적 억제제에 의한 상기 경로의 억제, 예를 들어 노긴, DAN 또는 DAN-유사 단백질에 의한 BMP의 억제; TGF-베타의 단클론 항체에 의한 중화; TGF-베타 수용체 키나제 1(또한 액티빈 수용체-유사 키나제, ALK5로서 공지됨), ALK4, ALK6, ALK7 또는 다른 TGF-베타-관련된 수용체 키나제의 소-분자 억제제에 의한 억제; 생리학적 억제제, Smad7의 과발현에 의한, 또는 Smad를 활성화로부터 불능으로 만드는 Smad 고정제로서 티오리독신을 사용함으로써 Smad 2 및 Smad3 신호전달의 억제에 의해 중단시킬 수 있다(문헌[Fuchs, O. Inhibition of TGF- Signaling for the Treatment of Tumor Metastasis and Fibrotic Diseases. Current Signal Transduction Therapy, Volume 6,　Number 1, January 2011, pp. 29-43(15)]).
물질이 TGF-베타 억제제인지를 결정하기 위한 다양한 방법들이 공지되어 있으며 이를 본 발명과 함께 사용할 수도 있다. 예를 들어, 세포를, 루시페라제 리포터 유전자를 구동하는 인간 PAI-1 프로모터 또는 Smad 결합 부위를 포함하는 리포터 구조물로 안정하게 형질감염시키는 세포 분석을 사용할 수 있다. 대조군에 대한 루시페라제 활성의 억제를 화합물 활성의 척도로서 사용할 수 있다(문헌[De Gouville et al., Br J Pharmacol. 2005 May; 145(2): 166-177]).
본 발명에 따른 TGF-베타 억제제는 단백질, 펩타이드, 소-분자, 소-간섭 RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앱타머 또는 항체일 수 있다. 상기 억제제는 천연이거나 합성일 수도 있다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 바람직한 소-분자 TGF-베타 억제제의 예는 표 1에 나열된 소 분자 억제제들을 포함한다:
수용체 키나제를 표적화하는 소-분자 TGF -베타 억제제
억제제 표적 IC50 ( nM ) 분자량 명칭 화학식
A83-01 ALK5 (TGF-βR1) 12 421.52 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아미드 C25H19N5S
ALK4 45
ALK7 7.5
SB -431542 ALK5 94 384.39 4-[4-(1,3-벤조다이옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]벤즈아미드 C22H16N4O3
ALK4 　
ALK7 　
SB -505124 ALK5 47 335.4 2-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-2-3급-부틸-3H이미다졸-
4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드 하이드레이트		 C20H21N3O2
ALK4 129
SB -525334 ALK5 14.3 343.42 6-[2-(1,1-다이메틸에틸)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-이미다졸-4-일]퀴녹살린 C21H21N5
SD -208 ALK5 49 352.75 2-(5-클로로-2-플루오로페닐)-4-[(4-피리딜)아미노]프테리딘 C17H10ClFN6
LY -36494 TGR-βRI 59 272.31 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린 C17H12N4
TGF-βRII 400
MLK-7K 1400
SJN -2511 ALK5 23 287.32 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘 C17H13N5
본 발명의 방법은 표 1에 나열된 억제제들 중 임의의 하나 이상의 용도를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 하나의 억제제와 나열된 또 다른 억제제와의 임의의 조합의 용도를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 SB-525334 또는 SD-208 또는 A83-01의 용도를 포함하거나; 또는 본 발명의 방법은 SD-208과 A83-01의 용도를 포함하거나; 또는 본 발명의 방법은 SD-208과 A83-01의 용도를 포함할 수 있다. 숙련가는 주로 다른 키나제들을 표적화하도록 설계되었지만 고 농도에서 TGF-베타 수용체 키나제를 또한 억제할 수 있는 다수의 다른 소-분자 억제제들이 존재한다는 것을 알 것이다. 예를 들어, SB-203580은 고 농도(예를 들어 대략 10 uM 이상)에서 ALK5를 억제하는 것으로 생각되는 p38 MAP 키나제 억제제이다. 상기 TGF-베타 신호전달 경로를 억제하는 임의의 상기와 같은 억제제를 또한 본 발명과 관련하여 사용할 수 있다.
A83-01을 10 nM 내지 10 uM 또는 20 nM 내지 5 uM, 또는 50 nM 내지 1 uM의 농도로 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 A83-01을 대략 500 nM로 배양 배지에 첨가할 수 있다. EM에 사용되는 경우, A83-01을 350 내지 650 nM, 예를 들어 450 내지 550 nM, 보다 바람직하게는 대략 500 nM의 농도로 배양 배지에 첨가할 수 있다. DM에 사용되는 경우, A83-01을 25 내지 75 nM, 예를 들어 40 내지 60 nM 또는 대략 50 nM의 농도로 배양 배지에 첨가할 수 있다.
SB-431542를 80 nM 내지 80 uM, 또는 100 nM 내지 40 uM, 또는 500 nM 내지 10 uM의 농도로 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 SB431542를 대략 1 uM로 배양 배지에 첨가할 수 있다.
SB-505124를 40 nM 내지 40 uM, 또는 80 nM 내지 20 uM, 또는 200 nM 내지 1 uM의 농도로 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 SB505124를 대략 500 nM로 배양 배지에 첨가할 수 있다.
SB-525334를 10 nM 내지 10 uM, 또는 20 nM 내지 5 uM, 또는 50 nM 내지 1 uM의 농도로 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 SB525334를 대략 100 nM로 배양 배지에 첨가할 수 있다.
LY 364947을 40 nM 내지 40 uM, 또는 80 nM 내지 20 uM, 또는 200 nM 내지 1 uM의 농도로 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 LY 364947을 대략 500 nM로 배양 배지에 첨가할 수 있다.
SD-208을 40 nM 내지 40 uM, 또는 80 nM 내지 20 uM, 또는 200 nM 내지 1 uM의 농도로 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 SD-208을 대략 500 nM로 배양 배지에 첨가할 수 있다.
SJN 2511을 20 nM 내지 20 uM, 또는 40 nM 내지 10 uM, 또는 100 nM 내지 1 uM의 농도로 배양 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어 A83-01을 대략 200 nM로 배양 배지에 첨가할 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은
유사분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGF10 및 HGF;
가스트린, 니코틴아미드, B27, N2 및 N-아세틸시스테인
이 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 상기 배지로 이루어지는 또 다른 제 2 배양 배지를 제공한다.
상기 또 다른 제 2 배양 배지는 분화 배지(DM)로서 유용하다. 상기 또 다른 제 2 배양 배지를 바람직하게는 배양 처음 2 주 후에 사용한다. 이 단계에서, BMP 억제제 및 Wnt 리간드는 더 이상 필요하지 않은 것처럼 보인다. 따라서, 일부 실시태양에서, 상기 또 다른 제 2 배양 배지는 BMP 억제제 또는 Wnt 리간드를 포함하지 않는다. 일부 실시태양에서, 상기 또 다른 제 2 배양 배지는 BMP 억제제 또는 Wnt 작용물질을 포함하지 않는다.
상기 제 1 배양 배지(EM, 즉 EM1 및 EM2 또는 EM1 또는 EM2)와 함께, 상기 기본 배지에 일부 실시태양에서 N-아세틸시스테인, EGF, 가스트린, FGF10, 니코틴아미드 및 HGF를 본 발명에서 상술한 양에 따라 보충할 수 있다. 예를 들어, 바람직하게는, 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 200 ng/㎖ N-아세틸시스테인을 보충한다. 바람직하게는, 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 50 ng/㎖ EGF를 보충한다. 바람직하게는, 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 10 nM 가스트린을 보충한다. 바람직하게는, 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 100 ng/㎖ FGF10을 보충한다. 바람직하게는, 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 10 mM 니코틴아미드를 보충한다. 바람직하게는, 상기 기본 배지에 약 또는 정확히 50 ng/㎖ HGF를 보충한다.
본 발명에 따라 사용되는 제 1 및 제 2 세포 배양 배지는 세포외 기질 상에서 상피 줄기 세포 또는 간 상피 줄기 세포 또는 단리된 담도 또는 단리된 간 단편의 생존 및/또는 증식 및/또는 분화를 하용한다.
생존 및/또는 증식을 허용하는 배지는 바람직하게는 적어도 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200일의 배양 동안 세포의 생존 및/또는 증식을 유도하거나 촉진하는 배지이다. 증식을 당해 분야에 공지된 기법, 예를 들어 BrdU 염색, Edu 염색, Ki67 염색을 사용하여 평가할 수 있으며 성장 곡선 분석의 사용을 수행할 수 있다. 예를 들어 우리는 10 개의 담도로부터, 6일 후에 웰당 10 개의 오르가노이드를 갖는 6 개의 웰(60 개의 새로운 오르가노이드)로 희석할 수 있음을 입증하였다. 6일의 각각의 계대 배양에서, 우리는 대략 360 개의 오르가노이드를 생성시킬 수 있다. 32 주에 걸쳐 1 계대 배양/주를 수행함으로써 우리는 단지 7 개월 만에 11,000 개 이상(11520)의 새로운 오르가노이드를 생성시킬 수 있다. 이는 산업상 중요한데, 그 이유는 이식을 위한 세포 및 오르가노이드의 입수가 중대한 문제를 제기하고 있기 때문이다. 마우스 이식의 경우, 예를 들어 최소 105 개의 세포가 필요하다. 가능하게는, 인간 이식의 경우, 이식이 성공적이기 위해서 106 또는 10 x 106 개가 필요할 수도 있다.
바꿔 말하면, 본 발명에 따라 사용되는 배지는 줄기 세포 집단을 적합한 조건 하에서 3 회 이상, 4 회 이상, 5 회 이상, 6 회 이상, 7 회 이상, 8 회 이상, 9 회 이상, 10 회 이상, 20 회 이상, 30 회 이상, 40 회 이상, 50 회 이상, 60 회 이상, 70 회 이상, 80 회 이상, 90 회 이상, 또는 100 회 이상 계대 배양 동안 확대시켜 간 오르가노이드를 형성시킬 수 있다.
상기 정의된 바와 같은 제 2 배지는 바람직하게는 5일 이상의 배양기간 동안 세포의 특정한 분화를 유도하거나 촉진한다. 분화를 본 발명에 정의된 바와 같은 간 계통과 회합된 특정 마커의 존재를 검출함으로써 측정할 수 있다. 상기 마커의 정체에 따라, 상기 마커의 발현을 본 발명에서 정의된 바와 같은 제 1 배지에서 또는 첫 번째 후속의 제 2 배지에서 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 일 이상 배양 후에 RTPCR 또는 면역조직화학에 의해 평가할 수 있다.
분화 배지는 바람직하게는 5일 이상의 배양기간 동안 세포의 특정한 분화를 유도하거나 촉진하는 배지이다. 분화를 본 발명에 정의된 바와 같은 간 계통과 회합된 특정 마커의 존재를 검출함으로써 측정할 수 있다.
본 발명의 상황 내에서, 상기 세포 배양 배지란 용어는 배지, 배양 배지 또는 세포 배지 또는 기본 배지 또는 기본 세포 배지 또는 기본 세포 배양 배지 또는 확대 배지 또는 분화 배지와 동의어이다.
본 발명의 더욱 추가의 태양에 따라, 본 발명의 배양 배지를 함유하는 밀봉-밀폐된 용기를 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 배양 배지는 확대 배지이다. 일부 실시태양에서, 상기 배양 배지는 분화 배지이다. 밀봉-밀폐된 용기가 오염을 방지하기 위해서, 상기 배양 배지의 운반 또는 보관에 바람직할 수도 있다. 상기 용기는 임의의 적합한 용기, 예를 들어 플라스크, 플레이트, 병, 단지, 바이알 또는 주머니일 수 있다.
줄기 세포의 수득 및/또는 배양 방법
간 단편 또는 간 오르가노이드를 수득하고/하거나 배양하는 방법은 상피 줄기 세포, 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편을 하나 이상의 본 발명에 따른 세포 배양 배지의 존재 하에서 세포외 기질과 접촉시켜 배양함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 간 단편 또는 간 오르가노이드를 수득하고/하거나 배양하는 방법은 상피 줄기 세포, 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편을 EM1 배지 및 이어서 EM2 배지 및 이어서 DM 배지의 존재 하에서 세포외 기질과 접촉시켜 배양함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 간 단편 또는 간 오르가노이드를 수득하고/하거나 배양하는 방법은 상피 줄기 세포, 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편을 EM1 배지의 사용 없이 EM2 배지 및 이어서 DM 배지의 존재 하에서 세포외 기질과 접촉시켜 배양함을 포함한다.
일부 실시태양에서, 간 단편 또는 간 오르가노이드를 수득하고/하거나 배양하는 방법은 상피 줄기 세포, 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편을 EM2 배지의 사용 없이 EM1 배지 및 이어서 DM 배지의 존재 하에서 세포외 기질과 접촉시켜 배양함을 포함한다.
상기 간 단편 또는 간 오르가노이드를 수득하고/하거나 배양하는 방법은
i) 상피 줄기 세포, 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편을 배지의 존재 하에서 세포외 기질과 접촉시켜 배양하고, 상기 배지가 유사분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF, 바람직하게는 FGF10 및 HGF, 니코틴아미드, 및 바람직하게는 Wnt 작용물질, 바람직하게는 R-스폰딘 1 내지 4 중 어느 하나가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하며; 후속으로
ii) 상기 줄기 세포, 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편을 본 발명에서 정의한 바와 같은 제 2 세포 배양 배지(DM 배지)의 존재 하에서 세포외 기질과 접촉시켜 배양함
을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 단계 i)에 앞서, 상기 방법은 상피 줄기 세포, 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편을, EGF, BMP 억제제, R-스폰딘 및 Wnt가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 상기 배지로 이루어지는 배지의 존재 하에서 세포외 기질과 접촉시켜 배양함을 포함한다. 바람직하게는, 상기 BMP 억제제는 노긴이고, EM1 배지는 "ENRW"(EGF, 노긴, R-스폰딘 및 Wnt)를 지칭한다.
하나의 실시태양에서, 상피 줄기 세포, 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편을 본 발명에서 개시한 바와 같은 EM2 배양 배지, 예를 들어 Wnt 작용물질, 예를 들어 R-스폰딘, 상피 성장 인자, FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF, 바람직하게는 FGF10, 및 니코틴아미드를 포함하는 배지에서 세포외 기질과 접촉시켜 배양함을 포함하는, 간 단편 또는 간 오르가노이드를 수득하고/하거나 배양하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 배지는 HGF를 또한 포함한다.
추가의 실시태양에서, 상피 줄기 세포, 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 조직 단편을 BMP 억제제, Wnt 작용물질, 유사분열촉진 성장 인자로서 상피 성장 인자, FGFR2 또는 FGFR4에 결합할 수 있는 FGF, 바람직하게는 FGF10 및 HGF, 가스트린, 니코틴아미드, B27, N2 및 N-아세틸시스테인을 포함하는 배지에서 세포외 기질과 접촉시켜 배양함을 포함하는, 간 단편 또는 간 오르가노이드를 수득하고/하거나 배양하는 방법을 제공한다.
또 다른 바람직한 방법에서, 상기 정의한 바와 같은 EM1 배지에서 2 주 이상 배양 후, 상기 배양을 BMP 억제제 및 Wnt 작용물질을 포함하지 않는 배지에서 속행한다. 일부 실시태양에서, 상기 배양을 본 발명의 EM2에서 속행한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 배양을, TGF-베타 억제제, 예를 들어 A83-01 및 노치 억제제, 예를 들어 DAPT를 추가로 포함하는 본 발명의 제 2 배지(DM)에서 속행한다. 일부 실시태양에서, 상기 배양을 본 발명의 EM2 및 이어서 DM 배지에서 속행한다.
따라서 간 오르가노이드, 상피 줄기 세포, 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 간 조직 단편을 수득하고/하거나 배양하기 위한 바람직한 방법에서 제 1 단계로 제 1 배지(EM)에서 배양하고, 이어서 후속으로 별도의 제 2 단계로 제 2 배지(DM)에서 배양한다. 상기 제 1 배양 단계는 2 주 이상의 지속기간을 가질 수 있으며 더 길 수도 있다, 예를 들어 3 주 이상, 4 주 이상, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 개월 이상일 수 있다. 상기 제 2 단계는 바람직하게는 6 주 이하, 보다 바람직하게는 1 개월 이하, 예를 들어 3 주 이하, 2 주 이하, 1 주 이하의 지속기간을 갖는다. 많은 세포들이 DM에서 2 주 후에 죽기 시작하며 따라서 상기 제 2 단계는 2 주 이하 또는 1 개월 이하가 바람직한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 단지 덜 바람직한 실시태양에서, 상기 제 2 단계는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16일 또는 3주 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 개월 이상의 지속기간을 가질 수도 있다. 각각의 단계를 바람직하게는 본 발명에서 정의한 바와 같은 세포외 기질을 사용하고 본 발명에 상세히 개시된 배양 배지를 사용하여 수행한다.
한편으로 또 다른 실시태양에서, 상기 방법을 제 2 배지로 전환 없이, 제 1 배지에서 수행한다. 이 방법은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16일 또는 3주 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 개월 이상의 지속기간을 가질 수도 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 제 1 배지에서의 배양 단계는 EM1 배지에서의 배양 및 이어서 EM2 배지에서의 배양 모두를 포함한다. 따라서, 상술한 기간들은 상기 세포 또는 단편을 EM1에서 및 후속으로 EM2 배지에서 배양하는 전체 기간을 지칭할 수도 있다. 일부 실시태양에서, 상기 EM1 배양 배지에서의 배양 단계는 10일 미만, 예를 들어 9일 미만, 8일 미만, 7일 미만, 6일 미만, 5일 미만, 4일 미만, 3일 미만, 2일 미만, 또는 1일 미만의 지속기간을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 EM1 배양 배지에서 배양 단계는 1 내지 10일, 예를 들어 1 내지 7일, 2 내지 6일, 3 내지 5일, 예를 들어 4 또는 5일의 지속기간을 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 EM2 배지에서의 배양 단계는 10일 이상, 예를 들어 11, 12, 13, 14, 15, 16일 이상, 또는 1 내지 3주, 또는 2 내지 4주 또는 3 내지 6주, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 개월 이상의 지속기간을 가질 수 있다.
각 배지 중에 존재하는 각 화합물의 바람직한 농도는 이미 본 발명에서 명세서 또는 실시예에 정의되었다.
간 단편 또는 간 오르가노이드를 수득하고/하거나 배양하기 위한 본 발명에 개시된 방법을 또한 Lgr5를 발현하는 세포 집단을 수득하고/하거나 배양하기 위해 사용할 수 있으며 상기와 같은 방법은 본 발명에 포함된다. 따라서 본 발명의 방법에 의해 수득된 Lgr5를 발현하는 세포 집단을 또한 제공한다.
숙련된 독자에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 배양 방법이 유리한데, 그 이유는 공급자 세포가 필요하지 않기 때문이다. 공급자 세포층을 종종 줄기 세포의 배양물을 지지하고 그의 분화를 억제하기 위해 사용한다. 공급자 세포층은 일반적으로 관심 세포와 함께 배양되고 상기 세포의 생육에 적합한 표면을 제공하는 세포의 단층이다. 상기 공급자 세포층은 관심 세포가 생육할 수 있는 환경을 제공한다. 공급자 세포를 종종 그의 증식을 방지하기 위해 유사분열에 의해 불활성화시킨다(예를 들어 조사 또는 미토마이신 C에 의한 처리에 의해). 상기 공급자 세포의 사용은 또한 세포의 계대 배양을 복잡하게 하기 때문에(상기 세포를 각 계대 배양 시 상기 공급자 세포로부터 분리시켜야 하고, 각 계대 배양에 새로운 공급자 세포가 요구된다), 바람직하지 않다. 상기 공급자 세포의 사용은 또한 상기 공급자 세포에 의해 목적하는 세포가 오염되게 할 수 있다. 이는 임의의 의학적 용도에 분명히 문제가 되며, 심지어 연구 상황에서조차, 상기 세포 상에서 수행된 임의의 실험의 결과에 대한 분석을 복잡하게 한다. 본 발명에서 다른 곳에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 배양 배지는 공급자 세포 접촉 없이 세포 배양에 사용될 수 있기 때문에 특히 유리하다, 즉 본 발명의 방법은 생육을 후원하고 있는 세포를 지지하기 위해 공급자 세포의 층을 필요로 하지 않는다.
따라서, 본 발명의 조성물은 공급자 세포 부재 조성물일 수 있다. 조성물은 통상적으로, 상기 조성물 중의 간 세포가 공급자 세포층의 부재 하에서 1 회 이상 계대 배양기간 동안 배양된 경우 공급자 세포 부재인 것으로 간주된다. 본 발명의 공급자 세포 부재 조성물은 통상적으로 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만의 공급자 세포(상기 조성물 중의 전체 세포 수의 %로서 나타냄)를 함유하거나 또는 바람직하게는 공급자 세포를 전혀 함유하지 않는다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 예를 들어 간 오르가노이드를 재생 의학에 사용하는 경우, 상기 방법은 상피 세포로부터 또는 단리된 간 단편으로부터 출발할 수 있다. 상기 세포 또는 간 단편은 자가조직이거나 동종이계일 수 있다. "자가조직" 세포는 세포 요법을 위해, 예를 들어 조직 재생을 허용하기 위해 상기 세포가 다시 도입되는 동일한 유기체로부터 기원하는 세포이다. 자가조직 세포는 원래 면역 거부 문제를 극복하기 위해서 환자에 대한 합치를 요구하지 않고/않거나, 이식 시 면역 억제 중재의 필요성을 감소시킨다. "동종이계" 세포는, 동일한 종이지만, 세포 요법을 위해, 예를 들어 조직 재생을 허용하기 위해 상기 세포가 도입되는 개체와 상이한 개체로부터 기원하는 세포이다. 상기 거부 문제를 방지하기 위해서 어느 정도의 환자 합치가 여전히 요구될 수도 있다. 조직 거부를 최소화하기 위한 기법은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있을 것이다.
본 발명의 바람직한 방법은 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 간 단편의 배양 방법을 포함한다.
또 다른 바람직한 방법은 상피 줄기 세포 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 간 단편으로부터의 간 오르가노이드를 수득하는 방법을 포함한다.
또 다른 바람직한 방법은 상피 줄기 세포 및/또는 상기 상피 줄기 세포를 포함하는 단리된 간 단편으로부터의 간 오르가노이드를 수득하고 배양하는 방법을 포함한다.
본 발명에서 초기에 나타낸 바와 같은 바람직한 방법에서, BMP 억제제는 노긴, DAN, 및 써베루스 및 그렘린을 포함하는 DAN-유사 단백질 중에서 선택되며, 바람직하게는 노긴이거나 상기 노긴을 포함하고, 및/또는 상기 Wnt 작용물질은 Wnt, 바람직하게는 Wnt-3a, R-스폰딘 1-4, 노린, 및 GSK-억제제 중 하나 이상으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 Wnt-3a 및/또는 R-스폰딘이거나 이를 포함한다.
또 다른 바람직한 방법에서, 간 오르가노이드는 하나의 단일 세포, 바람직하게는 Lgr5를 발현하는 세포로부터 기원하고, 보다 바람직하게는 상기 단일 세포는 관심 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조물을 포함한다. 상기 세포는 또한 간-특이성 마커, 예를 들어 Hnflα 및 Hnf4를 발현할 수 있다.
Lgr5를 발현하는 몇몇 세포 유형의 단리는 이미 앞서 개시되었다(예를 들어 WO2009/022907 및 WO2010/016766을 참조하시오). 그러나, 본 발명에 개시된 유형의 Lgr5를 발현하는 간 특이성 줄기 세포는 앞서 개시되지 않았다. 따라서, 본 발명은 적어도 Lgr5 및 하기의 마커 Hnflα, Hnf4a, Sox9, KRT7 및 KRT19 중 하나 이상의 현저한 수준의 천연 발현을 특징으로 하는 성체 줄기 세포의 집단을 제공한다. 상기 세포 집단은 또한 소장 및 위에 공통인 선조세포 집단의 마커, 예를 들어 Cd44 및 Sox9를 발현한다(문헌[Barker & Huch et al Cell stem cell 2010]). 이들은 본 발명에 따라 줄기 세포에서 고도로 발현되지만, 성체 간에서 발현되지 않으며, 이는 본 발명에 개시된 간 배양물의 자가분열 능력을 강화한다. 본 발명의 상기 태양에 따른 세포는 또한, 예를 들어 MMP7, Sp5 및 Tnfrs19를 포함한 Wnt 표적 유전자를 상향조절할 수 있다. 이는 상기 배양물의 자가분열 능력을 유지하기 위한, 활성이고 강건한 표준적인 Wnt 신호전달 활성의 요구에 대한 강한 증거를 제공한다.
"천연 발현"은 세포가 임의의 방식으로 재조합에 의해 조작되지 않음, 즉 상기 세포가 외래 유전 물질의 도입, 예를 들어 이종(비-천연) 또는 보다 강한 프로모터 또는 상기 내생 유전자 또는 상기 유전자의 외래-도입된 형태에 작동적으로 결합된 다른 조절 서열의 도입에 의해 상기 마커를 발현하거나 상기 마커의 발현을 조절하도록 인위적으로 유도되지 않음을 의미한다. 천연 발현은 상기 세포 내 게놈 DNA로부터, 예를 들어 존재하는 엑손 암호화 서열 사이의 인트론으로부터 있다. 천연 발현은 cDNA로부터가 아니다. 천연 발현은 필요한 경우 다양한 방법들 중 어느 하나, 예를 들어 외부로부터의 이종 서열이 존재하지 않는지를 검사하기 위해 유전자의 판독 프레임 내에서부터 서열화함으로써 입증될 수 있다. "성체"는 배-이후를 의미한다. 본 발명의 줄기 세포에 관하여, "성체 줄기 세포"란 용어는 상기 줄기 세포가 상기 배 단계 이후의 성장 단계에서 동물의 조직 또는 기관으로부터 단리됨을 의미한다.
상기 줄기 세포 집단은 또한 임의의 현저한 수준의 몇몇 마커의 천연 발현의 결여를 특징으로 하며, 상기 마커들 중 다수는 세포 분화와 관련된다. 구체적으로, 상기 단리된 성체 줄기 세포 집단의 세포는 Cd11b, CD13, CD14, AFP, Pdx1, 임의의 CYP 구성원 (예를 들어 CYP3A11, CYP 11A1) 중 하나 이상을 현저한 수준으로 천연으로 발현하지 않는다. 본 발명에 정의된 바와 같이, 이들 마커를 음성 마커라 한다.
"발현된"이란 용어는 세포 내 마커의 존재를 개시하는데 사용된다. 발현되는 것으로서 간주하기 위해서, 마커는 검출 가능한 수준으로 존재해야 한다. "검출 가능한 수준"은 상기 마커가 표준 실험 방법들 중 하나, 예를 들어 PCR, 블럿팅 또는 FACS 분석을 사용하여 검출될 수 있음을 의미한다. 유전자는 발현이 30 PCR 주기 후에 상당히 검출될 수 있는 경우(이는 세포에서 상기 세포당 약 100 사본수 이상의 발현 수준에 상응한다) 본 발명의 세포 집단에 의해 발현되는 것으로 간주된다. "발현하다" 및 "발현"이란 용어는 상응하는 의미를 갖는다. 상기 한계 이하의 발현 수준에서, 마커는 발현되지 않는 것으로 간주한다. 본 발명의 세포에서의 마커의 발현 수준과 또 다른 세포, 예를 들어 배아 줄기 세포에서의 동일 마커의 발현 수준 간의 비교를 바람직하게는, 동일한 종으로부터 단리된 2 개의 세포 유형을 비교함으로써 수행할 수 있다. 바람직하게는 상기 종은 포유동물이며, 보다 바람직하게는 상기 종은 인간이다. 상기와 같은 비교를 편의상 역 전사효소 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 실험을 사용하여 수행할 수 있다.
당해 분야에 공지된 다수의 물리적인 분리 방법들 중 어느 하나를 사용하여 본 발명의 상기 태양의 세포를 선택하고 이들을 다른 세포 유형과 구분할 수 있다. 상기와 같은 물리적 방법은 FACS 및 본 발명의 세포에 의해 특이적으로 발현되는 마커를 기본으로 하는 다양한 면역-친화성 방법을 수반할 수 있다. 상술한 바와 같이, Lgr5, Hnflα 및 Hnf4가 본 발명의 세포에서 높은 수준으로 발현되는 세포 마커들 중 셋이다. 따라서, 단지 예시에 의해, 본 발명의 세포를 상기 마커의 존재에 따른, 다수의 물리적 분리 방법에 의해 단리할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 세포를, 예를 들어 상기 마커들 중 하나에 대한 항체를 사용하는 FACS에 의해 단리할 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, 이는 형광 표지된 항체를 통해서 또는 1차 항체에 대한 결합 특이성을 갖는 형광 표지된 2차 항체를 통해 성취될 수 있다. 적합한 형광 표지의 예로는 비제한적으로 FITC, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)(등록상표)488, GFP, CFSE, CFDA-SE, 다이라이트(DyLight) 488, PE, PerCP, PE-알렉사 플루오르(등록상표)700, PE-Cy5 (TRI-COLOR(등록상표)), PE-Cy5.5, PI, PE-알렉사 플루오르(등록상표) 750, 및 PE-Cy7이 있다. 상기 목록은 단지 예로서 제공되며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
항-Lgr5 항체를 사용하는 FACS 분석이 정제된 세포 집단을 제공할 것임은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 그러나, 일부 실시태양에서, 다른 식별 가능한 마커, 바람직하게는 Hnflα 및 Hnf4 중 하나 이상을 사용하는 추가 라운드의 FACS 분석을 수행함으로써 상기 세포 집단을 더욱 정제하는 것도 바람직할 수 있지만, 다른 것들도 또한 사용할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 세포를, 당해 분야에 널리 공지된 분리 방법인 면역-친화성 정제에 의해 단리할 수 있다. 단지 예시로서, 본 발명의 세포를 c-키트에 대한 면역-친화성 정제에 의해 단리할 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 자명한 바와 같이, 상기 방법은 정제 컬럼 상의 항체의 고정화에 의존한다. 이어서 세포 샘플을 상기 컬럼에 로딩하여, 적합한 세포가 상기 항체에 의해 결합되게 하며, 따라서 상기 컬럼에 결합되게 한다. 세척 단계에 이어서, 상기 세포를 고정화된 항-c-키트 항체에 우선적으로 결합하는 경쟁자를 사용하여 상기 컬럼으로부터 용출시키며, 상기 세포가 상기 컬럼으로부터 방출될 수 있게 한다.
고정화된 항체를 사용하는 면역-친화성 정제가 정제된 세포 집단을 제공할 것임은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 그러나, 일부 실시태양에서, 상기 세포 집단을 다른 식별 가능한 마커들 중 하나 이상, 예를 들어 Hnf4를 사용하여 추가 라운드의 면역-친화성 정제를 수행함으로써 추가로 정제하고, 상기 단리된 클론들의 분액을 사용하여 다른 관련된 세포내 마커의 발현을 확인하는 것이 바람직할 수 있다.
동일한 물리적 분리 방법을 수반하기 위해서 연속 정제 단계가 반드시 요구되는 것은 아님은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 따라서, 예를 들어 세포를 항-Lgr5 항체를 사용하는 FACS 단계를 통해 정제한 다음, SSEA-1 친화성 컬럼을 사용하는 면역-친화성 정제 단계를 통해 정제할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포를 약 15일 이상, 약 20일 이상, 약 25일 이상, 또는 약 30일 이상 동안 단리 후에 배양할 수 있다. 몇몇 태양에서, 상기 세포를 더 오래 배양물 중에서 확대시켜 상기 세포 집단에서 세포 표현형의 동종성을 개선시킨다.
상기 방법의 다른 특징들을 정의만을 위한 설명 부분에서 정의한다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 큰 세포 덩어리보다는 단일 세포 현탁액 또는 작은 세포 덩어리(2 내지 50 세포/덩어리)를 통상적으로 시딩할 것이다. 상기와 같은 세포가 분열함에 따라, 상기 세포를 지지체 상에 세포 증식을 촉진하는 밀도로 시딩할 것이다. 전형적으로, 단일 세포를 단리하는 경우, 적어도 1 내지 500 세포/웰의 도말 밀도를 사용하며, 이때 상기 웰의 표면은 0.32 ㎠이다. 덩어리를 시딩하는 경우, 상기 도말 밀도는 바람직하게는 250 내지 2500 세포/㎠이다. 재도말을 위해서, 약 2500 세포/㎠ 내지 약 5,000 세포/㎠의 밀도를 사용할 수도 있다. 대도말 도중, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 큰 덩어리의 세포보다는 단일-세포 현탁액 또는 작은 덩어리의 세포를 통상적으로 시딩할 것이다.
본 발명의 오르가노이드
상술한 세포는 본 발명에서 "오르가노이드"라 칭하는 몸통으로 성장한다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 간 오르가노이드는 본 발명의 추가의 태양이다. 우리가 알고 있는 바로는, 상기와 같은 연장된 기간(즉 7 개월 이상의 배양; 본 발명에 포함된 실시예를 참조하시오) 후에 작용성이고 살아있는 간 오르가노이드가 수득된 것은 처음이다. 작용성은 바람직하게는 본 발명에 정의된 바와 같은 간 마커의 존재 및/또는 본 발명에 정의된 바와 같은 상기 오르가노이드의 구조를 특징으로 한다. 수득되는 간 오르가노이드의 최종 양은 배양기간과 상관되므로, 숙련가는 본 발명이 개척 발명이며 예를 들어 재생 의학에 새로운 가능성을 엶을 알 것이다.
예를 들어, 본 발명에 따른 오르가노이드는 1 x 103 세포 이상, 1 x 104 세포 이상, 1 x 105 세포 이상, 1 x 106 세포 이상, 1 x 107 세포 이상의 세포 집단을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 각각의 오르가노이드는 대략 1 x 103 세포 내지 5 x 103 세포를 포함하며; 일반적으로 10 내지 20 개의 오르가노이드가 24 웰 플레이트의 한 웰에서 함께 증식될 수 있다.
본 발명에 따른 세포 및 오르가노이드는 비-인간 동물 또는 인간일 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 배양 배지 및 방법을 사용하여 동물 및 인간 간 오르가노이드 모두를 시험관 내에서 증식시키고 유지할 수 있음을 최초로 입증하였다.
본 발명에 따라 생성된 오르가노이드의 예시적인 예들을 첨부된 도면에 제공한다. 본 발명에 따른 오르가노이드가, 외부에 하나 이상의 돌기 및 중심 관강을 갖는 세포층을 갖는 낭성 구조를 가질 수 있음을 알 수 있다. 상기 매트리젤 외부의 오르가노이드가 상기 매트리젤 중심의 오르가노이드보다 더 큰 경향이 있으며, 이는 아마도 상기 오르가노이드가 필요한 성장 인자에 더 양호한 통로를 갖기 때문이다. 구조적으로, 본 발명에 따른 오르가노이드는 종종 모양이 길게 늘어져 있다. 상기는 하나 이상의 돌출(budding) 구조, 즉 담관과 다르지 않은 구조를 갖는 단세포 상피층을 포함할 수 있다. 공초점 현미경 검사 하에서, 상기 구조는 케라틴에 대해 양성으로 염색될 수 있다. 상기는 편향된 핵 및 작은 세포질을 갖는 세포를 포함할 수도 있다. 상기 오르가노이드는 다층으로 형성되는 구획을 가질 수 있으며; 상기와 같은 세포는 종종 상기 세포에 대해 보다 중심에 있는, 즉 편향되지 않은 핵을 갖는 경향이 있다. 상기 다층 구획 중의 세포들은 틈, 또는 세포 사이의 관강을 포함하도록 스스로 조직화할 수 있다.
간 오르가노이드는 바람직하게는 간세포 및 담관 세포를 포함하며, 보다 바람직하게는 하기의 마커들 중 하나 이상이 검출될 수 있다: 하나 이상의 간세포 마커, 예를 들어 알부민, 트랜스티레트린, B-1 인테그린 및 글루타민 신시타제 및/또는 CYP3A11, FAH, tbx3, TAT 및 Gck 중 하나 이상 및/또는 하나 이상의 담관 세포 마커, 예를 들어 케라틴 7 및 19. 숙련가는 이들 각각의 마커를 검출하는 방법(즉 RT-PCR 및/또는 면역조직화학)을 안다. 바람직하게는 이들 각각의 마커의 발현을 실험 부분에서 수행되는 바와 같이 평가한다. 이들 각각의 마커는 대개 본 발명의 방법을 사용하여 적어도 2 주, 3 주 또는 1 개월의 배양 후에 발현된다. 상기 두 배양 조건 모두에서 상기 오르가노이드의 미세배열 분석은 간 오르가노이드가 성체 간 조직을 닮음을 입증하였다.
일부 실시태양에서, 간 오르가노이드 중 세포의 대략 35%, 예를 들어 세포의 25 내지 45%, 30 내지 40%, 33 내지 37%, 35% 이하, 또는 15 내지 35%가 간세포 표면 마커를 발현한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 생성된 세포 및 오르가노이드는 또한 간세포 기능, 예를 들어 성숙한 간 마커 알부민, B-1 인테그린, CK-8, CK-18, 트랜스티레틴(TTR), 글루코스 6P, Met, 글루타민 신타제(Glul), 트랜스페린, Fahd1, Fahd2a, K7, K19 및 시토크롬 P450 동형 3A13 (CYP3A13), 51 (CYP51) 2D10 (CYP2D10), 2j6 (CYP2j6), 39A1 (CYP39A1), 4A10 (CYP4A10), 4F13 (CYP4F13) 4F16 (CYP4F16), CYP4B1 및 20A1(CYP20A1)을 발현하거나 이를 양성으로 염색하는 기능을 갖는다. 또한, 일부 실시태양에서 배아 간 유전자 AFP는 성체 간에서와 같이, 상기 두 배양 조건 중 어느 조건에서도 검출되지 않는다. 일부 실시태양에서, 알파 태아 단백질의 발현은 배경 유전자 발현 바로 위에 있다.
또한, 널리 공지된 간 전사 인자, HNF1a, HNF1b 및 HNF4a가 상기 두 조건 모두에서 고도로 발현된다.
간 및 췌장은 밀접하게 관련된 기관이므로, 우리는 우리의 간 배양물이 췌장-특이성 유전자를 또한 발현하는지를 조사하였다. 췌장은 기능상 내분비 및 외분비 췌장으로 나뉜다. 상기 내분비 췌장은 주로 인슐린, 글루카곤 및 소마토스타틴을 발현하는 것을 특징으로 한다. 이들 호르몬의 발현은 내분비 췌장-특이성 전사 인자 세트(가장 중요한 것은 Pdx1 및 뉴로D이다)에 의해 엄격하게 조절된다. 상기 외분비 췌장은 특히 소화 효소 아밀라제, 췌장 리파제 및 키모트립신의 생산을 맡고 있는 포상 및 관상 구획에 의해 형성된다. 이들 유전자의 발현은 또한 Ptf1로서 특이적인 외분비 췌장 유전자에 의해 조절된다.
췌장 특이성 유전자 Ptfla, 췌장 아밀라제(Amy2a4), 췌장 리파제(Pnlip), 인슐린(ins1 및 ins2), 글루카곤(Gcg), 키모트립신(cela1), Pdx1 및 뉴로D는 본 발명에 개시된 간 배양물 중에 존재하지 않았다.
일부 실시태양에서, 하기 유전자들 중 하나 이상 또는 전부가 성체 간 간세포 중의 상응하는 유전자와 유사한 수준으로 간 오르가노이드에서 발현된다: Aqp1, Bmp2, Apo3, Apol7a, Sord, C3, Ppara, Pparg, tbx3, lgf1, ll17rb, ll1b, Tgfbi, Apoa1, Apoa4, Apob, Cyp26b1, Cyp27a1, Cyp2b13, Cyp2b9, Cyp2c37, Cyp2f2, Cyp2g1, Cyp2j13, Cyp3a11, Cyp4a10 및 Cypf14. 예를 들어, 도 16A를 참조하시오.
일부 실시태양에서, 하기의 유전자들 중 하나 이상이 성체 간 간세포 중의 상응하는 유전자에 비해 유사한 정지(shut down) 수준으로 간 오르가노이드에서 발현된다: Ccl2, Osmr, Icam1 및 Cxcl2.
일부 실시태양에서, 하기의 유전자들 중 하나 또는 둘 모두가 간 오르가노이드 및 신생 간 모두에서 상이하게 발현된다: mKi67 및 cdkn3.
일부 실시태양에서, 하기의 유전자들 중 하나, 둘 또는 모두가 간 으로가노이드 및 신생 간에서 유사한 수준으로 발현된다: cyp2j6, olfm4 및 Lefty1. 예를 들어 도 16B를 참조하시오.
일부 실시태양에서, 본 발명의 간 오르가노이드는 본 발명의 확대 배지(예를 들어 EM1 또는 EM2)에서 배양 시 관상 표현형을 갖는다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 간 오르가노이드는 본 발명의 분화 배지에서 배양 시 성체 간 마커를 발현한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 간 오르가노이드는 도 16C에 나타낸 바와 같은 유전자 발현 프로파일을 갖는다.
특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 마우스 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 도 18에 도시된 바와 같은 유전자 발현 프로파일을 갖는다. 예를 들어, 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 마우스 간 세포 집단 또는 오르가노이드는:
a) 하기의 줄기 세포 마커들 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11), 바람직하게는 전부를 발현하고/하거나: lgr5, lgr4, epcam, Cd44, Tnfrsf19, Sox9, Sp5, Cd24a, Prom1, Cdca7 및 Elf3;
b) 하기의 줄기 세포 마커는 발현하지 않고/않거나: Igr6;
c) 본 발명의 확대 배지에서 생육 시 하기의 간세포 또는 담관 세포 마커 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19), 바람직하게는 전부를 발현하고/하거나: Hnf1a, Hnf1b, Hnf4a, Hhex, Onecut1, Onecut2, Prox1, Cdh1, Foxa2, Gata6, Foxm1, Cebpa, Cebpb, Cebpd, Cebpg, Glul, Krt7, Krt19 및 Met;
d) 본 발명의 확대 배지에서 생육 시 하기의 유전자 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17)을 발현하지 않고/않거나: afp, Ins1, Ins2, Gcg, Ptf1a, Cela1, Cela2a, Cela3b, Neurod1, Neurod2, Neurog1, Neurog2, Neurog3, Amy2a4, Igf1r, Igf2 및 Cd34;
e) 하기의 재프로그램화 유전자들 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3)을 발현하고/하거나: Klf4, Myc 및 Pou5fl;
f) 하기의 재프로그램화 유전자를 발현하지 않으며: Sox2
여기에서 상기 유전자들의 발현을, 예를 들어 미세배열을 사용하여 바람직하게는 mRNA 수준에서 발현을 측정함으로써 검출한다.
보다 바람직하게는 본 발명의 마우스 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 상기 특징 a) 내지 f)를 전부 갖는다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 마우스 세포 집단 또는 오르가노이드에 대해 상술한 유전자 발현 프로파일은 본 발명의 확대 배지에서 배양한 마우스 세포 집단 또는 오르가노이드에 대한 것이다.
일부 실시태양에서, 도 19에 나타낸 유전자 발현 특징을 갖는 본 발명의 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 EM1에서 배양된 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 바람직하게는 EM1 세포 배양 배지에서 발현되는 바와 같은 도 19에 나타낸 유전자를 발현한다. 예를 들어, 본 발명의 EM2에서 배양된 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 바람직하게는 EM2 세포 배양 배지에서 발현되는 바와 같은 도 19에 나타낸 유전자를 발현한다. 예를 들어 본 발명의 DM에서 배양된 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 바람직하게는 DM 세포 배양 배지에서 발현되는 바와 같은 도 19에 나타낸 유전자를 발현한다.
예를 들어, 하나의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는:
a) 하기의 줄기 세포 특징 유전자들 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), 바람직하게는 전부를 발현하고/하거나: LGR4, TACSTD1/Epcam, CD44, SOX9, SP5, CD24, PROM1, CDCA7 및 ELF3;
b) 하기의 재프로그램화 유전자들 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4), 바람직하게는 전부를 발현하고/하거나: KLF4, MYC, POU5F1 및 SOX2;
c) 하기의 간세포/담관세포 특이 유전자들 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19), 바람직하게는 전부를 발현하고/하거나: HNF1A, HNF1B, HNF4A, HHEX, ONECUT1, ONECUT2, PROX1, CDH1, FOXA2, GATA6, FOXM1, CEBPA, CEBPB, CEBPD, CEBPG, GLUL, KRT7, KRT19 및 MET;
d) 하기의 간세포/담관 세포 특이 유전자들 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6), 바람직하게는 전부를 발현하지 않고/않거나: NEUROG2, IGF1R and CD34, AFP, GCG 및 PTF1A; 예를 들어, NEUROG2, IGF1R 및 CD34를 발현하지 않고/않거나;
e) 하기의 간세포 특이 유전자들 중 하나 이상(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18), 바람직하게는 전부를 발현하지 않고: TTR, ALB, FAH, TAT, CYP3A7, APOA1, HMGCS1, PPARG, CYP2B6, CYP2C18, CYP2C9, CYP2J2, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP4F8, CYP4V2 및 SCARB1;
여기에서, 상기 유전자들의 발현을, 예를 들어 미세배열을 사용하여 바람직하게는 mRNA 수준에서 발현을 측정함으로써 검출한다.
보다 바람직하게는 본 발명의 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 상기 특징 a) 내지 e)를 전부 갖는다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드 중의 유전자들은 도 19에 도시된 바와 같이 기준 RNA의 발현에 대해 상향조절되거나 하향조절된다. 바람직하게는, 상기 기준 RNA는 보편적인 인간 기준 RNA(스트라타진(Stratagene), 카탈로그 # 740000)이다. 일부 실시태양에서, 유전자는 상기 기준 RNA에 비해 상향조절되거나 하향조절되는 바와 같이 도 19에 또한 도시되는 경우 상기 기준 RNA에 비해 상향조절되거나 하향조절되지만, 상기 상향조절 또는 하향조절의 정도는 동일할 필요가 없다. 다른 실시태양에서, 상기 상향조절 또는 하향조절의 정도는 +/-35%, +/-30%, +/-25%, +/-20%, +/-20%, +/-15%, +/-10%, +/-5%, +/-3 또는 도 19에 도시된 바와 대략 동일하다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 인간 오르가노이드에서 상기 유전자 발현의 절대 수준은 +/-35%, +/-30%, +/-25%, +/-20%, +/-15%, +/-10%, +/-5%, +/-3% 또는 도 19에 도시된 바와 대략 동일하다.
본 발명의 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는 또한 바람직하게는 Lgr5 및/또는 Tnfrsf19, 바람직하게는 이들 모두를 발현한다. 일부 실시태양에서, 상기 인간 간 세포 집단 또는 오르가노이드는, 본 발명의 확대 배지에서 배양 시 Lgr5 및/또는 Tnfrsf19, 바람직하게는 이들 모두를 발현한다. 바람직하게는, Lgr5 및/또는 Tnfrsfr19의 발현은 RT PCR에 의해 검출된다. 일부 실시태양에서, Lgr5 및/또는 Tnfrsf19는, 확대 배지에서 배양 시의 오르가노이드 또는 세포의 발현 수준에 비해 분화 배지에서 배양 시 오르가노이드 또는 세포에서 훨씬 더 낮은 발현 수준으로 존재한다(예를 들어 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상 더 낮게).
본 발명에 따른 세포 및 오르가노이드는 바람직하게는, 예를 들어 106 세포당 대략 1 ㎍/시간 내지 10 ㎍/시간, 바람직하게는 106 세포당 2 ㎍ 내지 6 ㎍/시간의 속도로 알부민을 분비할 수 있다.
더욱 또한, 상기와 같은 세포 및 오르가노이드는 유레아를 분비할 수 있다. 예를 들어 세포의 35 ㎜ 접시에서, 유레아 합성의 활성은 48 시간 동안 1 ㎍ 내지 50 ㎍, 바람직하게는 5 ㎍ 내지 30 ㎍일 수 있다.
본 발명에 따른 세포 및 오르가노이드는, 예를 들어 염색 시 가시적인 글리코겐 저장을 보일 수 있다. 본 발명에 따른 세포 및 오르가노이드가 글리코겐을 능동적으로 합성하는 능력을, 상기 배양 배지를 2일간 저-글루코스 분화 배지로부터 10% FBS 및 0.2 μM 덱사메타손이 보충된 고-글루코스 DMEM으로 교환함으로써 시험할 수 있다.
본 발명에 따른 세포 및 오르가노이드는 유도성 시토크롬 P450 활성(예를 들어 CYP1A)을 가질 수도 있다. 상기와 같은 활성을, 예를 들어 에톡시레소루핀-O-데에틸라제(EROD) 분석을 사용하여 시험할 수 있다(문헌[Cancer Res, 2001, 61:8146-8170]). 예를 들어, 세포 또는 오르가노이드를 P450 기질, 예를 들어 3-메틸콜란트렌에 노출시키고 EROD 활성의 수준을 대조용 세포와 비교할 수 있다.
형태학적으로, 상기 세포는 간세포 모양을 나타낸다.
바람직한 간 오르가노이드는 도 2에 도시된 바와 같이 외부에 돌기가 있는 세포층이 있고 중심에 관광이 있는 낭성 구조를 포함하거나 또는 상기 구조로 이루어진다. 상기 간 오르가노이드는 하기의 특징들 중 하나 이상(예를 들어 2, 3 또는 4)을 가질 수 있다: (a) >5x105 세포/㎤, 바람직하게는 >10x105 세포/㎤의 세포 밀도를 갖는다; (b) 2 내지 30 개의 세포층과 동등한 두께, 바람직하게는 2 내지 15 개의 세포층과 동등한 두께를 갖는다; (c) 상기 세포가 3차원으로 상호 접촉한다, (d) 건강한 간 조직에 고유한 기능을 나타낸다, (e) 2 개의 한정된 도메인, 즉 고도로 편향된 세포가 검출되고 케라틴 마커가 발현되는 단층 상피 도메인(상기 도메인은 담관 도메인을 닮는다), 및 상기 오르가노이드의 주 몸통을 구성하고 편향되지 않은 세포를 갖는 다층 상피에 의해 형성되며, 알부민 발현이 검출될 수 도 있는 다른 도메인을 갖는, 길게 늘어진 모양을 갖는다. 상기와 같은 간 오르가노이드가 바람직하게는 간 단편이 아니고/아니거나 혈관을 포함하지 않고/않거나 간소엽 또는 담관을 포함하지 않음은 숙련가에게 명백하다.
본 발명과 관련하여, 간 단편은 성체 간, 바람직하게는 인간 성체 간의 일부이다. 바람직하게는 본 발명에서 동정된 바와 같은 간 오르가노이드는 따라서 간 단편이 아니다. 간 오르가노이드를 바람직하게는 성체 간으로부터의 세포, 바람직하게는 성체 간으로부터의 상피 줄기 세포, 보다 바람직하게는 Lgr5를 발현하는 성체 간으로부터의 상피 줄기 세포를 사용하여 수득한다.
일부 실시태양에서, 간 오르가노이드는 Lgr5를 발현하는 세포를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 상기 간 오르가노이드 중의 세포의 2% 이상, 보다 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상이 Lgr5를 발현한다. 유사하게, 본 발명은 Lgr5를 발현하는 세포 또는 세포 집단을 제공하며, 여기에서 상기 세포는 본 발명의 간 오르가노이드로부터 수득된다. 상기와 같은 세포의 자손이 또한 본 발명에 포함된다.
하나의 실시태양에서, 간 오르가노이드는 여전히 본 발명의 방법을 사용하여 배양되는 간 오르가노이드이며 따라서 세포외 기질과 접촉한다. 바람직하게는, 간 오르가노이드는 비-중간엽 세포외 기질 중에 묻혀있다. 본 발명의 상황 내에서, "접촉하여"는 물리적 또는 기계적 또는 화학적 접촉을 의미하며, 이는 상기 세포외 기질로부터 상기 간 오르가노이드를 분리시키기 위해서는 힘을 사용할 필요가 있음을 의미한다.
바람직한 실시태양에서, 간 오르가노이드를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 주 이상 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개월 이상 동안 배양할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시태양에서, 간 오르가노이드는, 바람직하게는 Lgr5를 발현하는 단일 세포로부터 기원하며, 보다 바람직하게는 상기 단일 세포는 관심 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조물을 포함한다.
본 발명은 또한 세포외 기질 상에 상피 줄기 세포 또는 상기 줄기 세포를 포함하는 단리된 오르가노이드 구조물을 배양하기 위한 본 발명에 따른 배양 배지의 용도를 제공하며, 이때 상기 줄기 세포는 바람직하게는 인간 배 줄기 세포를 포함하지 않는다. 인간 성체 줄기 세포가 바람직하다. 더욱 또한, 상기 간으로부터 분류된 단일의 상피 줄기 세포는 또한 본 발명에 따른 배양 배지에서 상기 3차원 오르가노이드를 개시시킬 수 있다. 본 발명은 또한 줄기 세포를 포함하는 간 단편을 배양하기 위한 본 발명에 따른 배양 배지의 용도를 제공한다.
상기 줄기 세포는 간 줄기 세포 또는 상피 줄기 세포인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 배양 배지는 모든 분화된 세포 유형들이 존재하는 간 오르가노이드를 형성시키는 장기적인 배양 조건의 확립을 허용하였다. 본 발명에 따른 배양 방법은 7 개월 이상, 8 개월 이상, 9 개월 이상, 10 개월 이상의 배양 기간을 허용하였다.
본 발명은 또한 바람직하게는 50% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 60% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 70% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 80% 이상의 생육 가능한 세포, 보다 바람직하게는 90% 이상의 생육 가능한 세포를 포함하는 간 오르가노이드를 제공한다. 세포의 생육성을 훽스트(Hoechst) 염색 또는 FACS에서 프로피디움 요오다이드 염색을 사용하여 평가할 수 있다.
상기 생육 가능한 세포는 바람직하게는 상술한 바와 같은 간 기능, 또는 간세포의 특징을 갖는다.
본 발명의 세포 및 오르가노이드의 용도
추가의 태양에서, 본 발명은 약물 발견 선별, 독성 분석 또는 재생 의학에서 상술한 바와 같은 본 발명에 따른 간세포 또는 오르가노이드의 용도를 제공한다. 본 발명은 더욱 또한 독성 분석에서 본 발명의 간 오르가노이드의 자손의 용도를 제공한다. 상기와 같은 독성 분석은 간 오르가노이드로부터 유도된 세포 또는 간 오르가노이드 또는 그의 일부를 사용하는 시험관 내 분석일 수 있다. 상기와 같은 자손 및 간 오르가노이드는 배양이 용이하며, 예를 들어 현재 독성 분석에 사용되는 Caco-2 (ATCC HTB-37), I-407 (ATCC CCL6), 및 XBF (ATCC CRL 8808)와 같은 상피 세포주보다 1차 상피 세포를 더 가깝게 닮는다. 간 오르가노이드에 의해 획득된 독성 결과는 환자에게서 획득된 결과를 보다 가깝게 닮을 것이 예상된다. 세포 기본 독성 시험을 기관 특이성 세포독성의 측정에 사용한다. 상기 시험에서 시험되는 화합물은 암 화학예방제, 환경 화학물질, 식품 보충제, 및 잠재적인 독성물질을 포함한다. 상기 세포를 일정한 기간 동안 배수 농도의 시험제에 노출시킨다. 상기 분석에서 시험제의 농도 범위를 5일의 노출 및 최고 용해 농도로부터의 로그 희석을 사용하여 예비 분석에서 측정한다. 상기 노출 기간의 끝에서, 상기 배양물을 생육 억제에 대해 평가한다. 데이터를 분석하여 50 퍼센트까지 종점을 억제하는 농도(TC50)를 측정한다.
예를 들어, 간세포에서 시토크롬 P450 효소의 유도는 약물의 효능 및 독성을 측정하는 핵심 인자이다. 특히, P450의 유도는 골치 아픈 약물-약물 상호작용의 중요한 기전이며, 이는 또한 약물 효능을 제한하고 약물 독성을 지배하는 중요한 인자이다. 시토크롬 P450 유도 분석은, 완전한 정상 인간 간세포를 요하기 때문에 전개하기가 어려웠다. 상기 세포는 고속 대량처리 분석의 대량 생성을 지속하기에 충분한 수의 생산에 아주 다루기 힘든 것으로 나타났다.
예를 들어, 본 발명의 상기 태양에 따라, 후보 화합물을 본 발명에 개시된 바와 같이 세포 또는 오르가노이드와 접촉시킬 수 있으며, 상기 세포 또는 상기 세포의 활성에 대한 임의의 변화를 모니터할 수 있다. 본 발명의 세포 또는 오르가노이드의 다른 비-치료학적 용도의 예는 간 발생학, 간 세포 계통, 및 분화 경로의 연구; 재조합 유전자 발현을 포함한 유전자 발현 연구; 간 손상 및 수복에 관련된 기전; 간의 염증 및 감염성 질병의 연구; 발병 기전의 연구; 및 간세포 형질전환의 기전 및 간암의 병인학의 연구를 포함한다.
고속 대량처리를 위해서, 상기 간 오르가노이드를 다중웰 플레이트, 예를 들어 96 웰 플레이트 또는 384 웰 플레이트에서 배양한다. 분자 라이브러리를 사용하여 상기 오르가노이드에 영향을 미치는 분자를 동정한다. 바람직한 라이브러리는 항체 단편 라이브러리, 펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리, 펩타이드 라이브러리(예를 들어 LOPAP(상표), 시그마 알드리치), 지질 라이브러리(BioMol), 합성 화합물 라이브러리(예를 들어 LOP AC(상표), 시그마 알드리치) 또는 천연 화합물 라이브러리(Specs, TimTec)를 포함한다. 더욱 또한, 선종 세포의 자손에서 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하거나 억제하는 유전자 라이브러리를 사용할 수 있다. 이러한 유전자 라이브러리는 cDNA 라이브러리, 안티센스 라이브러리, 및 siRNA 또는 다른 비-암호화 RNA 라이브러리를 포함한다. 상기 세포를 바람직하게는 일정한 기간 동안 배수 농도의 시험제에 노출시킨다. 상기 노출 기간의 끝에서, 배양물을 평가한다. "영향을 미치는"이란 용어는 세포의 임의의 변화, 예를 들어 비제한적으로 증식의 감소 또는 상실, 형태학적 변화, 및 세포사를 망라하는데 사용된다. 상기 간 오르가노이드를 또한 상기 간 오르가노이드는 아닌, 상피 암종 세포를 특이적으로 표적화하는 약물을 식별하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 간 오르가노이드는 또한 잠재적인 신규 약물 또는 공지되거나 신규의 식품 보조제의 독성 분석에서 Caco-2 세포와 같은 세포주의 사용을 대체할 수 있다.
더욱 또한, 상기와 같은 간 오르가노이드를 병원체의 배양에 사용할 수 있다.
간 오르가노이드를 포함하는 배양물은 재생 의학, 예를 들어 간 상피의 조사-후 및/또는 수술-후 수복, 만성 또는 급성 간 부전 또는 질병을 앓고 있는 환자의 상피 수복에 유용하다. 간 질병은 비제한적으로 간세포 암종, 알라질 증후군, 알파-1-항트립신 결함, 자가면역 간염, 담도 폐쇄, 만성 간염, 간암, 경화성 간 낭종 지방간, 갈락토스혈증 길버트 증후군, 원발성 담즙성 경화, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 원발 경화성 담관염, 레이 증후군, 유육종증, 티로신혈증, I형 글리코겐 저장 질병, 윌슨병, 신생아 간염, 비-알콜성 지방간염, 포르피린증 및 혈색소침착증을 포함한다.
간 부전에 이르는 유전자 상태는 본 발명의 배지 및/또는 방법에 따라 배양된 세포를 사용하는 부분 또는 전체 세포 교체 형태의 세포 기본 요법이 이로울 수 있다. 간 부전에 이르는 유전자 상태의 비제한적인 목록은 진행성 가족성 간내 담즙정체, III 유형 글리코겐 저장 질병, 타이로신혈증, 데옥시구아노신 키나제 결핍증, 피루베이트 카복실라제 결핍증, 선천성 적혈구생산 이상성 빈혈, 다낭성 간 질병, 다낭성 신장 질병, 알파-1 항트립신 결핍증, 요소주기 결함, 유기산혈증, 리소솜 저장 질병, 및 지방산 산화 장애를 포함한다. 세포 기본 요법이 또한 이로울 수 있는 다른 상태는 윌슨병 및 유전성 아밀로이드증(FAP)을 포함한다.
충분한 치료 효과에 도달하기 위해 완전한 간 이식을 요하는 간 부전의 다른 비-간세포 관련된 원인은 본 발명의 배지 및/또는 방법에 따라 배양된 세포를 사용하는 세포 기본 요법을 사용하는 일부 일시적인 기능 복원이 여전히 이로울 수도 있다. 상기와 같은 상태의 예에 대한 비제한적인 목록은 원발성 담즙성 경화, 원발 경화성 담관염, 알라질 증후군, 동종접합성 가족성 고콜레스테롤혈증, 경화증이 있는 B형 간염, 경화증이 있는 C형 간염, 버드-키아리 증후군, 원발성 고수산뇨증, 자가면역성 간염, 및 알콜성 간 질병을 포함한다.
본 발명의 간 오르가노이드를 기능부전 간세포를 수반하는 유전병의 치료 방법에 사용할 수 있다. 상기와 같은 질병은 조기 발병이거나 말기 발병일 수 있다. 조기 발병 질병은 대사 관련 기관 기능부전(예를 들어 알파-1-항트립신 결핍증), 글리코겐 저장 질병(예를 들어 GSD II, 폼페병), 타이로신혈증, 온화한 DGUOK, CDA 유형 I, 요소 주기 결함(예를 들어 OTC 결핍증), 유기산혈증 및 지방산 산화 장애를 포함한다. 말기 발병 질병은 원발성 고수산뇨증, 가족성 고콜레스테롤혈증, 윌슨병, 유전성 아밀로이드증 및 다낭성 간 질병을 포함한다. 본 발명의 간 오르가노이드로부터 발생하는 건강한 간세포에 의한 부분 또는 완전 교체를 사용하여 간 기능을 복원하거나 간 부전을 미룰 수 있다.
본 발명의 간 오르가노이드를 유전성 대사질환으로 인해 또는 간세포 감염의 결과로서 발생하는 만성 간 부전의 치료 방법에 사용할 수 있다. 유전성 대사 질환의 치료는 본 발명의 유전자 변형된 자가조직 간 오르가노이드의 투여를 수반할 수 있다. 간세포 감염의 치료는 본 발명의 동종 이계 간 오르가노이드의 투여를 수반할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 간 오르가노이드를 2 내지 3 개월의 기간에 걸쳐 투여한다.
본 발명의 간 오르가노이드를 사용하여, 예를 들어 파라세타몰, 약물 치료 또는 알콜의 사용으로부터 생성될 수 있는 간 중독의 결과로서의 급성 간 부전을 치료할 수 있다. 일부 실시태양에서, 간 기능을 복원하기 위한 요법은 동결된, 사용 준비가 된 본 발명의 오르가노이드로부터 수득한 동종 이계 간세포로부터의 간세포 현탁액을 주사함을 포함할 것이다. 적합한 오르가노이드를 동결시키는 능력은 상기 오르가노이드를 즉시 전달에 이용할 수 있고 따라서 수혈을 위해 기다릴 필요가 없음을 의미한다.
결함이 있는 간 기능의 교정 또는 교체의 경우에, 본 발명에 따라 생성된 하나 이상의 간 오르가노이드로부터 세포-기질 구조물을 제작하는 것이 가능할 수 있다. 간 세포 질량의 단지 약 10%만이 적합한 기능에 필요한 것으로 생각된다. 이는 공여체의 비교적 제한된 입수 및 보다 작은 어린 기관의 크기로 인해, 전체 기관 이식이 특히 바람직한 어린이에게로 오르가노이드 유닛 조성물을 이식할 수 있게 한다. 예를 들어, 8 개월 된 아동은 무게가 대략 250 g인 정상적인 간을 갖는다. 따라서 상기 아동은 약 25 g의 조직이 필요할 것이다. 성인의 간은 무게가 대략 1500 g이며; 따라서 필요한 이식조직은 상기 성인 간의 단지 약 1.5%일 것이다. 중합체 스캐폴드에 임의로 부착된, 본 발명에 따른 오르가노이드 유닛을 이식하는 경우, 새로운 숙주에서 증식이 일어날 것이며, 생성되는 간세포 덩어리는 상기 결함이 있는 숙주 기능을 대체한다. 본 발명자들은 비-인간 동물 또는 인간으로의 이식에 적합한 성체 간 줄기 세포 또는 상기 줄기세포를 포함하는 간 조직 단편으로부터 성숙한 간세포를 생성시키는 것이 가능함을 최초로 입증하였다. 본 발명에 따른 제 1 배양 배지를 사용하여, 본 발명자들은 간 줄기 세포의 집단을 유지 및 확대하는 것이 가능함을 입증하였다. 본 발명에 따른 제 2 배양 배지를 사용하여, 본 발명자들은 간모세포를 이식 목적에 적합한 성숙한 간세포로 생체 내 분화시킬 수 있음을 입증하였다. 따라서, 본 발명자들은 간 재생, 결함이 있는 간 기능의 교체 또는 교정을 위한 간세포의 신규 공급원을 제공한다.
본 발명자들은 또한 본 발명의 방법에 의해 생육된 오르가노이드의 면역결핍 마우스 내로의 성공적인 이식을 입증하였으며(실시예 7 참조), 이때 이식된 오르가노이드-유도된 세포는 생체 내에서 담관세포 및 간세포를 모두 생성시켰다. 따라서, 하나의 실시태양에서 본 발명은 인간 또는 동물 내로의 이식을 위한 본 발명의 오르가노이드 또는 오르가노이드-유도된 세포를 제공한다.
이식을 위한 인간 간 오르가노이드의 사용은 많은 이유로 인해 태아 또는 성체 간세포의 사용에 비해 유리하다. 먼저, 본 발명의 배양 방법은 세포의 무제한 확대, 및 따라서 무제한 공급을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 정확한 배양 조건 하에서(예를 들어 본 발명의 확대 배양 배지를 사용하여) Lgr5+ 세포가 시험관 내에서 1000 초과의 분열을 겪을 수 있음을 입증하였다. 따라서, Lgr5+ 세포를 상기 간 오르가노이드로부터 추출하고 재계대배양하여 이식 가능한 간세포 및 담관세포-생성 세포의 연속적인 자가분열 공급원을 제공할 수 있다. 대조적으로, 태아 또는 성체 간세포는 오직 단일 라운드의 이식만을 제공하는 공여 간으로부터 유래한다. 더욱 또한, 공여 세포를 단지 수일간 살아있도록 유지시킬 수 있지만 그의 간세포 성질은 상실될 수 있다. 이는 공여체를 입수할 수 있는 한 빨리 이식조직을 제조해야 함을 의미한다. 다른 한편으로 오르가노이드-유도된 세포는 수 회의 분열에 걸쳐서 및 연장된 기간 동안 그의 표현형을 유지하며, 이는 상기 세포가 어떠한 단계에서도 이식 준비가 되어 있고 이식에 이용될 수 있음을 의미한다. 이는 또한 상기 오르가노이드-유도된 세포를 일시적인 간 치료제로서 사용할 수 있게 하여 간 이식을 기다리고 있는 환자의 수명을 연장할 수 있다. 본 발명의 간 오르가노이드의 추가적인 이점은 상기 오르가노이드를 동결시킬 수 있고 나중에 기능 상실 없이 해동시킬 수 있다는 것이다. 이는 세포 은행, 용이한 보관 및 실제 사용을 위한 신속한 입수를 가능하게 한다. 이는 예를 들어 급성 간 독성의 치료에 사용될 수도 있는 "규격품"의 제조에 유용할 수 있다. 오르가노이드를 또한 간 공여체로부터 작은 생검으로서 취한 세포 또는 조직 단편으로부터 증식시킬 수 있어 상기 치료에 대한 임의의 윤리적 반대를 최소화한다. 상기 공여체는 심지어 치료하려는 환자로부터 있을 수 있으며, 이는 외래 세포 및 기관의 이식과 관련된 임의의 음성적인 부작용을 줄일 수 있고 면역억제 약물에 대한 필요성을 감소시킬 수 있다.
따라서, 세포 요법을 통한 인간 또는 동물 환자의 치료 방법은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명에서 "동물"이란 용어는 모든 포유동물, 바람직하게는 인간 환자를 나타낸다. 상기는 또한 배 및 태아 단계를 포함한 모든 발생 단계의 개별적인 동물을 포함한다. 예를 들어, 상기 환자는 성인일 수 있거나, 또는 상기 요법은 소아과용(예를 들어 신생아, 아동 또는 청소년)일 수 있다. 상기와 같은 세포 요법은 본 발명에 따라 생성된 세포 또는 오르가노이드의 임의의 적합한 수단을 통한 환자에의 투여를 포함한다. 구체적으로, 상기와 같은 치료 방법은 손상된 조직의 재생을 수반한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "투여"란 용어는 널리 인지된 형태의 투여, 예를 들어 정맥 내 투여 또는 주사뿐만 아니라 이식, 예를 들어 수술에 의한 이식, 본 발명에 따른 세포 또는 오르가노이드로부터 유도된 조직 가공된 간의 접합 또는 이식을 지칭한다. 세포의 경우에, 개인에 대한 전신 투여가, 예를 들어 흉관을 통한 상장 간동맥, 복강 동맥, 쇄골하정맥 내로의 주입, 상대정맥을 통한 심장 내로의 주입, 또는 횡경막하 림프를 통한 세포의 후속 이동과 함께 복강 내로의 주입, 또는 간동맥 혈액 공급 또는 간문맥 내로의 주입을 통한 간 부위 내로의 직접 주입에 의해 가능할 수 있다.
주입에 따라 사람 100 ㎏당 104 내지 1013 세포를 투여할 수 있다. 바람직하게는 사람 100 ㎏당 약 1 내지 5 x 104 내지 1 내지 5 x 107 세포를 정맥 내로 주입할 수 있다. 보다 바람직하게는, 사람 100 ㎏당 약 1 x 104 내지 10 x 106 세포를 정맥 내로 주입할 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포 또는 오르가노이드의 단일 투여를 제공한다. 다른 실시태양에서, 수 회 투여를 사용한다. 수회 투여를 초기 치료 섭생 동안, 예를 들어 3 내지 7일 연속해서 제공하고, 이어서 다른 때에 반복할 수 있다.
일부 실시태양에서 본 발명의 간 오르가노이드로부터 발생하는 건강한 간세포로 환자 간의 10 내지 20%를 재이식/교체하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 정의된 바와 같은 Lgr5를 발현하는 하나의 단일 세포로부터 간 오르가노이드를 재구성하는 것도 또한 가능하다. 상기 단일 세포를, 예를 들어 유전자 결핍 또는 돌연변이를 교정하기 위해서, 본 발명에 정의된 바와 같은 핵산 구조물의 도입에 의해 변형시킬 수도 있다. 또한 경우에 따라, 예를 들어 siRNA를 사용하여 발현을 특이적으로 제거하는 것도 또한 가능할 수 있다. 발현되는 잠재적인 폴리펩타이드는 대사성 간 질환에 결핍된 것들 중 어느 하나, 예를 들어 AAT(알파 항트립신)일 수 있다. 간 생리학을 밝히기 위해서, 우리는 또한 Wnt, EGF, FGF, BMP 또는 노치 경로에 연루된 유전자들을 발현하거나 불활성화시킬 수도 있다. 또한, 약물 독성을 선별하기 위해서, 간 약물 대사를 맡고 있는 유전자(예를 들어 CYP 과의 유전자)의 발현 또는 불활성화가 대단히 중요할 것이다.
하나의 실시태양에서, 상기 확대된 상피 줄기 세포를 관련된 조직 운명, 예를 들어 간세포 및 담관세포을 포함한 간 세포로 재프로그램화할 수도 있다. 지금까지, 성체 줄기 세포로부터 간 세포를 재생시키는 것은 가능하지 않았다. 본 발명의 배양 방법은 간세포 및 담관세포를 포함한 간 세포로, 밀접하게 관련된 상피 줄기 세포를 트랜스-분화시키는 인자들을 분석하는 것이 가능할 것이다.
유전자 요법을 손상되거나 병든 조직의 수복에 관한 방법에 추가로 사용할 수 있음은 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들어 DNA 및/또는 RNA와 같은 유전 정보를 줄기 세포에 전달하기 위해 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 유전자 전달 비히클을 사용할 수 있다. 숙련가는 유전자 요법에서 표적화된 특정 유전자를 교체하거나 수복할 수 있다. 예를 들어, 정상 유전자를 게놈 내의 불특정 위치에 삽입하여 비-작용성 유전자를 대체할 수 있다. 또 다른 예에서, 비정상적인 유전자 서열을 상동 재조합을 통해 정상 유전자 서열로 대체할 수 있다. 한편으로, 선택적인 역 돌연변이는 유전자를 그의 정상 기능으로 복원시킬 수 있다. 추가의 예는 특정 유전자의 조절(유전자가 켜지거나 꺼지는 정도)을 변경시키는 것이다. 바람직하게는, 상기 줄기 세포를 유전자 요법 접근법에 의해 생체 외에서 처리하고 후속으로 포유동물, 바람직하게는 치료가 필요한 인간으로 옮긴다. 예를 들어, 오르가노이드-유도된 세포를 환자에게 이식 전에 배양물 중에서 유전자 변형시킬 수도 있다.
본 발명자들은, 잔류 Lgr5는 검출될 수도 있지만, Lgr5가 건강한 간에서 검출될 수 없음을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 또한 Lgr5가 발현되는지를 검출함을 포함하는 간 손상의 진단 방법을 제공하며, 여기에서 상기 Lgr5 단백질의 발현은 간 손상을 가리킨다. 본 발명은 또한 간에서 Lgr5의 발현을 모니터함으로써 상기 간의 회복 또는 재생을 모니터하는 방법을 제공한다. Lgr5 발현을 임의의 적합한 방법, 예를 들어 유식 세포측정, 면역조직화학에 의해, 또는 PCR 방법의 사용에 의해 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 상술한 본 발명의 태양들 중 어느 하나에 따른 세포 및/또는 오르가노이드 및 상술한 본 발명의 태양들 중 어느 하나에 따른 배양 배지를 포함하는 조성물 또는 세포 배양 용기를 제공한다. 예를 들어, 상기와 같은 조성물 또는 세포 배양 용기는 상술한 바와 같은 배양 배지 중의 임의의 수의 본 발명의 방법에 따라 배양된 세포 또는 오르가노이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 배양 배지는 B27, N2, 200 ng/㎖ N-아세틸시스테인, 50 ng/㎖ EGF, 1 ㎍/㎖ R-스폰딘1, 10 nM 가스트린, 100 ng/㎖ FGF10, 10 mM 니코틴아미드 및 50 ng/㎖ HGF 및 50% Wnt 처리된 배지가 보충된 어드밴스드-DMEM/F12를 포함하거나 또는 상기 배지로 이루어진다.
정의
핵산 구조물은 관심 핵산 분자를 포함하며 상기 분자가 도입되는 세포에서 상기 주어진 핵산 분자의 발현을 보장할 것이다. 특히 바람직한 핵산 구조물은 발현 벡터이며, 여기에서 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 상기 세포에서 상기 핵산 분자(즉 암호화 서열)의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동적으로 결합된다. "발현 벡터"란 어구는 일반적으로 유전자/핵산 분자의 발현을 실행할 수 있는 핵산 분자를 지칭하며 상기는 상기와 같은 서열과 양립성인 세포 중에 함유된다. 상기 발현 벡터는 전형적으로는 적어도 적합한 프로모터 서열 및 임의로, 전사 종결 신호를 포함한다. 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 또는 DNA 또는 뉴클레오타이드 서열을, 본 발명의 방법에서 동정된 바와 같은 시험관 내 세포 배양물 내로의 도입 및 상기 배양물에서의 발현이 가능한 DNA/핵산 구조물에 통합시킨다. 특정 세포 내로의 도입을 위해 제조된 DNA 구조물은 전형적으로는 상기 세포에 의해 인식된 복제 시스템, 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 의도된 DNA 구획, 및 상기 폴리펩타이드-암호화 구획에 작동적으로 결합된 전사 및 번역 개시 및 종결 조절 서열을 포함한다. DNA 구획은 또 다른 DNA 구획과 작용 관계에 놓일 때 "작동적으로 결합된다". 예를 들어 프로모터 또는 인헨서는 상기가 암호화 서열의 전사를 자극하는 경우 상기 서열에 작동적으로 결합된다. 신호 서열에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA에 작동적으로 결합된다. 일반적으로, 작동적으로 결합된 DNA 서열은 인접하며, 신호 서열의 경우에, 인접하고 판독 상 중에 있다. 그러나, 인헨서는 상기가 조절하는 전사를 갖는 암호화 서열과 인접할 필요가 없다. 결합은 편리한 제한 부위 또는 연결자 또는 대신 삽입된 링커에서 연결에 의해 수행된다.
적합한 프로모터 서열의 선택은 일반적으로 DNA 구획의 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 따라 변한다. 적합한 프로모터 서열의 예는 당해 분야에 널리 공지된 진핵생물 프로모터를 포함한다(상기 문헌[Sambrook and Russell, 2001] 참조). 전사 조절 서열은 전형적으로는 세포에 의해 인식되는 이종기원의 인헨서 또는 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터는 CMV 프로모터를 포함한다. 발현 벡터는 사용될 수 있는 폴리펩타이드 암호화 구획에 대한 삽입 부위와 함께 복제 시스템 및 전사 및 번역 조절 서열을 포함한다. 세포 주 및 발현 벡터의 작용 가능한 조합의 예는 상기 문헌[Sambrook and Russell, 2001] 및 [Metzger et al. (1988) Nature 334: 31-36]에 개시되어 있다.
본 발명은 본 발명에서 동정된 바와 같은 Lgr5를 발현하는 세포에서 발현되는 관심의 특정 폴리펩타이드 또는 핵산 분자로 제한되지 않는다. 상기 방법의 목적에 따라, 간 세포에서 폴리펩타이드를 발현시키고/시키거나 간 세포에서 폴리펩타이드의 발현을 불활성화시키는 것을 고려할 수 있다. 발현되는 가능한 폴리펩타이드는 대사성 간 질환에 결핍된 것들 모두, 예를 들어 AAT(알파 항트립신)일 수 있다. 간 생리학을 밝히기 위해서, 우리는 또한 Wnt, EGF, FGF, BMP 또는 노치 경로에 연루된 유전자들을 발현시키거나 불활성화시킬 수도 있다. 또한, 약물 독성을 선별하기 위해서, 간 약물 대사를 맡고 있는 유전자(예를 들어 CYP 과의 유전자)의 발현 또는 불활성화가 대단히 중요할 것이다.
본 발명의 일부 태양은 상기 정의한 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구조물 또는 발현 벡터의 용도에 관한 것이며, 여기에서 상기 벡터는 유전자 요법에 적합한 벡터이다. 유전자 요법에 적합한 벡터는 문헌[Anderson 1998, Nature 392: 25-30]; [Walther and Stein, 2000, Drugs 60: 249-71]; [Kay et al., 2001, Nat. Med. 7: 33-40]; [Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-604]; [Amado and Chen, 1999, Science 285: 674-6]; [Federico, 1999, Curr. Opin. Biotechnol.10: 448-53]; [Vigna and Naldini, 2000, J. Gene Med. 2: 308-16]; [Marin et al., 1997, Mol. Med. Today 3: 396-403]; [Peng and Russell, 1999, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 454-7]; [Sommerfelt, 1999, J. Gen. Virol. 80: 3049-64]; [Reiser, 2000, Gene Ther. 7: 910-3]; 및 상기 문헌 중에 인용된 참고문헌들에 개시되어 있다. 예로서 통합 및 비-통합 벡터, 예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스(AdV), 아데노-관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 폭스 바이러스, 알파바이러스 및 헤르페스 바이러스를 기본으로 하는 것들이 있다.
특히 적합한 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스(Ad) 및 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다. 이들 벡터는 간 세포를 포함하여 광범위한 분열 및 비-분열 세포 유형을 감염시킨다. 또한 아데노바이러스 벡터는 높은 수준의 트랜스유전자 발현이 가능하다. 그러나, 세포 입장 후 상기 아데노바이러스 및 AAV 벡터의 에피솜 성질로 인해, 상기 바이러스 벡터들이 상기 가리킨 바와 같이 트랜스유전자의 단지 일시적인 발현만을 요하는 치료 용도에 가장 적합하다(문헌[Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-2604]; [Goncalves, 2005, Virol J. 2(1):43]). 바람직한 아데노바이러스 벡터를 상기 문헌[Russell, 2000]에 재고찰된 바와 같이 숙주 반응을 감소시키도록 변형시킨다. AAV 유전자 전달의 안전성 및 효능이 인간에서 광범위하게 연구되었으며 간, 근육, CNS 및 망막에서 고무적인 결과를 얻었다(문헌[Manno et al Nat medicine 2006, Stroes et al ATVB 2008, Kaplitt, Feigin, Lancet 2009]; [Maguire, Simonelli et al NEJM 2008]; [Bainbridge et al NEJM 2008]). AAV2는 인간 및 실험 모델 모두에서 유전자 전달 연구에 가장 잘 특성화된 혈청형이다. AAV2는 골격근, 신경세포, 혈관 평활근 세포 및 간세포에 대해 천연 향성을 나타낸다. 따라서 AAV2는 간 조직 표적화를 위한 벡터의 양호한 선택이다. 아데노-관련된 바이러스-기재 비통합 벡터의 다른 예는 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 의사유형 AAV를 포함한다. AAV8 및 AAV9와 같은 비-인간 혈청형의 사용이 피실험자에게서 상기 면역학적 반응을 극복하기에 유용할 수 있으며, 임상 시험이 막 개시되었다(문헌[ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00979238]). 간 세포 내로의 유전자 전달을 위해서, 아데노바이러스 혈청형 5 또는 AAV 혈청형 2, 7 또는 8이 유효한 벡터 및 따라서 바람직한 Ad 또는 AAV 혈청형인 것으로 나타났다(문헌[Gao, Molecular Therapy (2006) 13, 77-87]).
본 발명의 용도에 바람직한 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 기재 발현 구조물이다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시키는 독특한 능력을 갖는다(문헌[Amado and Chen, 1999 Science 285: 674-6]). 렌티바이러스 기재 발현 구조물의 제작 및 사용 방법이 미국 특허 제 6,165,782, 6,207,455, 6,218,181, 6,277,633 및 6,323,031 호 및 문헌[Federico, 1999, Curr Opin Biotechnol 10: 448-53] 및 [Vigna et al., 2000, J Gene Med 2000; 2: 308-16]에 개시되어 있다.
일반적으로, 유전자 요법 벡터는 발현되는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 이때 뉴클레오타이드 서열이 상기 나타낸 바와 같이 적합한 조절 서열에 작동적으로 결합한다는 의미에서 상술한 발현 벡터와 같을 것이다. 상기와 같은 조절 서열은 적어도 프로모터 서열을 포함할 것이다. 유전자 요법 벡터로부터의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 프로모터는 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV) 중간 초기 프로모터, 바이러스 긴 말단 반복 프로모터(LTR), 예를 들어 쥐 몰로니 백혈병 바이러스(MMLV) 라우스 육종 바이러스, 또는 HTLV-1로부터의 것들, 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터 및 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터를 하기에 개시한다.
작은 유기 또는 무기 화합물의 투여에 의해 유도될 수 있는 여러 유도성 프로모터 시스템이 개시되었다. 상기와 같은 유도성 프로모터는 중금속에 의해 조절되는 것들, 예를 들어 메탈로티오닌 프로모터(Brinster et al. 1982 Nature 296: 39-42; Mayo et al. 1982 Cell 29: 99-108), RU-486(프로제스테론 길항물질)(Wang et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8180-8184), 스테로이드(Mader and White, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607), 테트라사이클린(Gossen and Bujard 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551; 미국 특허 제 5,464,758 호; Furth et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9302-9306; Howe et al. 1995 J. Biol. Chem. 270: 14168-14174; Resnitzky et al. 1994 Mol. Cell. Biol. 14: 1669-1679; Shockett et al. 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6522-6526) 및 V16의 활성화 도메인으로서 tetR 폴리펩타이드 및 에스트로젠 수용체의 리간드 결합 도메인으로 구성된 다중-키메릭 전사촉진제를 기본으로 하는 tTAER 시스템(Yee et al., 2002, 미국 특허 제 6,432,705 호)을 포함한다.
RNA 간섭에 의한 특이 유전자들의 녹다운을 위한 작은 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 적합한 프로모터(하기 참조)는 상기 언급한 폴리머라제 II 프로모터 이외에, 폴리머라제 III 프로모터를 포함한다. 상기 RNA 폴리머라제 III(pol III)은 다양한 작은 핵 및 세포질 비-암호화 RNA, 예를 들어 5S, U6, 아데노바이러스 VA, Vault, 텔로머라제 RNA, 및 tRNA의 합성을 맡고 있다. 이들 RNA를 암호화하는 다수 유전자들의 프로모터 구조를 측정하였으며 RNA pol III 프로모터가 3 가지 유형의 구조에 속하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Geiduschek and Tocchini-Valentini, 1988 Annu. Rev. Biochem. 57: 873-914]; [Willis, 1993 Eur. J. Biochem. 212: 1-11; Hernandez, 2001, J. Biol. Chem. 276: 26733-36]을 참조하시오). siRNA의 발현에 특히 적합한 것은 RNA pol III 프로모터의 유형 3이며, 이에 의해 전사는 오직 5'-인접 영역, 즉 전사 출발 부위의 상류에서만 발견되는 시스-작용 요소에 의해 구동된다. 상류 서열 요소는 전사 TATA 박스(문헌[Mattaj et al., 1988 Cell 55, 435-442]), 근접 서열 요소 및 원위 서열 요소(DSE; 문헌[Gupta and Reddy, 1991 Nucleic Acids Res. 19, 2073-2075])를 포함한다. 유형 3 pol III 프로모터의 조절 하에 있는 유전자의 예는 U6 작은 핵 RNA(U6 snRNA), 7SK, Y, MRP, H1 및 텔로머라제 RNA 유전자이다(예를 들어 문헌[Myslinski et al., 2001, Nucl. Acids Res. 21: 2502-09]을 참조하시오).
유전자 요법 벡터는 제 2 또는 추가의 폴리펩타이드를 암호화하는 제 2 또는 하나 이상의 추가의 뉴클레오타이드 서열을 임의로 포함할 수 있다. 제 2 또는 추가의 폴리펩타이드는 발현 구조물을 함유하는 세포의 동정, 선택 및/또는 선별을 허용하는 (선택가능한) 마커 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 목적에 적합한 마커 단백질은 예를 들어 형광 단백질 GFP, 및 선택 가능한 마커 유전자 HSV 티미딘 키나제(HAT 배지 상에서의 선택을 위해), 세균 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제(하이그로마이신 B 상에서의 선택을 위해), Tn5 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제(G418 상에서의 선택을 위해), 및 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)(메토트렉세이트 상에서의 선택을 위해), CD20, 저 친화성 신경 성장 인자 유전자이다. 이들 마커 유전자의 수득을 위한 공급원 및 그의 사용 방법은 문헌[Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]에 제공되어 있다.
한편으로, 제 2 또는 추가의 뉴클레오타이드 서열은 필요한 것처럼 보이는 경우, 트랜스제닉 세포로부터 환자를 치유시키는 고장-안전 기전을 제공하는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 상기와 같은 뉴클레오타이드 서열(종종 자살 유전자라 칭함)은 전구약물을, 폴리펩타이드가 발현되는 트랜스제닉 세포를 살해할 수 있는 독성 물질로 전환시킬 수 있는 상기 폴리펩타이드를 암호화한다. 상기와 같은 자살 유전자의 적합한 예는 예를 들어 이 콜라이 시토신 데아미나제 유전자 또는 헤르페스 단순 바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 수두 대상포진 바이러스(이 경우 강사이클로비어가 환자에게서 IL-10 트랜스제닉 세포를 살해하는 전구약물로서 사용될 수 있다)(문헌[Clair et al., 1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31: 844-849])로부터의 티미딘 키나제 유전자들 중 하나를 포함한다.
특이적인 폴리펩타이드의 발현의 녹다운을 위해, 유전자 요법 벡터 또는 다른 발현 구조물이 바람직하게는 RNAi제, 즉 RNA 간섭이 가능하거나 또는 RNA 간섭이 가능한 RNA 분자의 일부인 RNA 분자를 암호화하는 목적하는 뉴클레오타이드 서열의 발현에 사용된다. 상기와 같은 RNA 분자를 siRNA(짧은 간섭 RNA, 예를 들어 짧은 헤어핀 RNA 포함)라 칭한다. 한편으로, siRNA 분자는 직접적으로, 예를 들어 Lgr5를 발현하는 세포, 또는 간 세포(즉 간세포 또는 담관 세포) 또는 간 오르가노이드 내에서 또는 이들에 이웃하여 투여되는 약학 조성물 중에 있을 수 있다.
목적하는 뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자 mRNA의 영역에 대한 안티센스 RNA를 암호화하는 안티센스 암호 DNA 및/또는 상기 표적 유전자 mRNA의 동일 영역에 대한 센스 RNA를 암호화하는 센스 암호 DNA를 포함한다. 본 발명의 DNA 구조물에서, 안티센스 및 센스 암호 DNA는 각각 안티센스 및 센스 RNA를 발현할 수 있는 상기 본 발명에서 정의한 바와 같은 하나 이상의 프로모터에 작동적으로 결합한다. "siRNA"는 바람직하게는 포유동물 세포에서 독성이 아닌 짧은 길이 이중-가닥 RNA인 작은 간섭 RNA를 의미한다(문헌[Elbashir et al., 2001, Nature 411: 494-98]; [Caplen et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-47]). 상기 길이는 21 내지 23 개 뉴클레오타이드로 반드시 제한되지는 않는다. 독성을 보이지 않는 한 siRNA의 길이에 대한 특별한 제한은 없다. "siRNA"는 예를 들어 15, 18 또는 21 뉴클레오타이드 이상 25, 30, 35 또는 49 뉴클레오타이드 이하의 길이일 수 있다. 한편으로, 발현되는 siRNA의 최종 전사 생성물의 이중-가닥 RNA 부분은 예를 들어 15, 18 또는 21 뉴클레오타이드 이상 25, 30, 35 또는 49 뉴클레오타이드 이하의 길이일 수 있다.
"안티센스 RNA"는 바람직하게는 표적 유전자 mRNA에 상보성인 서열을 갖는 RNA 가닥이며 상기 표적 유전자 mRNA에 결합함으로써 RNAi를 유도하는 것으로 생각된다. "센스 RNA"는 상기 안티센스 RNA에 상보성인 서열을 가지며, 그의 상보성 안티센스 RNA에 어닐링하여 siRNA를 형성한다. 상기와 관련하여 "표적 유전자"란 용어는 바람직하게는 본 발명의 시스템에 의해 발현되는 siRNA로 인해 침묵하는 발현을 갖는 유전자를 지칭하며 임의로 선택될 수 있다. 상기 표적 유전자로서 바람직하게는, 예를 들어 공지되어 있지만 그 작용은 밝힐 여지가 있는 서열을 갖는 유전자, 및 질병의 원인인 것으로 생각되는 발현을 갖는 유전자가 선택된다. 표적 유전자는 siRNA의 가닥들 중 하나(안티센스 RNA 가닥)에 결합할 수 있는 길이인 15 뉴클레오타이드 이상의 길이를 갖는 유전자의 mRNA의 부분 서열이 측정된 한, 게놈 서열이 완전히 밝혀지지 않은 것일 수도 있다. 따라서, 일부 서열(바람직하게는 15 뉴클레오타이드 이상)이 밝혀진 유전자, 발현된 서열 태그(EST) 및 mRNA의 부분을 그들의 완전한 길이 서열이 측정되지 않았다 하더라도 "표적 유전자"로서 선택할 수 있다.
2 개의 RNA 가닥이 짝을 이루는 siRNA의 이중-가닥 RNA 부분은 완전한 쌍의 것들로 제한되지 않으며, 불합치(상응하는 뉴클레오타이드들이 상보적이지 않다), 튀어나옴(한쪽 가닥 상의 상응하는 상보성 뉴클레오타이드의 결여) 등으로 인해 짝을 이루지 못한 부분을 함유할 수도 있다. 짝을 이루지 못한 부분은 상기 부분이 siRNA 형성을 간섭하지 않는 정도로 함유될 수 있다. 본 발명에 사용된 "튀어나옴"은 바람직하게는 1 내지 2 개의 짝을 이루지 못한 뉴클레오타이드, 및 2 개의 RNA 가닥이 바람직하게는 1 내지 7, 보다 바람직하게는 1 내지 5 개의 튀어나온 부분을 함유하는 siRNA의 이중-가닥 RNA 영역을 포함한다. 또한, 본 발명에 사용된 "불합치"는 바람직하게는 2 개의 RNA 가닥이 쌍을 이루는 siRNA의 이중-가닥 RNA 영역 중에, 바람직하게는 1 내지 7, 보다 바람직하게는 1 내지 5 개의 수로 함유된다. 바람직한 불합치에서, 상기 뉴클레오타이드들 중 하나는 구아닌이고, 다른 것은 유라실이다. 상기와 같은 불합치는 센스 RNA를 암호화하는 DNA에서 C에서 T, G에서 A로의 돌연변이, 또는 이들의 혼합물에 기인하지만, 이들로 특별히 제한되지는 않는다. 더욱 또한, 본 발명에서 2 개의 RNA 가닥이 짝을 이루는 siRNA의 이중 가닥 RNA 영역은 튀어나온 부분과 불합치된 부분을, 합해서 바람직하게는 1 내지 7, 보다 바람직하게는 1 내지 5 개의 수로 함유할 수 있다. 상기와 같은 짝을 이루지 못한 부분들(불합치 또는 튀어나온 부분 등)은 안티센스와 센스 암호 DNA 사이의 하기에 개시하는 재조합을 억제할 수 있으며 하기에 개시하는 바와 같은 siRNA 발현 시스템을 안정하게 한다. 더욱 또한, 2 개의 RNA 가닥이 짝을 이루는 siRNA의 이중 가닥 RNA 영역 중 짝을 이루지 못한 부분을 함유하지 않는 줄기 고리 DNA를 서열화하는 것은 어렵지만, 상술한 바와 같이 불합치 또는 튀어나온 부분을 도입시킴으로써 상기 서열화가 가능하다. 더욱이, 상기 짝을 이루는 이중 가닥 RNA 영역 중에 불합치 또는 튀어나온 부분을 함유하는 siRNA는 이 콜라이 또는 동물 세포에서 안정하다는 이점을 갖는다.
siRNA의 말단 구조는 siRNA가 그의 RNAi 효과로 인해 표적 유전자 발현을 침묵하게 할 수 있는 한 평활하거나 부착성(돌출)일 수 있다. 상기 부착(돌출) 단부 구조는 단지 3' 돌출로만 국한되지 않으며, 5' 돌출 구조도 상기 RNAi 효과를 유도할 수 있는 한 포함될 수 있다. 또한, 돌출 뉴클레오타이드의 수는 이미 보고된 2 또는 3 개로 제한되지 않으며, 상기 돌출이 상기 RNAi 효과를 유도할 수 있는 한 임의의 수일 수 있다. 예를 들어, 상기 돌출은 1 내지 8, 바람직하게는 2 내지 4 뉴클레오타이드로 이루어진다. 본 발명에서, 부착 단부 구조를 갖는 siRNA의 총 길이는 짝을 이룬 이중 가닥 부분의 길이와 양쪽 단부에 돌출하는 단일 가닥을 포함하는 한 쌍의 길이의 합으로서 표현된다. 예를 들어, 양쪽 단부에 4 개의 뉴클레오타이드 돌출을 갖는 19 bp 이중 가닥 RNA 부분의 경우에, 전체 길이는 23 bp로서 표현된다. 더욱 또한, 상기 돌출 서열은 표적 유전자에 대해 낮은 특이성을 가지므로, 상기 표적 유전자 서열에 상보성(안티센스)이거나 동일(센스)할 필요는 없다. 더욱 또한, siRNA가 표적 유전자에 대한 그의 유전자 침묵을 유지할 수 있는 한, siRNA는 예를 들어 그의 한쪽 단부의 상기 돌출 부분 중에 저 분자량 RNA(천연 RNA 분자, 예를 들어 tRNA, rRNA 또는 바이러스 RNA, 또는 인공 RNA 분자일 수 있다)를 함유할 수도 있다.
또한, "siRNA"의 말단 구조는 양쪽 단부가 상술한 바와 같이 반드시 컷오프 구조이며, 이중 가닥 RNA의 한쪽 단부가 링커 RNA("shRNA")에 의해 연결된 줄기-고리 구조를 가질 수 있다. 상기 이중 가닥 RNA 영역(줄기-고리 부분)의 길이는 예를 들어 15, 18 또는 21 뉴클레오타이드 이상 25, 30, 35 또는 49 뉴클레오타이드 이하의 길이일 수 있다. 한편으로, 발현되는 siRNA의 최종 전사 산물인 이중 가닥 RNA의 길이는 예를 들어 15, 18 또는 21 뉴클레오타이드 이상 25, 30, 35 또는 49 뉴클레오타이드 이하의 길이이다. 더욱 또한, 상기 줄기 부분의 짝짓기를 방해하지 않는 길이를 갖는 한 상기 링커의 길이에 대한 특별한 제한은 없다. 예를 들어, 상기 줄기 부분의 안정한 짝짓기 및 상기 부분을 암호화하는 DNA 사이의 재조합을 억제하기 위해서, 상기 링커 부분은 클로버-잎 tRNA 구조를 가질 수 있다. 상기 링커가 상기 줄기 부분의 짝짓기를 방해하는 길이를 갖는다 하더라도, 예를 들어 전구 RNA가 성숙한 RNA로 진행되는 동안 인트론이 절제되어, 상기 줄기 부분의 짝짓기를 허용하도록 상기 링커 부분이 상기 인트론을 포함하게 제작할 수 있다. 줄기-고리 siRNA의 경우에, 고리 구조를 갖지 않는 RNA의 어느 한 단부(머리 또는 꼬리)는 저 분자량 RNA를 가질 수도 있다. 상술한 바와 같이, 상기 저 분자량 RNA는 천연 RNA 분자, 예를 들어 tRNA, rRNA, snRNA 또는 바이러스 RNA, 또는 인공 RNA 분자일 수 있다.
각각 상기 안티센스 및 센스 암호 DNA로부터 안티센스 및 센스 RNA를 발현하기 위해서, 본 발명의 DNA 구조물은 상기 정의된 바와 같은 프로모터를 포함한다. 상기 구조물 중의 상기 프로모터의 수 및 위치는 원칙적으로 안티센스 및 센스 암호 DNA를 발현할 수 있는 한 임의로 선택될 수 있다. 본 발명의 DNA 구조물의 단순한 예로서, 프로모터가 안티센스와 센스 암호 DNA 모두의 상류에 위치하는 직렬 발현 시스템이 형성될 수 있다. 이러한 직렬 발현 시스템은 양쪽 단부에 상기 언급한 컷오프 구조를 갖는 siRNA를 생성시킬 수 있다. 상기 줄기-고리 siRNA 발현 시스템(줄기 발현 시스템)에서, 안티센스 및 센스 암호 DNA를 반대 방향으로 배열하고, 이들 DNA를 링커 DNA를 통해 연결하여 하나의 유닛을 제작한다. 프로모터를 상기 유닛의 한쪽에 결합시켜 줄기-고리 siRNA 발현 시스템을 제작한다. 본 발명에서, 상기 링커 DNA의 길이 및 서열에 특별한 제한은 없으며, 그의 길이가 종결 서열이 아니고 그의 길이 및 서열이 상술한 바와 같이 성숙한 RNA 생산 중 줄기 부분 짝짓기를 방해하지 않는 한 임의의 길이 및 서열을 가질 수 있다. 예로서, 상기 언급한 tRNA 등을 암호화하는 DNA를 링커 DNA로서 사용할 수 있다.
상기 직렬 및 줄기-고리 발현 시스템 모두의 경우에, 5' 단부는 상기 프로모터로부터 전사를 촉진할 수 있는 서열을 갖는다. 보다 구체적으로, 직결 siRNA의 경우에, siRNA 생산의 효율을, 안티센스 및 센스 암호 DNA의 5' 단부에서 상기 프로모터로부터 전사를 촉진할 수 있는 서열을 가함으로써 개선시킬 수 있다. 줄기-고리 siRNA의 경우에, 상기와 같은 서열을 상술한 유닛의 5' 단부에서 첨가할 수 있다. 상기와 같은 서열로부터의 전사물을, siRNA에 의한 표적 유전자 침묵이 방해되지 않는 한, siRNA에 결합되어 있는 상태로 사용할 수 있다. 상기 상태가 상기 유전자 침묵을 방해하는 경우, 트리밍 수단(예를 들어 당해 분야에 공지된 바와 같은 리보자임)을 사용하여 상기 전사물의 트리밍을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 안티센스 및 센스 RNA를 같은 벡터에서 또는 다른 벡터에서 발현시킬 수 있음은 숙련가에게 명백할 것이다. 상기 센스 및 안티센스 RNA 하류에 과잉 서열 첨가를 피하기 위해서, 각 가닥들(안티센스 및 센스 RNA를 암호화하는 가닥)의 3' 단부에 전사 종결자를 두는 것이 바람직하다. 상기 종결자는 4 개 이상의 연속적인 아데닌(A) 뉴클레오타이드의 서열일 수 있다.
본 서류 및 특허청구범위에서, "포함하는"이란 동사 및 그의 활용들은 상기 단어에 이어지는 항목들을 포함하지만, 구체적으로 언급되지 않은 항목들을 제외하지 않음을 의미하는 비제한적인 의미로 사용된다. 또한 "이루어지는"이란 동사는 본 발명에 정의된 바와 같은 생성물이 구체적으로 나타낸 것들보다 추가의 성분(들)(이때 상기 추가의 성분(들)은 본 발명의 독특한 특징을 변경시키지 않는다)을 포함할 수 있음을 의미하는 "필수적으로 이루어진"으로 대체할 수 있다. 또한, 본 발명에 정의된 바와 같은 방법은 구체적으로 나타낸 것들보다 추가적인 단계(들)(상기 추가적인 단계(들)는 본 발명의 독특한 특징을 변경시키지 않는다)를 포함할 수 있다. 또한, 부정관사 "하나의"에 의해 요소를 언급하는 것은, 내용상 하나 및 단지 하나의 상기 요소만이 있을 것을 명백히 요구하지 않는 한, 하나보다 많은 상기 요소가 존재할 가능성을 제외하지 않는다. 따라서 부정관사 "하나의"는 대개 "하나 이상"을 의미한다. "약" 또는 "대략"이란 단어는 수치(약 10)와 함께 사용될 때, 바람직하게는 10 이상 또는 주어진 값의 1% 미만의 값일 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고문헌들은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
하기의 실시예들은 단지 예시를 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 식으로도 제한하고자 하지 않는다.
도면의 설명
도 1은 간 오르가노이드 성장 인자 요건을 나타낸다. (A) FGF10, HGF 및 니코틴아미드가 보충된, EGF(E), R-스폰딘 1(R), 노긴(N), Wnt3A 처리된 배지(W) 또는 이들의 조합과 함께 유지된 간 오르가노이드의 DIC 상. (B) 오르가노이드의 수를 매주 카운트하고 필요에 따라 계대 배양하였다. 결과를 3 개의 독립적인 실험들의 평균±SEM으로 나타낸다. (C) Lgr5, 케라틴 7(K7) 및 알부민(Alb) 유전자의 RTPCR에 의한 유전자 발현 분석. (D) 오르가노이드로 성장하는 단리된 담도. 시딩 후 상응하는 일수로부터의 차동 간섭 콘트라스트 상. 배율 10x(0, 1, 3 및 5일). 15일 배율 4x. 배양물을 기계적 해리에 의해 매 4 내지 7일마다 계대배양하였다. 배양물을 8 개월 이상 증식시켰다.
도 2는 간 오르가노이드의 형태를 나타낸다. (A) 상부 패널: 상이한 도메인을 나타내는 마우스 간의 파라핀 섹션(PT = 간삼조, CV = 중심 정맥). 하부 패널: 상이한 도메인 b(단층 상피) 및 h(중층 상피)를 나타내는 간 오르가노이드의 파라핀 섹션 (B) 우측 패널: 간 오르가노이드에서 카데린 염색. 2 개의 상이한 도메인들이 확인될 수 있다. 간의 담관 구조를 닮은 단층 상피에 의해 형성된 도메인 b. 상기 담관 도메인은 판사이토케라틴(PCK)에 대해 양성 염색을 나타내는 고도로 편향된 세포에 의해 형성된다(하부 패널). 좌측 패널은 상기 간 오르가노이드 내 제 2 도메인의 존재를 나타낸다. 상기 h 도메인은 편향되지 않은 세포를 갖는 중층 상피에 의해 형성된다. 상기 세포들은 중심 관강 주변에서 조직화되고 간세포 마커 Alb를 발현한다. 배율 10x.
도 3은 간 배양물 중의 Wnt 신호전달을 나타낸다. Lac Z 발현이 Lgr5-LacZ 또는 Axin2 LacZ 마우스로부터 유래한 배양물에서 검출되었다. B16 마우스로부터 유래한 간 배양물에서는 양성 염색이 검출되지 않았다. 배율 4x, 삽화 20x.
도 4는 간 분화 마커의 발현을 나타낸다. (A) 담관세포 마커 케라틴 7(K7) 및 간세포 마커 케라틴 8(K8) 및 알부민(Alb)의 발현에 대한 면역조직화학 및 면역형광 분석. (B) 간세포 마커: 알부민(Alb), 트랜스티레틴(Ttr), 글루타민 신시타제(Glu), 글루코스 6 포스파타제(G6P) 및 시토크롬 P450 동형 3A11(CYP3A11); 및 담관세포 마커 케라틴 7(K7) 및 케라틴 19(K19)의 유전자 발현에 대한 분석.
도 5는 간 단세포 배양물을 나타낸다. (A) 분류된 세포의 면적을 가리키는 유식 세포측정 플롯. (B) 지정된 시점들에서 오르가노이드로 성장하는 단세포. 배율 40x(1 내지 3일), 10x(16일), 4x(21일). (C&D) Lgr5GFP 단일 분류된 세포의 콜로니 형성 효율의 대표적인 상. 100 개 세포를 3중으로 시딩하고 콜로니를 10일 후에 카운트하였다.
도 6은 간 배양물의 미세배열 분석을 나타낸다. ER 또는 노긴이 보충된 ER 배지(ENR) 또는 노긴 및 Wnt가 보충된 ER 배지(ENRW)에서 1 개월 동안 유지된 성체 간 조직 및 간 오르가노이드 배양물의 유전자 발현 프로파일에 대한 분석. 상기 유전자 프로파일을 상이한 샘플들과 이마 지방조직(BAT) 백색 지방 조직(WAT), 근육 및 신생 간 사이에서 비교하였다. (A) 히트 맵(hit map) 분석은 배양물이 성체 간에 대해 유사하지만 근육으로서 비-간 관련된 조직 및 BAT 및 WAT에 대해 상이한 프로파일을 보임을 나타낸다. (B) 상이한 조건 하에서 간세포 마커 및 담관세포 마커의 목록.
도 7은 마우스 간 오르가노이드 배양물이 장기간 배양 후 안정한 염색체 분석을 보임을 나타낸다.
A - 24 시간의 기간 동안 FGF10, HGF 및 니코틴아미드가 보충된 EGF(E) 및 R-스폰딘 1(R)에서 유지되거나(좌측 도면, ER) 또는 노긴(N) 및 Wnt3A 처리된 배지(W)가 보충된 동일한 조합에서 유지된(우측 도면, ENRW) 간 오르가노이드의 DIC 상.
B - 배양물에서 8 개월 후의 마우스 간 오르가노이드의 염색체 분석. 정상적인 염색체 수(n = 40, 좌측 패널 도면) 및 전형적인 간세포 특징인 배수성이 발견되었다(n = 80, 우측 패널 도면).
도 8은 보충 인자 FGF10, HGF 및 니코틴아미드; 성장 및 분화에 대한 영향을 나타낸다.
A - 간모세포에서부터 성숙한 간세포로의, 3 단계의 간 발생 도중 차별적으로 발현된 유전자들을 도시하는 다이어그램이다.
B - 사용된 프로토콜을 나타내는 도해이다. 배양물을 실험 2일 전에 확대 배지 EM2(ERFHNic: EGF(E) 및 R-스폰딘 1(R), FGF10, HGF 및 니코틴아미드가 보충됨; ERFHNic는 도 8B에서 'ER'로서 나타낸다)에 시딩하였다. 2일 후에, 배양 배지를 본문에 서술된 농도로, EGF(E) 단독, 또는 FGF10(F) 및 HGF(H) 및 니코틴아미드(Nic) 및 이들의 조합 중에서 선택된 추가적인 보충물과 함께 또는 상기 보충물 없이 R-스폰딘 1(ER)이 보충된 EGF로 교환하였다. 5일 후에 배양물을 분할하고 각각의 조건에 대해 1:4 비로 재도말하였다. 이러한 조건 하에서, 배양물을 분할하였으며 총 10 주의 기간 동안 매 7일마다 재도말하였다.
C - 각각의 배양 조건에서 최초 분할 후 제1일에 시험하였다. 결과는 FGF10 또는 HGF 또는 니코틴아미드 또는 이들의 조합과 병용된 EGF 및 R-스폰딘 1이 1 회 이상의 계대 배양을 성취하는데 필수적임을 보인다.
D - 장기간 배양 후, FNic가 보충된 ER 또는 FHNic가 보충된 ER의 조합 모두 높은 계대 수를 생성시킨다. 계대 배양 10 회 후에, 증식률은 상기 3 개의 보충 인자들을 포함하는 배양 조건의 경우 더 양호하다; ERFHNic(도 15A, B).
E - 몇몇 인자의 회수 후(출발점은 ERFHNic였다) 5일째에 상이한 간세포 마커(CYP3A11, Alb, FAH) 및 도관세포 마커(K19) 및 줄기 세포 마커 IGR5의 발현을 나타내는 RT-PCR 분석. 오직 조건 EF만이 시험된 모든 간세포 마커들의 발현을 보였음에 주목한다. HPRT를 하우스키핑 유전자로서 사용하여 유전자 발현을 표준화하였다.
도 9는 3 개의 상이한 간 배양 조건으로부터의 세포 및 성체 간 조직에서 상이한 간세포 및 담관세포 특이적 전사 인자의 정량분석을 나타내는 표를 나타낸다. 또한 노치 및 TGF-베타 신호전달 경로의 핵심 성분들의 발현을 나타낸다. E = EFHNic, ER = ERFHNic, ENRW = ENRWFHNic.
도 10은 분화 프로토콜을 나타낸다.
A - 사용된 프로토콜을 나타내는 도해이다. 배양물을 실험 2일 전에 확대 배지(ERFHNic: EGF(E) 및 R-스폰딘 1(R), FGF10, HGF 및 니코틴아미드가 보충됨; ERFHNic는 도 10A에서 'ER'로서 나타낸다)에 시딩하였다. 2일 후에, 배양 배지를, 나타낸 농도로, A8301(A), 또는 DAPT(D), 또는 FGF10(F) 또는 HGF(H) 또는 니코틴아미드(Nic) 또는 R-스폰딘 1(R) 또는 Wnt3A 또는 노긴(N) 또는 이들의 조합이 보충된 EGF(E)로 교환하였다. RNA를 여러 시점들에서 단리하였다. 마우스 간 조직을 양성 대조군(+)으로서 취한 반면 물을 음성 대조군(-)으로서 취하였다.
B - 분화 조건 후 7일째에 간세포 마커 CYP3A11, Alb, FAH, tbx3, TAT 및 Gck의 발현을 나타내는 RT-PCR 분석. 오직 조건 EADF만이 시험된 모든 간세포 마커들의 발현을 나타내었다. HPRT를 하우스키핑 유전자로서 사용하여 유전자 발현을 표준화하였다.
C - 분화 조건 후의 시간 과정 발현 분석. 분화 후 2, 5 및 8일째에, 간세포 마커 CYP3A11, Alb, FAH 및 담관세포 마커 K19의 발현을 RTPCR에 의해 분석하였다. 간 마커 CYP3A11 및 FAH의 발현이 5일째에 시작하여 8일 후에 피크임에 주목한다. HPRT를 하우스키핑 유전자로서 사용하여 유전자 발현을 표준화하였다. A; A8301, D; DAPT, F; FGF10, H; HGF, De; 덱사메타손.
D - 상이한 농도의 분화 화합물 A 및 D 7일 후 간세포 마커 CYP3A11, Alb, FAH, tbx3, TAT, G6P 및 Gck의 발현을 나타내는 적정 실험. HPRT를 하우스키핑 유전자로서 사용하여 유전자 발현을 표준화하였다.
E - 간 마커 K19, 알부민 및 간세포 표면 마커에 대한 면역형광 염색. 훽스트를 사용하여 핵을 염색하였다.
F - Albcreert2LacZ 마우스 간-유도된 오르가노이드상에서의 Xgal 염색. 알부민 양성 세포(화살표)가 타목시펜 유도된 Albcreert2LacZ 유도된 배양물에서 EADF 분화 후에 검출되었다.
도 11은 ERFHNic 배양 조건 하에서 인간-유래한 간 배양물을 나타낸다.
도 12는 생리학적 조건 하에서 또는 손상 후 재생 중 Wnt 신호전달 자극에 대한 간 반응을 나타낸다.
A: Axin2 LacZ 마우스에서 Lgr5 리간드 R-스폰딘1의 주입은 간 세포가 Wnt 자극에 반응성임을 보인다(화살표는 X-gal 양성 세포를 가리킨다). Lgr5 발현이 없으며, 따라서 발명자들은 Lgr4를 사용하여 상기 반응을 개시하였음을 가정한다.
B: Axin2 LAcZ 마우스에서 CCL4 주입은 재생 응답기간 동안 Wnt 신호전달이 활성화됨을 보인다.
도 13은 간 손상-재생 모델에 따른 Lgr5 상향조절을 나타낸다.
성체 Lgr5-LacZ KI 마우스에게 0.8 ㎖/㎏의 간독성 화합물 CCL4를 주사하였다. 도면은 주사하지 않은(손상되지 않은) 간에서 Wnt 경로가 오직 상기 도관을 따라 늘어선 세포들에서만 활성임을 보인다. CCl4 세포에 의한 손상 후에 또한 도관을 따라 늘어서있지 않은 세포들은 활성화된 Wnt 경로를 갖는다.
A - CCL4 손상된 간에서 Lgr5의 상향조절을 나타내는 시간 과정 실험(화살표는 x-gal 양성 세포를 나타낸다). 대조용의 CCL4 주사된 WT 마우스 및 위약-주사된 Lgr5LacZ Ki 마우스는 어떠한 염색도 나타내지 않았다(우측 패널).
B - Lgr5는 간 마커와 함께 염색됨.
도 14는 K19의 단리된 도관 염색을 나타낸다.
Lgr5LacZ 도관 단리. K19 염색은 상기 단리되고 시딩된 구조물이 실제로 간 내 도관임을 입증한다.
도 15는 성장 인자 요건을 나타낸다.
3 개의 보충 인자(FGF10, HGF 및 니코틴아미드)는 간 배양물의 장기적인 자기-유지에 필수적이다. 장기간 배양 후, FNic($) 또는 ERFHNic($$)를 포함하는 ER의 조합은 모두 높은 계대 수를 생성시킨다. 10 회 계대 배양 후, 증식률은 상기 3 개의 보충 인자를 포함하는 배양 조건의 경우 더 양호하다; ERFHNic(도 16B 참조).
도 16은 분화 조건 하에서 마우스 간 오르가노이드의 유전자 발현 프로파일이 성체 및 신생 간 프로파일을 닮음을 나타낸다.
A - 분화 조건 EADF 및 성체 또는 신생 간 사이에서 유사하게 발현되거나(a) 또는 유사하게 정지된(b) 유전자를 나타내는 유전자 클러스터.
B - 간 오르가노이드와 성체 또는 신생 간 사이에서 차별적으로 발현된 유전자(a) 및 EADF와 신생 간 사이에서 유사하게 발현된 유전자(b)를 나타내는 유전자 클러스터.
C - 발현 배지 중의 선택된 도관 마커, Ngn3 발현에 필요한 전사 인자, 및 성체 간, 성체 췌장, 췌장 오르가노이드 및 간 오르가노이드의 내분비 마커의 발현 수준을 비교하는, 미세배열 분석으로부터의 원 신호 데이터.
도 17은 간 질환 마우스 모델 내로의 세포 이식을 나타낸다.
오르가노이드를 마우스 모델, 즉 성체 FGR 마우스(FAH-/-RAG-/-IL2R-/-)에 이식하였다. 간세포를 대조용으로서 상기 마우스에게 이식하였다.
A - FAH 녹아웃 마우스 내에 이식된 간 오르가노이드로부터 유도된 K19 양성 세포(좌측 상부 패널) 및 Fah 양성 세포(중간 패널). 간세포 이식된 대조군(상부 우측 패널). 하부의 유식 세포측정 플롯은 간세포 양성 세포의 %가 양성 FAH 이식된 간세포를 생성시킨 그룹에서 더 높음을 보인다.
C & D - 이식된 세포의 유식 세포측정 분석. (C) Lgr5-GFP 마우스로부터 수득된 클론 1, 및 (D) Lgr5-lacZ 마우스로부터 수득된 클론 2. 상기 간세포 표면 마커는 대 세포 및 고도로 과립성인 세포, 즉 성숙한 간세포의 표현형을 나타내는 세포를 포함하는 양성 부분 모집단을 나타낸다.
E - 이식 스케줄.
도 18은 마우스 간 특징 유전자를 나타낸다.
a) 마우스 간 줄기 세포에서 발현된 마커; b) 마우스 간 줄기 세포에서 발현되지 않은 마커; c) 확대 배지에서 마우스 간 오르가노이드에 대한 마우스 간 줄기 세포 특징이 발현된 간세포 및 담관세포 마커; d) 확대 배지에서 마우스 간 오르가노이드에 대한 마우스 간 줄기 세포 특징이 발현되지 않은 간세포 및 담관세포 마커; e) 마우스 간 오르가노이드에서 발현된 재프로그램화 유전자; f) 마우스 간 오르가노이드에서 발현되지 않은 재프로그램화 유전자를 나타내는 표. 상기 결과를 기준 RNA로서 보편적인 인간 기준 RNA(스트라타진, 카탈로그 # 740000)을 사용하는 간 미세배열을 사용하여 획득하였다. 검출된 절대 숫자가 100 미만인 경우, 상기 유전자는 검출되지 않은 것으로서 간주하였다.
도 19는 인간 간 특징 유전자를 나타낸다.
인간 오르가노이드의 간 미세배열의 결과를 나타내는 표. 좌측에서 우측으로, a) 확대 배지 EM1, b) 확대 배지 EM2, c) 분화 배지, d) 성체 간에 대한 결과를 나타낸다.
좌측 4 개 컬럼의 숫자(log2)는 모든 분석에 사용된 샘플과 기준(상업적인) RNA 샘플간의 비교 결과이다. 상기 기준 샘플 중에 존재하는 RNA에 대한 각 샘플 중의 mRNA의 상대적인 발현을 나타낸다. 사용된 기준 RNA는 보편적인 인간 기준 RNA(스트라타진, 카탈로그 # 740000)이었다. 따라서, 상기 컬럼 중의 음의 숫자는 실제 발현 수준과 관련되지 않고, 단지 상기 기준 샘플 중에 상기 RNA가 더 적게 있음을 의미한다. 우측 4 개의 컬럼은 절대 숫자이다. 상기가 100 이하이면, 이는 검출되지 않는 것으로 간주한다.
실시예
실시예 1 - 간 오르가노이드 생육 및 확대를 위한 확대 배지
단리 후에, 담도(도 1 참조)를 매트리젤에 현탁하고 상이한 생육 인자 조건에서 배양하였다. FGF10(100 ng/㎖), HGF(25-50 ng/㎖) 및 니코틴아미드(1-10 mM)가 보충된 EGF(50 ng/㎖) 및 R-스폰딘 1(1 ug/㎖)의 조합(ERFHNic)이 상기 배양물의 장기간 유지에 필수적이었으며, 이는 Wnt 신호전달 및 EGF 신호전달이 시험관 내에서 성체 간 선조세포 증식을 유지하기 위해 엄격히 요구됨을 가리킨다. 노긴(100 ng/㎖) 및 Wnt 처리된 배지(50%)의 첨가는 또한 상기 배양물의 장기간 유지를 나타내었다(도 1A 및 1B 참조). 장기간 유지를 지지하는 상기 조건 하에서, Lgr5 발현뿐만 아니라 간세포 마커(알부민) 및 담관세포 마커(K7)는 RT-PCR에 의해 검출되었다(도 1C 참조). 이러한 조건 하에서 간 오르가노이드를 1:8 희석으로 기계적 또는 효소적 해리에 의해 매주 계대 배양하였으며, 수 개월 동안 증식시켰다(도 1D).
우리는 상기 배양물 중의 Wnt 표적 유전자 Axin2 및 Lgr5의 발현을 분석하였다. 2 개의 Axin2LacZ 및 Lgr5-LacZ 간 배양물은 모두 시딩 후 1 개월째에 상기 간 오르가노이드 중의 Axin2- 및 Lgr5-양성 세포의 존재를 드러냈으며, 따라서 이는 상기 Wnt 신호전달이 활성이고 배양물 증식에 필요함을 입증한다(도 3). 상기 간 배양물은 또한 간세포 마커(예를 들어 알부민, 트랜스티레트린, 글루타민 신시타제) 및 담관세포 마커(케라틴 7 및 19)를 발현한다(도 4 참조).
Lgr5LacZ 또는 Lgr5GFP 마우스로부터의 단일 Lgr5 세포를 분류한 경우, 단일 콜로니들이 오르가노이드로 성장하였다. 이러한 배양물은 또한 담관세포 및 간세포 계통의 마커를 발현하며 상기 배양물을 4 개월 넘게 유지하고 1:6 내지 1:8로 규칙적으로 분할시켰다(도 5A & B 참조). 흥미롭게도, 오직 Lgr5 양성 세포로부터 유도된 배양물만이 오르가노이드로 성장하였다(도 5C & D). 이들 데이터는 Lgr5 세포가 상기 배양물의 선조세포이며 2 개의 상이한 간 계통의 자손을 번식시킬 수 있음을 가리킨다.
상기 간 오르가노이드가 Lgr5+ 세포로부터 유도됨이 확립되었을 때, 우리는 성체 간 특징과 비교된 개별적인 유전자 특징의 측정에 착수하였다. RNA를 성체 간, 및 FGF10, 니코틴아미드 및 간세포 성장 인자가 보충된 ER 또는 ENRW 배지에서 증식된 간 오르가노이드로부터 단리하였다. 상기 성체 간 및 2 개의 간 배양 조건의 유전자 특징은 보편적인 RNA 기준의 발현에 관한 비교 유전자 발현 프로파일링을 통해 후속적으로 유도되었다. 상기 모든 샘플들에 대한 하이브리드화를 위한 동일한 기준 RNA의 사용은 우리로 하여금 상기 3 개의 독립적인 샘플들(성체 간, ER 및 ENRW)을 비교하게 하였다. 히트 맵 분석은 상기 두 배양 조건 모두의 발현 프로파일이 성체 간 조직 발현 프로파일과 매우 닮은 반면, 근육 또는 지방조직 프로파일과 비교 시 동일한 프로파일을 공유하지 않음을 밝혔다(도 6 참조). 성체 간과 간 배양물 간의 유사한 유전자 발현 프로파일 중에서, HNF1a, HNF1b, HNF4, Alb, Glul, Met, G6P, Fahd1, Fahd2a, CYP4B1, K7 및 K19로서 간 특이 유전자들이 검출된다. 상기 히트 맵 분석은 상기 두 배양 조건이 모두 서로 및 성체 간 샘플과 비교 시 유사한 발현 패턴을 제공함을 밝힌다. 그러나, 상기 데이터를 상세히 분석할 때, 우리는 Wnt 부재 및 노긴 부재 조건이 상기 두 성장 인자를 모두 포함하는 조건보다 더 차별적인 패턴을 나타냄을 관찰할 수 있다. 이는 간세포 분화(알부민 발현에 의해)가 Wnt의 존재 하에서 거의 존재하지 않는 도 1C에 나타낸 데이터와 일치한다. 상기 결과는 Wnt가 상기 분화의 희생으로 상기 배양물의 자가분열을 촉진함을 가리킬 수 있다.
또한, 상기 두 배양 조건 모두에서뿐만 아니라 성체 간에서, AFP로서 비-특이적인 성체 간 유전자, 및 Pdx1 또는 뉴로D로서 비-간 전사 인자를 검출할 수 있다.
성체 간에서는 아닌, 상기 두 배양 조건 모두에서, 상기 줄기 세포 마커 Lgr5가 상기 간 배양 특징 중 가장 고도로 풍부한 유전자들 중 하나임은 주목할만하다. 또한, Cd44 및 Sox9(문헌[Barker & Huch et al Cell stem cell 2010])로서 소장 및 위의 선조세포 집단의 세포 마커는 성체 간에서는 아닌, 상기 두 배양 조건 모두에서 고도로 발현되었으며, 이는 다시 상기 간 성체의 자가분열 능력뿐만 아니라 정상적인 성체 간의 정지 상태를 가리킨다.
추가로, Lgr5와 별개로, 다중 Wnt 표적 유전자들이 또한, 특히 MMP7, Sp5 및 Tnfrs19를 포함하는 성체 간에 비해 상기 간 배양물 중에서 매우 상향조절되었으며, 이는 상기 배양물의 자가분열 능력을 유지하는, 활성이고 강건한 기본적인 Wnt 신호전달 활성 요건의 강한 증거를 제공한다.
실시예 2 - 개선된 분화 배지
ER 또는 ENRW 조건 하에서 상기 간 배양물은 자가분열하며 이를 1년까지 매주 기준으로 유지 및 확대시킬 수 있다(도 7A). 1년 후 염색체 분석은 염색체 이상의 증거를 보이지 않는다. 상기 분석된 세포의 66%가 넘게 정상적인 염색체 수를 나타내었고 이 중 13%는 또한 간세포의 특징적인 특징인 배수성을 나타내었다(도 7B).
FGF10(100 ng/㎖), HGF(25-50 ng/㎖) 및 니코틴아미드(1-10 mM)가 보충된 EGF(50 ng/㎖) 및 R-스폰딘 1(1 ug/㎖)의 조합이 상기 배양물의 장기간 유지에 바람직하였다. 이러한 조건 하에서, 우리는 담도 및 일부 간모세포 또는 미성숙-간세포 마커(Glul, 알부민)를 발현하는 장수 세포 배양물을 수득하였다. 그러나, 상기 간세포 마커에 대해 양성인 세포의 수는 매우 낮았다. 이러한 배양 조건 하에서 성숙한 간세포 마커(예를 들어 p450 시토크롬)는 검출되지 않았다. 상기 결과는 여기에 개시된 배양 조건이 보다 낮은 수에도 불구하고 간세포-유사 세포, 그러나 충분히 성숙하지 않은 간세포를 생성시킬 수 있는 간 선조세포의 확대를 촉진함을 암시한다(도 8A).
시험관 내에서 상기 배양물의 간세포 성질을 증대시키고 성숙한 간세포를 수득하기 위해서, 우리는 먼저 상기 EGF 및 R-스폰딘 1에 첨가된 3 개의 보충 인자(FGF10, HGF 및 니코틴아미드)가 간세포 발현뿐만 아니라 상기 배양물의 자가분열에 대해 양의 효과를 발휘하는지 또는 음의 효과를 발휘하는지를 측정하였다. 우리는 간 오르가노이드 배양물을 생성시켰고 이를 EGF 또는 EGF 및 R-스폰딘 1 + FGF10 또는 HGF 또는 니코틴아미드 또는 이들의 조합과 함께 배양하고, 상기 배양물을 총 10 주의 기간 동안 매주 한 번 분할하였다. 각 시점에서 우리는 또한 여러 성숙한 간세포 마커들(FAH, CYP3A11) 및 간모세포 마커(알부민)의 발현을 분석하였다(도 8B).
도 1의 데이터와 일치하게(실시예 1 참조), 우리는 FGF10과 병용된 R-스폰딘 1 및 니코틴아미드가 간 배양물의 생육과 자가분열에 필수적임을 관찰하였다(도 8C&D). R-스폰딘1 및 니코틴아미드는 모두 성숙한 마커 CYP3A11의 발현을 억제하며 간모세포 마커 알부민의 발현은 여전히 촉진한다. 오직 EGF만을 함유하는 배지에(R-스폰딘1 부재 및 니코틴아미드 부재) FGF10 또는 HGF의 첨가는 매우 낮은 수준에도 불구하고 성숙한 마커 CYP3A11의 발현을 촉진하였다(도 8E). 간세포 분화를 촉진시킬 수도 있는 추가적인 화합물들을 확인하기 위해서, 우리는 EGF + HGF 및/또는 FGF10의 기본 조건을 기본으로, 2 개의 상이한 접근법을 사용하였다.
첫 번째 접근법은 EGF + FGF10 또는 HGF 조건 이외에 일련의 화합물들을 시험함을 수반하였다. 상기 분석된 화합물들의 완전한 목록을 표 2에 나타낸다.
화합물 신호 농도 결과
Alb CYP3AII
엑센딘4 글루카곤 유사 펩타이드 2 동족체 시그마(Sigma) E7144 0.1-1uM
레티노산 RAR-RXR 수용체 리간드 시그마(Sigma) 25nM
레티노산+엑센딘4
소닉 헤지호그 인비트로젠(Invitrogen) C25II 500-100ng/ml
BMP4 BMP 신호전달 페프로테크(Peprotech) 120-05 20ng/ml
DAPT 감마-세크레타제 억제제 시그마 D5942 10 nM
A8301 Alk5/4 /7 억제제 토크리스 바이오사이언스(Tocris Bioscience) 2939 50 nM
DAPT + A8301 +++ +++
FGF4 FGFR1,2 리간드 페프로테크 50ng/ml
FGF1 FGFR1,2,3,4 리간드 페프로테크 450-33A 100ng/ml
덱사메타손 시그마 D4902 25MG 10 M-1mM
온코스타틴 M (OSM) R&D systems 495-MO-025 10-1000 ng/ml
FGF4+OSM+Dexa
IGF 페프로테크 100ng/ml
발프로산 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 ERK, PKC Wnt/-카테닌 경로의 조절제 스템젠트(Stemgent) 04-0007 250 M
나트륨 부티레이트 히스톤 데아세틸라제 억제제 스템젠트 04-0005 250 M
BIX01294 G9a HMTase 억제제 스템젠트 04-0002 1 M
RG 108 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제 스템젠트 04-0001 1 M
TSA 100 nM + -
하이드로코르티손 글루코코르티코이드 시그마 H6909 5nM
온코스타틴 M
(OSM)		 R&D systems 495-MO-025 10-1000 ng/ml
ARA 시그마 A 0937 500 nM
R 59022 다이아실글리세롤 키나제 억제제 시그마 D 5919 500nM-50nM + +
알테레놀 바이트라트레(Arterenol bitrartre): ---- 안드레노수용체 작용물질 시그마 A 0937 500nM-50nM-5nM
LIF 103
PD 035901 MEK1억제제 액손 메드켐(Axon Medchem) cat n 1386 500nM
CHIR99021 GSK3 억제제 액손 메드켐(Axon Medchem) cat n 1408 3uM
DMSO 1%
L-아스코르브산 시그마 077K13021 1mM
VEGF 페프로테크
매트리젤 50%
매트리젤 20%
VEGF+DEXA
두 번째 접근법은 생체 내에서 담즙 및 간세포 분화를 성취하기 위해 필수적인 전사 인자들의 발현에 관한 공개된 개발 연구로부터의 지식을 고려하였다. FGF10, HGF 및 니코틴아미드가 보충된 E 또는 ER 또는 ENRW 조건 하에서 오르가노이드 중의 전사 인자들의 발현에 대한 비교 분석을 도 8에 나타낸다. tbx3 및 prox1 이외에, 간세포 명세에 필요한 모든 전사 인자들이 존재하였다. 그러나, 우리는 또한 특정한 담즙 전사 인자의 발현이 R-스폰딘1(R)을 함유하는 배양물에서 고도로 상향조절되었음을 알았으며, 이는 상기 배양물 유전자 발현이 보다 담즙 세포 운명 쪽으로 치우쳤음을 가리킨다.
노치 및 TGF-베타 신호전달 경로는 생체 내 담즙 세포 운명에 관련되었다. 실제로, Rbpj(활성 노치 신호전달을 성취하는데 필수적임)의 결실은 이상 관강형성을 생성시키고(문헌[Zong Y. Development 2009]) 간 외식체에 대한 TGF-베타의 첨가는 시험관 내 담즙 분화를 촉진한다(문헌[Clotman F. Genes and Development 2005]). 노치 및 TGF-베타 신호전달 경로는 상기 간 배양물에서 고도로 상향조절되었기 때문에(도 9), 우리는 담도 세포-운명의 억제가 상기 세포의 분화를 보다 간세포 표현형 쪽으로 촉발할 수도 있음을 추론하였다. A8301은 TGF-베타 수용체 ALK5, 4, 및7의 억제제로서, DAPT는 상기 노치 경로의 활성화에 필수적인 활성 프로테아제인 감마-세크레타제의 억제제로서 선택되었다. 우리는 먼저 상기 세포를 확대 조건(ER 배지)에서 2일간 배양하였고 2일째에(도 10A) 우리는 상이한 화합물들의 조합을 첨가함으로써 분화 조건을 시작하였다. 배지를 이틀마다 교환하였으며, 분화된 마커의 발현을 8 내지 9일 후에 분석하였다. ER 및 ENRW 조건을 음성 대조군으로서 사용하였다.
EGF + FGF10과 DAPT 및 A8301과의 조합은 분석된 간세포 마커(CYP3A11, TAT, 알부민)의 발현의 놀랍게도 큰 증대를 생성시켰다(도 10B). 상기 효과는 이미 5일까지 검출될 수 있었으며 8 내지 9일째에 피크였다(도 10C). 최대 농도 효율은 각각 10 uM(DAPT) 및 50 nM(A8301)(도 10D)에서 성취되었다. 덱사메타손(공지된 간세포 분화 분자)의 첨가는 유전자 발현에 어떠한 개선도 생성시키지 않았다. EGF, FGF10, A8301 및 DAPT의 조합은, 간세포 마커 알부민에 대한 면역형광 및 AlbCreLacZ 유도된 오르가노이드 상에서 2F8 및 Xgal 염색에 의해 평가 시, 상기 발현을 증대시킬 뿐만 아니라 간세포-유사 세포의 수를 증가시킨다(도 10E & F). 그러므로, 우리는 상기 언급한 분화 프로토콜이 간 줄기 세포 배양물로부터 시험관 내에서 간세포 유사 세포의 생성을 촉진한다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 3 - 인간 간 오르가노이드
상기 확대 조건들(ERFHNic 및 ENRWFHNic)을 사용하여, 우리는 또한 상기 확대 배지에 500 uM TGF 베타 억제제(A83-01)의 첨가와 함께 인간 담즙-유도된 배양물을 확대시킬 수 있었다(도 11).
물질 및 방법(실시예 1 내지 3의 경우)
간 배양물-담도 단리
단리된 성체 간 조직을 저온 어드밴스드-DMEM/F12(인비트로젠)로 세척하고 이어서, 상기 조직을 대략 5 ㎜ 조각으로 자르고 저온 해리 완충제(DMEM 배지 중의 콜라게나제, 디스파제, FBS)로 추가 세척하였다. 상기 조직 단편을 37 ℃에서 2 시간 동안 해리 완충제와 함께 배양하였다. 이어서, 상기 조직 단편을 10 ㎖ 피펫으로 10 ㎖의 저온 단리 완충제 중에 격렬히 현탁하였다. 죽은 세포를 함유하는 처음 상등액은 버리고 침전물을 10 내지 15 ㎖의 해리 완충제로 현탁하였다. 상기 조직 단편의 추가의 격렬한 현탁 후에, 상등액에는 담도가 농축된다. 이러한 과정을 충분한 담도가 수득될 때까지 반복한다.
단리된 담도를 펠릿화하고 50 ㎕의 매트리젤(BD 바이오사이언스)과 혼합하고, 24-웰 조직 배양 플레이트 상에 시딩하고, 상기 매트리젤의 완전한 중합시까지 37 ℃에서 5 내지 10 분간 배양하였다. 중합 후에, 500 ㎕의 조직 배양 배지를 과부하하였다.
배지 조성: B27, N2, 200 ng/㎖ N-아세틸시스테인, 50 ng/㎖ EGF, 1 ㎍/㎖ R-스폰딘1, 가스트린: 10 nM, FGF10 100 ng/㎖, 니코틴아미드 10 mM 및 HGF: 50 ng/㎖ 및 50% Wnt 처리된 배지가 보충된 어드밴스드-DMEM/F12.
전체 배지를 매 2일마다 교환하였다. 1 주일 후에, Wnt 처리된 배지를 회수하고 형성된 오르가노이드를 1000 ㎕ 피펫을 사용하여 상기 매트리젤로부터 회수하고 기계적으로 작은 단편들로 해리하고 새로운 매트리젤로 옮겼다. 주당 1 회 또는 2 회 1:4 분할비로 계대 배양을 수행하였다. 이러한 조건 하에서 배양물을 6 개월 이상 유지시켰다.
시약
인간 간세포 성장 인자(HGF)를 페프로테크로부터, EGF를 인비트로젠으로부터, R-스폰딘을 누벨로(Nuvelo)로부터, 노긴을 페프로테크로부터, FGF10을 페프로테크로부터, 가스트린을 시그마 알드리치로부터, 니코틴아미드를 시그마로부터 구입하였다.
미세배열
Lgr5-유도된 간 배양물의 발현 분석을 위해, RNA를 퀴아겐(Qiagen) RNAase 키트를 사용하여, 성체 간으로부터 또는 Wntcm 및 노긴 부재(ER) 또는 Wntcm 및 노긴 존재(ENRW) 하의 배지에서 배양된 간 배양물로부터 단리하였다. 150 ng의 전체 RNA를 저 RNA 투입 선형 Amp 키트(에이질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로 표지하였다. 보편적인 마우스 기준 RNA(에이질런트)를 구별하여 표지하고 성체 간 조직 또는 ER 또는 ENRW 처리된 배양물에 하이브리드화하였다. 4X44K 에이질런트 홀 마우스(Whole Mouse) 게놈 2색 미세배열(G4122F)을 사용하였다. 표지화, 하이브리드화, 및 세척을 에이질런트 지침에 따라 수행하였다.
실시예 4 - Lgr5 발현이 간 손상에 이어서 상향조절된다
간에서, Wnt 신호전달은 중심 정맥 영역에서 활성이다. 우리는 최근에 Wnt 신호전달이 간 대사에 중요한 역할을 함을 관찰하였다(문헌[Boj et al. personal communication]). 간 도관 세포에서, Wnt 신호전달은 간 손상에 이어서 활성화된다(문헌[Hu et al 2007, Gastroenterology, 133(5): 1579-91]). 유사하게, Wnt 신호전달에 대해 충실한, 일반적인 리포터를 나타내는 Axin2-LacZ 대립유전자를 사용하는 경우, 우리는 또한 Wnt 작용물질 Rspol의 주사 후(도 12A 참조) 또는 간독성 화합물 사염화 탄소(CCl4)에 의한 간 손상(도 12B 참조)에 이어 전체 간 세포조직에서 Wnt 신호전달의 상향 조절이 관찰되었다.
상기 Wnt 표적 유전자 Lgr5는 여러 가지 능동적으로 자가분열하는 조직에서 줄기 세포를 표시하지만, 손상 시 발현되는 것은 앞서 보고되지 않았다. 우리의 선행 개시된 Lgr5-LacZ 노크인 마우스(문헌[Barker et al, 2007, Nature 449 (7165): 1003-7])는, 잔류 mRNA 발현이 qPCR에 의해 검출되지만, Lgr5가 건강한 간에서 필수적으로 검출될 수 있음을 보인다. Lgr5-LacZ 노크인 마우스 상에 CCl4의 주사(LacZ a마우스의 경우 상기 문헌[Barker et al, 2007] 및 CCl4 방법의 설명의 경우 문헌[Furuyama K et al., Nat Genetics, 43, 34-41, 2001]을 참조하시오)에 이어서, 우리는 간에서 새로 형성된 돌기 구조물 중의 상기 리포터의 명백한 발현을 관찰하였으며(도 13A 참조), 이는 손상 후 6.5일째에 피크였고 9일까지 유지되어, 일단 상기 간이 손상 후 13일째에 완전히 재생되면 명백한 쇠퇴를 나타내었다(도 13A, 우측 상부 패널 참조). 상기 리포터의 발현은 유사한 손상 프로토콜을 겪은 야생형 한배 새끼에서는 검출되지 않았다(도 13A, 우측 기부 패널 참조).
활성 재생 부위에서 Lgr5 발현의 출현은 Lgr5가 손상 시 재생적인 줄기 세포/선조세포의 Wnt에 의한 드 노보 활성화를 알릴 수도 있음을 암시한다. 실제로, 우리는 상기 새로이 출현하는 Lgr5 세포가 성숙한 간 세포(K19 또는 FAH) 또는 성상 세포(SMA)의 마커를 발현하지 않고, 대신에 최근에 개시된 간 선조세포 마커 Sox9에 양성임을 발견하였다(도 13). 이는 시험관 내에서 오르가노이드를 수득하기 위한 출발점인 Lgr5+ 세포가 간 손상의 유도에 의해 또는 R-스폰딘에 의한 Wnt 신호전달의 자극에 의해 간 단편으로부터 수득될 수 있음을 의미한다. 상기 손상 또는 R-스폰딘에 의한 간 세포에서의 Lgr5 발현의 유도를 상기 세포를 수득하기 전에 생체 내에서, 단리된 간에서 생체 외에서, 또는 간 세포의 간 단편 또는 집단에서 시험관 내에서 수행할 수 있다.
실시예 5 - 간 오르가노이드 배양물의 장기간 확대
실시예 1에서, FGF10(100 ng/㎖), HGF(25-50 ng/㎖) 및 니코틴아미드(1-10 mM)가 보충된 EGF(50 ng/㎖) 및 R-스폰딘 1(1 ug/㎖)의 조합이 배양물의 장기간 유지에 바람직함을 발견하였다. 우리는 이제 또한 EGF 및 R-스폰딘1에 첨가된 3 개의 보충 인자(FGF10, HGF 및 니코틴아미드)가 모두 3 개월을 넘는 동안 상기 배양물의 확대에 필요함을 입증한다. 이를 평가하기 위해서, 도 14에 나타낸 바와 같이 우리가 상기 간 세포조직으로부터 담도를 단리하였고(K19 염색을 사용하여 상기 단리된 구조물의 정체를 확인하였다), 이를 i) EGF; 또는 ii) EGF 및 R-스폰딘1 + FGF10 또는 HGF 또는 니코틴아미드; 또는 iii) EGF 및 R-스폰딘1 + FGF10 및 HGF 및 니코틴아미드(ERFHNic)와 함께 배양함으로써 간 오르가노이드 배양물을 생성시켰다. 우리는 총 14 주의 기간 동안 1주일에 한 번 상기 배양물을 분할하였다. 결과는 실시예 1 및 2에 보고된 바와 같이, FGF10과 병용된 EGF, R-스폰딘1 및 니코틴아미드가 상기 간 배양물의 생육 및 자가분열에 필수적임을 입증하였다. 10 회의 계대 배양 후에, HGF가 결여된 배양물은 HGF가 보충된 배양물에 비해 생육 단점을 나타내었다. 여전히 생육 가능하지만, 증식비가 상기 완전한 조합(FGF10, HGF 및 니코틴아미드)이 보충된 배양물의 1:6 내지 1:8에 비해 1:2 내지 1:4로 감소하였다. 15 회의 계대 배양 후, HGF가 보충되지 않은 ERFNic를 갖는 배양물은 더 이상 생육가능하지 않았다. 따라서, 이러한 결과는 HGF가 장기간 유지 후 양호한 증식률을 유지하기 위해 필수적임을 암시한다(도 15).
실시예 6 - 분화 조건 하에서 간 오르가노이드에서 발현된 마커
실시예 2에 개시된 분화 프로토콜을 사용하여, 우리는 간 오르가노이드에서 간모세포 마커(알부민) 및 간세포 표면 마커를 검출할 수 있었다. 이들 간세포-유사 세포의 수를 정량분석하기 위해서, 우리는 간세포 표면 마커를 사용하여 상기 배양물의 유식 세포측정을 수행하였다. 우리는 확대 배양 조건에서 간세포 표면 마커-양성 세포가 거의 검출되지 않은 반면, 분화 후에, 상기 세포의 35% 이하가 상기 간세포 표면 마커에 대해 양성임을 관찰하였다(도 17B&C 참조).
이어서 우리는 상기 분화 조건하에서 마우스 간 오르가노이드의 유전자 발현 프로파일을 분석하였다(도 16 및 도 1, 우리는 예를 들어 Alb, FAH, 및 TAT 및 Cyp3 유전자의 강한 상향조절을 본다). 우리는 분화 후 상기 마우스 간 오르가노이드의 유전자 발현이 성숙한 마우스 간세포 및/또는 마우스 간의 경우와 닮음을 발견하였다.
실시예 7 - 마우스 내로의 간 오르가노이드의 이식
세포를 ERFHNic 확대 조건 및 EAFD 분화 조건을 사용하여 증식시킨 오르가노이드로부터 취하고 이를 I형 타이로신혈증 인간 질병에 대한 마우스 모델인 타이로신 대사 효소 퓨마릴아세토아세테이트 하이드롤라제(FAH) 결핍 마우스의 면역결핍 균주에 이식하였다(문헌[Azuma et al. 2007, Nature Biotech, 25(8), 903-910]). 이식 스케줄을 도 17D에 나타낸다. 예비 결과는 산란된 FAH 양성 세포가 FAH 결핍 마우스의 간 세포조직에서 발견될 수 있음을 보이며, 이는 상기 오르가노이드 배양물로부터 유도된 간 세포가 수용자 간에 이식되었음을 가리킨다(도 17A, 우측). 더욱 또한, 현저하게 증가된 수의 K19 양성 세포가 또한 상기 수용자 마우스의 간에서 검출되었다. 이는 상기 오르가노이드-유도된 이식된 세포가 생체 내에서 두 계통, 즉 간세포(FAH 마커에 의해 입증된 바와 같이) 및 담관세포(K19 마커에 의해 입증된 바와 같이)를 모두 생성시킬 수 있음을 암시한다(도 17A 참조, 좌측 상부 패널). 이는 2 개의 별도의 배양물로부터의 2 개의 별도의 클론으로부터 나온 이식 세포의 유식 세포측정 분석에 의해 추가로 지지되었다(각각 도 17B 및 17C). 상기 Lgr5+ 세포에 GFP를 함유하는 바이러스를 형질도입시켰으며 유식 세포측정 분석을 분화 후에 수행하였다. 상기 간세포 표면 마커에 대해 양성인 세포는 보다 큰 산란을 보이며, 이는 과립모양 및 성숙성, 즉 성숙한 간세포를 나타내는 보다 큰 세포를 가리킨다. 상기 간세포 표면 마커에 대해 음성인 세포는 보다 적은 산란을 생성시켰으며 이는 보다 작은 세포, 즉 덜 성숙한 선조세포를 가리킨다. 따라서, 모든 세포 유형들이 분화 배지 중에 존재한다(성숙 및 미성숙 세포). 상기 분화된 세포의 나머지, 따라서 FACS 분석에 사용되지 않은 세포를 이식 실험에 사용하였다.
실시예 8
본 발명의 방법에 따라 배양된 마우스 간으로부터의 오르가노이드를 미세배열 분석을 사용하여 분석하여 발현된 유전자 및 발현되지 않은 유전자를 측정하였다.
실시예 9
본 발명의 EM1, EM2 및 DM 배지를 사용하여 배양한 인간 간으로부터의 오르가노이드 및 인간 간을 올리고뉴클레오타이드 미세배열 분석을 사용하여 분석하여 발현된 유전자 및 발현되지 않은 유전자를 측정하였다. 현저하게 상이한 유전자 발현 프로파일이 확대 배지 중에서 발현된 유전자들, 즉 분화 배지에서 발현된 유전자와 성체 간에서 발현된 유전자 사이에서 현저하였다. 간세포 유전자 발현 성향은 상기 마우스에서의 경우와 대충 동일하지만, 상기 오르가노이드의 분화는 마우스 간 오르가노이드에서보다 더 적었다. 이는 사용된 인간 세포의 사용에 기인할 수도 있다.
종종 올리고뉴클레오타이드 미세배열을 사용하는 분석에서 발생하는 바와 같이, Lgr5 및 Tnfrsfl9는 검출되지 않았다. 그러나, 이들은 확대 배지에서 배양된 오르가노이드 중에 존재하는 것으로 밝혀졌다.
물질 및 방법(실시예 4 내지 7의 경우)
동물 처리
2 내지 8 개월된 Lgr5LacZ 또는 Axin2-LacZ 또는 WT 한배 새끼 BL6/Balbc F1 마우스에게 옥수수 오일 중에 용해된 0.8 ㎖/㎏의 CCL4(n=) 또는 옥수수 오일 단독(n=)을 복강 내 주사하였다. 마우스를 2 또는 5 또는 9 또는 13일 후에 죽이고 간을 단리하고 RNA 또는 b 갈락토시다제 염색을 위해 추가로 가공하였다.
β-갈락토시다제(lacZ) 염색
간 조직을 단리하고 즉시 4 ℃에서 회전 플랫폼 상에서 20 배 부피의 빙냉 고정제(PBS0 중의 1% 폼알데하이드; 0.2% 글루테르알데하이드; 0.02% NP40) 중에서 2 시간 동안 배양하였다. 상기 고정제를 제거하고 상기 조직을 실온에서 회전 플랫폼 상에서 20 분 동안 세척 완충제(PBS0; 2 mM MgCl2; 0.02% NP40; 0.1% Na데옥시콜레이트)로 2 회 세척하였다. 이어서 상기 β-갈락토시다제 기질(PBS0 중의 5 mM K3FE(CN)6; 5 mM K4Fe(CN)6·3H2O; 2 mM MgCl2; 0.02% NP40; 0.1% Na데옥시콜레이트; 1 ㎎/㎖ X-gal)을 가하고 상기 조직을 암실에서 37 ℃에서 2 시간 및 실온에서 밤새 배양하였다. 상기 기질을 제거하고 상기 조직을 실온에서 회전 플랫폼 상에서 20 분간 PBS0로 2 회 세척하였다. 이어서 상기 조직을 암실에서 4 ℃에서 회전 플랫폼 상에서 20 배 부피의 PBS0 중의 4% 파라폼알데하이드(PFA)에서 밤새 고정시켰다. 상기 PFA를 제거하고 상기 조직을 실온에서 회전 플랫폼 상에서 20 분 동안 PBS0 중에서 2 회 세척하였다.
상기 염색된 조직을 조직 카세트로 옮기고 파라핀 블록을 표준 방법을 사용하여 제조하였다. 조직 섹션(4 μM)을 제조하고 중성 레드로 대조염색하였다.
R-스폰딘1 처리
6 내지 8 주된 Axin2-lacZ 마우스에게 100 ㎍의 정제된 인간 R-스폰딘1을 IP 주사하고 간에서의 LacZ 발현 분석을 위해 48 시간 후에 죽였다.
RT-PCR
RNA를 RNeasy 미니 RNA 추출 키트(퀴아겐)를 사용하여 위 세포 배양물 또는 새로 단리된 조직으로부터 추출하고 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 역 전사효소(프로메가)를 사용하여 역 전사하였다. cDNA를 앞서 개시된 바와 같이 열 순환기(GeneAmp PCR System 9700; 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 영국 런던 소재)에서 증폭시켰다(문헌[Huch et al., 2009]). 사용된 프라이머들을 하기 표 3에 나타낸다.

유전자 명칭 		유전자
기호 		서열 PCR 산물 ( bp )
시토크롬 P450, 과 3, CYP3A11 fw TGGTCAAACGCCTCTCCTTGCTG 100
아과 a, 폴리펩타이드 11 rv ACTGGGCCAAAATCCCGCCG
글루코스-6-포스파타제 G6P fw GAATTACCAAGACTCCAGG 581
rv TGAGACAATACTTCCGGAGG
케라틴 19 Krt19 fw GTCCTACAGATTGACAATGC 549
rv CACGCTCTGGATCTGTGACA
알부민 Alb fw GCGCAGATGACAGGGCGGAA 358
rv GTGCCGTAGCATGCGGGAGG
t-박스 3 Tbx3 fw AGCGATCACGCAACGTGGCA 441
rv GGCTTCGCTGGGACACAGATCTTT
프로스페로-관련된-호메오박스 Prox1 fw TTCAACAGATGCATTACC 270
단백질 1 rv TCTTTGCCCGCGATGATG
퓨마릴아세토아세테이트- Fah fw ACGACTGGAGCGCACGAGAC 183
하이드롤라제 rv AGGGCTGGCTGTGGCAGAGA
타이로신 아미노트랜스퍼라제 Tat fw TTTGGCAGTGGCTGAAAGGCA 258
rv GGGCCCAGGATCCGCTGACT
트립토판2,3-다이옥시게나제 Tdo2 fw ACTCCCCGTAGAAGGCAGCGA 583
rv TCTTTCCAGCCATGCCTCCACT
류신-풍부 반복부- Lgr5 fw GGAAATGCTTTGACACACATTC 413
함유 G-단백질 rv GGAAGTCATCAAGGTTATTATAA
결합된 수용체 5
트랜스티레틴 TTR fw ATGGTCAAAGTCCTGGATGC 220
rv AATTCATGGAACGGGGAAAT
글루코키나제 Gck fw AAGATCATTGGCGGAAAG 193
rv GAGTGCTCAGGATGTTAAG
하이포잔틴 Hprt fw AAGCTTGCTGGTGAAAAGGA 186
포스포리보실트랜스퍼라제 rv TTGCGCTCATCTTAGGCTTT
면역조직화학
여기에서 사용된 면역염색 과정은 앞서 문헌[Huch et al. 2009]에 개시되었다. 간단히, 5-마이크로미터 섹션을 파라핀제거하고, 탈수하고, 조직 섹션을 PBS-T(PBS; 트윈20 0.1%)를 사용하여 투과성으로 만들었다. 필요한 경우, 섹션들을 항원 보상을 위해 10 mM 시트레이트 완충제(pH 6.0)로 처리하고, 보편적인 차단 완충제(BioGenex)를 사용하여 차단하고 1차 항체와 함께 배양하였다. 이어서 섹션들을 PBS로 2 회 세척하고 퍼옥시다제 접합된 2차 항체와 함께 배양하였다. DAB+(DAKO)를 색원체 기질로서 사용하였다. 섹션들을 마이어의 헤마톡실린으로 대조염색하고 레이카(Leica) DMR 현미경 상에서 가시화하였다. 사용된 1차 항체는 토끼 항-Sox9(1:600; RT에서 1 시간, 밀리포어(Millipore)), 마우스 항-SMA(1:1000, 4 ℃에서 밤새), 토끼 항-FAH(1:5000; 37 ℃에서 밤새, 엠 그롬페(M. Grompe)로부터의 선물), 토끼 항-K19(1:500; 4 ℃에서 밤새, 엠 그롬페로부터의 선물)이었다. 사용된 퍼옥시다제 접합된 2차 항체는 마우스 또는 토끼 브라이트비젼(Brightvision)(임뮤노로직(Immunologic))이었다.
면역형광
완전 적재(whole mount) 염색을 위해서, 오르가노이드 또는 단리된 담도를 아세톤(오르가노이드) 또는 PFA4%(담도)로 30 분간 고정시키고, PBS로 1 회 세척하고, PBS 0.3%트리톤-X100으로 5 분간 투과성으로 만들고, 보편적인 차단 용액(파워 블록 HK085-5KE BioGenex)을 사용하여 차단하고 PBS1%FBS 중에 희석된 1차 항체와 함께 밤새 배양하였다. PBS에서 수 회 세척에 이어서, 샘플을 상기 2차 항체와 함께 배양하였다. 핵을 훽스트33342로 염색하였다. 공초점 현미경 검사(레이카, SP5)를 사용하여 상을 획득하였다. 볼로시티(Volocity) 소프트웨어(임프로비젼(Improvision))를 사용하여 3차원 재건을 수행하였다. 사용된 1차 항체는 토끼 항-K19(1:500; 엠 그롬페로부터의 선물), 래트 항-간세포 표면 마커(1:50, 엠 그롬페로부터의 선물), 염소 항-알부민(1:50, 산타 크루즈(snata Cruz))이었다. 사용된 2차 항체는 모두 당나귀에서 발생되었으며 이를 상이한 알렉사 플루오로포어(당나귀 항-염소 568, 당나귀 항 래트-488, 당나귀 항 토끼-647, 몰레큘라 프로브스(Molecular probes))에 접합시켰다.
유식 세포측정
해리된 세포를 1:20 희석비의 MIC1-1C3 하이브리도마 상등액 또는 1:50 희석비의 OC2-2F8 하이브리도마 상등액의 첨가 전에 1 ㎖의 DMEM + 2% FBS 중에 1 x 104 세포/밀리리터로 재현탁하고, 4 ℃에서 30 분간 배양하였다. 저온의 둘베코 포스페이트 완충된 염수(DPBS)로 세척한 후에, 세포를 마우스 혈청 단백질(잭슨 임뮤노리써치(Jackson Immunoresearch))에 대해 흡착된 1:200 희석비의 APC-접합된 염소 항-래트 2차 항체를 함유하는 DMEM + 2% FBS에 재현탁하였다. 프로피디움 요오다이드 염색을 사용하여 배제시킬 죽은 세포를 표지하였다. 세포를 분석하고 사이토페이아 인플럭스(Cytopeia inFlux) V-GS(벡톤-디킨슨(Becton-Dickenson))로 분류하였다.
이식 분석
분류된 세포 집단을 비장에 주사하고 NTBC를 회수하여 간세포 선택을 유도하는 것을 앞서 개시한 바와 같이 수행하였다(문헌[Overturf et al., 1996]). 약물 회수를 3 주의 기간 후에 수행한 다음, 정상 체중이 상기 수용자 동물에서 회복될 때까지 재투여하였다.
<110> Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen <120> Liver organoid, uses thereof and culture method for obtaining them <130> Inc.9270 <140> 10-2013-7005407 <141> 2013-02-28 <150> EP 10171265.1 <151> 2010-07-29 <150> US 61/368736 <151> 2010-07-29 <150> US 61/520569 <151> 2011-06-10 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 tggtcaaacg cctctccttg ctg 23 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 actgggccaa aatcccgccg 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gaattaccaa gactccagg 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 tgagacaata cttccggagg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gtcctacaga ttgacaatgc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 cacgctctgg atctgtgaca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gcgcagatga cagggcggaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gtgccgtagc atgcgggagg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 agcgatcacg caacgtggca 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ggcttcgctg ggacacagat cttt 24 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 ttcaacagat gcattacc 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 tctttgcccg cgatgatg 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 acgactggag cgcacgagac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 agggctggct gtggcagaga 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 tttggcagtg gctgaaaggc a 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 gggcccagga tccgctgact 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 actccccgta gaaggcagcg a 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 tctttccagc catgcctcca ct 22 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 ggaaatgctt tgacacacat tc 22 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 ggaagtcatc aaggttatta taa 23 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 atggtcaaag tcctggatgc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 aattcatgga acggggaaat 20 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 aagatcattg gcggaaag 18 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 gagtgctcag gatgttaag 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 aagcttgctg gtgaaaagga 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 ttgcgctcat cttaggcttt 20

Claims (53)

  1. 간 오르가노이드를 수득하기 위한 방법으로,
    간 단편, 간 담도 또는 하나 이상의 lgr5+ 간 상피 줄기 세포를 배지의 존재 하에서 세포외 기질과 접촉시켜 배양함을 포함하며,
    상기 배지가 상피 성장 인자(EGF), R-스폰딘, 및 니코틴아미드; 및 섬유아세포 성장 인자 10(FGF10) 및/또는 간세포 성장 인자(HGF);가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하며,
    상기 R-스폰딘은 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중에서 선택된 어느 하나인, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    BMP 억제제 또는 TGF-베타 억제제가 배양 배지에 첨가된 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 배지는 FGF 10 및 HGF를 포함하는, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1일 이상 후에, 배지를 제 2 배지로 교환하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    제 2 배지가 (ⅰ) EGF; TGF-베타 억제제; 노치 억제제; 및 FGF 또는 HGF;가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하는 분화 배지인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 간 단편, 간 담도 또는 하나 이상의 lgr5+ 간 상피 줄기 세포를, EGF, BMP 억제제, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중에서 선택된 R-스폰딘, 및 Wnt가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 또는 상기 배지로 이루어지는 세포 배양 배지에서; 및 후속으로 EGF, FGF, HGF, 니코틴아미드, 및 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중에서 선택된 R-스폰딘이 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 또는 상기 배지로 이루어지는 제 2 확대 배지에서; 및 후속으로 (ⅰ)EGF, TGF-베타 억제제, 노치 억제제, 및 FGF 또는 HGF가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하거나 또는 상기 배지로 이루어지는 분화 배지에서 배양함을 포함하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 배양 배지는 Wnt 과 구성원, 노린, 및 GSK-억제제 중에서 선택되는 Wnt 작용물질을 더 포함하는, 방법.
  8. 제 2 항에 있어서,
    TGF-베타 억제제가 A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY 364947, SD-208, SJN 2511로 이루어진 그룹 중에서 선택된 소 분자 억제제인 방법.
  9. 삭제
  10. 제 1 항에 있어서,
    가스트린, B27, N2 및 N-아세틸시스테인 그룹 중 1, 2, 3 또는 4 개가 기본 배지에 첨가된 방법.
  11. EGF; R-스폰딘; 니코틴아미드; 및 FGF 10 또는 HGF;가 첨가된 동물 또는 인간 세포용 기본 배지를 포함하며,
    상기 R-스폰딘은 R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3 및 R-스폰딘 4 중에서 선택된 어느 하나인,
    간 단편, 간 담도 또는 하나 이상의 lgr5+ 간 상피 줄기 세포의 배양을 위한 세포 배양 배지.
  12. 제 11 항에 있어서,
    BMP 억제제, TGF-베타 억제제 및 HGF 그룹 중 1, 2 또는 3개가 배양 배지에 첨가된 세포 배양 배지.
  13. 삭제
  14. 제 12 항에 있어서,
    TGF-베타 억제제가 A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY 364947, SD-208, SJN 2511로 이루어진 그룹 중에서 선택된 소 분자 억제제인 세포 배양 배지.
  15. 삭제
  16. 제 11 항에 있어서,
    가스트린, B27, N2 및 N-아세틸시스테인 그룹 중 1, 2, 3 또는 4 개가 기본 배지에 첨가된 세포 배양 배지.
  17. 제 1 항의 방법에 의해 수득되는 간 오르가노이드.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 간 오르가노이드는 낭성 구조, 및 외부에 하나 이상의 돌기 및 중심 관강을 갖는 세포층을 포함하는 간 오르가노이드.
  19. 제 17항에 있어서,
    하기의 특징들 중 하나 이상을 갖는 간 오르가노이드: (a) >5x105 세포/㎤ 의 세포 밀도를 갖는다; (b) 2 내지 30 개의 세포층과 동등한 두께 또는 2 내지 15 개의 세포층과 동등한 두께를 갖는다; (c) 상기 세포가 3차원으로 상호 접촉한다, (d) 건강한 간 조직에 고유한 기능을 나타낸다, (e) 2 개의 한정된 도메인을 갖는, 길게 늘어진 모양을 갖는다.
  20. 제 17항에 있어서,
    편향된 세포가 검출되고 케라틴 마커가 발현되는 단층 상피 도메인, 및 오르가노이드의 주 몸통을 구성하고 편향되지 않은 세포를 갖는 다층 상피에 의해 형성되는 제 2 도메인을 포함하며, 알부민을 임의로 발현하는 간 오르가노이드.
  21. 제 17항에 있어서,
    Lgr5를 발현하는 세포로부터 기원하고 1 x 103 세포 내지 5 x 104 세포의 집단을 포함하는 간 오르가노이드.
  22. 제 17 항에 따른 간 오르가노이드를 약물 발견 선별; 독성 분석; 간 발생학, 간 세포 계통, 및 분화 경로의 연구; 재조합 유전자 발현을 포함한 유전자 발현 연구; 간 손상 및 수복에 관련된 기전; 간의 염증 및 감염성 질병의 연구; 발병 기전의 연구; 또는 간세포 형질전환의 기전 및 간암의 병인학의 연구에 이용하는 방법.
  23. 제 17 항에 따른 간 오르가노이드를 포함하는 간 질환, 상태 또는 질병, 또는 재생 의학을 위한 약학 조성물.
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