CN114381419A - 仿生人工肝组织及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种仿生人工肝组织及其制备方法与应用。本发明提供的仿生人工肝组织含有接近人体天然组织的极高的细胞密度，肝细胞呈现致密排布的特征更，肝组织功能良好。该人工肝组织具有成熟肝组织具有的白蛋白分泌、药物代谢、氮代谢和尿素合成等功能，表达成熟肝细胞的标志性蛋白标记物。本发明提供的构建方法工艺稳定，不仅可以使细胞快速增殖，获得与天然组织类似的极高的细胞密度，且获得的肝组织功能良好。本发明提供的构建方法可根据需要定制化设计、批量化生产。本发明的仿生人工肝组织可用于药物临床前检测、再生医学和体内移植、生物人工肝和肝功能代偿、肝脏疾病研究与治疗、药物测试与新药开发等领域。

Description

仿生人工肝组织及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物材料和生物医学工程领域，具体地说，涉及一种仿生人工肝组 织及其制备方法与应用。

背景技术

据世界卫生组织统计，全球每年有大约2000万人罹患包括脂肪肝、病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等在内的各种肝脏疾病，而肝移植是目前临床治疗晚期肝病唯一的有 效途径，临床上等待肝移植的病人数量远远多于供肝的数量。体外肝脏支持系统(生 物人工肝)可以有效缓解这一问题，但目前的生物人工肝细胞功能不足，且培养方 式受限，缺乏功能性良好的体外肝组织用于肝功能代偿。

肝脏是机体代谢的主要器官，在药物代谢中起着重要作用。到目前为止，由于 人体试验的伦理和安全限制，平面培养的肝细胞和动物模型是最常用的药物肝毒性 筛选和新药研发的模型，已有大量研究表明相较于平面培养的细胞，三维培养的细 胞的生长状态更加接近体内组织细胞；而动物模型与人类的肝脏功能的巨大差异， 导致现有的药物筛选技术都难以很好地模拟体内组织。一方面会降低药效测试准确 度，药物上市后仍可能出现人体毒性和副作用事件，其中被召回的药物约50％都源于 药物的肝毒性；另一方面，也无法构建仿生病理模型进行病理学研究和新药研发。

人体天然肝组织的细胞密度达到10⁸～10⁹个/mL量级，细胞-细胞之间形成致密连接，并有广泛分布的血管作为营养传输媒介。目前公知，人体组织的结构与生理功 能之间存在密切联系，接近体内生理条件的细胞密度，对于肝组织的生理功能实现 具有重要意义。而在体外，由于构建技术和培养条件的局限性，尚未见到如此高密 度的人工肝组织的技术报道。因此，目前亟需接近人体肝组织细胞密度(达到10⁷～10⁸个/mL量级)的体外肝组织模型，服务于药物临床前检测、再生医学和体内移植、生 物人工肝和肝功能代偿、肝脏疾病研究与治疗、新药开发等领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种仿生人工肝组织及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种仿生人工肝组织，所述仿生 人工肝组织的尺寸大小为0.1～50cm，其宏观结构可以是柱状、块状、片状、囊状、 管状、网格状、编织状或任意形状组合；

所述仿生人工肝组织包含直径大小为50～2000μm的微丝和内径大小为0.01～300mm的中空通道；其中，所述微丝是由生物相容性材料和细胞通过铸模法或3D打印工 艺形成的，呈丝状或圆柱状结构；所述中空通道是由相邻的数根微丝围绕形成的； 中空通道的大小、形状和分布密度可以根据需求设计；

所述仿生人工肝组织中至少包含肝细胞，肝细胞呈现致密排列特征；

所述仿生人工肝组织具有接近人体天然肝组织的极高的细胞密度，细胞密度达到甚至超过10⁷～10⁸个/mL量级；

所述仿生人工肝组织的杨氏模量为0.1-150KPa。

优选地，所述细胞来源于胚胎干细胞、诱导多能干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖 细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、肝母细胞、间充质干细胞或成体干细胞，以 及这些细胞分化得到的肝细胞；人体各种组织来源的肝细胞及其细胞系；以及上述 所有细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞；优选肝脏干细胞及其细 胞系、诱导多能干细胞分化得到的肝脏细胞。

进一步地，所述细胞还可以包括胆管上皮细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞、 内皮细胞、成纤维细胞、枯否细胞等中的一种或多种，包括上述细胞及其细胞系，以 及上述细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞；细胞来源于诱导多能干 细胞、胚胎干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、间充 质干细胞或成体干细胞，由多种细胞分化得到，或人体各种组织获得；优选成纤维细 胞和/或内皮细胞。

本发明中，所述生物相容性材料可选自天然水凝胶材料和/或人工合成的水凝胶材料。

所述天然水凝胶材料可选自壳聚糖、壳聚糖衍生物、明胶、明胶衍生物、藻酸 盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、透明质酸、透明质酸衍生 物、纤维素、纤维素衍生材料、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白、糖蛋白衍生 材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋 白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶等中的至少一种；优选壳聚糖、壳聚糖衍 生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维蛋白、明胶和/或明胶衍生物。

所述人工合成的水凝胶材料可选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚谷氨酸-聚乙二醇、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚乙醇酸、聚乙二醇-聚二氧六 环酮、聚乙二醇、聚四氟乙烯、聚氧化乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚三亚甲基碳酸 酯、聚对二氧环己酮、聚醚醚酮，以及它们的衍生物或聚合物等中的至少一种；优 选聚乙醇酸或聚乳酸。

本发明的仿生人工肝组织具有高度仿生的生理功能，阳性表达成熟肝组织的标志性基因和蛋白，具有白蛋白分泌、氮代谢、尿素合成、解毒和药物代谢的肝组织 生理功能。

第二方面，本发明提供仿生人工肝组织的制备方法，包括：

(1)将生物相容性材料与细胞均匀混合得到含有细胞的前体溶液；

(2)将所述前体溶液按照预先设计的结构(图7)制备成三维水凝胶结构体；

(3)对三维水凝胶结构体进行后处理；

(4)三维水凝胶结构体的体外培养和/或细胞诱导分化获得仿生人工肝组织。

其中，所述细胞至少包含肝细胞。

步骤(2)可采用如下方法将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体：铸模法、消失模法、生物3D打印法、喷墨打印法、熔融沉积成型法、静 电纺丝法、静电驱动打印法、立体光刻法或激光烧结法等。

所述方法可以是通过控制温度使三维结构成型，温度控制范围在0℃～37℃，优选4℃～36℃。

所述方法还可以是通过光处理使三维结构成型，优选白光或紫外光。

步骤(3)所述后处理方法包括稳定化处理和/或牺牲材料处理。

其中，对三维水凝胶结构体进行稳定化处理所用的交联试剂选自二价阳离子、 京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物等 中的至少一种；优选二价阳离子和/或凝血酶。

所述交联试剂的浓度为0.1mM～10M，优选10mM～500mM。

对三维水凝胶结构体进行牺牲材料处理，包括去除多余材料，所述多余材料包 括三维水凝胶结构体中的温敏材料(如明胶、胶原蛋白、N-异丙基丙烯酰胺和聚乙 烯吡咯烷酮等)、交联试剂等。

步骤(4)对三维水凝胶结构体进行体外培养，包括静置培养和/或动态培养。

优选地，静置培养在培养皿、多孔板中进行；动态培养在生物反应器、脉动培 养装置、微重力培养装置、搅拌培养装置、波浪式培养装置、芯片或灌注等培养系 统中进行。

体外培养所用细胞培养液是在基础培养液的基础上添加了诱导肝细胞分化和维持肝细胞功能的因子；其中，所述诱导肝细胞分化和维持肝细胞功能的因子选自骨 形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、二甲基亚砜、抑癌蛋白M 等中的至少一种。

优选地，所述细胞培养液包含50-120ng/ml激活素A，10-50ng/ml骨形态发生蛋 白2，10-50ng/ml骨形态发生蛋白4，10-50ng/ml成纤维细胞生长因子4，0.1％-2％v/v 二甲基亚砜，10-50ng/ml肝细胞生长因子，1×10^-5-1×10^-4M抑癌蛋白M，1mM抗坏 血酸，0.2mM N-乙酰半胱氨酸酰胺和1×10^-7M地塞米松。各因子之间协同作用，共 同促进肝细胞的分化和成熟。

体外培养条件为：35℃～38℃，5％CO₂。

第三方面，本发明提供按照所述方法制备的仿生人工肝组织。

所述仿生人工肝组织的宏观结构为柱状、块状、片状、囊状、管状、网格状、 编织状或任意形状组合。

优选地，所述仿生人工肝组织的尺寸大小为0.1～50cm。

优选地，所述仿生人工肝组织包含直径大小为50～2000μm的微丝。

优选地，所述仿生人工肝组织具有内径大小为0.01～300mm的中空通道。

优选地，所述仿生人工肝组织的杨氏模量为0.1-150KPa。

本发明提供的仿生人工肝组织含有接近人体天然组织的极高的细胞密度，肝细胞形成致密团簇，肝组织功能良好。该人工肝组织具有成熟肝组织具有的白蛋白分 泌、药物代谢、氮代谢和尿素合成等功能，表达成熟肝细胞的标志性蛋白标记物。

第四方面，本发明提供所述仿生人工肝组织的以下任一应用：

1)药物临床前检测；

2)用作再生医学和体内移植的材料；

3)用作生物人工肝和肝功能代偿的研究；

4)肝脏疾病病理学研究；

5)新药研发。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供的仿生人工肝组织符合人类肝脏极高细胞密度的生理组织特性。正常人体组织细胞密度在每毫升10⁸～10⁹个细胞左右。本发明通过培养因子的精 准化控制，结合三维结构和仿生的生物材料，所构建的仿生人工肝组织中的细胞密 度可达到每毫升10⁸个细胞左右的量级，并且具有良好的肝脏功能，填补了目前体外 构建高密度、高度仿生、功能良好的人工肝结构体的技术空白。

(二)本发明提供的仿生人工肝组织具有良好的肝脏功能。本发明提供的仿生 人工肝组织高表达成熟肝组织/细胞所特有的白蛋白分泌相关和药物代谢相关的功能 蛋白和基因，具有良好的分泌白蛋白和氮代谢的功能，并且组织的肝功能可维持较 长时间。本发明提供的人工肝组织可用于药物临床前检测的药筛模型，以及再生医 学和体内移植，或生物人工肝和肝功能代偿，可代谢和清除体内外内外源化合物， 补充需肝脏合成或代谢的蛋白质等必须物质。因其高度仿生的特性，可用于肝脏疾 病病理学研究与治疗、新药研发等领域。

(三)本发明提供人工肝结构体的宏观和微观形态可调控，可根据需要定制化 生产。可采用以下的一种或多种技术制备：铸模法、消失模法、生物3D打印法、喷 墨打印法、熔融沉积成型法、静电纺丝法、静电驱动打印法、立体光刻技术法、激 光烧结技术法。通过上述方法，可以根据具体需求，制造出形状复杂、尺寸可控的 三维结构。还可对三维结构的宏观形状与微观结构进行调控，满足不同细胞对营养 物质、氧气浓度和生存微环境的需求。整体结构上既可形成微米和毫米级尺度的微 型人工肝结构体，也可形成厘米、甚至分米级尺度的大型人工肝结构体。

(四)本发明的仿生人工肝组织提供了促进肝细胞增殖、分化和功能维持的稳 定微环境。平面培养细胞的方法虽简单易行，却不能模拟细胞生长的三维环境：平 面培养条件下，随着细胞密度的增加，细胞膜上糖蛋白进行信号转导，会抑制细胞 的增殖。本发明提供的生物材料为细胞提供了附着点，细胞可以在结构内迁移和聚 集，生物材料的多孔性保证了细胞与培养环境中的营养物质和气体交换，利于细胞 的增殖和分化。通过调节诱导分化培养液的成分，可以诱导细胞在分化成熟，并维 持成熟肝脏细胞的生理功能。

(五)本发明提供的构建方法工艺稳定，不仅可以使细胞快速增殖，获得与天 然组织类似的极高的细胞密度，且获得的肝组织功能良好。本发明构建的人工肝组 织的弹性模量在0.1-150KPa，接近健康成人肝组织的弹性模量。本发明构建的人工肝 组织结构稳定性好，可以维持三维立体结构实现长期培养和动态培养，有利于均匀、 充足的养分和气体交换，促进细胞增殖和功能维持。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中仿生人工肝组织的三维结构示意图。其中，A为用铸 模法制备的三维立体结构示意图，B为用3D打印法制备三维立体结构的示意图，C为 铸模法制备的具有极高密度肝细胞分布的仿生人工肝组织的示意图，其中团簇状为 组织内的肝细胞团簇。

图2为本发明较佳实施例中挤出式生物3D打印工艺与多层网格结构示意图。

图3为本发明较佳实施例中仿生人工肝组织的显微形貌图。光学显微镜下可见密集分布的肝细胞，肝细胞以紧密排列的细胞团簇形式存在。

图4为本发明较佳实施例中仿生人工肝组织的细胞增殖情况。

图5为本发明较佳实施例中仿生人工肝组织的成熟肝细胞的关键标志性蛋白表达情况。

图6为本发明较佳实施例中仿生人工肝组织的功能情况。其中，A表示本发明仿 生人工肝组织中白蛋白和尿素分泌水平，与二维培养的同种条件比较；B表示肝组织 的关键标志性基因表达标准化到平面培养的同种细胞的水平，与二维培养的同种条 件比较。*，**和***表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，*表示P<0.05，** 表示P<0.01，***表示P<0.001。

图7为本发明用于构建仿生人工肝组织的不同设计结构的示意图。

具体实施方式

本发明提供一种仿生人工肝组织，其具有细胞密度接近于人体天然肝组织的细胞密度的特征。

在本发明具体实施方式中，所述仿生人工肝组织的宏观结构为柱状、块状、片状、囊状、管状、网格状、编织状或任意形状组合。

在本发明具体实施方式中，所述仿生人工肝组织具有尺寸为0.1～50cm的三维结构。在一些具体实施例中，所述肝组织具有尺寸为2cm×2cm×0.2cm的三维结构。

在本发明具体实施方式中，所述仿生人工肝组织所述肝组织由直径大小为50～2000 μm的微丝组成。

在本发明具体实施方式中，所述仿生人工肝组织具有内径大小为0.01～300mm的中 空通道。

在本发明具体实施方式中，所述仿生人工肝组织具有较好的力学性能，杨氏模量为0.1-150KPa。

在本发明具体实施方式中，所述的仿生人工肝组织含有极高密度的活性细胞，细胞密度达到10⁷～10⁸个/mL量级，细胞种类包括但不限于肝细胞。细胞来源于：诱导多 能干细胞、胚胎干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、 肝母细胞、间充质干细胞和成体干细胞等多种细胞及其细胞系，以及这些细胞分化得 到的肝细胞；人体各种组织来源的肝细胞及其细胞系；以及上述所有细胞经过基因编 辑、病毒包装或改造获得的相关细胞。优选肝脏干细胞及其细胞系、诱导多能干细胞 分化得到的肝脏细胞。

在本发明具体实施方式中，所述含有极高密度的活性细胞的仿生人工肝组织，其中的活性细胞除了肝细胞之外，还可以包含以下一种或者多种细胞：由诱导多能干细 胞、胚胎干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、间充质 干细胞和成体干细胞等多种细胞分化得到胆管上皮细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞、 内皮细胞、成纤维细胞、枯否细胞，人体各种组织来源的胆管上皮细胞、肝星状细胞、 肝窦内皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、枯否细胞及其细胞系，以及上述所有细胞经 过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞。优选成纤维细胞和/或内皮细胞。

在本发明具体实施方式中，所述仿生人工肝组织含有生物相容性材料。

在本发明具体实施方式中，所述生物相容性材料选自天然材料和/或人工合成材料；

在本发明具体实施方式中，所述天然水凝胶材料选自壳聚糖、壳聚糖衍生物、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、透明 质酸、透明质酸衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖 蛋白、糖蛋白衍生材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、丝素蛋白、丝素蛋白 衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶中的一种或多种，优选壳聚 糖、壳聚糖衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维蛋白和/或明胶、明胶衍生物；

在本发明具体实施方式中，所述人工合成的水凝胶材料选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚谷氨酸-聚乙二醇、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚乙醇 酸、聚乙二醇-聚二氧六环酮、聚乙二醇、聚四氟乙烯、聚氧化乙烯、聚乙烯醋酸乙烯 酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚对二氧环己酮、聚醚醚酮、以及以上材料的衍生物和聚合 物中的至少一种，优选聚乙醇酸或聚乳酸。

本发明还提供上述仿生人工肝组织的制备方法，包括以下步骤：

(1)将生物相容性材料与细胞均匀混合得到含有细胞的前体溶液；

(2)将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体；

(3)对三维水凝胶结构体进行后处理；

(4)三维水凝胶结构体的体外培养和/或细胞诱导分化获得仿生人工肝组织。

进一步地，将仿生人工肝组织应用于药物临床前检测、再生医学和体内移植、生物人工肝和肝功能代偿、肝脏疾病研究与治疗、药物测试和新药研发等方面。

按照上述方法可以构建形成一种极高细胞密度的人工肝组织，细胞密度接近人体天然肝组织。

根据本发明极高细胞密度的仿生人工肝组织的制备方法，可采用如下方法将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维结构体：铸模法(或工艺)、消失模法(或工 艺)、生物3D打印法(或工艺)、喷墨打印法(或工艺)、熔融沉积成型法(或工艺)、 静电纺丝法(或工艺)、静电驱动打印法(或工艺)、立体光刻技术法(或工艺)、激光 烧结技术法(或工艺)。

在本发明一些具体实施方式中，所述制备方法通过控制温度使三维结构成型，温度控制范围在0℃～37℃，优选4℃～36℃。

在本发明一些具体实施方式中，所述制备方法通过光处理使三维结构成型，优选白光或紫外光。

根据本发明极高细胞密度的仿生人工肝组织的制备方法，基于不同制备方法进行结构体后处理，后处理方法主要包括稳定化处理和牺牲材料处理。

根据本发明极高细胞密度的仿生人工肝组织的制备方法，可以对三维结构进行稳定化处理，得到结构稳定、含有活性细胞的三维结构体。

在本发明一些具体实施方式中，对三维水凝胶结构体进行稳定化处理所用的试剂(交联试剂)选自以下的一种或多种：二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、 环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物，优选为二价阳离子和/或凝血酶。

在本发明一些具体实施方式中，所用的交联溶液(交联试剂)的质量百分比浓度为0.1mM～10M，优选10mM～500mM。

根据本发明极高细胞密度的仿生人工肝组织的制备方法，可以对三维结构进行牺牲材料处理，去除多余材料。包括但不限于通过控制温度去除结构内的温敏材料，通 过离子置换作用去除结构内的离子交联的材料，通过酶解去除酶交联的材料。

根据本发明的仿生人工肝组织的制备方法，步骤(4)所述对人工肝组织进行培养；或者，进一步地，还包括进行细胞收集和/或检测的步骤。

其中，所述人工肝结构体可以静置培养和/或动态培养。人工肝结构体可以培养在各种本领域常用的培养用具中，如培养皿、多孔板等。所述动态培养方法可使用本领 域常用的仪器，如借助各种形式的生物反应器、脉动培养、微重力培养装置、搅拌培 养装置、波浪式培养装置、芯片、灌注等培养系统。

其中，所述仿生人工肝组织于35℃～38℃，5％CO₂条件下培养。

本发明对细胞培养液和培养方法进行了改良，添加了维持肝细胞功能的因子培养14～20天：50～120ng/ml激活素A(Gibco,PHG9014)，10～50ng/ml骨形态发生蛋白2(Gibco,PHC7146)，10～50ng/ml骨形态发生蛋白4(Gibco,PHC9533)，10～50ng/ml 成纤维细胞生长因子4(R&D SYSTEMS,233-FB-025)，0.1％～2％二甲基亚砜(Sigma, D2650)，10～50ng/ml肝细胞生长因子(R&D SYSTEMS，294-HGN-005)，1×10^-5M～1 ×10^-4M抑癌蛋白M(INVITROGEN，PHC5015)，1mM抗坏血酸(Sigma,1043003)， 0.2mM N-乙酰半胱氨酸酰胺(Sigma,A0737)，1×10^-7M地塞米松(D4902)。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。

本文中使用的术语“交联溶液”是指在三维水凝胶结构形成过程中起到交联作用的溶液，其可以是本领域技术人员公知可用于使得水凝胶材料发生交联从而形成固化 结构的材料，例如氯化钙溶液，浓度为0.1mM～10M，优选1mM～100mM，例如100mM 浓度的氯化钙溶液。

本文中使用的术语“生物打印”是指一种在体外构建具有生物活性的细胞-材料三维空间结构体的先进技术。基于“离散-堆积”原理和计算机设计，经由与自动的或半自 动的、计算机辅助的三维成型装置(例如三维打印机)相匹配的方法，将活细胞、基 质材料、蛋白质等活性材料作为基本成形原料，进行的三维精确沉积，这一技术在构 建复杂结构的多种细胞/外基质材料三维结构体方面具有独特优势。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。 实施例1双喷头三维打印设备制备仿生人工肝组织

本实施例提供一种利用生物3D打印技术构建的一种仿生人工肝组织，如图1所示。

1、肝脏祖细胞的获得与培养

使用诱导性多能干细胞(iPSCs)进行诱导分化，获得肝脏祖细胞。具体实施步 骤为：将iPS细胞(Stem Cell)使用细胞分散酶(Dispase,Roche Diagnostics)解离并 接种于Matrigel基底上(Becton Dickinson)上。随后，将iPSCs培养于L-WNT3A (CRL2647；ATCC)-expressing cell-conditioned RPMI 1640培养液中(Sigma)培养3～4 天向限定性内胚层阶段进行分化，培养液成分包括：50ng/mL激活素A(Activin A， R&D Systems)，1％GlutaMAX^TMSupplement(Gibco,35050061)，1％青链霉素(Gibco)， 2％FBS和1×B-27(Thermo Fisher Scientific)，获得限定性内胚层阶段的细胞。随后， 将限定性内胚层阶段的细胞培养于RPMI 1640基础培养液中培养6天，获得肝脏祖细 胞，培养液中包含：30ng/mL骨形态发生蛋白(BMP4,R&D Systems)和30ng/mL 成纤维细胞生长因子(FGF4,R&DSystems)，1％GlutaMAX^TMSupplement和1×B-27 (Thermo Fisher Scientific)。

2、成纤维细胞的平面培养

人成纤维细胞(HFL1,CCL-153)购自ATCC公司。使用扩增培养基对人成纤维细胞进行平面贴壁培养，每2天更换培养液，当细胞达到85％汇合时按照1:3的比例传代。 人成纤维细胞的培养基的成分为：DMEM培养液(Gibco,11960044)中添加10％FBS 血清(Gibco,16000)，1％成纤维细胞生长添加剂(RayBiotech，230-00791-100)，1％ 青链霉素(Gibco,15140122)。

3、打印材料的制备

配制21％的聚乳酸(Sigma-Aldrich，765112，分子量10000Da)溶液和21％的纤 维蛋白原溶液(Sigma-Aldrich，F3879)。

向步骤1获得的肝脏祖细胞中，先加入PBS润洗表面，然后加入胰酶(Gibco，25200072)覆盖细胞表面，37℃条件下消化3min后收集，离心得到单细胞悬液。

向步骤2的人成纤维细胞中加入PBS润洗表面，然后加入胰酶(Gibco，25200072)覆盖细胞表面，37℃条件下消化3min后收集，离心得到人成纤维细胞的沉淀，用基 础培养基重悬，得到单细胞悬液。

分别将两种细胞悬液与提前加热的聚乳酸溶液/纤维蛋白原溶液混合均匀，获得打印溶液A(单细胞悬液A)：肝脏祖细胞浓度为2.5×10⁶个细胞/mL，7％聚乳酸溶液 和7％纤维蛋白原溶液，以及打印溶液B(单细胞悬液B)：人成纤维细胞浓度为2.5×10⁶个细胞/mL，7％聚乳酸溶液和7％纤维蛋白原溶液。

4、生物3D打印制备仿生人工肝结构体

使用捷诺飞生物科技股份有限公司的挤出式打印设备(Regenovo，Bio-architectX)构建三维结构体。分别将获得的可打印的单细胞悬液A和B装载至双喷头生物3D 打印机上，控制打印机腔内温度、打印底板温度和喷头温度为20℃，按照设计好的 CAD文件与计算机路径，可以构建多种具有复杂结构的三维立体结构。本实施例中 使用双喷头打印机，构建了每层6根微丝(微丝的成分同打印溶液A、B)，一共6层， 每根微丝长2cm，高0.5cm的立体六边形网格结构，结构示意图如图2所示。构建后使 用500mM凝血酶溶液浸泡结构体10min完成稳定化后处理，得到三维人工肝结构体。

5、人工肝组织培养与功能成熟

人工肝结构体构建完成后，于37℃5％CO₂条件下采用程序性诱导培养基培养10天，获得具有极高细胞密度的仿生人工肝组织。前5～6天，采用第一阶段诱导培养基， 具体成分为：RPMI 1640培养液，20ng/ml骨形态发生蛋白2(BMP2,Gibco,PHC7146)， 20ng/ml骨形态发生蛋白4(BMP4,Gibco,PHC9533)，30ng/ml成纤维细胞生长因子4 (FGF4,R&DSYSTEMS，233-FB-025)，20ng/ml肝细胞生长因子(HGF,R&D systems,294-HGN-005)，0.1％DMSO(Sigma)和1×B-27Supplement(Gibco, 17504044)。之后更换为第二阶段诱导培养基，具体成分为：肝细胞培养基(HCM； Lonza)，含有1％表皮细胞生长因子(R&D systems,236-EG-200)，5×10^-5M抑癌蛋白 M(INVITROGEN,PHC5015)，2％GlutaMAX^TMSupplement(Gibco,35050061), 5×10^-5M氢化可的松琥珀酸钠(常州四药)，0.2％二甲基亚砜(Sigma,D2650)，0.05％ 胰岛素(Sigma,I9278)，0.05％转铁蛋白(Transferrin，Sigma,T8158)，0.05％肾上腺素 (Sigma,E4642)，1mM抗坏血酸(Sigma,1043003)，0.2mM N-乙酰半胱氨酸酰胺(Sigma,A0737)，1×10^-7M地塞米松(D4902)。

本发明的细胞培养液在已有研究的基础上进行了改良，增加了维持肝细胞功能的因子：骨形态发生蛋白，成纤维细胞生长因子，肝细胞生长因子和抑癌蛋白M等多 种因子。

6、人工肝组织动态培养

静置培养10天后，再采用动态培养模式继续培养10天。本实施例中采用脉动培养，脉动生物反应器参见ZL200910079726.8。

采用崇州市崇阳众诚不锈钢配件服务部生产的蠕动泵JD-200来提供相应的循环动力，设定其工作电压为12V，流速为60ml/min；直流电机为北京艾克斯电机有限公 司生产的电机ZGB37RH52i，设定其工作电压为12V、转速为100r/min；采用100ml 的注射器；将自制导杆和滑块导轨，以及各部件，如直流电机、导杆、滑块导轨、 注射器用自制的支架固定在底板上，连接各部件。

细胞培养液循环部分由培养液瓶、蠕动泵和培养盒构成，各部分由硅胶管连接，培养液经硅胶管由蠕动泵从培养液瓶泵入培养盒(内置工程化组织)，然后经硅胶管 流回培养液瓶；导轨滑块、注射器和直流电机构成脉动部分，直流电机与导轨滑块 连接推动注射器活塞往复运动，注射器与蠕动泵的出液端连接后和培养盒连接，由 此形成脉动流；压力表设置在培养盒上，检测置于培养盒内的组织内的培养液压力。

在进行体外培养以前，先拆卸脉动生物反应器的连接管、注射器，利用高温高 压灭菌。然后接通脉动生物反应器，蠕动泵和直流电机接通，先在培养液瓶中加入 少量75％的酒精，利用酒精在脉动循环系统中流动灭菌；倒掉酒精然后在培养液瓶中 加入一定量已灭菌的PBS溶液，利用该溶液冲洗残余酒精。

关掉电源，然后在培养液瓶中加入待培养需使用的培养液，用灭菌好的镊子夹 住步骤1-5制备的工程化肝组织接到培养盒的接头上。为使工程化组织牢固地接在接 头上，用已灭菌的细线固定工程化组织的两头。待脉动生物反应器系统完全连接好 后，接通电源，调整蠕动泵的电压为12V，调节人造组织处所受压力到0.1MPa，即可 可以持续运行脉动生物反应器对工程化组织进行脉动培养。

在培养过程中保持上述电压和组织的压力，使线性控制脉动培养过程中脉动频率在100次/分钟。

直流电机运行平稳后，带动滑块在导轨上推动注射器活塞往复运动，活塞拉出 时从培养液瓶中吸取培养液，挤出时把吸入的培养液注入蠕动泵形成的循环系统中 流经培养盒中的工程化组织流回培养液瓶。通过调节注射器每次吸入、挤出的培养 液的量可调节培养工程化组织处的压力。由此，蠕动泵和直流电机持续运动，脉动 生物反应器就提供了一个脉动循环的培养液流实现了对工程化组织的脉动培养。

7、细胞形态观察

形态观察：第0天(打印后24小时以内)、第1天、第10天、第20天分别用光学显 微镜(Olympus,CX40)每天观察细胞形态变化，并拍摄记录人工肝组织内细胞生长形 态和细胞额形成情况(图3)。从第5～6天开始观察到细胞形成团簇，且细胞团簇随着 时间逐渐变大；在第20天，人工肝组织内的肝细胞持续增殖，形成了致密的团簇， 且紧密而均匀地分布于结构内。图3为实施例1制备的具有极高细胞密度的仿生人工 肝组织的显微形貌。

8、细胞增殖检测分析

为了检测仿生人工肝组织的细胞增殖水平，使用增殖检测试剂盒(Cell countingkit-8，Dojindo)，按照试剂盒使用说明步骤操作。具体操作步骤：将样品用PBS冲洗1 次，加入800μl细胞培养液和80μl CCK-8溶液浸没结构体，37℃孵育2h。然后吸取110μl 孵育反应液到96孔板中，使用酶标仪(BIO-RAD，Model 680)在450nm处检测样品 OD值。每个样品3个重复，做空白对照。选择在培养的第1天、第10天和第20天进行 检测。结果如图4所示，最终得到的人工肝组织的细胞密度为1.2×10⁸个/mL。所得仿 生肝组织为高1mm的立体六边形网格结构，一共6层，每根微丝长2cm，杨氏模量为 1KPa。该人工肝组织包含直径大小约为500μm的微丝和内径大小约为800μm的中空通 道。

9、人工肝组织的表型和功能检测

采用免疫荧光染色检测肝细胞功能的关键蛋白表达(如CYP3A4和ALB)，采用 酶联免疫吸附试验(Elisa)检测构建三维组织的肝功能水平，采用qPCR技术检测成 熟肝细胞标志性基因的转录水平。

1)免疫荧光染色：用磷酸缓冲液(PBS)(BI,02-024-1AC)洗涤结构；4％多聚甲醛在室温下固定30分钟，用PBS洗涤3次，每次5分钟；含0.3％Triton-X(Sigma,X100) 和5％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Multicell,800-096-EG)的混合液封闭 1小时；吸出封闭缓冲液，加入稀释后的一抗(含0.3％Triton-X和1％BSA)，CYP3A4 (abcam，ab3572)和ALB(abcam，ab83465)，4℃过夜孵育。用PBS洗涤3次，每次5分 钟；加入对应二抗Alexa

594(abcam，ab150080)和Alexa

488(abcam， ab150113)，室温避光孵育2小时后，用PBS洗涤3次，每次5分钟；接着加入DAPI染 细胞核，室温避光孵育5分钟。

2)采用白蛋白分泌检测试剂盒(Bethyl，E80-129、E101、E115)和尿素分泌检 测试剂盒(BIO ASSAY SYSTEMS，DIUR-500)按照试剂盒说明书检测所得肝组织 的白蛋白分泌和尿素分泌功能。结果显示，与常规平面培养(所用培养基成分相同) 的同种细胞相比，本发明制备的人工肝组织的白蛋白分泌水平是平面培养细胞的29 倍，尿素分泌水平是平面培养细胞的2.3倍，数据均有显著性差异。

注：平面培养方式一般在常规培养皿中，如6孔板中进行。

3)qPCR检测技术：提取细胞RNA操作步骤：用PBS洗涤结构1次，每个结构加 入1mlTrizol(Gibco,15596026)，反复吹打混匀，在室温静置10分钟，然后转移至1.5ml 的EP管中，加入200ul氯仿，快速摇30秒，室温放置5分钟后，在4℃以12000g条件离 心10分钟。去除上清液，加入等体积异丙醇，在4℃以12000g条件离心10分钟。弃去 上清，用75％无水乙醇洗涤沉淀，风干后可获得RNA，使用DEPC水溶解。用 spectrophotometer(ThermoScientific)来检测RNA浓度及纯度。

RNA反转录操作步骤：采用PrimeScript^TMII 1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，6210)，完全按照试剂盒说明书来进行操作。RNA含量均调整为5ng。引物 为：OligodT Primer。反转录PCR程序为：42℃50min，95℃，5min，4℃保温，所用 PCR仪(ABI，SimpliAmpTM热循环仪)。

荧光定量PCR操作步骤：使用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(ThermoScientific,K0251)试剂盒，完全按照试剂盒说明书进行操作。按要求加入反应液后， 将反应板置于qPCR仪进行检测，反应程序为：95℃，10min，95℃15s，60℃30s， 40个循环，72℃30s，72℃10min。

qPCR所用引物序列如下(5′-3′)：

GAPDH引物序列：

Forward：TGCACCACCAACTGCTTAGC

Reverse：GGCATGGACTGTGGTCATGAG

ALB引物序列：

Forward：GCACAGAATCCTTGGTGAACAG

Reverse：ATGGAAGGTGAATGTTTCAGCA

CYP3A4引物序列：

Forward：TAACAGTCTTTCCATTCCTC

Reverse：GGACTCAGTTTCTTTTGAAT

MRP2引物序列：

Forward：TGAGCAAGTTTGAAACGCACAT

Reverse：AGCTCTTCTCCTGCCGTCTCT

ALB和CYP3A4是成熟肝细胞分泌功能和药物代谢功能的标志性蛋白，MRP2是 肝细胞形成组织性排列后出现极性和胆小管结构的标志性蛋白。检测结果显示，本 发明提供的人工肝组织各种基因的表达水平均高于平面培养的同种细胞，其中， CYP3A4的基因转录水平是同等条件(采用相同的培养基，仅细胞培养方式不同，细 胞培养在平面条件下，如6孔板中进行)下二维培养细胞的3.5倍，三维打印结构体中 ALB基因转录水平是同等条件下二维培养细胞的12.7倍，三维打印结构体中MRP2基 因转录水平是同等条件下二维培养细胞的2.1倍，数据均有显著性差异。

实施例2利用铸模法制备极高细胞密度的人工肝组织

本实施例提供一种利用铸模法制备多种结构的具有极高细胞密度的仿生人工肝组织，包括如下步骤：

1、肝脏干细胞培养

HepaRG是一种由人体肝癌组织获得的肝脏干细胞，具有向肝脏细胞和胆管上皮细胞双向分化的能力。将HepaRG细胞(Sigma，HPRGC1)在细胞扩增培养液中进行 培养，细胞扩增培养液的成分为Williams'Medium E培养液(Sigma,W4125)中添加10％FBS血清(Gibco,16000)，0.05％胰岛素(Sigma,I9278)，5×10^-7M氢化可的松琥珀 酸酯(Sigma,H4881)，1％青链霉素(Gibco,15140122)和1％GlutaMAX^TMSupplement (Gibco,35050061)。当细胞90％汇合时，按照1:5的比例传代，每2-3天更换一次培养 液。

2、铸模前体溶液的制备

配制16％的海藻酸钠溶液和30％的明胶溶液。

对增殖期间的HepaRG细胞，先加入PBS润洗表面，然后加入胰酶(Gibco，25200072)覆盖细胞表面，37℃条件下消化3min后收集，离心得到单细胞悬液。对 细胞进行计数后按比例稀释，然后与提前加热的海藻酸钠/明胶混合溶液混合均匀， 最终获得的打印溶液(前体溶液)中细胞浓度为1×10⁵个细胞/mL，4％海藻酸钠溶液 和15％明胶溶液。

3、铸模法构建含有肝细胞的三维结构体

将步骤2得到的前体溶液倒入预先设计好的模具中。本实施例中所用的模具示意图如图1所示，形成体积为外圆柱直径为3cm，中央圆柱直径1cm，圆柱壁厚300um的 中空圆柱体样三维结构体。将模具至于20℃下进行交联15min，交联后将成型的结构 取出，浸入5％(w/v)的戊二醛溶液中进行交联，随后浸入500mM的氯化钙溶液进 行交联。然后采用分化培养基培养15天，得到仿生人工肝组织(三维结构体)。分化 培养基成分为：肝细胞培养基(HCM；Lonza)，30ng/ml成纤维细胞生长因子4(FGF4, R&D SYSTEMS，233-FB-025)，20ng/ml肝细胞生长因子(HGF,R&D systems, 294-HGN-005)，0.05％肾上腺素(Sigma,E4642)，0.2％二甲基亚砜(Sigma,D2650)，1 mM抗坏血酸(Sigma,1043003)，0.2mM N-乙酰半胱氨酸酰胺(Sigma,A0737)和 1×10^-7M地塞米松(D4902)。

本发明的细胞培养液在已有研究的基础上进行了改良，增加了促进肝细胞分化和维持肝细胞功能的因子：成纤维细胞生长因子，肝细胞生长因子和肾上腺素等物 质。

加入分化培养液后，将三维结构体于37℃5％CO₂条件下进行培养，每2～3天更换新鲜培养基。期间可用光学显微镜观察细胞形态变化。

4、人工仿生肝组织观察与细胞活死检测

1)第0天、第1天、第7天、第14天、第20天分别用光学显微镜(Olympus,CX40) 每天观察细胞形态变化，并拍摄记录三维结构体内细胞生长形态和细胞团簇形成情 况。从第7天开始观察到明显的细胞团簇，且细胞团簇随着时间逐渐变大；在第20天， 在结构内看到肝细胞增殖后，形成了致密的团簇，且均匀分布于人工肝组织内部。

2)第1天、第7天、第14天、第20天分别对三维结构体内细胞进行活死染色检测。 本发明使用2uM Calcein-AM(Dojindo，C326)和4.5uM PI(Dojindo，P346)的混合 溶液分别对活(绿色)/死(红色)细胞进行染色，染色避光进行，持续15分钟。使 用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)观察记录。对活死染色的照片进行 数据统计，各时间点人工组织内细胞存活率约在90％以上。

5、仿生肝组织细胞的增殖检测分析

为了检测三维结构体内的细胞增殖水平，使用增殖检测试剂盒(Cell countingkit-8，Dojindo)，按照试剂盒使用说明步骤操作。具体操作步骤：在培养的第20天， 将样品用PBS冲洗1次，加入800μl细胞培养液和80μl CCK-8溶液浸没结构体，37℃孵 育2h。然后吸取110μl孵育反应液到96孔板中，使用酶标仪(BIO-RAD，Model 680) 在450nm处检测样品OD值。每个样品3个重复，做空白对照。结果显示，实施例2制 备的类肝组织的细胞密度与常规平面培养的细胞相比，三维仿生肝组织的细胞增殖 水平是平面培养同种细胞的19.44倍，最终得到的三维仿生肝组织的细胞数可达每毫 升8.1×10⁷个细胞。所得仿生肝组织为圆柱壁厚300um的中空圆柱体样三维结构体，外 圆柱直径为3cm，中央圆柱直径1cm，杨氏模量为1KPa。

6、仿生人工肝组织的功能检测

为了检测三维结构体中肝细胞的功能，采用免疫荧光染色检测了标记肝细胞功能的关键蛋白表达(如CYP3A4和ALB)，如图5所示，采用酶联免疫吸附试验(Elisa) 检测构建三维组织的肝功能水平，采用qPCR技术检测成熟肝细胞标志性基因的转录 水平(图6)。

1)免疫荧光染色：用磷酸缓冲液(PBS)(BI,02-024-1AC)洗涤结构；4％多聚甲醛在室温下固定30分钟，用PBS洗涤3次，每次5分钟；含0.3％Triton-X(Sigma,X100) 和5％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Multicell,800-096-EG)的混合液封闭 1小时；吸出封闭缓冲液，加入稀释后的一抗(含0.3％Triton-X和1％BSA)，CYP3A4 (abcam，ab3572)和ALB(abcam，ab83465)，4℃过夜孵育。用PBS洗涤3次，每次5分 钟；加入对应二抗Alexa

594(abcam，ab150080)和Alexa

488(abcam， ab150113)，室温避光孵育2小时后，用PBS洗涤3次，每次5分钟；接着加入DAPI染 细胞核，室温避光孵育5分钟。其中，CYP3A4是成熟肝细胞药物代谢功能的标志性 蛋白；ALB是成熟肝细胞分泌功能的标志性蛋白。用激光共聚焦显微镜(LSCM， Nikon，Z2)观察记录。CYP3A4蛋白与DAPI染色结果以及ALB蛋白与DAPI染色结 果见图5。由图可知，在人工肝组织中，CYP3A4和ALB蛋白均高表达。

2)采用白蛋白分泌检测试剂盒(Bethyl，E80-129、E101、E115)和尿素分泌检 测试剂盒(BIO ASSAY SYSTEMS，DIUR-500)按照试剂盒说明书检测所得肝组织 的白蛋白分泌和尿素分泌功能，结果如图6(A)所示，结果显示实施例2制备的具有 类组织密度的肝组织三维结构体与常规平面培养(所用培养基成分相同)的细胞相 比，三维仿生肝组织的白蛋白分泌水平是平面培养细胞的36倍，尿素分泌水平是平 面培养细胞的1.9倍。

3)qPCR检测技术

提取细胞RNA操作步骤：用PBS洗涤三维结构体1次，每个结构体加入1ml Trizol(Gibco,15596026)，反复吹打混匀，在室温静置10分钟，然后转移至1.5ml的EP 管中，加入200ul氯仿，快速摇30秒，室温放置5分钟后，在4℃以12000g条件离心10 分钟。去除上清液，加入等体积异丙醇，在4℃以12000g条件离心10分钟。弃去上清， 用75％无水乙醇洗涤沉淀，风干后可获得RNA，使用DEPC水溶解。用spectrophotometer (Thermo Scientific)来检测RNA浓度及纯度。

RNA反转录操作步骤：采用PrimeScript^TMII 1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，6210)，完全按照试剂盒说明书来进行操作。RNA含量均调整为5ng。引物 为OligodT Primer。反转录PCR程序为：42℃50min，95℃，5min，4℃保温，所用 PCR仪(ABI，SimpliAmpTM热循环仪)。

荧光定量PCR操作步骤：使用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(ThermoScientific,K0251)试剂盒，完全按照试剂盒说明书进行操作。按要求加入反应液后， 将反应板置于qPCR仪进行检测，反应程序为：95℃，10min，95℃15s，60℃30s， 40个循环，72℃30s，72℃10min。获得基因在不同时间点的表达。

qPCR所用引物序列如下(5′-3′)：

GAPDH引物序列：

Forward：TGCACCACCAACTGCTTAGC

Reverse：GGCATGGACTGTGGTCATGAG

ALB引物序列：

Forward：GCACAGAATCCTTGGTGAACAG

Reverse：ATGGAAGGTGAATGTTTCAGCA

CYP3A4引物序列：

Forward：TAACAGTCTTTCCATTCCTC

Reverse：GGACTCAGTTTCTTTTGAAT

MRP2引物序列：

Forward：TGAGCAAGTTTGAAACGCACAT

Reverse：AGCTCTTCTCCTGCCGTCTCT

ALB和CYP3A4是成熟肝细胞分泌功能和药物代谢功能的标志性蛋白，MRP2是 肝细胞形成组织性排列后出现极性和胆小管结构的标志性蛋白。检测结果如图6(B) 所示，人工肝组织各种基因的表达水平均高于平面培养的同种细胞基因表达水平， 其中，CYP3A4的基因转录水平是同等条件下二维培养(所用培养基成分相同)细胞 的2.9倍，三维打印结构体中ALB基因转录水平是同等条件下二维培养细胞的19.2倍， 三维打印结构体中MRP2基因转录水平是同等条件下二维培养细胞的1.56倍，数据均 有显著性差异。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但 在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易 见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明 要求保护的范围。

Claims (10)

1.仿生人工肝组织，其特征在于，所述仿生人工肝组织的尺寸大小为0.1～50cm，其宏观结构为柱状、块状、片状、囊状、管状、网格状、编织状或任意形状组合；

所述仿生人工肝组织包含直径大小为50～2000μm的微丝和内径大小为0.01～300mm的中空通道；其中，所述微丝是由生物相容性材料和细胞通过铸模法或3D打印工艺形成的，呈丝状或圆柱状结构；所述中空通道是由相邻的数根微丝围绕形成的；

所述仿生人工肝组织中至少包含肝细胞，肝细胞呈现致密排列特征；

所述仿生人工肝组织具有接近人体天然肝组织的极高的细胞密度，细胞密度达到甚至超过10⁷～10⁸个/mL量级；

所述仿生人工肝组织的杨氏模量为0.1-150KPa。

2.根据权利要求1所述的仿生人工肝组织，其特征在于，所述细胞来源于胚胎干细胞、诱导多能干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、肝母细胞、间充质干细胞或成体干细胞，以及这些细胞分化得到的肝细胞；人体各种组织来源的肝细胞及其细胞系；以及上述所有细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞；优选肝脏干细胞及其细胞系、诱导多能干细胞分化得到的肝脏细胞。

3.根据权利要求2所述的仿生人工肝组织，其特征在于，所述细胞还包括胆管上皮细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、枯否细胞中的一种或多种，包括上述细胞及其细胞系，以及上述细胞经过基因编辑、病毒包装或改造获得的相关细胞；细胞来源于诱导多能干细胞、胚胎干细胞、肝脏干细胞、肝脏祖细胞、内胚层细胞、肝脏内胚层细胞、间充质干细胞或成体干细胞，由多种细胞分化得到，或人体各种组织获得；优选成纤维细胞和/或内皮细胞。

4.根据权利要求1所述的仿生人工肝组织，其特征在于，所述生物相容性材料选自天然水凝胶材料和/或人工合成的水凝胶材料；

其中，所述天然水凝胶材料选自壳聚糖、壳聚糖衍生物、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、透明质酸、透明质酸衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白、糖蛋白衍生材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶中的至少一种；优选壳聚糖、壳聚糖衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维蛋白、明胶和/或明胶衍生物；

所述人工合成的水凝胶材料选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚谷氨酸-聚乙二醇、聚己内酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚乙醇酸、聚乙二醇-聚二氧六环酮、聚乙二醇、聚四氟乙烯、聚氧化乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚对二氧环己酮、聚醚醚酮，以及它们的衍生物或聚合物中的至少一种；优选聚乙醇酸或聚乳酸。

5.根据权利要求1-4任一项所述的仿生人工肝组织，其特征在于，所述仿生人工肝组织具有高度仿生的生理功能，阳性表达成熟肝组织的标志性基因和蛋白，具有白蛋白分泌、氮代谢、尿素合成、解毒和药物代谢的肝组织生理功能。

6.仿生人工肝组织的制备方法，其特征在于，包括：

(1)将生物相容性材料与细胞均匀混合得到含有细胞的前体溶液；

(2)将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体；

(3)对三维水凝胶结构体进行后处理；

(4)三维水凝胶结构体的体外培养和/或细胞诱导分化获得仿生人工肝组织；

其中，所述细胞至少包含肝细胞，所述细胞同权利要求2或3中所述，所述生物相容性材料同权利要求4中所述。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)采用如下方法将所述前体溶液按照预先设计的结构制备成三维水凝胶结构体：铸模法、消失模法、生物3D打印法、喷墨打印法、熔融沉积成型法、静电纺丝法、静电驱动打印法、立体光刻法或激光烧结法；

所述方法是通过控制温度使三维结构成型，温度控制范围在0℃～37℃，优选4℃～36℃；和/或

所述方法是通过光处理使三维结构成型，优选白光或紫外光。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述后处理方法包括稳定化处理和/或牺牲材料处理；

其中，对三维水凝胶结构体进行稳定化处理所用的交联试剂选自二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、凝血酶及其衍生物中的至少一种；优选二价阳离子和/或凝血酶；所述交联试剂的浓度为0.1mM～10M，优选10mM～500mM；

对三维水凝胶结构体进行牺牲材料处理，包括去除多余材料，所述多余材料包括三维水凝胶结构体中的温敏材料、交联试剂。

9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)对三维水凝胶结构体进行体外培养，包括静置培养和/或动态培养；

优选地，静置培养在培养皿、多孔板中进行；动态培养在生物反应器、脉动培养装置、微重力培养装置、搅拌培养装置、波浪式培养装置、芯片或灌注培养系统中进行；和/或

体外培养所用细胞培养液是在基础培养液的基础上添加了诱导肝细胞分化和维持肝细胞功能的因子；其中，所述诱导肝细胞分化和维持肝细胞功能的因子选自骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、二甲基亚砜、抑癌蛋白M中的至少一种；

优选地，所述细胞培养液包含50-120ng/ml激活素A，10-50ng/ml骨形态发生蛋白2，10-50ng/ml骨形态发生蛋白4，10-50ng/ml成纤维细胞生长因子4，0.1％-2％v/v二甲基亚砜，10-50ng/ml肝细胞生长因子，1×10^-5-1×10^-4M抑癌蛋白M，1mM抗坏血酸，0.2mM N-乙酰半胱氨酸酰胺和1×10^-7M地塞米松；和/或

体外培养条件为：35℃～38℃，5％CO₂。

10.权利要求1-5任一项所述的仿生人工肝组织或按照权利要求6-9任一项所述方法制备的仿生人工肝组织的以下任一应用：

1)药物临床前检测；

2)用作再生医学和体内移植的材料；

3)用作生物人工肝和肝功能代偿的研究；

4)肝脏疾病病理学研究；

5)新药研发。

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