JP2017140033A - 肝臓オルガノイド、その使用、およびそれを得るための培養方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子(EGF)、FGFR2又はFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、ニコチンアミド、および好ましくは、Wntアゴニスト、好ましくはR−スポンジ1、R−スポンジン2、R−スポンジン3、またはR−スポンジン4が加えられた動物細胞用又はヒト細胞用の基本培地を含む培地の存在下で、上皮幹細胞及び/又は該上皮幹細胞を含む単離された組織断片を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程を含む、肝臓断片又は肝臓オルガノイドを得る方法。
【選択図】図1D
Description
本発明は、肝臓オルガノイド、その使用、およびそれを得るための方法に関する。
肝臓の基本構造単位は肝小葉である。それぞれの肝小葉は、中心輸出静脈に向かって放射状に延びている、洞様毛細血管によって裏打ちされた肝細胞板状構造からなる。肝小葉はほぼ六角形をなし、6つの角はそれぞれ門脈三管(門脈、胆管、および肝動脈)の存在によって定められる。肝細胞は肝臓の主要な実質細胞タイプであるが、胆管細胞(胆管上皮細胞)、内皮細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、ナチュラルキラー細胞、および肝臓星状細胞と協力して機能する。この複合構造は肝機能にとって極めて重要である。
[本発明1001]
以下の工程を含む、肝臓断片または肝臓オルガノイドを得るおよび/または培養するための方法:
分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子(EGF)、FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、ニコチンアミド、および好ましくは、Wntアゴニスト、好ましくはR-スポンジン1、R-スポンジン2、R-スポンジン3、またはR-スポンジン4が加えられた動物細胞用またはヒト細胞用の基本培地を含む培地の存在下で、上皮幹細胞および/または該上皮幹細胞を含む単離された組織断片を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程。
[本発明1002]
肝臓断片が胆管に由来する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
肝臓断片が損傷、例えば、機械的損傷を受けている、本発明1001または本発明1002の方法。
[本発明1004]
基本培地がadvanced-DMEM/F12である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
BMP阻害剤、ガストリン、B27、N2、およびN-アセチルシステインの群からの1つまたは複数、好ましくは、2つ、3つ、4つ、または全てが基本培地に加えられる、本発明1001の方法。
[本発明1006]
EGF、BMP阻害剤、R-スポンジン、およびWntアゴニストが全て基本培地に加えられる、本発明1005の方法。
[本発明1007]
BMP阻害剤が、Noggin、DAN、ならびにCerberusおよびGremlinを含むDAN様タンパク質より選択される; ならびに/または
Wntアゴニストが、Wnt、Wnt-3a、Norrin、およびGSK阻害剤のうちの1つまたは複数より選択される、ならびに/または
R-スポンジンが、R-スポンジン1、R-スポンジン2、R-スポンジン3、およびR-スポンジン4より選択される、
本発明1006の方法。
[本発明1008]
HGFも基本培地に加えられる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
培養して少なくとも1日後に、培地を、BMP阻害剤もWntアゴニストも含まない培地と交換する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
BMP阻害剤もWntアゴニストも含まない培地が、分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子(EGF)、FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、およびHGF、ニコチンアミド、ならびにR-スポンジン1、R-スポンジン2、R-スポンジン3、R-スポンジン4のうちのいずれか1つのR-スポンジンが加えられた基本培地を含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
EGF、R-スポンジン1、FGF10、HGF、およびニコチンアミドが全て基本培地に加えられるか、または任意で、R-スポンジン1の代わりにR-スポンジン4が加えられる、本発明1010の方法。
[本発明1012]
培養して少なくとも2週間後に、培地を、BMP阻害剤もWntアゴニストも含まない培地と交換する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
第2の培地が、EGF、FGF、および/またはHGF、TGF-β阻害剤、ならびにNotch阻害剤が加えられた動物細胞用またはヒト細胞用の基本培地を含む、本発明1012の方法。
[本発明1014]
分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子; FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、およびHGF; Notch阻害剤、ならびにTGF-β阻害剤が全て基本培地に加えられる、本発明1013の方法。
[本発明1015]
FGFがFGF10である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
Notch阻害剤が、γ-セクレターゼ阻害剤、任意で、DAPTまたはジベンザゼピン(DBZ)またはベンゾジアゼピン(BZ)またはLY-411575である、本発明1013〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
TGF-β阻害剤がタンパク質、ペプチド、または低分子である、本発明1013〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
TGF-β阻害剤が、A83-01 SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY364947、SD-208、SJN2511からなる群より選択される低分子阻害剤である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
ガストリン、B27、N2、およびN-アセチルシステインの群からの1つまたは複数、好ましくは、2つ、3つ、または全てが基本培地に加えられる、本発明1013〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
上皮幹細胞および/または単離された組織断片を、EGF、BMP阻害剤、R-スポンジン、およびWntが加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる細胞培地において培養し;その後に、分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGFR2もしくはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、およびHGF、ニコチンアミド、ならびに好ましくは、Wntアゴニスト、好ましくはR-スポンジン1もしくはR-スポンジン4が加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる細胞培地において培養し;その後に、EGF、FGF、および/もしくはHGF、TGF-β阻害剤、ならびにNotch阻害剤が加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる細胞培地において培養する工程を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1021]
肝臓オルガノイドが、Lgr5を発現する単一細胞から生じる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1022]
フィーダー細胞を含まない、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1023]
Lgr5、Hnf1α、およびHnf4のうちの1つまたは複数のマーカーの、有意なレベルでの天然発現を特徴とする、成体肝臓幹細胞の集団。
[本発明1024]
成体肝臓幹細胞がヒト成体肝臓幹細胞である、本発明1023の成体肝臓幹細胞集団。
[本発明1025]
本発明1001〜1021のいずれかの方法によって得られた、本発明1023または本発明1024の成体肝臓幹細胞集団。
[本発明1026]
本発明1023、1024、または1025のタイプの細胞を少なくとも1種類含む、肝臓オルガノイド。
[本発明1027]
少なくとも1種類の肝細胞および少なくとも1種類の胆管細胞をさらに含む、本発明1026の肝臓オルガノイド。
[本発明1028]
以下のマーカーのうちの少なくとも1つを発現する、本発明1026または1027のいずれかの肝臓オルガノイド:
肝細胞マーカー、例えば、アルブミン、B-1インテグリン、トランスサイレトリン(transthyretrin)、およびグルタミンシンテターゼ; ならびに/または少なくとも1つの胆管細胞マーカー、例えば、ケラチン7および19。
[本発明1029]
少なくとも1×103個の細胞〜5x104個の細胞、例えば、少なくとも1×103個の細胞〜5×103個の細胞の集団を含む、本発明1026〜1028のいずれかの肝臓オルガノイド。
[本発明1030]
嚢胞構造と、その外側にある、少なくとも1つの芽および中心管腔を有する細胞層とを含む、本発明1026〜1029のいずれかの肝臓オルガノイド。
[本発明1031]
以下の特徴のうちの1つまたは複数(例えば、2つ、3つ、4つ、または5つ全て)を有する、本発明1026〜1030のいずれかの肝臓オルガノイド:
(a)>5×105細胞/cm3、好ましくは>10×105細胞/cm3の細胞密度を有すること; (b)2〜30層の細胞層に相当する厚み、好ましくは、2〜15層の細胞層に相当する厚みを有すること; (c)細胞が三次元で相互に接触し、(d)健康な肝臓組織に固有の機能を示し、(e)2つの規定されたドメインを有する細長い形状を有すること。
[本発明1032]
アルブミンを分泌することができる、本発明1023〜1031のいずれかの細胞集団またはオルガノイド。
[本発明1033]
尿素を分泌する、本発明1023〜1032のいずれかの細胞集団またはオルガノイド。
[本発明1034]
目に見えるグリコーゲン貯蔵を示す、本発明1023〜1033のいずれかの細胞集団またはオルガノイド。
[本発明1035]
誘導性チトクロムP450活性を有する、本発明1023〜1034のいずれかの細胞集団またはオルガノイド。
[本発明1036]
形態学的に細胞が肝細胞様に見える、本発明1023〜1035のいずれかの細胞集団またはオルガノイド。
[本発明1037]
細胞外マトリックスと接触している、本発明1023〜1036のいずれかの肝臓オルガノイド。
[本発明1038]
少なくとも1ヶ月間、少なくとも2ヶ月間、少なくとも3ヶ月間、少なくとも4ヶ月間、少なくとも5ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも7ヶ月間、少なくとも8ヶ月間、少なくとも10ヶ月間、少なくとも15ヶ月間、少なくとも20ヶ月間、少なくとも24ヶ月間またはそれ以上培養することができる、本発明1023〜1037のいずれかの肝臓オルガノイド。
[本発明1039]
幹細胞シグネチャー遺伝子であるLGR4、TACSTD1/Epcam、CD44、SOX9、SP5、CD24、PROM1、CDCA7、およびELF3のうちの少なくとも1つ、好ましくは全てを発現する、本発明1023〜1038のいずれかのヒト肝臓細胞集団またはヒト肝臓オルガノイド。
[本発明1040]
リプログラミング遺伝子であるKLF4、MYC、POU5F1、およびSOX2のうちの少なくとも1つ、好ましくは全てを発現する、本発明1023〜1039のいずれかのヒト肝臓細胞集団またはヒト肝臓オルガノイド。
[本発明1041]
肝細胞/胆管細胞特異的遺伝子であるHNF1A、HNF1B、HNF4A、HHEX、ONECUT1、ONECUT2、PROX1、CDH1、FOXA2、GATA6、FOXM1、CEBPA、CEBPB、CEBPD、CEBPG、GLUL、KRT7、KRT19、およびMETのうちの少なくとも1つ、好ましくは全てを発現する、本発明1023〜1040のいずれかのヒト肝臓細胞集団またはヒト肝臓オルガノイド。
[本発明1042]
肝細胞/胆管細胞特異的遺伝子であるNEUROG2、IGF1R、およびCD34、AFP、GCG、およびPTF1Aのうちの少なくとも1つ、好ましくは全てを発現しない、例えば、NEUROG2、IGF1R、およびCD34を発現しない、本発明1023〜1041のいずれかのヒト肝臓細胞集団またはヒト肝臓オルガノイド。
[本発明1043]
肝細胞特異的遺伝子であるTTR、ALB、FAH、TAT、CYP3A7、APOA1、HMGCS1、PPARG、CYP2B6、CYP2C18、CYP2C9、CYP2J2、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP4F8、CYP4V2、およびSCARB1のうちの少なくとも1つ、好ましくは全てを発現する、本発明1023〜1042のいずれかのヒト肝臓細胞集団またはヒト肝臓オルガノイド。
[本発明1044]
創薬スクリーニング、毒性アッセイ、または再生医療における、本発明1023〜1043のいずれかの肝臓オルガノイドの使用。
[本発明1045]
分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、およびHGF、
ガストリン、ニコチンアミド、B27、N2、およびN-アセチルシステイン; ならびに好ましくは、
BMP阻害剤; ならびに
Wntアゴニスト
が加えられた動物細胞用またはヒト細胞用の基本培地を含む、細胞培地。
[本発明1046]
分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、ニコチンアミド、ならびに好ましくは、Wntアゴニスト、好ましくはR-スポンジン1および/またはWnt-3aが加えられた動物細胞用またはヒト細胞用の基本培地を含む、細胞培地。
[本発明1047]
HGFをさらに含む、本発明1046の細胞培地。
[本発明1048]
EGF、FGF、および/もしくはHGF、TGF-β阻害剤、ならびにNotch阻害剤が加えられた動物細胞用またはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる、細胞培地。
[本発明1049]
上皮幹細胞または単離された組織断片を細胞外マトリックス上で培養するための、本発明1045〜1048のいずれかの培地の使用。
[本発明1050]
肝臓断片または肝臓オルガノイドを得るおよび/または培養するための、本発明1049の使用。
[本発明1051]
肝臓におけるWntシグナル伝達を刺激する工程を含む、肝臓を再生するための、またはLgr5を発現する細胞を得るための方法。
[本発明1052]
肝臓の障害、状態、または疾患の治療において使用するための、本発明1023〜1043のいずれかの肝臓オルガノイドまたは細胞集団。
[本発明1053]
肝臓の障害、状態、または疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に、本発明1023〜1043のいずれかの細胞集団または肝臓オルガノイドを投与する工程を含む前記方法。
第1の局面において、本発明は、肝臓断片または肝臓オルガノイドを得るおよび/または培養するための方法であって、分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、ニコチンアミド、ならびに好ましくは、Wntアゴニスト、好ましくはR-スポンジン1、R-スポンジン2、R-スポンジン3、またはR-スポンジン4、および/またはWnt-3aが加えられた動物細胞用またはヒト細胞用の基本培地を含む培地の存在下で、上皮幹細胞および/または該上皮幹細胞を含む単離された組織断片を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程を含む前記方法を提供する。好ましくは、HGFも添加される。
単離された幹細胞は、好ましくは、前記幹細胞が天然に存在する細胞ニッチを少なくとも部分的に模倣する微小環境において培養される。この細胞ニッチは、幹細胞運命を制御する重要な調節シグナルである生体材料、例えば、マトリックス、スキャフォールド、および培養基の存在下で前記幹細胞を培養することによって模倣することができる。このような生体材料は、天然生体材料、半合成生体材料、および合成生体材料、ならびに/またはその混合物を含む。スキャフォールドは二次元ネットワークまたは三次元ネットワークを提供する。このようなスキャフォールドに適した合成材料は、多孔性固体、ナノファイバー、およびヒドロゲル、例えば、自己組織化ペプチドを含むペプチド、リン酸ポリエチレングリコールからなるヒドロゲル、フマル酸ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリ酢酸セルロース、および/またはそのコポリマー(例えば、Saha et al., 2007. Curr Opin Chem Biol. 11(4):381-387; Saha et al., 2008. Biophysical Journal 95:4426-4438; Little et al., 2008. Chem. Rev 108, 1787-1796を参照されたい)より選択されるポリマーを含む。当業者に公知なように、例えば、スキャフォールドの弾力性などの機械的特性は、幹細胞の増殖、分化、および移動に影響を及ぼす。好ましいスキャフォールドは、例えば、組織再生および/または創傷治癒を促進するために、対象における移植後に天然成分によって交換される生分解性(コ)ポリマーを含む。前記スキャフォールドは、対象における移植後の免疫原性応答を実質的に誘導しないことがさらに好ましい。前記スキャフォールドには、幹細胞の増殖および/または分化および/または移動に必要なシグナルを供給する、天然リガンド、半合成リガンド、または合成リガンドが添加される。好ましい態様において、前記リガンドは明確なアミノ酸断片を含む。前記合成ポリマーの例は、Pluronic(登録商標)F127ブロック共重合体界面活性剤(BASF)およびEthisorb(登録商標)(Johnson and Johnson)を含む。
本発明の方法において用いられる細胞培地は、本明細書において提供される限定を受ける任意の適切な細胞培地を含む。細胞培地は、典型的には、培養細胞の維持を支援するのに必要な多数の成分を含有する。以下の開示を考慮に入れて、適切な成分組み合わせを容易に処方することができる。一般的に、本発明による培地は、文献および以下に詳述されるように、標準的な細胞培養成分、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、炭素エネルギー源、および緩衝液を含む栄養溶液である。
本発明の1つの局面において、分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGFR2もしくはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、ニコチンアミド、および好ましくは、Wntアゴニスト、好ましくはR-スポンジン1が加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる細胞培地が提供される。この培地はEM2と呼ばれる。
1つの局面において、本発明は、EGF、BMP阻害剤、R-スポンジン、およびWntが加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる細胞培地を提供する。好ましくは、BMP阻害剤はNogginであり、EM1培地は「ENRW」(EGF、Noggin、R-スポンジン、およびWnt)と呼ばれる。この培地はEM1と呼ばれる。本発明者らは、WntおよびNogginを含有する培地が、細胞の初期拡大を刺激するのに理想的であることを発見した。従って、一部の態様において、EM1培地は1継代または1週間しか用いられないが、細胞に有害(farmful)でないので約1年間使用できることも予想される。従って、一部の態様において、EM1培地は、0日目〜10日目、例えば、0〜7日目、0〜6日目、0〜5日目、0〜4日目、0〜3日目、0〜2日目、0〜1日目に細胞を培養するのに用いられるか、1週間またはそれ以上、例えば、2週間、3週間、4週間またはそれ以上、または1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月またはそれ以上用いられる。この場合、0日目は、細胞の起源組織から細胞が単離された日であり、1日目は次の日である。一部の態様において、EM1培地は培養の最初の日のみ、または最初の2日間のみ用いられる。一部の態様において、EM1培地は、1継代またはそれ以上、例えば、1継代、2継代、3継代、4継代、5継代、6継代、7継代、8継代、9継代、10継代、15継代、20継代、25継代、30継代またはそれ以上、例えば、20〜30継代、用いられる。一部の態様において、EM1培地は、凍結工程後に、または最適な増殖と両立しない培地もしくは温度変化を伴う他の任意の輸送工程後に用いられる。
分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGFR2もしくはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、およびHGF、
ガストリン、ニコチンアミド、B27、N2、およびN-アセチルシステイン、ならびに好ましくは;
BMP阻害剤、好ましくはNoggin; ならびに
Wntアゴニスト、好ましくはR-スポンジン1および/もしくはWnt-3a
が加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる細胞培地が提供される。
好ましくは基本培地に加えられる成分はBMP阻害剤である。BMPは、二量体リガンドとして、2つの異なる受容体セリン/スレオニンキナーゼであるI型受容体およびII型受容体からなる受容体複合体に結合する。II型受容体はI型受容体をリン酸化し、その結果、この受容体キナーゼが活性化される。その後に、I型受容体は特異的受容体基質 (SMAD)をリン酸化し、その結果、転写活性につながるシグナル伝達経路が生じる。
基本培地に加えられ得るさらなる成分はWntアゴニストである。本発明の培地に関して、Wntアゴニストは本明細書において「W」とも呼ばれる。Wntシグナル伝達経路は、Wntタンパク質がFrizzled受容体ファミリーメンバーの細胞表面受容体に結合した時に起こる一連の事象によって定義される。これによって、細胞内β-カテニンを分解する、アキシン(axin)、GSK-3、およびタンパク質APCを含むタンパク質複合体を阻害するDishevelledファミリータンパク質が活性化される。その結果として生じる核β-カテニンの増加によって、TCF/LEFファミリー転写因子による転写が増強される。
基本培地に加えられるなおさらなる成分は、上皮細胞増殖因子(EGF; (好ましくは、Peprotechから入手する)、FGFR2またはFGFR4に結合することができる線維芽細胞増殖因子(FGF)、および肝細胞増殖因子(HGF)(好ましくは、これもPeprotechから入手する)の群より選択される分裂促進増殖因子の組み合わせである。FGFR2(FGF受容体)またはFGFR4に結合することができるFGFは、好ましくは、FGF4、FGF7、またはFGF10(好ましくは、Peprotechから入手する)であり、最も好ましくは、FGF10である。好ましくは、EGF、FGF、およびHGFの3つ全てが用いられる。本発明の培地に関して、EGFは本明細書において「E」とも呼ばれ、FGFは本明細書において「F」とも呼ばれ、HGFは本明細書において「H」とも呼ばれる。EGFは、様々な外胚葉性培養細胞および中胚葉性培養細胞の強力な分裂促進因子であり、インビボおよびインビトロでの特定の細胞の分化ならびに細胞培養中の一部の線維芽細胞の分化に非常に大きな影響を及ぼす。EGF前駆体は、タンパク分解されると、細胞を刺激する53アミノ酸ペプチドホルモンを生じる膜結合分子として存在する。EGFは、原形質膜に位置するEGF受容体に結合することによって標的細胞において効果を発揮する。EGF受容体は膜貫通タンパク質チロシンキナーゼである。EGFと受容体が結合するとキナーゼが活性化され、その後に、受容体の自己リン酸化が起こる。自己リン酸化は、受容体と受容体基質との相互作用に必須である。EGFによって活性化されるシグナル伝達経路には、プロテインキナーゼCの活性化および細胞内Ca2+濃度の上昇につながるホスファチジルイノシトール経路、ならびにMAPキナーゼ活性化につながるras経路が含まれる。これらの経路は、細胞の増殖、分化、および生存の調節に関与する(Herbst, 2004, Int Journal of radiation oncology, 59, 2, S21-S26)。
好ましい培地およびその使用方法を実施例において説明する。
分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGFR2もしくはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、およびHGF、
ガストリン、ニコチンアミド、B27、N2、およびN-アセチルシステイン、ならびに好ましくは、
BMP阻害剤、より好ましくはNoggin、ならびに
Wntアゴニスト、より好ましくはR-スポンジン1および/もしくはWnt-3a
が加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる細胞培地を提供する。
分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGF10、およびHGF、
ガストリン、ニコチンアミド、B27、N2、およびN-アセチルシステイン、
BMP阻害剤、より好ましくはNoggin、ならびに
Wntアゴニスト、より好ましくはR-スポンジン1およびWnt-3a
が加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる第1の好ましい培地を含む。
別の局面において、EGF、TGF-β阻害剤、およびNotch阻害剤が加えられた動物細胞用またはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる第2の細胞培地が提供される。本発明者らは、この培地が細胞分化に有用であることを発見した。細胞分化に用いられる培地は本明細書においてDMと呼ばれることがある。
分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGF10、およびHGF;
Notch阻害剤; ならびに
TGF-β阻害剤
が加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むか、または該基本培地からなる。
分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGF10、およびHGF;
ガストリン、ニコチンアミド、B27、N2、およびN-アセチルシステイン
が加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる代替の第2の培地を提供する。
肝臓断片または肝臓オルガノイドを得るおよび/または培養するための方法は、本発明による1種類または複数種の細胞培地の存在下で、上皮幹細胞および/または該上皮幹細胞を含む単離された組織断片を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程を含む。
i)分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、およびHGF、ニコチンアミド、ならびに好ましくは、Wntアゴニスト、好ましくはR-スポンジン1〜4のうちのいずれか1つが加えられた動物細胞用またはヒト細胞用の基本培地を含む培地の存在下で、上皮幹細胞および/または該上皮幹細胞を含む単離された組織断片を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程; ならびにその後に、
ii)本明細書において定義された第2の細胞培地(DM培地)の存在下で、幹細胞および/または該上皮幹細胞を含む単離された組織断片を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程
を含んでもよい。
前記の細胞は、本明細書において「オルガノイド」と呼ばれる物体に増殖する。従って、本発明の方法によって取得可能な肝臓オルガノイドは本発明のさらなる局面である。本発明者らが知る限りでは、このような長期間(すなわち、少なくとも7ヶ月間の培養; 本明細書に含まれる実施例を参照されたい)の後に機能し、かつ生きている肝臓オルガノイドが得られたのは今回が初めてである。機能は、好ましくは、本明細書において定義された肝臓マーカーの存在によって、および/または本明細書において定義された前記オルガノイドの構造によって特徴付けられる。得られた肝臓オルガノイドの最終量は培養期間と相関するので、当業者であれば、本発明が先駆的な発明であり、例えば、再生医療における新たな可能性を開く可能性があることを理解するだろう。
a)以下の幹細胞マーカーの少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11)、好ましくは全てを発現する: lgr5、lgr4、epcam、Cd44、Tnfrsfl9、Sox9、Sp5、Cd24a、Prom1、Cdca7、およびElf3; ならびに/または
b)以下の幹細胞マーカーを発現しない: lgr6; ならびに/または
c)本発明の拡大培地において増殖された時に、以下の肝細胞マーカーまたは胆管細胞マーカーの少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19)、好ましくは全てを発現する: Hnf1a、Hnf1b、Hnf4a、Hhex、Onecut1、Onecut2、Prox1、Cdh1、Foxa2、Gata6、Foxm1、Cebpa、Cebpb、Cebpd、Cebpg、Glu1、Krt7、Krt19、およびMet; ならびに/または
d)本発明の拡大培地において増殖された時に、以下の遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17)を発現しない: afp、Ins1、Ins2、Gcg、Ptf1a、Cela1、Cela2a、Cela3b、Neurod1、Neurod2、Neurog1、Neurog2、Neurog3、Amy2a4、Igflr、Igf2、およびCd34; ならびに/または
e)以下のリプログラミング遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、もしくは3)を発現する: Klf4、Myc、およびPou5f1; ならびに/または
f)以下のリプログラミング遺伝子を発現しない: Sox2。
ここで、遺伝子の発現は、好ましくは、発現を、例えば、マイクロアレイを用いてmRNAレベルで測定することによって検出される。
a)以下の幹細胞シグネチャー遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9)、好ましくは、全てを発現する: LGR4、TACSTD1/Epcam、CD44、SOX9、SP5、CD24、PROM1、CDCA7、およびELF3; ならびに/または
b)以下のリプログラミング遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4)、好ましくは、全てを発現する: KLF4、MYC、POU5F1、およびSOX2; ならびに/または
c)以下の肝細胞/胆管細胞特異的遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19)、好ましくは、全てを発現する: HNF1A、HNF1B、HNF4A、HHEX、ONECUT1、ONECUT2、PROX1、CDH1、FOXA2、GATA6、FOXMl、CEBPA、CEBPB、CEBPD、CEBPG、GLUL、KRT7、KRT19、およびMET; ならびに/または
d)以下の肝細胞/胆管細胞特異的遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6)、好ましくは、全てを発現しない: NEUROG2、IGF1R、およびCD34、AFP、GCG、およびPTF1A、例えば、NEUROG2、IGF1R、およびCD34を発現しない; ならびに/または
e)以下の肝細胞特異的遺伝子の少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18)、好ましくは、全てを発現する: TTR、ALB、FAH、TAT、CYP3A7、APOA1、HMGCS1、PPARG、CYP2B6、CYP2C18、CYP2C9、CYP2J2、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP4F8、CYP4V2、およびSCARB1。
ここで、遺伝子の発現は、好ましくは、発現を、例えば、マイクロアレイを用いてmRNAレベルで測定することによって検出される。
さらなる局面において、本発明は、創薬スクリーニング、毒性アッセイ、または再生医療における、前記の本発明による肝臓細胞またはオルガノイの使用を提供する。さらに、本発明は、毒性アッセイにおける本発明の肝臓オルガノイドの子孫の使用を提供する。このような毒性アッセイは、肝臓オルガノイドに由来する細胞または肝臓オルガノイドもしくはその一部を用いたインビトロアッセイでもよい。このような子孫および肝臓オルガノイドは、例えば、毒性アッセイにおいて現在用いられている上皮細胞株、例えば、Caco-2(ATCC HTB-37)、I-407(ATCC CCL6)、およびXBF(ATCC CRL8808)より培養しやすく、初代上皮細胞によく似ている。肝臓オルガノイドを用いて得られる毒性結果は、患者において得られる結果によく似ていると予想される。細胞ベースの毒性試験は、臓器特異的細胞傷害性を確かめるのに用いられる。前記試験において試験される化合物は癌化学予防剤、環境化学物質、栄養補助食品、および潜在的な中毒物質を含む。細胞は、ある期間、複数種の濃度の試験薬剤に曝露される。アッセイにおける試験薬剤の濃度は、5日間の曝露および最大溶解濃度からの対数希釈を用いた予備アッセイにおいて確かめられる。曝露期間の終わりに、培養物の増殖阻害を評価する。データを分析して、エンドポイントを50パーセント阻害した濃度(TC50)を求める。
核酸構築物は関心対象の核酸分子を含み、核酸構築物が導入されている細胞において所定の核酸分子の発現を確かなものにする。特に好ましい核酸構築物は、ポリペプチドをコードする核酸分子が、前記細胞において前記核酸分子(すなわち、コード配列)を発現させることができるプロモーターに機能的に連結された発現ベクターである。「発現ベクター」という句は、一般的に、発現ベクターが含む遺伝子/核酸分子を、このような配列と適合する細胞において発現させることができる核酸分子を指す。これらの発現ベクターは、典型的には、少なくとも適切なプロモーター配列を含み、任意で、転写集結シグナルを含む。ポリペプチドをコードする核酸配列またはDNA配列またはヌクレオチド配列は、本発明の方法において特定されるように、インビトロ細胞培養物への導入が可能であり、インビトロ細胞培養物において発現可能なDNA/核酸構築物の中に組み込まれる。特定の細胞に導入するために調製されたDNA構築物は、典型的には、前記細胞によって認識される複製系、望ましいポリペプチドをコードする目的のDNAセグメント、ならびにポリペプチドをコードするセグメントに機能的に連結された転写および翻訳の開始調節配列および終結調節配列を含む。DNAセグメントは、別のDNAセグメントと機能的な関係で配置された時に「機能的に連結されている」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーはコード配列の転写を刺激するのであればコード配列に機能的に連結されている。シグナル配列のDNAは、ポリペプチド分泌に関与するプレタンパク質として発現されるのであれば、ポリペプチドをコードするDNAに機能的に連結されている。一般的に、機能的に連結されたDNA配列は連続しており、シグナル配列の場合、連続しており、かつ読み枠(reading phase)の中にある。しかしながら、エンハンサーは、エンハンサーによって転写が制御されるコード配列と連続している必要はない。便利な制限部位またはその代わりに挿入されるアダプターもしくはリンカーにおける連結によって、連結は成し遂げられる。
単離後、胆管(図1を参照されたい)をマトリゲルに懸濁し、異なる増殖因子条件下で培養した。FGF10(100ng/ml)、HGF(25〜50ng/ml)、およびニコチンアミド(1〜10mM)が添加された、EGF(50ng/ml)およびR-スポンジン1(1ug/ml)の組み合わせ(ERFHNic)は培養物の長期維持に必須であった。このことから、Wntシグナル伝達およびEGFシグナル伝達は、成体肝臓前駆体増殖をインビトロで維持するために厳格に必要とされることが分かる。Noggin(100ng/ml)およびWnt条件培地(50%)の添加もまた培養物の長期維持を示した(図1Aおよび1Bを参照されたい)。長期維持を支援したこれらの条件下で、Lgr5発現ならびに肝細胞マーカー(アルブミン)および胆管細胞マーカー(K7)がRT-PCRによって検出された(図1Cを参照されたい)。これらの条件下で、肝臓オルガノイドは機械的解離または酵素的解離によって1:8に希釈されて毎週継代され、何ヶ月も増殖された(図1D)。
ER条件下またはENRW条件下では、肝臓培養物は自己複製し、週単位で、1年まで維持および拡大することができる(図7A)。1年後の核型分析は染色体異常の証拠を示さない。分析した細胞の66%超が正常な染色体数を示し、これらの13%が肝細胞の特徴的な形質である倍数性も示した(図7B)。
これらの拡大条件(ERFHNicおよびENRWFHNic)を使用し、500uMのTGFβ阻害剤(A83-01)を拡大培地に加えて、本発明者らはヒト胆管由来培養物を拡大することもできた(図11)。
肝臓培養-胆管単離
単離された成体肝臓組織を冷Advanced-DMEM/F12(Invitrogen)で洗浄し、次いで、組織を約5mmの動物断片に切り刻み、冷解離緩衝液(DMEM培地に溶解したコラゲナーゼ、ディスパーゼ、FBS)でさらに洗浄した。組織断片を解離緩衝液と37℃で2時間インキュベートした。次いで、10mlピペットを用いて、組織断片を冷単離緩衝液10mlに激しく懸濁した。死細胞を含有する最初の上清を捨て、沈殿物を10〜15mlの解離緩衝液に懸濁した。さらに組織断片を激しく懸濁した後に、胆管の中に上清が豊富にある。十分な胆管が得られるまで、この手順を繰り返す。
ヒト肝細胞増殖因子(HGF)はPeprotechから購入し、EGFはinvitrogenから購入し、R-スポンジンはNuveloから購入し、Nogginはpeprotechから購入し、FGF10はPeprotechから購入し、ガストリンはSigma Aldrichから購入し、ニコチンアミドはSigmaから購入した。
Lgr5に由来する肝臓培養物の発現分析のために、Qiagen RNAaseキットを用いて、RNAを、成体肝臓、またはWntcmおよびNogginを含まない培地(ER)、もしくはWntcmおよびNogginを含む培地(ENRW)において培養した肝臓培養物から単離した。150ngの全RNAを、low RNA Input Linear Amp kit(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)で標識した。Universal mouse Reference RNA(Agilent)には異なる標識をし、成体肝臓組織またはERもしくはENRWで処理された培養物にハイブリダイズさせた。4X44K Agilent Whole Mouse Genome dual colour Microarrays(G4122F)を使用した。標識、ハイブリダイゼーション、および洗浄はAgilentのガイドラインに従って行った。
肝臓において、Wntシグナル伝達は中心静脈領域において活発である。本発明者らは、最近、Wntシグナル伝達が肝臓代謝において重要な役割を果たしていることを観察した(Boj et al. 私信)。胆管細胞において、肝臓損傷後にWntシグナル伝達は活性化される(Hu et al 2007, Gastroenterology, 133(5):1579-91)。同様に、Wntシグナル伝達の確かな普遍的レポーターであるAxin2-LacZ対立遺伝子を用いて、本発明者らは、WntアゴニストRspo1の注射後(図12Aを参照されたい)または肝毒性化合物である四塩化炭素(CCl4)による肝臓損傷後(図12Bを参照されたい)にも、肝臓実質全体においてWntシグナル伝達がアップレギュレートされることを観察した。
実施例1において、培養物の長期維持には、FGF10(100ng/ml)、HGF(25〜50ng/ml)、およびニコチンアミド(1〜10mM)が添加された、EGF(50ng/ml)およびR-スポンジン1(1ug/ml)の組み合わせが好ましいことが見出された。今や、本発明者らは、3ヶ月超、培養物を拡大するのには、EGFおよびR-スポンジン1に加えられる3種類の補助因子(FGF10、HGF、およびニコチンアミド)が全て必要だという証拠をつかんでいる。これを評価するために、本発明者らは、図14に示したように肝臓実質から胆管を単離し(K19染色を用いて、単離された構造の同一性を確認した)、i)EGF; またはii)EGFおよびR-スポンジン1+FGF10もしくはHGFもしくはニコチンアミド; またはiii)EGFおよびR-スポンジン1+FGF10およびHGFおよびニコチンアミド(ERFHNic)と共に胆管を培養することによって肝臓オルガノイド培養物を作製した。本発明者らは、計14週間にわたって1週間に1回、培養物をスプリットした。実施例1および実施例2において報告したように、結果から、肝臓培養物の増殖および自己複製には、EGF、R-スポンジン1、およびニコチンアミドとFGF10の組み合わせが必須であることが確かめられた。10回の継代後に、HGFを含まない培養物は、HGFが添加された培養物と比較して増殖の不利益を示した。依然として生存していたが、増殖比は、完全な組み合わせ(FGF10、HGF、およびニコチンアミド)が添加された培養物の1:6〜1:8と比較して1:2〜1:4まで減少した。15回の継代後に、HGFが添加されていないERFNicを用いた培養物はもはや生存していなかった。従って、これらの結果は、長期維持後、良好な増殖速度の維持にはHGFが必須であることを示唆している(図15)。
実施例2に記載の分化プロトコールを用いて、本発明者らは、肝臓オルガノイドにおいて肝芽細胞マーカー(アルブミン)および肝細胞表面マーカーを検出することができた。これらの肝細胞様細胞の数を定量するために、本発明者らは、肝細胞表面マーカーを用いて培養物のフローサイトメトリー分析を行った。本発明者らは、拡大培養条件では肝細胞表面マーカー陽性細胞はほとんど検出されなかったのに対して、分化後には、細胞の35%までがこの肝細胞表面マーカー陽性であったことを観察した(図17BおよびCを参照されたい)。
ERFHNic拡大条件およびEAFD分化条件を用いて増殖させたオルガノイドから細胞を採取し、チロシン血症I型ヒト疾患のマウスモデルであるチロシン異化酵素フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ(FAH)欠損マウスの免疫不全系統(Azuma et al. 2007, Nature Biotech, 25(8), 903-910)に移植した。移植計画を図17Dに示した。予備結果から、FAH欠損マウスの肝臓実質において分散したFAH陽性細胞が見られることが分かった。このことは、オルガノイド培養物に由来する肝臓細胞がレシピエント肝臓に移植されたことを示している(図17A、右側を参照されたい)。さらに、レシピエントマウスの肝臓において極めて多数のK19陽性細胞も検出された。このことは、オルガノイドに由来する移植細胞がインビボで両系列を産生できることを示唆している: 肝細胞(FAHマーカーにより証明される)および胆管細胞(K19マーカーにより証明される)(図17A、左上パネルを参照されたい)。このことは、2つの別個の培養物に由来する2つの別個のクローンに由来する移植細胞のフローサイトメトリー分析によってさらに裏付けられた(それぞれ図17Bおよび17C)。Lgr5+細胞をGFP含有ウイルスによって形質導入し、分化後にフローサイトメトリー分析を行った。肝細胞表面マーカー陽性細胞は、大きな細胞を示す広い分散を示す。これは、粒状性および成熟性、すなわち、成熟した肝細胞を表している。肝細胞表面マーカー陰性の細胞の分散はわずかであった。このことは、小さな細胞、すなわち、成熟していない前駆体を示している。従って、分化しつつある培養物には全ての細胞タイプが存在する(成熟細胞および未熟細胞)。分化細胞の残りである、FACS分析に用いられなかった細胞を移植実験に使用した。
発現している遺伝子および発現していない遺伝子を確かめるためにマイクロアレイ分析を用いて、本発明の方法に従って培養されたマウス肝臓に由来するオルガノイドを分析した。
発現している遺伝子および発現していない遺伝子を確かめるためにオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析を用いて、本発明のEM1培地、EM2培地、およびDM培地を用いて培養したヒト肝臓に由来するオルガノイドならびにヒト肝臓を分析した。拡大培地において発現している遺伝子と、分化培地において発現している遺伝子と、成体肝臓において発現している遺伝子との間で、有意に異なる遺伝子発現プロファイルが目に見えて分かった。肝細胞遺伝子発現の傾向はマウスとほぼ同じであるが、オルガノイドの分化はマウス肝臓オルガノイドの方が弱かった。これは、使用したヒト細胞の使用によるものである可能性がある。
動物処置
2〜8ヶ月齢のLgr5LacZまたはAxin2-LacZまたはWT同腹仔BL6/Balbc F1マウスに、トウモロコシ油に溶解した0.8ml/kg CCL4(n=)またはトウモロコシ油のみ(n=)を腹腔内注射した。2日後または5日後または9日後または13日後にマウスを屠殺した。肝臓を単離し、RNAまたはβガラクトシダーゼ染色のためにさらに処理した。
肝臓組織を単離し、すぐに、20倍量の氷冷固定液(1%ホルムアルデヒド; 0.2%グルタルアルデヒド; 0.02%NP40を含むPBSO)に入れ、回転プラットフォーム(rolling platform)の上に置いて4℃で2時間インキュベートした。固定液を除去し、組織を、回転プラットフォームの上に置いて洗浄緩衝液(PBSO; 2mM MgCl2; 0.02%NP40; 0.1%デオキシコール酸Na)で室温で20分間、2回洗浄した。次いで、β-ガラクトシダーゼ基質(5mM K3FE(CN) 6; 5mM K4Fe(CN) 6.3H2O; 2mM MgCl2; 0.02%NP40; 0.1%デオキシコール酸Na; 1mg/ml X-galをPBSOに溶解)を添加し、組織を暗所、37℃で2時間および室温で一晩インキュベートした。基質を除去し、組織を回転プラットフォームの上に置いて室温で20分間、PBSOで2回洗浄した。次いで、組織を、PBSOに溶解した20倍量の4%パラホルムアルデヒド(PFA)に入れ、回転プラットフォームの上に置いて暗所、4℃で一晩固定した。PFAを除去し、組織を回転プラットフォームの上に置いてPBSOで室温で20分間、2回洗浄した。
6〜8週間齢のAxin2-lacZマウスに100μgの精製ヒトR-スポンジン1をIP注射し、肝臓におけるLacZ発現分析のために48時間後に屠殺した。
RNAを、RNeasy Mini RNA Extraction Kit(Qiagen)を用いて胃細胞培養物または新鮮に単離された組織から抽出し、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(Promega)を用いて逆転写した。cDNAを、以前に述べられたように(Huch et al., 2009)、サーマルサイクラー(GeneAmp PCR System 9700; Applied Biosystems, London, UK)において増幅した。使用したプライマーを以下の表3に示した。
ここで使用した免疫染色手順は、Huch et al. 2009において以前に述べられた。簡単に述べると、5マイクロメートル切片を脱パラフィンし、再水和し、組織切片を、PBS-T(PBS; Tween20 0.1%)を用いて透過処理した。必要に応じて、抗原賦活化のために切片を10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)で処理し、Universalブロッキング緩衝液(BioGenex)を用いてブロックし、一次抗体とインキュベートした。次いで、切片をPBSで2回洗浄し、ペルオキシダーゼ結合二次抗体とインキュベートした。DAB+(DAKO)を色素原基質として使用した。切片をマイヤーヘマトキシリンで対比染色し、Leica DMR顕微鏡において視覚化した。使用した一次抗体は、ウサギ抗Sox9(1:600; RTで1時間, Millipore)、マウス抗SMA(1:1000, 4℃で一晩, Sigma)、ウサギ抗FAH(1:5000; 37℃で一晩、M.Grompeからの寄贈品)、ウサギ抗K19(1:500; 4℃で一晩、M.Grompeからの寄贈品)であった。使用したペルオキシダーゼ結合二次抗体はMouseまたはRabbit Brightvision(Immunologic)であった。
ホールマウント染色のために、オルガノイドまたは単離された胆管をアセトン(オルガノイド)またはPFA4%(胆管)で30分間固定し、PBSで1回洗浄し、PBS 0.3%Triton-X100で5分間、透過処理し、Universalブロッキング溶液(Power block HK085-5KE BioGenex)を用いてブロックし、PBS1%FBSで希釈した一次抗体と一晩インキュベートした。PBSで数回洗浄した後に、試料を二次抗体とインキュベートした。核をHoescht33342で染色した。共焦点顕微鏡観察(Leica, SP5)を用いて画像を取得した。Volocityソフトウェア(Improvision)を用いて三次元再構築を行った。使用した一次抗体は、ウサギ抗K19(1:500; M.Grompeからの寄贈品)、ラット抗肝細胞表面マーカー(1:50、M.Grompeからの寄贈品)、ヤギ抗アルブミン(1:50, santa Cruz)であった。使用した二次抗体は全てロバにおいて作製され、異なるAlexaフルオロフォアに結合された(ロバ抗ヤギ568、ロバ抗ラット488、ロバ抗ウサギ-647, Molecular Probes)。
解離した細胞を、1mlのDMEM+2%FBSに1×104細胞/ミリリットルで再懸濁した後に、1:20に希釈したMIC1-1C3ハイブリドーマ上清または1:50に希釈したOC2-2F8ハイブリドーマ上清を添加し、4℃で30分間インキュベートした。冷ダルベッコリン酸緩衝食塩水(DPBS)で洗浄した後に。細胞を、マウス血清タンパク質に対して吸着されたAPC結合ヤギ抗ラット二次抗体(Jackson Immunoresearch)の1:200希釈液を含有するDMEM+2%FBSに再懸濁した。排除のためにヨウ化プロピジウム染色を用いて死細胞を標識した。細胞を分析し、Cytopeia inFluxV-GS(Becton-Dickenson)を用いて分取した。
以前に述べられたように(Overturf et al. 1996)、脾臓への選別された細胞集団の注射および肝細胞選択を誘導するNTBCの中止を行った。3週間で休薬がなされた後に、レシピエント動物において正常体重が回復するまで再投与が行われた。
Claims (53)
- 以下の工程を含む、肝臓断片または肝臓オルガノイドを得るおよび/または培養するための方法:
分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子(EGF)、FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、ニコチンアミド、および好ましくは、Wntアゴニスト、好ましくはR-スポンジン1、R-スポンジン2、R-スポンジン3、またはR-スポンジン4が加えられた動物細胞用またはヒト細胞用の基本培地を含む培地の存在下で、上皮幹細胞および/または該上皮幹細胞を含む単離された組織断片を、細胞外マトリックスと接触させて培養する工程。 - 肝臓断片が胆管に由来する、請求項1記載の方法。
- 肝臓断片が損傷、例えば、機械的損傷を受けている、請求項1または請求項2記載の方法。
- 基本培地がadvanced-DMEM/F12である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- BMP阻害剤、ガストリン、B27、N2、およびN-アセチルシステインの群からの1つまたは複数、好ましくは、2つ、3つ、4つ、または全てが基本培地に加えられる、請求項1記載の方法。
- EGF、BMP阻害剤、R-スポンジン、およびWntアゴニストが全て基本培地に加えられる、請求項5記載の方法。
- BMP阻害剤が、Noggin、DAN、ならびにCerberusおよびGremlinを含むDAN様タンパク質より選択される; ならびに/または
Wntアゴニストが、Wnt、Wnt-3a、Norrin、およびGSK阻害剤のうちの1つまたは複数より選択される、ならびに/または
R-スポンジンが、R-スポンジン1、R-スポンジン2、R-スポンジン3、およびR-スポンジン4より選択される、
請求項6記載の方法。 - HGFも基本培地に加えられる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 培養して少なくとも1日後に、培地を、BMP阻害剤もWntアゴニストも含まない培地と交換する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- BMP阻害剤もWntアゴニストも含まない培地が、分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子(EGF)、FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、およびHGF、ニコチンアミド、ならびにR-スポンジン1、R-スポンジン2、R-スポンジン3、R-スポンジン4のうちのいずれか1つのR-スポンジンが加えられた基本培地を含む、請求項9記載の方法。
- EGF、R-スポンジン1、FGF10、HGF、およびニコチンアミドが全て基本培地に加えられるか、または任意で、R-スポンジン1の代わりにR-スポンジン4が加えられる、請求項10記載の方法。
- 培養して少なくとも2週間後に、培地を、BMP阻害剤もWntアゴニストも含まない培地と交換する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 第2の培地が、EGF、FGF、および/またはHGF、TGF-β阻害剤、ならびにNotch阻害剤が加えられた動物細胞用またはヒト細胞用の基本培地を含む、請求項12記載の方法。
- 分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子; FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、およびHGF; Notch阻害剤、ならびにTGF-β阻害剤が全て基本培地に加えられる、請求項13記載の方法。
- FGFがFGF10である、請求項14記載の方法。
- Notch阻害剤が、γ-セクレターゼ阻害剤、任意で、DAPTまたはジベンザゼピン(DBZ)またはベンゾジアゼピン(BZ)またはLY-411575である、請求項13〜15のいずれか一項記載の方法。
- TGF-β阻害剤がタンパク質、ペプチド、または低分子である、請求項13〜16のいずれか一項記載の方法。
- TGF-β阻害剤が、A83-01 SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY364947、SD-208、SJN2511からなる群より選択される低分子阻害剤である、請求項17記載の方法。
- ガストリン、B27、N2、およびN-アセチルシステインの群からの1つまたは複数、好ましくは、2つ、3つ、または全てが基本培地に加えられる、請求項13〜18のいずれか一項記載の方法。
- 上皮幹細胞および/または単離された組織断片を、EGF、BMP阻害剤、R-スポンジン、およびWntが加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる細胞培地において培養し;その後に、分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGFR2もしくはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、およびHGF、ニコチンアミド、ならびに好ましくは、Wntアゴニスト、好ましくはR-スポンジン1もしくはR-スポンジン4が加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる細胞培地において培養し;その後に、EGF、FGF、および/もしくはHGF、TGF-β阻害剤、ならびにNotch阻害剤が加えられた動物細胞用もしくはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる細胞培地において培養する工程を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 肝臓オルガノイドが、Lgr5を発現する単一細胞から生じる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- フィーダー細胞を含まない、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- Lgr5、Hnf1α、およびHnf4のうちの1つまたは複数のマーカーの、有意なレベルでの天然発現を特徴とする、成体肝臓幹細胞の集団。
- 成体肝臓幹細胞がヒト成体肝臓幹細胞である、請求項23記載の成体肝臓幹細胞集団。
- 請求項1〜21のいずれか一項記載の方法によって得られた、請求項23または請求項24記載の成体肝臓幹細胞集団。
- 請求項23、24、または25に記載のタイプの細胞を少なくとも1種類含む、肝臓オルガノイド。
- 少なくとも1種類の肝細胞および少なくとも1種類の胆管細胞をさらに含む、請求項26記載の肝臓オルガノイド。
- 以下のマーカーのうちの少なくとも1つを発現する、請求項26または27のいずれか一項記載の肝臓オルガノイド:
肝細胞マーカー、例えば、アルブミン、B-1インテグリン、トランスサイレトリン(transthyretrin)、およびグルタミンシンテターゼ; ならびに/または少なくとも1つの胆管細胞マーカー、例えば、ケラチン7および19。 - 少なくとも1×103個の細胞〜5x104個の細胞、例えば、少なくとも1×103個の細胞〜5×103個の細胞の集団を含む、請求項26〜28のいずれか一項記載の肝臓オルガノイド。
- 嚢胞構造と、その外側にある、少なくとも1つの芽および中心管腔を有する細胞層とを含む、請求項26〜29のいずれか一項記載の肝臓オルガノイド。
- 以下の特徴のうちの1つまたは複数(例えば、2つ、3つ、4つ、または5つ全て)を有する、請求項26〜30のいずれか一項記載の肝臓オルガノイド:
(a)>5×105細胞/cm3、好ましくは>10×105細胞/cm3の細胞密度を有すること; (b)2〜30層の細胞層に相当する厚み、好ましくは、2〜15層の細胞層に相当する厚みを有すること; (c)細胞が三次元で相互に接触し、(d)健康な肝臓組織に固有の機能を示し、(e)2つの規定されたドメインを有する細長い形状を有すること。 - アルブミンを分泌することができる、請求項23〜31のいずれか一項記載の細胞集団またはオルガノイド。
- 尿素を分泌する、請求項23〜32のいずれか一項記載の細胞集団またはオルガノイド。
- 目に見えるグリコーゲン貯蔵を示す、請求項23〜33のいずれか一項記載の細胞集団またはオルガノイド。
- 誘導性チトクロムP450活性を有する、請求項23〜34のいずれか一項記載の細胞集団またはオルガノイド。
- 形態学的に細胞が肝細胞様に見える、請求項23〜35のいずれか一項記載の細胞集団またはオルガノイド。
- 細胞外マトリックスと接触している、請求項23〜36のいずれか一項記載の肝臓オルガノイド。
- 少なくとも1ヶ月間、少なくとも2ヶ月間、少なくとも3ヶ月間、少なくとも4ヶ月間、少なくとも5ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、少なくとも7ヶ月間、少なくとも8ヶ月間、少なくとも10ヶ月間、少なくとも15ヶ月間、少なくとも20ヶ月間、少なくとも24ヶ月間またはそれ以上培養することができる、請求項23〜37のいずれか一項記載の肝臓オルガノイド。
- 幹細胞シグネチャー遺伝子であるLGR4、TACSTD1/Epcam、CD44、SOX9、SP5、CD24、PROM1、CDCA7、およびELF3のうちの少なくとも1つ、好ましくは全てを発現する、請求項23〜38のいずれか一項記載のヒト肝臓細胞集団またはヒト肝臓オルガノイド。
- リプログラミング遺伝子であるKLF4、MYC、POU5F1、およびSOX2のうちの少なくとも1つ、好ましくは全てを発現する、請求項23〜39のいずれか一項記載のヒト肝臓細胞集団またはヒト肝臓オルガノイド。
- 肝細胞/胆管細胞特異的遺伝子であるHNF1A、HNF1B、HNF4A、HHEX、ONECUT1、ONECUT2、PROX1、CDH1、FOXA2、GATA6、FOXM1、CEBPA、CEBPB、CEBPD、CEBPG、GLUL、KRT7、KRT19、およびMETのうちの少なくとも1つ、好ましくは全てを発現する、請求項23〜40のいずれか一項記載のヒト肝臓細胞集団またはヒト肝臓オルガノイド。
- 肝細胞/胆管細胞特異的遺伝子であるNEUROG2、IGF1R、およびCD34、AFP、GCG、およびPTF1Aのうちの少なくとも1つ、好ましくは全てを発現しない、例えば、NEUROG2、IGF1R、およびCD34を発現しない、請求項23〜41のいずれか一項記載のヒト肝臓細胞集団またはヒト肝臓オルガノイド。
- 肝細胞特異的遺伝子であるTTR、ALB、FAH、TAT、CYP3A7、APOA1、HMGCS1、PPARG、CYP2B6、CYP2C18、CYP2C9、CYP2J2、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP4F8、CYP4V2、およびSCARB1のうちの少なくとも1つ、好ましくは全てを発現する、請求項23〜42のいずれか一項記載のヒト肝臓細胞集団またはヒト肝臓オルガノイド。
- 創薬スクリーニング、毒性アッセイ、または再生医療における、請求項23〜43のいずれか一項記載の肝臓オルガノイドの使用。
- 分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、およびHGF、
ガストリン、ニコチンアミド、B27、N2、およびN-アセチルシステイン; ならびに好ましくは、
BMP阻害剤; ならびに
Wntアゴニスト
が加えられた動物細胞用またはヒト細胞用の基本培地を含む、細胞培地。 - 分裂促進増殖因子として、上皮細胞増殖因子、FGFR2またはFGFR4に結合することができるFGF、好ましくはFGF10、ニコチンアミド、ならびに好ましくは、Wntアゴニスト、好ましくはR-スポンジン1および/またはWnt-3aが加えられた動物細胞用またはヒト細胞用の基本培地を含む、細胞培地。
- HGFをさらに含む、請求項46記載の細胞培地。
- EGF、FGF、および/もしくはHGF、TGF-β阻害剤、ならびにNotch阻害剤が加えられた動物細胞用またはヒト細胞用の基本培地を含むかまたは該基本培地からなる、細胞培地。
- 上皮幹細胞または単離された組織断片を細胞外マトリックス上で培養するための、請求項45〜48のいずれか一項記載の培地の使用。
- 肝臓断片または肝臓オルガノイドを得るおよび/または培養するための、請求項49記載の使用。
- 肝臓におけるWntシグナル伝達を刺激する工程を含む、肝臓を再生するための、またはLgr5を発現する細胞を得るための方法。
- 肝臓の障害、状態、または疾患の治療において使用するための、請求項23〜43のいずれか一項記載の肝臓オルガノイドまたは細胞集団。
- 肝臓の障害、状態、または疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項23〜43のいずれか一項記載の細胞集団または肝臓オルガノイドを投与する工程を含む前記方法。
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