CN114377209B - 含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体及其制备方法与应用 - Google Patents

含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114377209B
CN114377209B CN202011163991.7A CN202011163991A CN114377209B CN 114377209 B CN114377209 B CN 114377209B CN 202011163991 A CN202011163991 A CN 202011163991A CN 114377209 B CN114377209 B CN 114377209B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
liver
bile duct
culture
artificial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011163991.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114377209A (zh
Inventor
姚睿
徐铭恩
冯璐
梁少君
刘明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regenovo Biotechnology Co ltd
Tsinghua University
Original Assignee
Regenovo Biotechnology Co ltd
Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regenovo Biotechnology Co ltd, Tsinghua University filed Critical Regenovo Biotechnology Co ltd
Priority to PCT/CN2021/076789 priority Critical patent/WO2022083037A1/zh
Publication of CN114377209A publication Critical patent/CN114377209A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114377209B publication Critical patent/CN114377209B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3813—Epithelial cells, e.g. keratinocytes, urothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/28—Materials or treatment for tissue regeneration for liver reconstruction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C12N2500/62—DMSO
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/18—Liver cell growth factor (LCGF, Gly-His-Lys)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/237—Oncostatin M [OSM]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/14—Coculture with; Conditioned medium produced by hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/56—Fibrin; Thrombin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体及其制备方法与应用。本发明的人工结构体含有肝实质细胞和胆管上皮细胞等多种细胞。肝细胞呈肝板样或团簇形态，胆管上皮细胞呈胆管样三维脉管网络形态。该人工肝结构体具有成熟肝组织的白蛋白分泌功能和氮代谢功能，表达成熟肝细胞的标志性蛋白标记物。该人工肝结构体还具有胆管上皮细胞连接形成的胆管网络结构，表达胆管上皮细胞标志物。本发明人工结构体的制备方法，可采用多种来源的细胞，根据需要定制化设计和批量化生产。本发明的人工肝结构体是一种具有广泛用途的肝脏模型，用于药物临床前检测、环境监测、毒理检测、组织工程、再生医学、新药研发、研究肝组织发育、研究疾病发生和发展等领域。

Description

含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物材料和生物医学工程领域，具体地说，涉及一种含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体及其制备方法与应用。
背景技术
肝脏是人体最重要的解毒器官，几乎所有的外源性和内源性有毒物质都要通过肝脏的分解才能排出体外，导致药物不良反应的最主要原因即为药物性肝损伤。近90％通过临床前药物筛选实验的化合物最终在临床试验中失败，其中三分之一化合物的失败归因于其药物毒性。对于已经投入市场中的药物也屡屡发生召回事件，其中约有50％是由于药物性肝损伤。由于人体试验的伦理和安全限制，现阶段常用的药物检测模型是动物模型和平面培养的细胞，结果却往往难以复制到人体上。约50％的已知会导致人类肝脏损伤的药物在非临床动物试验结果中会显示出对肝脏没有毒性。而平面单层的细胞培养模式使得细胞表面受体的分布于群聚状态，导致体外平面培养的成熟肝细胞很快丧失其表型与功能特征。由此可以看出，无论是经典的单层培养细胞模型，还是临床前检测所用的动物模型，经常无法有效检测出药物对于人体肝脏的毒性等副作用。因此，开发出能够模拟人体肝脏的体外肝脏模型在临床前实验阶段来进行新药研发和毒性药物筛选至关重要。
天然肝脏组织是由包括肝细胞、胆管上皮细胞等多种细胞成分组成的含有胆管网络、血管网络等复杂空间结构的器官，其中肝内胆管系统是一套由肝内胆管上皮细胞形成的负责肝内胆汁的产生与转运的复杂管道系统。肝内胆管由胆管上皮细胞组成，分泌并吸收来自于肝细胞的胆汁，进而汇入肝外胆管，将来自于肝脏的胆汁输送到十二指肠或存储到胆囊中。肝内胆管堵塞会引起胆汁淤积，进而引起急性梗阻性化脓性胆管炎，可危及生命。目前，构建含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体技术领域仍是空白，尚未见到相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体，所述人工肝结构体的尺寸大小为0.1～50cm，其宏观结构可以是柱状、块状、片状、囊状、管状、网格状、编织状或任意形状组合；其中，肝细胞呈肝板样或团簇形态，胆管上皮细胞呈胆管样三维脉管网络形态；
所述的人工肝结构体包含直径大小为50～2000μm的微丝和内径大小为0.01～300mm的中空通道；其中，所述微丝是由生物相容性材料和细胞通过铸模法或3D打印工艺形成的，呈丝状或圆柱状结构；所述中空通道是由相邻的数根微丝围绕形成的；中空通道的大小、形状和分布密度可以根据需求设计；
所述细胞至少包含肝细胞和胆管上皮细胞；
所述的人工肝结构体的杨氏模量为0.1-150KPa。
优选地，所述肝细胞和胆管上皮细胞来源于胚胎干细胞、诱导多能干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、肝母细胞、间充质干细胞或成体干细胞，以及这些细胞分化得到的肝细胞；人体各种组织来源的肝细胞及其细胞系；以及上述所有细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞；优选肝脏干细胞及其细胞系、诱导多能干细胞分化得到的肝脏细胞和胆管细胞。
所述细胞还可以包括肝星状细胞、肝窦内皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、枯否细胞等中的一种或多种，包括上述细胞及其细胞系，以及上述细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞；细胞来源于诱导多能干细胞、胚胎干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、间充质干细胞或成体干细胞，由多种细胞分化得到，或人体各种组织获得；优选成纤维细胞和/或内皮细胞。
本发明中，所述生物相容性材料可选自天然水凝胶材料和/或人工合成的水凝胶材料。
其中，所述天然水凝胶材料选自壳聚糖、壳聚糖衍生物、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白、糖蛋白衍生材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶等中的至少一种；优选壳聚糖、壳聚糖衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、明胶和/或明胶衍生物。
所述人工合成的水凝胶材料选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚谷氨酸-聚乙二醇、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚乙醇酸、聚乙二醇-聚二氧六环酮、聚乙二醇、聚四氟乙烯、聚氧化乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚对二氧环己酮、聚醚醚酮等，以及它们的衍生物或聚合物中的至少一种；优选聚乙醇酸或聚乳酸。
本发明的含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体具有高度仿生的生理功能，阳性表达成熟肝组织的标志性基因和蛋白，具有白蛋白分泌、氮代谢、尿素合成、解毒和药物代谢的肝组织生理功能；所述人工肝结构体还具有胆管上皮细胞连接形成的胆管网络结构，表达胆管上皮细胞标志物。
第二方面，本发明提供含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体的制备方法，包括：
(1)将生物相容性材料与细胞均匀混合得到含有细胞的前体溶液；
(2)将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体；
(3)对三维水凝胶结构体进行后处理；
(4)三维水凝胶结构体的体外培养和/或细胞诱导分化获得含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体。
其中，所述细胞至少包含肝细胞和胆管上皮细胞。
步骤(2)可采用如下方法将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体：铸模法、消失模法、生物3D打印法、喷墨打印法、熔融沉积成型法、静电纺丝法、静电驱动打印法、立体光刻法或激光烧结法等。
所述方法可以是通过控制温度使三维结构成型，温度控制范围在0℃～37℃，优选4℃～36℃。
所述方法还可以是通过光处理使三维结构成型，优选白光或紫外光。
步骤(3)所述后处理方法包括稳定化处理和/或牺牲材料处理。
其中，对三维水凝胶结构体进行稳定化处理所用的交联试剂选自二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物等中的至少一种；优选二价阳离子和/或凝血酶。
所述交联试剂的浓度为0.1mM～10M，优选10mM～500mM；
对三维水凝胶结构体进行牺牲材料处理，包括去除多余材料，所述多余材料包括三维水凝胶结构体中的温敏材料(如明胶、胶原蛋白、N-异丙基丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮等)、交联试剂等。
步骤(4)对三维水凝胶结构体进行体外培养，包括静置培养和/或动态培养。
优选地，静置培养在培养皿、多孔板中进行；动态培养在生物反应器、脉动培养装置、微重力培养装置、搅拌培养装置、波浪式培养装置、芯片或灌注等培养系统中进行。
体外培养所用细胞培养液是在基础培养液的基础上添加了诱导肝细胞分化和维持肝细胞功能的因子以及诱导胆管细胞分化因子；其中，所述诱导肝细胞分化和维持肝细胞功能的因子选自骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、二甲基亚砜、抑癌蛋白M等中的至少一种；所述诱导胆管细胞分化因子选自角质细胞生长因子、丁酸钠、牛黄胆酸钠、表皮细胞生长因子等中的至少一种。
优选地，所述细胞培养液包含50-120ng/ml激活素A，10-50ng/ml骨形态发生蛋白2，10-50ng/ml骨形态发生蛋白4，10-50ng/ml成纤维细胞生长因子4，0.1％-2％v/v二甲基亚砜，10-50ng/ml肝细胞生长因子，1×10-5-1×10-4M抑癌蛋白M，10-50ng/ml角质细胞生长因子，1×10-6-5×10-6M丁酸钠，1×10-6-5×10-6M牛黄胆酸钠和1×10-6-5×10-6M表皮细胞生长因子。各因子之间协同作用，共同促进肝细胞、胆管上皮细胞的分化和成熟。
体外培养条件为：35℃～38℃，5％CO2。
第三方面，本发明提供按照上述方法制备的含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体。
所述人工肝结构体的宏观结构为柱状、块状、片状、囊状、管状、网格状、编织状或任意形状组合；其中，肝细胞呈肝板样或团簇形态，胆管上皮细胞呈胆管样三维脉管网络形态。
优选地，所述人工肝结构体的尺寸大小为0.1～50cm。
优选地，所述人工肝结构体包含直径大小为50～2000μm的微丝。
优选地，所述人工肝结构体具有内径大小为0.01～300mm的中空通道。
优选地，所述人工肝结构体的杨氏模量为0.1-150KPa。
该人工肝结构体具有成熟肝组织的白蛋白分泌功能和氮代谢功能，表达成熟肝细胞的标志性蛋白标记物。该人工肝结构体还具有胆管上皮细胞连接形成的胆管网络结构，表达胆管上皮细胞标志物。
第四方面，本发明提供所述人工肝结构体的以下任一应用：
1)药物临床前检测；
2)环境监测；
3)毒理检测；
4)组织工程；
5)再生医学；
6)新药研发；
7)肝组织发育的研究；
8)疾病发生和发展的研究。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明首次成功构建出同时实现肝细胞与胆管结构共存的人工肝组织，通过精准控制的程序性生长因子，结合生物材料和3D结构，实现干细胞向肝脏细胞和胆管上皮细胞的双向分化，或肝细胞与胆管上皮细胞的共培养和功能维持。本发明提供的人体肝组织含有肝细胞和胆管上皮细胞等多种细胞类型，并且具有微米级的多分支胆管网络结构，填补了目前人工肝结构体领域技术的空白。
(二)肝内胆管是由胆管上皮细胞组成的复杂的导管网络结构，可将肝细胞产生的胆汁排入十二指肠。肝内胆管不仅在胆汁加工、运输中起重要作用，还积极响应与急/慢性肝损伤相关的炎症反应，是多种遗传性疾病(如Alagille综合征和囊性纤维化)、自身免疫性疾病(如原发性硬化性胆管炎)、感染引起的胆管炎以及药物毒性的作用器官。含有胆管组织的肝组织构建可以作为更加仿生的肝脏模型用于胆管相关的药物毒性检测、肝脏生理发育研究和胆管损伤相关疾病的发生发展研究。
(三)本发明提供的仿生肝组织具有胆管上皮细胞组成的胆管样网络结构与致密肝细胞团簇，接近生理肝脏中小叶间肝内胆管与肝板紧密连接的天然组织结构。由于成熟肝细胞的功能维持对培养环境要求苛刻，故体外培养难度大，功能维持时间短。本发明提供的含有单管组织的仿生肝组织，因其生理结构的高度仿生性，具有良好的成熟肝组织分泌功能，高表达白蛋白分泌、药物代谢相关的功能蛋白和基因，并且组织的肝功能可维持较长时间。
(四)本发明提供人工肝结构体的宏观和微观形态可调控，可根据需要定制化生产。可采用以下的一种或多种技术制备人工肝结构体：铸模技术、消失模技术、生物3D打印技术、喷墨打印、熔融沉积成型、静电纺丝、静电驱动打印、立体光刻技术、激光烧结技术。通过上述方法，可以根据具体需求，制造出复杂形状、各种尺寸的三维结构，进而对三维结构的宏观形状与微观结构进行调控，满足不同细胞对营养物质、氧气浓度和生存微环境的需求，在此基础上，整体结构上既可形成微米和毫米级尺度的微型人工肝结构体，也可形成厘米、甚至分米级尺度的大型人工肝结构体。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体的示意图。其中，A为用铸模法制备的三维立体结构示意图，B为用3D打印法制备三维立体结构的示意图，C为铸模法制备的含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体的示意图，其中团簇状为组织内的肝细胞团簇，线条状为组织内的胆管网络结构。
图2为本发明较佳实施例中挤出式生物3D打印技术示意图与立体多层网格状人工肝结构体示意图。
图3为本发明较佳实施例中含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体形貌。含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体显微形貌，类球形为肝细胞团簇，如星形标记所示；梭形为胆管上皮细胞形成的网络结构，如黑色箭头所示。
图4为本发明较佳实施例中含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体中胆管上皮细胞和成熟肝细胞的关键标志性蛋白表达情况。其中，A：CYP3A4与CK19蛋白染色结果，B：ALB与CK19蛋白染色结果，C：CK19蛋白与DAPI染色结果，D：CK19蛋白在结构内的三维层扫图。
图5为本发明较佳实施例中人工肝组织功能表征与基因表达情况。其中，A表示人工肝结构体白蛋白和尿素分泌水平，与二维培养的同种条件比较；B表示人工肝结构体的关键标志性基因表达标准化到平面培养肝细胞的水平，与二维培养的同种条件比较。
图6为本发明较佳实施例中构建的人工肝组织不同设计结构的示意图。
具体实施方式
本发明提供一种含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体，该结构体内含有胆管上皮细胞、肝脏细胞等多种细胞类型。肝细胞呈肝板样或团簇形态，胆管上皮细胞呈胆管样三维脉管网络形态。该人工肝结构体具有成熟肝组织的白蛋白分泌功能和氮代谢功能，表达成熟肝细胞的标志性蛋白标记物。该人工肝结构体还具有胆管上皮细胞连接形成的胆管网络结构，表达胆管上皮细胞标志物。该人体肝组织可根据需要定制化设计、批量化生产，可用于药物临床前检测、环境监测、毒理检测、组织工程、再生医学、新药研发、研究肝组织发育、研究疾病发生和发展等领域。
在本发明具体实施方式中，所述含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体的宏观结构为柱状、块状、片状、囊状、管状、网格状、编织状或任意形状组合。
在本发明具体实施方式中，所述含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体具有尺寸为0.1～50cm的三维结构。在一些具体实施例中，所述含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体具有尺寸为2cm×2cm×0.2cm的三维结构。
在本发明的具体实施方式中，所述含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体由直径大小为50～2000μm的微丝组成。
在本发明的具体实施方式中，所述含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体具有内径大小为0.01～300mm的中空通道。
在本发明的具体实施方式中，所述人工肝结构体的杨氏模量为0.1-150KPa。
在本发明的具体实施方式中，所述人工肝结构体内含有活性细胞，包括但不限于肝细胞和胆管上皮细胞。这两种细胞来源于：胚胎干细胞、诱导多能干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、胆管上皮祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、肝母细胞、间充质干细胞和成体干细胞等多种细胞及其细胞系，以及这些细胞分化得到的肝细胞和胆管上皮细胞；人体各种组织来源的肝细胞和胆管上皮细胞及其细胞系；以及上述所有细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞。优选肝脏干细胞及其细胞系、肝细胞和胆管细胞。
在本发明的具体实施方式中，所述含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体，其中包括活性细胞，除了肝细胞和胆管上皮细胞之外，还可以包含以下一种或者多种细胞：由诱导多能干细胞、胚胎干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、间充质干细胞和成体干细胞等多种细胞分化得到肝星状细胞、肝窦内皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、枯否细胞，人体各种组织来源的肝星状细胞、肝窦内皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、枯否细胞及其细胞系，以及上述细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞。优选成纤维细胞和/或内皮细胞。
在本发明的具体实施方式中，所述人工肝结构体含有生物相容性材料。
在本发明的具体实施方式中，所述生物相容性材料选自天然材料(天然水凝胶材料)和/或人工合成材料(人工合成的水凝胶材料)；
在本发明的具体实施方式中，所述天然水凝胶材料选自壳聚糖、壳聚糖衍生物、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白、糖蛋白衍生材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶中的一种或多种，更优选壳聚糖、壳聚糖衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、明胶和/或明胶衍生物；
在本发明的具体实施方式中，所述人工合成的水凝胶材料选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚谷氨酸-聚乙二醇、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚乙醇酸、聚乙二醇-聚二氧六环酮、聚乙二醇、聚四氟乙烯、聚氧化乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚对二氧环己酮、聚醚醚酮、以及上述材料的衍生物和聚合物中的至少一种，更优选聚乙醇酸或聚乳酸。
本发明还提供上述含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将生物相容性材料与细胞均匀混合得到含有细胞的前体溶液；
(2)将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体；
(3)三维水凝胶结构体后处理；
(4)三维水凝胶结构体的体外培养和/或细胞诱导分化获得所述含有胆管组织和肝组织的人工肝组织(人工肝结构体)。
进一步地，将所述人工肝组织应用于药物检测、环境监测、毒理检测、组织工程、再生医学、新药研发、肝组织发育、疾病发生和发展等领域。
按照上述方法可以构建得到具有成熟肝功能的细胞团簇和胆管网络结构的仿生人工肝结构体。
根据本发明含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体的制备方法，可采用如下方法将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维结构体：铸模法(或工艺)、消失模法(或工艺)、生物3D打印法(或工艺)、喷墨打印法(或工艺)、熔融沉积成型法(或工艺)、静电纺丝法(或工艺)、静电驱动打印法(或工艺)、立体光刻技术法(或工艺)、激光烧结技术法(或工艺)。
在本发明一些具体实施方式中，所述制备方法通过控制温度使三维结构成型，温度控制范围在0℃～37℃，优选4℃～36℃。
在本发明一些具体实施方式中，所述制备方法通过光处理使三维结构成型，优选白光或紫外光。
根据本发明含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体的制备方法，基于不同制备方法进行结构体后处理，后处理方法主要包括稳定化处理和牺牲材料处理。
根据本发明含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体的制备方法，可以对三维结构进行稳定化处理，得到结构稳定，含有活性细胞的三维结构体。
在本发明一些具体实施方式中，所述对三维水凝胶结构体进行稳定化处理所用的试剂(交联试剂)选自以下的一种或多种：二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物，更优选为二价阳离子和/或凝血酶。
在本发明一些具体实施方式中，所用交联溶液(交联试剂)的质量百分比浓度为0.1mM～10M，更优选10mM～500mM。
根据本发明含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体的制备方法，可以对三维结构进行牺牲材料处理，去除多余材料。包括但不限于通过控制温度去除结构内的温敏材料，通过离子置换作用去除结构内的离子交联的材料，通过酶解去除酶交联的材料。
根据本发明含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体的制备方法，步骤(4)所述对含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体进行培养；或者，进一步地，还包括进行细胞收集和/或检测的步骤。
其中，所述人工肝结构体可以静置培养和/或动态培养。人工肝结构体可以培养在各种本领域常用的培养用具中，如培养皿、多孔板等。所述动态培养方法可使用本领域常用的仪器，如借助各种形式的生物反应器、脉动培养、微重力培养装置、搅拌培养装置、波浪式培养装置、芯片、灌注等培养系统。
其中，所述含有胆管组织和肝组织的人工肝结构体于35℃～38℃，5％CO2条件下培养。
本发明对细胞培养液和培养方法进行了改良，添加了维持肝细胞功能的因子，培养10～20天：50～120ng/ml激活素A(Gibco,PHG9014)，10～50ng/ml骨形态发生蛋白2(Gibco,PHC7146)，10～50ng/ml骨形态发生蛋白4(Gibco,PHC9533)，10～50ng/ml成纤维细胞生长因子4(R&D SYSTEMS,233-FB-025)，0.1％～2％二甲基亚砜(Sigma,D2650)，10～50ng/ml肝细胞生长因子(R&D SYSTEMS，294-HGN-005)，1×10-5～1×10-4M抑癌蛋白M(INVITROGEN，PHC5015)；以及添加了诱导分化产生胆管上皮细胞和功能维持的因子，培养10～20天：10～50ng/ml角质细胞生长因子(R&D SYSTEMS，251-KG-010)，1×10-6～5×10-6M丁酸钠(Sigma,6339)，1×10-6～5×10-6M牛黄胆酸钠(Sigma，303410)，1×10-6～5×10-6M表皮细胞生长因子(R&D SYSTEMS，236-EG-200)。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。
本文中使用的术语“交联溶液”是指在三维水凝胶结构形成过程中起到交联作用的溶液，其可以是本领域技术人员公知可用于使得水凝胶材料发生交联从而形成固化结构的材料，例如氯化钙溶液，浓度为0.1mM～10M，优选1mM～100mM，例如100mM浓度的氯化钙溶液。
本文中使用的术语“生物打印”是指一种在体外构建具有生物活性的细胞-材料三维空间结构体的先进技术。基于“离散-堆积”原理和计算机设计，经由与自动的或半自动的、计算机辅助的三维成型装置(例如三维打印机)相匹配的方法，将活细胞、基质材料、蛋白质等活性材料作为基本成形原料，进行的三维精确沉积，这一技术在构建复杂结构的多种细胞/外基质材料三维结构体方面具有独特优势。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1利用双喷头生物3D打印技术制备人工肝结构体
本实施例提供一种可以通过生物3D打印设备构建的人工肝结构体，如图2所示。
1、肝细胞的平面培养
人正常肝细胞(L-02)购自普诺赛(Procell)公司，货号为HL-7702。使用扩增培养基对人正常肝细胞进行平面贴壁培养，每2天更换培养液，当细胞达到85％汇合时按照1:3的比例传代。人正常肝细胞的培养基的成分为：Williams'Medium E培养液(Sigma,W4125)中添加10％FBS血清(Gibco,16000)，1％青链霉素(Gibco,15140122)，20ng/mL肝细胞生长因子(HGF,R&D Systems)和50μMβ巯基乙醇。
2、胆管上皮细胞的平面培养
人肝内胆管上皮细胞购自Procell公司(CP-H042)。使用扩增培养基对人肝内胆管上皮细胞进行平面贴壁培养，每2天更换培养液，当细胞达到85％汇合时按照1:3的比例传代。人肝内胆管上皮细胞的培养基的成分为：Vivo 15培养液(Lonza 04-418Q)中添加10％FBS血清(Gibco,16000)，1％上皮细胞生长添加剂(Procell，CP-H042)，5×10-5mol/L氢化可的松琥珀酸钠(常州四药)，0.05％胰岛素(Sigma,I9278)，0.05％转铁蛋白(Transferrin，Sigma,T8158)，0.05％盐酸肾上腺素(Epinephrine hydrochloride，Sigma,E4642)，1％青链霉素(Gibco,15140122)。
3、打印墨水的制备
配制21％的聚乙醇酸(上海源叶生物科技有限公司，S26878，分子量1-2万Da)溶液和21％的纤维蛋白原溶液(Sigma-Aldrich，F3879)。
对增殖期间的人正常肝细胞，先加入PBS润洗表面，然后加入胰酶(Gibco，25200072)覆盖细胞表面，37℃条件下消化3min后收集，离心得到人正常肝细胞的沉淀，用基础培养基重悬，得到单细胞悬液。
对增殖期间的人肝内胆管上皮细胞，先加入PBS润洗表面，然后加入胰酶(Gibco，25200072)覆盖细胞表面，37℃条件下消化3min后收集，离心得到人肝内胆管上皮细胞的沉淀，用基础培养基(Vivo 15培养液，Lonza，04-418Q)重悬，得到单细胞悬液。
分别将两种细胞悬液与提前加热的聚乙醇酸溶液/纤维蛋白原溶液混合均匀，获得打印溶液A(单细胞悬液A)：人正常肝细胞浓度为0.5×105个细胞/mL，7％聚乙醇酸溶液和7％纤维蛋白原溶液；以及打印溶液B(单细胞悬液B)：人肝内胆管上皮细胞浓度为0.5×105个细胞/mL，7％聚乙醇酸溶液和7％纤维蛋白原溶液。
4、三维打印构建含有细胞的三维水凝胶结构体
使用捷诺飞生物科技股份有限公司的挤出式打印设备(Regenovo，Bio-architectX)构建三维结构体。分别将获得的可打印的单细胞悬液A和B装载至双喷头生物3D打印机上，控制打印机腔内温度、打印底板温度和喷头温度为20℃，按照设计好的CAD文件与计算机路径，可以构建多种具有复杂结构的三维立体结构。本实施例中使用双喷头打印机，构建了每层6根微丝(微丝的成分同打印溶液A、B)，一共6层，每根微丝长2cm，高0.5cm的立体六边形网格结构，结构示意图如图2所示。构建后使用200mM的凝血酶溶液进行浸泡交联完成稳定化后处理，得到三维水凝胶结构体。
5、三维水凝胶结构体的培养与功能成熟
人工肝结构体构建完成后，于37℃5％CO2条件下采用共培养培养基培养10天，获得具有胆管组织和肝组织的仿生人工结构体。共培养培养基的成分为Williams'Medium E培养液(Sigma,W4125)，10％FBS血清(Gibco,16000)，100ng/ml激活素A(Activin A，Gibco,PHG9014)，20ng/ml骨形态发生蛋白2(Gibco,PHC7146)，20ng/ml骨形态发生蛋白4(Gibco,PHC9533)，1％二甲基亚砜(Sigma,D2650)，20ng/ml肝细胞生长因子(R&D SYSTEMS，294-HGN-005)，5×10-5M抑癌蛋白M(INVITROGEN，PHC5015)，20ng/ml角质细胞生长因子(R&DSYSTEMS，251-KG-010)，1.8×10-6M丁酸钠(Sigma,6339)，1×10-5M牛黄胆酸钠(Sigma，303410)，5×10-5M表皮细胞生长因子(R&D SYSTEMS，236-EG-200)。
本发明的细胞培养液在已有研究的基础上进行了改良，增加了维持肝细胞功能的因子：激活素A，骨形态发生蛋白，二甲基亚砜，肝细胞生长因子和抑癌蛋白M，以及诱导分化产生胆管上皮细胞以及胆管细胞功能维持的因子：角质细胞生长因子，丁酸钠，牛黄胆酸钠和表皮细胞生长因子。
6、三维结构体的动态培养
静置培养10天后，再采用动态培养模式继续培养10天。
本实施例中采用脉动培养，脉动生物反应器参见ZL200910079726.8。
采用崇州市崇阳众诚不锈钢配件服务部生产的蠕动泵JD-200来提供相应的循环动力，设定其工作电压为12V，流速为60ml/min；直流电机为北京艾克斯电机有限公司生产的电机ZGB37RH52i，设定其工作电压为12V、转速为100r/min；采用100ml注射器；将自制导杆和滑块导轨，以及各部件，如直流电机、导杆、滑块导轨、注射器用自制的肝组织固定在底板上，连接各部件。
细胞培养液循环部分由培养液瓶、蠕动泵和培养盒构成，各部分由硅胶管连接，培养液经硅胶管由蠕动泵从培养液瓶泵入培养盒(内置工程化组织)，然后经硅胶管流回培养液瓶；导轨滑块、注射器和直流电机构成脉动部分，直流电机与导轨滑块连接推动注射器活塞往复运动，注射器与蠕动泵的出液端连接后和培养盒连接，由此形成脉动流；压力表设置在培养盒上，检测置于培养盒内的组织内的培养液压力。
在进行体外培养以前，先拆卸脉动生物反应器的连接管、注射器，利用高温高压灭菌。然后接通脉动生物反应器，蠕动泵和直流电机接通，先在培养液瓶中加入少量75％的酒精，利用酒精在脉动循环系统中流动灭菌；倒掉酒精然后在培养液瓶中加入一定量已灭菌的PBS溶液，利用该溶液冲洗残余酒精。
关掉电源，然后在培养液瓶中加入细胞培养液，用灭菌好的镊子夹住步骤1-5制备的工程化肝组织接到培养盒的接头上。为使工程化组织牢固地接在接头上，用已灭菌的细线固定工程化组织的两头。待脉动生物反应器系统完全连接好后，接通电源，调整蠕动泵的电压为12V，调节人造组织处所受压力到0.1MPa，即可可以持续运行脉动生物反应器对工程化组织进行脉动培养。
在培养过程中保持上述电压和组织的压力，使线性控制脉动培养过程中脉动频率在100次/分钟。
直流电机运行平稳后，带动滑块在导轨上推动注射器活塞往复运动，活塞拉出时从培养液瓶中吸取培养液，挤出时把吸入的培养液注入蠕动泵形成的循环系统中流经培养盒中的工程化组织流回培养液瓶。通过调节注射器每次吸入、挤出的培养液的量可调节培养工程化组织处的压力。由此，蠕动泵和直流电机持续运动，脉动生物反应器就提供了一个脉动循环的培养液流实现了对工程化组织的脉动培养。
7、细胞形态观察与生物学检测
形态观察：第0天(打印后24小时以内)、第1天、第10天、第20天分别用光学显微镜(Olympus,CX40)每天观察细胞形态变化，并拍摄记录三维结构体内细胞生长形态和胆管网络形成情况(图3)。从第4天左右开始观察到明显的细胞团簇，且细胞团簇随着时间逐渐变大；在第20天左右开始观察到胆管网络结构的出现。此时所得三维仿生人体肝组织微观形貌如图3所示，获得了既有肝细胞团(星号所示)也有胆管网络(黑色箭头所示)的体外人工肝结构体显微形貌，从图中可以看出结构内部的贯穿通道(即中空通道)。
活死染色检测：使用2uM Calcein-AM(Dojindo，C326)和4.5uM PI(Dojindo，P346)的混合溶液分别对活(绿色)/死(红色)细胞进行染色，染色避光进行，持续15分钟。使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)观察记录。对活死染色的照片进行数据统计，打印结束Day0结构体内细胞存活率约95％左右。
生物学检测：为了检测三维结构体中胆管网络的形成和肝细胞功能维持情况，采用免疫荧光染色检测了肝细胞与肝内胆管上皮细胞特异性标记蛋白的表达(如CYP3A4、ALB和CK19)(图4)，采用酶联免疫吸附试验(Elisa)检测构建三维组织的肝功能水平，采用qPCR技术检测肝细胞与胆管上皮细胞相关基因的转录水平。
免疫荧光染色：用磷酸缓冲液(PBS)(BI,02-024-1AC)洗涤结构；4％多聚甲醛在室温下固定30分钟，用PBS洗涤3次，每次5分钟；含0.3％Triton-X(Sigma,X100)和5％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Multicell,800-096-EG)的混合液封闭1小时；吸出封闭缓冲液，加入稀释后的一抗(含0.3％Triton-X和1％BSA)，CYP3A4(abcam，ab3572)、ALB(abcam，ab83465)和CK19(RD，MAB3506)，4℃过夜孵育。用PBS洗涤3次，每次5分钟；加入对应二抗Alexa
Figure BDA0002745154230000121
594(abcam，ab150080)和Alexa
Figure BDA0002745154230000122
488(abcam，ab150113)，室温避光孵育2小时后，用PBS洗涤3次，每次5分钟；接着加入DAPI染细胞核，室温避光孵育5分钟。用激光共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)观察记录。
图4是对三维仿生肝组织的关键蛋白进行免疫荧光染色的结果，其中ALB、CYP3A4为成熟肝细胞的标志性蛋白，CK19是胆管上皮细胞的标记蛋白。其中，(A)是CYP3A4与CK19蛋白染色结果，(B)是ALB与CK19蛋白染色结果，(C)是CK19蛋白与DAPI染色结果，(D)是CK19蛋白在结构内的三维层扫图。由图可知，上述蛋白全部高表达。其中，CYP3A4是成熟肝细胞药物代谢功能的标志性蛋白；CK19是胆管上皮细胞的标记物，可以看出胆管上皮细胞在结构微丝内形成网络结构；ALB是成熟肝细胞分泌功能的标志性蛋白。可以看出肝细胞团具有成熟的分泌和代谢功能，胆管上皮细胞围绕肝细胞团形成网络结构，从(D)可以看出胆管细胞自组装形成三维中空管状结构(所述中空管状结构的内径约为800μm各管道之间的平均间隔距离约为500μm，管道分布密度约为50个/cm2)，符合人体肝脏生理结构。
采用白蛋白分泌检测试剂盒(Bethyl，E80-129、E101、E115)和尿素分泌检测试剂盒(BIO ASSAY SYSTEMS，DIUR-500)按照试剂盒说明书检测所得肝组织的白蛋白分泌和尿素分泌功能。结果显示本发明制备的含有胆管结构的肝组织与常规平面培养的细胞相比，三维仿生肝组织的白蛋白分泌水平是平面培养细胞(所用培养基成分相同)的7.9倍，尿素分泌水平是平面培养细胞的2.7倍。所得三维仿生肝组织为高2mm的立体六边形网格结构，一共10层，每根微丝长2cm。该仿生肝组织的杨氏模量为1.5KPa。该仿生肝组织包含直径大小约为500μm的微丝和内径大小约为800μm的中空通道。
注：平面培养方式一般在常规培养皿中，如6孔板中进行。
qPCR基因检测：提取细胞RNA操作步骤：用PBS洗涤结构1次，每个结构加入1mlTrizol(Gibco,15596026)，反复吹打混匀，在室温静置10分钟，然后转移至1.5ml的EP管中，加入200ul氯仿，快速摇30秒，室温放置5分钟后，在4℃以12000g条件离心10分钟。去除上清液，加入等体积异丙醇，在4℃以12000g条件离心10分钟。弃去上清，用75％无水乙醇洗涤沉淀，风干后可获得RNA，使用DEPC水溶解。用spectrophotometer(Thermo Scientific)检测RNA浓度及纯度。RNA反转录操作步骤：采用PrimeScriptTM II 1st strand cDNA SynthesisKit(TaKaRa，6210)，完全按照试剂盒说明书来进行操作。RNA含量均调整为5ng。引物为：Oligo dT Primer。反转录PCR程序为：42℃50min，95℃，5min，4℃保温，所用PCR仪(ABI，SimpliAmpTM热循环仪)。荧光定量PCR操作步骤：使用Maxima SYBR Green qPCR MasterMix(Thermo Scientific,K0251)试剂盒，完全按照试剂盒说明书进行操作。按要求加入反应液后，将反应板置于qPCR仪进行检测，反应程序为：95℃，10min，95℃15s，60℃30s，40个循环，72℃30s，72℃10min。获得基因在不同时间点的表达情况。
qPCR所用引物序列如下(5′-3′)：
CK19引物序列：
Forward：ATGGCCGAGCAGAACCGGAA
Reverse：CCATGAGCCGCTGGTACTTCC
ALB引物序列：
Forward：GCACAGAATCCTTGGTGAACAG
Reverse：ATGGAAGGTGAATGTTTCAGCA
CYP3A4引物序列：
Forward：TAACAGTCTTTCCATTCCTC
Reverse：GGACTCAGTTTCTTTTGAAT
检测结果显示，三维打印结构体各种基因的表达水平均高于二维培养基因表达水平，CYP3A4是成熟肝细胞药物代谢功能的标志性蛋白，其基因转录水平是同等条件下二维培养细胞的5.1倍，ALB是成熟肝细胞分泌功能的标志性蛋白，三维打印结构体中ALB基因转录水平是同等条件(采用相同的培养基，仅细胞培养方式不同，细胞培养在平面条件下，如6孔板中进行)下二维培养细胞的3.2倍；CK19是胆管上皮细胞的特异性表达的标记蛋白，三维打印结构体中CK19基因转录水平是同等条件下二维培养细胞的3.4倍，数据均有显著性差异。
实施例2利用铸模法制备人工肝结构体
本实施例提供一种通过铸模法制备人工肝结构体的方法，如图5和图6所示。包括如下步骤：
1、肝脏干细胞诱导
使用诱导性多能干细胞(iPSCs)进行诱导分化，获得肝脏干细胞。具体实施步骤为：将iPS细胞(安徽中盛溯源生物科技有限公司)使用细胞分散酶(Dispase,RocheDiagnostics)解离并接种于BD Matrigel Growth Factor Reduced Basement MembraneMatrix(Becton Dickinson)上。随后，将iPSCs置于L-WNT3A(CRL2647；ATCC)-expressingcell-conditioned RPMI 1640培养液中(Sigma)培养4天向限定性内胚层阶段进行分化，培养液成分包括：100ng/mL Activin A(R&D Systems),1％GlutaMAX(Thermo FisherScientific),1％青链霉素(Gibco)，0.2％FBS和1×B-27(Supplement，Thermo FisherScientific)，获得限定性内胚层阶段的细胞。随后，将限定性内胚层阶段的细胞培养于RPMI 1640基础培养液中培养8天，获得肝脏干细胞，培养液中包含：30ng/mL骨形态发生蛋白(BMP4,R&D Systems)和20ng/mL成纤维细胞生长因子(FGF4,R&D Systems),1％GlutaMAX和1×B-27(Thermo Fisher Scientific)。
2、铸模前体溶液的制备
配制16％的海藻酸钠溶液和30％的明胶溶液。
对增殖期间的肝脏干细胞，先加入PBS润洗表面，然后加入胰酶(Gibco，25200072)覆盖细胞表面，37℃条件下消化3min后收集，离心得到肝脏干细胞的沉淀，用基础培养基重悬，得到单细胞悬液，对细胞进行计数后按比例稀释，然后与提前加热的海藻酸钠/明胶混合溶液混合均匀，最终获得的前体溶液中细胞浓度为1×105个细胞/mL，4％海藻酸钠和15％明胶。
3、铸模法构建含有细胞的三维水凝胶结构体
将混好细胞的前体溶液倒入预先设计好的模具中。本实施例中所用模具的结构示意图如图1所示，形成体积为截面六边形直径6cm，中央圆柱直径2cm，高6cm的中空六面体样三维结构体。将含有细胞的生物墨水(前体溶液)倒入模具后，将模具于15℃进行交联15min，交联后将成型的结构取出，浸入5％(w/v)的戊二醛溶液进行交联，随后浸入300mM的氯化钙溶液进行交联然后于肝脏干细胞的双向分化培养基中进行培养，具体成分为：RPMI1640培养液，含有20ng/mL肝细胞生长因子(HGF,R&D Systems),1％GlutaMAX(ThermoFisher Scientific),1％青链霉素(Gibco),1×B27 Supplement Minus Vitamin A，1×10-5M白介素6(Miltenyi)，1μM牛黄胆酸钠(Sigma)，1μM丁酸钠(Sigma)，培养15天，得到人工肝结构体。
最后，更换为肝细胞和胆管上皮细胞诱导成熟培养液培养15天，具体成分包括肝细胞培养基(HCM；Lonza)，25％人ES/iPS干细胞无血清培养基mTeSRTM1 medium(StemCell,05850)，20ng/ml骨形态发生蛋白2(BMP2,Gibco,PHC7146)，20ng/ml骨形态发生蛋白4(BMP4,Gibco,PHC9533)，30ng/ml成纤维细胞生长因子4(FGF4,R&D SYSTEMS，233-FB-025)，20ng/ml肝细胞生长因子(HGF,R&D systems,294-HGN-005)，5×10-5M抑癌蛋白M(OSM,INVITROGEN,PHC5015)，20ng/ml角质细胞生长因子(KGF,R&D,251-KG-010)，1.8×10-6M丁酸钠(Sigma,6339)，1×10-5M牛黄胆酸钠(Sigma，303410)，1％表皮细胞生长因子(EGF,R&Dsystems，236-EG-200)，1％上皮细胞生长添加剂(Gibco，PHG0367)，0.1M地塞米松(Sigma-Aldrich，D4902)，抗坏血酸(1:1,000)，1:1,000转铁蛋白(Sigma,T8158)，0.05％胰岛素(Sigma,I9278)，1％青链霉素(Gibco,15140122)，1.5％二甲基亚砜(Sigma,D2650)，1％GlutaMAXTM Supplement(Gibco,35050061),1％MEM Non-Essential Amino AcidsSolution(Gibco,11140050)。
本发明的细胞培养液在已有研究的基础上进行了改良，增加了诱导肝细胞分化和维持肝细胞功能的因子：骨形态发生蛋白，成纤维细胞生长因子，肝细胞生长因子，二甲基亚砜和抑癌蛋白M，以及诱导胆管细胞分化因子：角质细胞生长因子，丁酸钠，牛黄胆酸钠和表皮细胞生长因子等多种因子。
4、细胞形态观察与生物学检测
形态观察：第0天(打印后24小时以内)、第1天、第10天、第20天分别用光学显微镜(Olympus,CX40)每天观察细胞形态变化，并拍摄记录三维结构体内细胞生长形态和胆管网络形成情况。从第4天左右开始观察到明显的细胞团簇，且细胞团簇随着时间逐渐变大；在第20天左右开始观察到胆管网络结构的出现。
活死染色检测：使用2uM Calcein-AM(Dojindo，C326)和4.5uM PI(Dojindo，P346)的混合溶液分别对活(绿色)/死(红色)细胞进行染色，染色避光进行，持续15分钟。使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)观察记录。对活死染色的照片进行数据统计，打印结束Day0结构体内细胞存活率约95％左右。
生物学检测：为了检测三维结构体中胆管网络的形成和肝细胞功能维持情况，采用免疫荧光染色检测了肝细胞与肝内胆管上皮细胞特异性标记蛋白的表达(如CYP3A4、ALB和CK19)，采用酶联免疫吸附试验(Elisa)检测构建三维组织的肝功能水平(图5A)，采用qPCR技术检测肝细胞与胆管上皮细胞相关基因的转录水平(图5B)。其中免疫荧光染色方法与实施例1相同。
采用白蛋白分泌检测试剂盒(Bethyl，E80-129、E101、E115)和尿素分泌检测试剂盒(BIO ASSAY SYSTEMS，DIUR-500)按照试剂盒说明书检测所得肝组织的白蛋白分泌和尿素分泌功能。结果显示(图5A)实施例所得的含有胆管结构的肝组织与常规平面培养的细胞相比，三维仿生肝组织的白蛋白分泌水平是平面培养细胞的9.5倍，尿素分泌水平是平面培养细胞的1.7倍，数据均有显著性差异。
qPCR基因检测：提取细胞RNA操作步骤：用PBS洗涤结构1次，每个结构加入1mlTrizol(Gibco,15596026)，反复吹打混匀，在室温静置10分钟，然后转移至1.5ml的EP管中，加入200ul氯仿，快速摇30秒，室温放置5分钟后，在4℃以12000g条件离心10分钟。去除上清液，加入等体积异丙醇，在4℃以12000g条件离心10分钟。弃去上清，用75％无水乙醇洗涤沉淀，风干后可获得RNA，使用DEPC水溶解。用spectrophotometer(Thermo Scientific)来检测RNA浓度及纯度。RNA反转录操作步骤：采用PrimeScriptTM II 1st strand cDNASynthesis Kit(TaKaRa，6210)，完全按照试剂盒说明书来进行操作。RNA含量均调整为5ng。引物为Oligo dT Primer。反转录PCR程序为：42℃50min，95℃，5min，4℃保温，所用PCR仪(ABI，SimpliAmpTM热循环仪)。荧光定量PCR操作步骤：使用Maxima SYBR Green qPCRMaster Mix(Thermo Scientific,K0251)试剂盒，完全按照试剂盒说明书进行操作。按要求加入反应液后，将反应板置于qPCR仪进行检测，反应程序为：95℃，10min，95℃15s，60℃30s，40个循环，72℃30s，72℃10min。获得基因在不同时间点的表达情况(图5B)。
qPCR所用引物序列如下(5′-3′)：
CK19引物序列：
Forward：ATGGCCGAGCAGAACCGGAA
Reverse：CCATGAGCCGCTGGTACTTCC
ALB引物序列：
Forward：GCACAGAATCCTTGGTGAACAG
Reverse：ATGGAAGGTGAATGTTTCAGCA
CYP3A4引物序列：
Forward：TAACAGTCTTTCCATTCCTC
Reverse：GGACTCAGTTTCTTTTGAAT
由图5B可知，实施例2制备的人工肝结构体各种基因的表达水平均高于二维培养(所用培养基成分相同)中基因表达水平，CYP3A4是成熟肝细胞药物代谢功能的标志性蛋白，其基因转录水平是同等条件下二维培养细胞的2.3倍，ALB是成熟肝细胞分泌功能的标志性蛋白，三维打印结构体中ALB基因转录水平是同等条件下二维培养细胞的36.2倍；CK19是胆管上皮细胞的特异性表达的标记蛋白，三维打印结构体中CK19基因转录水平是同等条件下二维培养细胞的18.7倍。**和***表示数据有显著性差异。
所得三维人工肝组织的截面是外切圆直径为6cm的六边形，高6cm；中央含有直径2cm的圆柱结构和6根辐条支撑结构(图1)。细胞密度约为8×106个/cm3，杨氏模量为1.5KPa。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (13)

1.含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体，其特征在于，所述人工肝结构体的尺寸大小为0.1~50 cm，其宏观结构为柱状、块状、片状、囊状、管状、网格状、编织状或任意形状组合；其中，肝细胞呈肝板样或团簇形态，胆管上皮细胞呈胆管样三维脉管网络形态；
所述的人工肝结构体包含直径大小为50~2000 μm的微丝和内径大小为0.01~300 mm的中空通道；其中，所述微丝是由生物相容性材料和细胞通过铸模法或3D打印工艺形成的，呈丝状或圆柱状结构；所述中空通道是由相邻的数根微丝围绕形成的；
所述细胞至少包含肝细胞和胆管上皮细胞；
所述的人工肝结构体的杨氏模量为0.1-150Kpa；
所述肝细胞和胆管上皮细胞来源于诱导多能干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝母细胞、间充质干细胞或成体干细胞，以及这些细胞分化得到的肝细胞；人体各种组织来源的肝细胞及其细胞系；以及上述所有细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞；
含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体的制备方法包括：
（1）将生物相容性材料与细胞均匀混合得到含有细胞的前体溶液；
（2）将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体；
（3）对三维水凝胶结构体进行后处理；
（4）三维水凝胶结构体的体外培养和/或细胞诱导分化获得含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体；
其中，所述细胞至少包含肝细胞和胆管上皮细胞；
步骤（4）对三维水凝胶结构体进行体外培养，包括静置培养和/或动态培养；
体外培养所用细胞培养液包含50-120 ng/ml激活素A，10-50 ng/ml骨形态发生蛋白2，10-50 ng/ml骨形态发生蛋白4，10-50 ng/ml成纤维细胞生长因子4，1%-2% v/v二甲基亚砜，10-50 ng/ml肝细胞生长因子，1×10-5-1×10-4M抑癌蛋白M，10-50 ng/ml角质细胞生长因子，1×10-6-5×10-6M丁酸钠，1×10-6-5×10-6M牛黄胆酸钠和1×10-6-5×10-6M表皮细胞生长因子。
2.根据权利要求1所述的人工肝结构体，其特征在于，所述肝细胞和胆管上皮细胞来源于肝脏干细胞及其细胞系、诱导多能干细胞分化得到的肝脏细胞和胆管细胞。
3.根据权利要求1所述的人工肝结构体，其特征在于，所述细胞还包括肝星状细胞、肝窦内皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、枯否细胞中的一种或多种，包括上述细胞及其细胞系，以及上述细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞；细胞来源于诱导多能干细胞、胚胎干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、间充质干细胞或成体干细胞，由多种细胞分化得到，或人体各种组织获得。
4.根据权利要求3所述的人工肝结构体，其特征在于，所述细胞还包括成纤维细胞和/或内皮细胞。
5.根据权利要求1所述的人工肝结构体，其特征在于，所述生物相容性材料选自天然水凝胶材料和/或人工合成的水凝胶材料；
其中，所述天然水凝胶材料选自壳聚糖、壳聚糖衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、明胶和/或明胶衍生物；
所述人工合成的水凝胶材料选自聚乙醇酸或聚乳酸。
6.根据权利要求1-5任一项所述的人工肝结构体，其特征在于，所述人工肝结构体具有高度仿生的生理功能，阳性表达成熟肝组织的标志性基因和蛋白，具有白蛋白分泌、氮代谢、尿素合成、解毒和药物代谢的肝组织生理功能；所述人工肝结构体还具有胆管上皮细胞连接形成的胆管网络结构，表达胆管上皮细胞标志物。
7.权利要求1-6任一项所述人工肝结构体的制备方法，其特征在于，包括：
（1）将生物相容性材料与细胞均匀混合得到含有细胞的前体溶液；
（2）将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体；
（3）对三维水凝胶结构体进行后处理；
（4）三维水凝胶结构体的体外培养和/或细胞诱导分化获得含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体；
其中，所述细胞至少包含肝细胞和胆管上皮细胞，所述细胞同权利要求1或2中所述，所述生物相容性材料同权利要求5中所述。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（2）采用如下方法将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体：铸模法、消失模法、生物3D打印法、喷墨打印法、熔融沉积成型法、静电纺丝法、静电驱动打印法、立体光刻法或激光烧结法；
所述方法是通过控制温度使三维结构成型，温度控制范围在0℃~37℃；和/或
所述方法是通过光处理使三维结构成型；光处理使用白光或紫外光。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）中通过控制温度使三维结构成型，温度控制范围在4℃~36℃。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述后处理方法包括稳定化处理和/或牺牲材料处理；
其中，对三维水凝胶结构体进行稳定化处理所用的交联试剂选自二价阳离子、京尼平、戊二醛、己二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物中的至少一种；所述交联试剂的浓度为0.1mM~10M；
对三维水凝胶结构体进行牺牲材料处理，包括去除多余材料，所述多余材料包括三维水凝胶结构体中的温敏材料、交联试剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤（3）中对三维水凝胶结构体进行稳定化处理所用的交联试剂为二价阳离子和/或凝血酶；所述交联试剂的浓度为10mM~500mM。
12.根据权利要求7-11任一项所述的方法，其特征在于，步骤（4）对三维水凝胶结构体进行体外培养，包括静置培养和/或动态培养；
其中，静置培养在培养皿、多孔板中进行；动态培养在生物反应器、脉动培养装置、微重力培养装置、搅拌培养装置、波浪式培养装置、芯片或灌注培养系统中进行；和/或
体外培养所用细胞培养液包含50-120 ng/ml激活素A，10-50 ng/ml骨形态发生蛋白2，10-50 ng/ml骨形态发生蛋白4，10-50 ng/ml成纤维细胞生长因子4，1%-2% v/v二甲基亚砜，10-50 ng/ml肝细胞生长因子，1×10-5-1×10-4M抑癌蛋白M，10-50 ng/ml角质细胞生长因子，1×10-6-5×10-6M丁酸钠，1×10-6-5×10-6M牛黄胆酸钠和1×10-6-5×10-6M表皮细胞生长因子；和/或
体外培养条件为：35℃~38℃，5%CO2。
13.权利要求1-6任一项所述的人工肝结构体或按照权利要求7-12任一项所述方法制备的人工肝结构体的以下任一应用：
1）药物临床前检测；
2）环境监测；
3）毒理检测；
4）新药研发；
5）肝组织发育的研究；
6）疾病发生和发展的研究。
CN202011163991.7A 2020-10-19 2020-10-27 含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体及其制备方法与应用 Active CN114377209B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2021/076789 WO2022083037A1 (zh) 2020-10-19 2021-02-19 仿生人工肝组织及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011120082 2020-10-19
CN2020111200825 2020-10-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114377209A CN114377209A (zh) 2022-04-22
CN114377209B true CN114377209B (zh) 2022-09-23

Family

ID=81194819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011163991.7A Active CN114377209B (zh) 2020-10-19 2020-10-27 含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114377209B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011016485A1 (ja) * 2009-08-04 2011-02-10 国立大学法人岡山大学 ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導方法
CN103237888A (zh) * 2010-07-29 2013-08-07 荷兰皇家科学院 肝脏的类器官、其用途以及获得它们的培养方法
CN106916781A (zh) * 2015-12-25 2017-07-04 清华大学 一种体外三维人体肝组织的构建方法及其应用
WO2018187380A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 Greene Nguyen Deborah Lynn Use of engineered liver tissue constructs for modeling liver disorders
CN110403731A (zh) * 2019-07-30 2019-11-05 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 基于活细胞3d打印的组织工程仿生肝叶结构及制备方法
CN111139213A (zh) * 2020-01-06 2020-05-12 清华大学 多层次结构支架及其制备方法与应用
WO2020182987A1 (en) * 2019-03-13 2020-09-17 Cellink Ab Liver tissue model constructs and methods for providing the same

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011016485A1 (ja) * 2009-08-04 2011-02-10 国立大学法人岡山大学 ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導方法
CN103237888A (zh) * 2010-07-29 2013-08-07 荷兰皇家科学院 肝脏的类器官、其用途以及获得它们的培养方法
CN106916781A (zh) * 2015-12-25 2017-07-04 清华大学 一种体外三维人体肝组织的构建方法及其应用
WO2018187380A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 Greene Nguyen Deborah Lynn Use of engineered liver tissue constructs for modeling liver disorders
WO2020182987A1 (en) * 2019-03-13 2020-09-17 Cellink Ab Liver tissue model constructs and methods for providing the same
CN110403731A (zh) * 2019-07-30 2019-11-05 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 基于活细胞3d打印的组织工程仿生肝叶结构及制备方法
CN111139213A (zh) * 2020-01-06 2020-05-12 清华大学 多层次结构支架及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Three-dimensional bioprinted hepatorganoids prolong survival of mice with liver failure;Huayu Yang，et al.;《GUT》;20200205;第70卷(第3期);第567-574页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114377209A (zh) 2022-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11214768B2 (en) Methods of generating functional human tissue
EP3150704B1 (en) Culture method and cell mass
CN111139213B (zh) 多层次结构支架及其制备方法与应用
US20110281351A1 (en) Process for producing laminated high-density cultured artificial tissue, and laminated high-density cultured artificial tissue
US20140199276A1 (en) Inkjet printing of tissues and cells
WO2014066649A1 (en) A strategy for engineering various 3d tissues, organoids and vasculature
US20240139378A1 (en) Bioengineered vascular network
WO2010040699A1 (en) Multi-culture bioreactor system
EP3743505A2 (en) Rolled scaffold for large scale cell culture in monolayer
US20210222128A1 (en) Inducible tissue constructs and uses thereof
Chae et al. 3D bioprinting adipose tissue for breast reconstruction
CN114377209B (zh) 含有胆管和肝脏组织的人工肝结构体及其制备方法与应用
Kuo et al. Guided differentiation and tissue regeneration of induced pluripotent stem cells using biomaterials
WO2005100549A1 (ja) 臓器特異的幹細胞の増殖方法及び増殖装置
Obregón et al. Bioreactors in tissue engineering
CN113717925B (zh) 一种人工肝脏类器官及其制备方法和应用
CN114381419A (zh) 仿生人工肝组织及其制备方法与应用
WO2022083037A1 (zh) 仿生人工肝组织及其制备方法与应用
CN114381420B (zh) 类肝组织结构体及其制备方法与应用
CN112206074B (zh) 管状类血管结构体及其构建方法
Morsi et al. Advancement of lung tissue engineering: an overview
Marti-Figueroa Engineering 3-D Neural Organoid Morphology
Nguyen Dynamic coculture of a prevascularized engineered bone construct
Meneghello Development of a Novel PVA-PLGA Hollow Fibre Bioreactor for Tissue Engineering
Thomas Design of a Hydrogel for 3-D Bioprinting Neural Tissue

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant