CN112522183A - 干细胞体外扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种干细胞体外扩增方法，所述方法包括：A、将2D环境下培养的干细胞团块消化成单细胞，与水凝胶溶液混合，得到单细胞‑水凝胶悬液；B、采用生物打印技术将所述单细胞‑水凝胶悬液打印成含有干细胞的微结构体；C、采用干细胞培养液培养所述微结构体，使干细胞在微结构体提供的三维环境中稳定扩增。本发明提供的干细胞扩增方法，工艺简单、温和，不仅能够为干细胞增殖提供稳定的3D微环境，还增加了细胞扩增空间，减少外界刺激对干细胞的不良影响，在保证细胞大量扩增的同时，维持多能干细胞全能性/其他干细胞干性。本发明为干细胞在组织工程、再生医学或药物研究等方面，提供大量种子细胞。

Description

干细胞体外扩增方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种干细胞体外扩增方法。

背景技术

干细胞是一类具有增殖和分化潜能的细胞，能够分化成各种组织器官的特异性细胞类型。按照分化潜能的大小，干细胞可以分为全能干细胞(Totipotent Stem Cell)、多能干细胞(Pluripotent Stem Cell)、专能干细胞(Multipotent Stem Cell)和单能干细胞(Unipotent Stem Cell)。其中，多能干细胞(Pluripotent Stem Cell)可以分化成为来源于三胚层的所有细胞，形成所有组织和器官，用于多种组织器官修复、疾病治疗和药物筛查，因而成为干细胞研究的热点。

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)和诱导多能干细胞(InducedPluripotent Stem Cell，iPSC)是目前研究较多的多能干细胞。然而，由于生命伦理道德问题和免疫排斥问题，ESC的研究颇受争议。iPSC则避免了ESC的伦理道德问题，iPSC可通过对体细胞进行基因重编程获得，来源广泛，并且解决了干细胞移植的免疫排斥问题，成为干细胞研究领域的一项重大突破。

尽管iPSC来源广泛，但是它对各种外界因素的扰动较为敏感，包括力学刺激、温度变化、光照等，这些因素的改变很可能导致iPSC的凋亡、分化，降低细胞存活率和全能性。因此，合适、稳定的微环境对iPSC的培养和应用至关重要。

目前iPSC(同ESC的培养)多采用2D方法在包被Matrigel(基质胶)或Vitronectin(玻连蛋白)的多孔板上进行贴壁培养，随着时间增加，孔板底面出现大而致密的克隆，当细胞克隆过大或者细胞汇合度达到85％时即需要进行传代。采用2D培养方法无法模拟干细胞在体内的活动，由于空间限制需要多次传代，增加对细胞的不利因素，影响细胞状态，导致细胞的大量分化或凋亡。为了更好地模拟体内稳定的3D微环境进行干细胞扩增，减少对细胞不利操作的次数，维持干细胞分化能力，亟待开发新的干细胞扩增方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种干细胞体外扩增方法，其是一种基于3D打印的干细胞扩增方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种干细胞体外扩增方法，包括以下步骤：

A、将2D环境下培养的干细胞团块消化成单细胞，与水凝胶溶液混合，得到单细胞-水凝胶悬液；

B、采用生物打印技术将所述单细胞-水凝胶悬液打印成含有干细胞的微结构体；

C、采用干细胞培养液培养所述微结构体，使干细胞在微结构体提供的三维环境中稳定扩增。

步骤A包括以下子步骤：

A1、干细胞的2D培养：将干细胞在包被有基质胶和/或玻连蛋白微孔板中进行贴壁培养，当细胞达到80％-90％汇合度时按照1:5-20的比例传代3-8次(若汇合度未达到80％，干细胞克隆团较大也需要传代，传代比例根据实际细胞数量确定)，每18-24小时更换一次培养基，培养4-7天，用于后续消化；

A2、单细胞-水凝胶悬液的制备：消化前，向A1所得培养物中加入Rock抑制剂，然后加入细胞消化液将干细胞团块消化成单细胞，离心收集单细胞沉淀，用培养基重悬细胞，然后与水凝胶溶液混合，并加入适量基质胶和/或玻连蛋白，混匀，得到单细胞-水凝胶悬液。

步骤B包括：将所述单细胞-水凝胶悬液装载到生物打印设备，打印至装有交联剂的容器中，得到结构稳定含有干细胞的微结构体。

步骤C包括：将所述微结构体转移至离心管中，微结构体沉降至离心管底部，将上层清液吸走，用培养基清洗后，将将所述微结构体接入微孔板中培养，并向培养基中加入Rock抑制剂，培养18-24小时后去除Rock抑制剂，每天更换一次培养基，使干细胞在微结构体提供的三维环境中稳定扩增。

所述干细胞为多能干细胞或专能干细胞，优选诱导多能干细胞(iPSC)。

本发明还适用于除了多能干细胞以外的其他干细胞，例如，来自哺乳动物和灵长类动物的胚胎干细胞(ESC)。

所述专能干细胞如造血干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、成骨干细胞、软骨干细胞、肌肉干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、内皮干细胞、角膜干细胞、毛囊干细胞、胃肠干细胞、乳腺干细胞、心脏干细胞等。

本发明中，水凝胶选用天然和/或人工合成的具有生物兼容性的水凝胶材料。

天然水凝胶材料选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、氨基酸、氨基酸衍生物、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白及衍生材料、透明质酸、透明质酸衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白衍生物、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶等中的至少一种，优选海藻酸钠、明胶、基质胶或胶原。

人工合成的水凝胶材料选自聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯等中的至少一种，优选聚乳酸或乳酸-羟基乙酸共聚物。

本发明所述生物打印技术采用喷墨生物打印技术，所述喷墨生物打印技术是基于热气泡法、压电式、阀基式或高压静电法的3D打印技术。

本发明使用的细胞消化液包含蛋白水解酶和胶原酶。例如，可以使用商品化试剂ReLeSR^TM(Stemcell Technologies,05872)，

细胞消化液(LifeTechnologies，A11105-01)等。

优选地，所述交联剂为可溶性钙盐溶液，如CaCl₂溶液。

优选地，所述Rock抑制剂为Y-27632。

前述的方法，细胞培养条件为：35℃～38℃(优选37℃)，5％CO₂。

第二方面，本发明提供iPSC体外扩增方法，包括以下步骤：

1)iPSC的2D培养

将iPSC在包被有基质胶和/或玻连蛋白微孔板中进行贴壁培养，当细胞达到85％汇合度时按照1:10的比例进行传代3次(若汇合度未达到85％，iPSC克隆团较大也需要传代，传代比例根据实际细胞数量确定)，每18-24小时更换一次完全培养基，培养时间6天，可用于后续消化；

2)单细胞-水凝胶悬液的制备

iPSC消化成单细胞前，加入Rock抑制剂(Y-27632)至完全培养基孵育0.5-2小时，培养基中Rock抑制剂的终浓度为5-20uM，然后加入细胞消化液将iPSC细胞团块消化成单细胞，离心收集单细胞沉淀，用基础培养基重悬细胞，然后与水凝胶溶液混合，并加入适量基质胶和/或玻连蛋白，混匀，得到单细胞-水凝胶悬液；

3)采用喷墨生物打印技术获得含有iPSC的微结构体

将单细胞-水凝胶悬液装载到喷墨生物打印设备，打印至装有100-400mMCaCl₂溶液(优选100mM CaCl₂溶液)的容器中，得到结构稳定含有iPSC的微结构体；

4)含有iPSC的微结构体的收集

将含有iPSC的微结构体收集至离心管(注意：将皿底的微结构全部冲洗下来移入离心管)中，微结构体沉降至离心管底部，将上层清液吸走，用基础培养基清洗后，加入完全培养基，将含有iPSC的微结构体接入微孔板，铺满皿底1/3～1/2；值得注意的是，为保证细胞存活率，从细胞消化成单细胞开始到接种细胞至多孔板的时间不要超过半小时；

5)iPSC在微结构体中扩增培养

微孔板中接入微结构体后，向培养基中加入Rock抑制剂(Y-27632)，培养基中Rock抑制剂的终浓度为5-20uM，培养18-24小时后去除Rock抑制剂，每天更换一次完全培养基，使iPSC在微结构体提供的三维环境中稳定扩增。

优选地，所用完全培养基和基础培养基均购自Stemcell Technologies公司(加拿大)，其中完全培养基套盒中包含基础培养基和添加物，在配制完全培养基时基础培养基和添加物按照4:1的重量比混合均匀即可。例如，hPSC完全培养基mTeSR^TM(StemcellTechnologies,85850)。

所述水凝胶溶液为1％-10％海藻酸钠溶液或1％-10％海藻酸钠与10％-20％明胶混合溶液；其中用于配制海藻酸钠溶液、海藻酸钠与明胶混合溶液的试剂均为0.5％-1.5％氯化钠溶液。更优选地，所述水凝胶溶液为4％海藻酸钠溶液或6％海藻酸钠与20％明胶混合溶液；其中用于配制海藻酸钠溶液、海藻酸钠与明胶混合溶液的试剂均为0.9％氯化钠溶液。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)微结构体制备过程温和，且外界刺激对结构体中的细胞影响减少。喷墨生物打印制备微结构的过程比较温和，对细胞的伤害较小。同时，细胞包裹在微结构体中，外界环境变化(包括力学刺激、温度变化等)对细胞的影响减小。

(二)微结构体提供了长期培养的3D稳定微环境。常见的2D培养方法虽简单易行，却不能模拟干细胞生长的3D环境，由于细胞生长空间有限需要多次传代，增加对iPSC/ESC的刺激，影响细胞全能性。本方法获得的细胞微结构不仅为iPSC/ESC提供温和稳定的微环境，生物材料中加入基质胶和/或玻连蛋白后为细胞提供了附着点，细胞可以在微结构内进行粘附、迁移；水凝胶材料的多孔性，保证了细胞和培养环境正常的物质交换，还增加了细胞扩增的空间，减少传代次数和外界刺激，因此有利于维持iPSC/ESC的全能性(或者其他干细胞的干性)。

(三)含有干细胞的微结构体可用于静态或动态培养。微结构的生物材料载体作为稳定的物理结构，可以保护内部的细胞或者细胞团簇免受外界剪切力的影响，可以结合旋转烧瓶培养、微重力三维细胞培养系统、旋转细胞培养系统等动态培养条件扩增细胞，有利于均匀、充足的养分和气体交换。

(四)有利于形成更加均匀、仿生的3D细胞团簇。将孔板中干细胞团簇消化成单细胞后，用微结构进行培养，可以实现细胞大量扩增，并且维持了细胞的全能性。同时微结构促使细胞聚集成3D团簇，更加仿生。由于扩增起点都是单细胞，因此形成的3D团簇大小均匀，为后期干细胞分化提供了均一的起点。

附图说明

图1为本发明实施例1中打印后不同天数的微结构体内hiPSC形态和活死染色情况；其中，A：打印后不同天数的微结构体内hiPSC形态；B：打印后不同天数的hiPSC活死染色。

图2为本发明实施例1中微结构体中hiPSC随时间的增殖曲线。

图3A为本发明实施例1中微结构体打印后第7天，OCT-4，SSEA4和核的免疫荧光染色情况。

图3B为本发明实施例1中微结构体qPCR检测不同时间点的Nanog、OCT-4基因表达情况。

图4为本发明实施例2中微结构体中hESC随时间变化的增殖曲线。

图5为本发明实施例2中微结构体qPCR检测不同时间点的Nanog、OCT-4基因表达情况。

具体实施方式

本发明基于3D打印技术实现干细胞扩增的具体方法如下：

1、iPSC/ESC的2D培养

iPSC/ESC在包被Matrigel或Vitronectin的6孔板中进行贴壁培养，当细胞达到85％汇合时按照1:10的比例传代(若汇合度未达到85％，iPSC/ESC克隆团较大也需要传代，传代比例根据实际细胞数量确定)，每18-24小时更换一次hPSC完全培养基。

hPSC完全培养基(Stemcell Technologies,85850)由基础培养基(Basal Medium)和添加物(Supplement)两部分混合而成。所用完全培养基和基础培养基均购自StemcellTechnologies公司。2、单细胞-水凝胶悬液的制备

iPSC/ESC消化成单细胞前，加入终浓度为10uM的Rock抑制剂(Y-27632)至hPSC完全培养基孵育1小时，然后加入1ml/孔单细胞消化液(如ReLeSR^TM，

细胞消化液)消化iPSC/ESC细胞克隆，离心收集iPSC/ESC单细胞沉淀。用基础培养基重悬细胞，然后与4％海藻酸钠溶液(或6％海藻酸钠与20％明胶混合溶液)混合，接着加入Matrigel或Vitronectin，最终获得的细胞浓度为1×10⁶个细胞/mL。其中，4％海藻酸钠溶液(或6％海藻酸钠与20％明胶混合溶液)、基础培养基与Matrigel(或Vitronectin)的体积比为18:6:1。

其中，所述海藻酸钠溶液是由海藻酸钠粉末与0.9％氯化钠溶液按质量比4:100混合而成，明胶溶液是由明胶粉末与0.9％氯化钠溶液按质量比20:100混合而成。

3、采用喷墨生物打印方法获得含有干细胞的微结构体

将单细胞-材料悬液装载到喷墨生物打印设备，微球从打印针头出来后，由针头下方的玻璃皿接收，皿中加入了100mM CaCl₂溶液。CaCl₂溶液与海藻酸钠溶液发生交联，从而获得结构稳定的干细胞微结构体。

其中，CaCl₂溶液由无水氯化钙颗粒溶于灭菌蒸馏水获得。

4、干细胞微结构体的收集

打印完成后，迅速将皿中的微结构收集至15ml或50ml离心管(注意：将皿底的微结构全部冲洗下来移入离心管)，微结构快速沉降至离心管底部，将上层清液吸走，加入基础培养基冲洗2次，最后加入hPSC完全培养基，将细胞微结构种入多孔板(6孔板、12孔板或24孔板)，铺满皿底1/3～1/2左右。

值得注意的是，为保证细胞存活率，从细胞消化成单细胞开始到接种细胞至多孔板的时间不要超过半小时。

5、细胞在微结构中的扩增培养

接种完微结构后加入终浓度为10uM的Rock抑制剂(Y-27632)至hPSC完全培养基，一天后去除Rock抑制剂，每天换液。随着细胞扩增，hPSC完全培养基的体积从2ml/孔到3ml/孔逐渐增加，培养13天后，获得iPSC/ESC团簇。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1采用高压静电打印技术制备hiPSC微结构体

1、生物材料溶液(水凝胶溶液)的制备

4％海藻酸钠溶液：将海藻酸钠粉末(Sigma，A0682)与0.9％氯化钠溶液按照4:100的质量比混合，用磁力搅拌器搅拌约5分钟，在80℃条件下加热3小时，取出室温搅拌1小时，再重复此加热搅拌两次，第三次80℃加热后，取出搅拌约20小时使其均匀溶解，使用0.45μm一次性滤膜过滤材料，分装后置于4℃保存。

玻连蛋白(Vitronectin，VTN)：将VTN(Stemcell Technologies,07180)，在室温(15℃-25℃)解融，未使用完的VTN置于4℃，可存放2周。切勿反复冻融。

2、hiPSC在6孔板上培养

6孔板提前用VTN进行包被，VTN用CellAdhere^TM稀释缓冲液(StemcellTechnologies,07183)稀释到终浓度10ug/mL(例如，40uL的VTN加入到1ml的CellAdhere^TM稀释缓冲液中)。使用稀释好的VTN溶液包被6孔板，1.5ml/孔。轻柔地摇晃培养皿，让VTN溶液均匀的覆盖培养皿表面。(注意：如果培养皿的表面没有完全覆盖，不可用于人ESC或iPSC培养)。使用前在室温(15℃-25℃)孵育至少1个小时，且尽量避免VTN挥发。(注意：若不是立即使用，培养皿必须密封防止VTN溶液的蒸发，比如使用

封口膜密封，在4℃可以存放一周。使用前，经冷藏的包被培养皿需要在室温下放置30分钟以恢复到室温)。吸出孔中的VTN溶液(注意不要刮花包被的表面)，加入2ml/孔CellAdhere^TM稀释液清洗一次培养皿，便可用于iPSC培养。

hiPSC的培养使用hPSC完全培养基mTeSR^TM(Stemcell Technologies,85850)，当细胞汇合度达到85％时，按照1:10的比例进行传代3次，每18-24小时更换一次hPSC完全培养基。培养6天，可用于后续消化。

3、hiPSC消化成单细胞制备单细胞-水凝胶悬液

iPSC消化成单细胞前，向培养基中加入终浓度为10uM的Rock抑制剂(Y-27632)(Selleckchem，S1049)至hPSC完全培养基孵育1小时，然后在37℃用ReLeSR^TM(StemcellTechnologies,05872)，按1ml/孔加入，孵育1分钟，接着用

细胞消化液(Life Technologies，A11105-01)，按2ml/孔加入，孵育6分钟，将iPSC消化成单细胞；然后，1000rpm离心2分钟获得iPSC单细胞沉淀，用基础培养基重悬细胞，然后与4％海藻酸钠溶液混合，加入VTN，最终获得的细胞密度为1×10⁶个细胞/mL。其中，4％海藻酸钠溶液、基础培养基与VTN的体积比为18:6:1。

4、hiPSC单细胞微结构体的打印与培养

将单细胞-水凝胶悬液装入10ml一次性无菌注射器中，使用高压静电法打印细胞微结构(具体参见Yao R,Zhang R,Luan J,et al.Alginate and alginate/gelatinmicrospheres for human adipose-derived stem cell encapsulation anddifferentiation[J].Biofabrication,2012,4(2):025007)，在室温下，直流高压电源电压设置为8KV，注射泵推进速度10ml/h，电极间距离(打印针头到接收装置铜片距离)为2cm，接收皿中加入100mM CaCl₂溶液，微结构落入接收皿交联后，迅速将皿中的微结构收集至50ml离心管，微结构快速沉降至离心管底部，吸走上层清液，用基础培养基冲洗2次后加入hPSC完全培养基，将细胞微结构种入6孔板，铺满皿底1/2左右。在接种完微结构后加入终浓度为10uM的Rock抑制剂(Y-27632)至完全培养基，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。一天后去除Rock抑制剂，每天换液。

5、打印后不同天数的微结构体内hiPSC形态记录与活死细胞染色检测

1)第0天(打印后24小时以内)、第1天、第4天、第7天、第10天和第13天分别在光镜下拍摄记录微结构体内hiPSC形态(图1，A)。从第4天开始观察到明显的细胞团簇，且细胞团簇随着时间逐渐变大；同时，到第13天观察到海藻酸钠微球几乎全部破碎。

2)第0天(打印后24小时以内)、第1天、第4天、第7天、第10天和第13天分别对iPSC细胞进行活死染色检测(图1，B)。本发明使用2uM Calcein-AM(Dojindo，C326)和4.5uM PI(Dojindo，P346)的混合溶液分别对活(绿色)/死(红色)细胞进行染色，染色避光进行，持续15分钟。使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)观察记录。培养到第13天，微结构体中的细胞存活率约94％左右。

6、hiPSC在微结构体中的增殖检测

本发明分别对第1天、第4天、第7天、第10天和第13天的细胞微结构进行计数，得到了hiPSC随时间的增殖曲线。

1)首先收集对应天数的微结构体，溶于55mM柠檬酸钠、20mM EDTA和150mM氯化钠溶液的混合溶剂中，在37℃孵育15分钟，600rpm离心2分钟，获得iPSC团簇。

2)依次用1ml/孔ReLeSR^TM和2ml/孔

细胞消化液在37℃孵育1分钟和6分钟将细胞团簇消化成单细胞，1000rpm离心3分钟，去上清液，用1ml mTeSR^TM重悬细胞，取20ul至细胞计数板在镜下观察计数，所取天数计数结果分别与第一天相除，绘制细胞增殖曲线(图2)。第6天后，随着天数增加，细胞显著扩增。

7、微结构体中hiPSC的全能性检测

为了检测微结构体中iPSC细胞的全能性，分别采用免疫荧光染色和qPCR技术检测了iPSC关键蛋白的表达(如OCT-4、SSEA4、Nanog)。

1)免疫荧光染色：采用上述增殖检测中步骤1)的方法得到细胞团簇，用磷酸缓冲液(PBS)(BI,02-024-1AC)洗涤1次；4％多聚甲醛在室温下固定15分钟，用PBS洗涤3次，每次5分钟；含0.3％Triton-X(Sigma,X100)和5％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(Multicell,800-096-EG)的混合液封闭1小时；吸出封闭缓冲液，加入稀释后的一抗(含0.3％Triton-X和1％BSA)，OCT-4(abcam，ab19857)和SSEA4(abcam，ab16287)，4℃过夜孵育。用PBS洗涤3次，每次5分钟；加入对应二抗(abcam，ab205718)和(abcam，ab205719)，室温避光孵育2小时后，用PBS洗涤3次，每次5分钟；接着加入DAPI染细胞核，室温避光孵育5分钟。用激光共聚焦显微镜(LSCM，Nikon，Z2)观察记录(图3A)。

2)qPCR技术：采用上述增殖检测中步骤1)的方法得到细胞团簇，用PBS洗涤1次，加入1ml/孔Trizol在室温放置10分钟，然后移至1.5ml的EP管，然后加入200ul氯仿，快速摇30秒，室温放置2分钟后移至离心机在4℃以12000g离心10分钟。去除上清液，加入1ml 75％无水乙醇，吸出上清液后空气风干获得RNA。使用PrimeScript^TM II 1st Strand cDNASynthesis Kit(TaKaRa，6210A)合成cDNA，PowerUp^TM SYBR^TM Green Master Mix(ThermoScientific，K0252)配制反应体系(Nanog，OCT-4)，反应液加入反应孔中，将反应板置于qPCR仪上根据需要进行PCR反应程序设置，获得Nanog、OCT-4在不同时间点的表达(图3B)。

qPCR所用引物序列如下(5′-3′)：

OCT-4引物序列(SEQ ID NO:1-2)：

Forward：GGTTCTCGATACTGGTTCGC

Reverse：GTGGAGGAAGCTGACAACAA

Nanog引物序列(SEQ ID NO:3-4)：

Forward：CAGGGCTGTCCTGAATAAGC

Reverse：GATTTGTGGGCCTGAAGAAA

以上结果表明，直到第13天，微结构体中的iPSC都具有较高的全能性，高于85％；与Day0相比，第13天Nanog表达86％，OCT-4表达90％。采用打印的3D微结构体进行hiPSC培养，不仅能够达到扩增目的，还能够有效维持细胞的全能性。

实施例2采用压电热气泡喷墨打印技术制备hESC微结构体

1、生物材料溶液(水凝胶溶液)的制备

20％明胶溶液：将明胶粉末(Sigma，G1890)与0.9％氯化钠溶液按照20:100的质量比混合，用磁力搅拌器搅拌约5分钟，在80℃条件下加热3小时，取出冷却至室温，再重复此加热两次，第三次80℃加热后取出，快速分装后置于4℃保存。

6％海藻酸钠溶液的制备方法同实施例1。将6％海藻酸钠溶液与20％明胶溶液按2:1的体积比混合，即为水凝胶溶液。

Matrigel(Corning，354234)在4℃过夜解冻，并且在冰上进行分装操作，在-20℃长期保存。切勿反复冻融。

2、hESC在6孔板上培养

6孔板提前用Matrigel进行包被，Matrigel在冰上用DMEM F12(ThermoScientific，11330)1:100稀释。使用稀释好的Matrigel溶液包被6孔板，1.5ml/孔。轻柔地前后摇晃培养皿，使Matrigel溶液均匀的覆盖培养皿表面(注意：如果培养皿的表面没有完全覆盖，不可用于人ESC或iPSC培养)。使用前在室温(15℃～25℃)孵育至少1个小时，且不要让Matrigel溶液挥发(注意：若不是立即使用，培养皿必须密封防止Matrigel溶液的蒸发，比如使用

封口膜密封，在4℃可以存放一周。使用前，经冷藏的包被培养皿需要在室温下放置30分钟以恢复到室温)。吸出孔中的Matrigel溶液(注意不要刮花包被的表面)，便可用于hESC培养。

hESC的培养与iPSC一样，使用完全培养基mTeSR^TM(Stemcell Technologies,85850)，当细胞汇合度达到85％时，按照1:10的比例进行传代，每18-24小时更换一次完全培养基。培养6天，可用于后续消化。

3、hESC消化成单细胞-水凝胶悬液

hESC消化成单细胞的方法同实施例1。hESC消化成单细胞后，与6％海藻酸钠和20％明胶混合溶液混合，加入Matrigel(在冰上操作)，最终获得细胞密度为1×10⁶个细胞/mL。其中，6％海藻酸钠和20％明胶混合溶液、基础培养基与Matrigel的体积比为18:6:1。

4、hESC单细胞微结构体的打印与培养

将单细胞-水凝胶悬液装入压电喷墨打印装置的3ml的储液室(具体参见LorberB,Hsiao W K,Hutchings I M,et al.Adult rat retinal ganglion cells and glia canbe printed by piezoelectric inkjet printing[J].Biofabrication,2013,6(1):015001)，在计算机控制下设置波形重复频率为1KHz，脉冲大小60V。喷头至接受皿液面距离1.5cm，接收皿中加入100mM CaCl₂溶液，微结构落入接收皿交联后，迅速将皿中的微结构收集至50ml离心管，微结构快速沉降至离心管底部，吸走上层清液，用基础培养基冲洗2次后加入完全培养基，将细胞微结构种入6孔板，铺满皿底1/2左右。在接种完微结构后加入终浓度为10uM的Rock抑制剂(Y-27632)至完全培养基，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。一天后去除Rock抑制剂，每天换液。

5、hESC在微结构体中的活死和增殖检测

分别对第1天、第4天、第7天、第10天和第13天的细胞微结构进行计数，得到了hESC随时间的增殖曲线，并同时对消化成的单细胞用台盼蓝染料进行染色(死细胞会被染成蓝色)，同时计算细胞存活率。

1)首先收集对应天数的微结构体，溶于55mM柠檬酸钠、20mM EDTA和150mM氯化钠溶液的混合溶剂中，在37℃孵育15分钟，600rpm离心2分钟，获得hESC团簇。

2)依次用1ml/孔ReLeSR^TM和2ml/孔

细胞消化液在37℃孵育1分钟和6分钟将细胞团簇消化成单细胞，1000rpm离心3分钟，去上清液，用1ml mTeSR^TM重悬细胞，取36ul至EP管，加入4ul的台盼蓝染料(Thermo Fisher，15250061)混匀，1分钟后取20ul经台盼蓝染色的细胞悬液至细胞计数板，在镜下观察计数，并且计算细胞存活率。计算细胞增殖时，所取天数计数结果分别与第一天相除，绘制细胞增殖曲线(图4)。第7天后，随着天数增加，细胞显著扩增，微结构体中的细胞存活率第1、4、7、10和13天分别为96％、90％、93％、91.3％和91％左右。

6、微结构体中hESC的全能性检测

为了检测微结构体中iPSC细胞的全能性，采用qPCR技术检测了ESC关键蛋白的表达(如OCT-4、Nanog)。采用上述增殖检测中步骤1)的方法得到细胞团簇，用PBS洗涤1次，加入1ml/孔Trizol在室温放置10分钟，然后移至1.5ml的EP管，然后加入200ul氯仿，快速摇30秒，室温放置2分钟后移至离心机在4℃以12000g离心10分钟。去除上清液，加入1ml 75％无水乙醇，吸出上清液后空气风干获得RNA。使用PrimeScript^TM II 1st Strand cDNASynthesis Kit(TaKaRa，6210A)合成cDNA，PowerUp^TM SYBR^TM Green Master Mix(ThermoScientific，K0252)配制反应体系(Nanog，OCT-4)，反应液加入反应孔中，将反应板置于qPCR仪上根据需要进行PCR反应程序设置，获得Nanog、OCT-4在不同时间点的表达(图5)。qPCR所用引物序列同实施例1。

图5结果表明，直到第13天，微结构体中的ESC都具有较高的全能性，高于85％；与Day0相比，第13天Nanog表达88％，OCT-4表达91％。采用打印的3D微结构体进行hESC培养，不仅能够达到扩增目的，还能够有效维持细胞的全能性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 杭州捷诺飞生物科技股份有限公司 清华大学

<120> 干细胞体外扩增方法

<130> KHP191114605.8

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggttctcgat actggttcgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatttgtggg cctgaagaaa 20

Claims (10)

1.干细胞体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将2D环境下培养的干细胞团块消化成单细胞，与水凝胶溶液混合，得到单细胞-水凝胶悬液；

B、采用生物打印技术将所述单细胞-水凝胶悬液打印成含有干细胞的微结构体；

C、采用干细胞培养液培养所述微结构体，使干细胞在微结构体提供的三维环境中稳定扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A包括以下子步骤：

A1、干细胞的2D培养：将干细胞在包被有基质胶和/或玻连蛋白微孔板中进行贴壁培养，当细胞达到80％-90％汇合度时按照1:5-20的比例传代3-8次，每18-24小时更换一次培养基，培养4-7天，用于后续消化；

A2、单细胞-水凝胶悬液的制备：消化前，向A1所得培养物中加入Rock抑制剂，然后加入细胞消化液将干细胞团块消化成单细胞，离心收集单细胞沉淀，用培养基重悬细胞，然后与水凝胶溶液混合，并加入适量基质胶和/或玻连蛋白，混匀，得到单细胞-水凝胶悬液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B包括：将所述单细胞-水凝胶悬液装载到生物打印设备，打印至装有交联剂的容器中，得到结构稳定含有干细胞的微结构体。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C包括：将所述微结构体转移至离心管中，微结构体沉降至离心管底部，将上层清液吸走，用培养基清洗后，将将所述微结构体接入微孔板中培养，并向培养基中加入Rock抑制剂，培养18-24小时后去除Rock抑制剂，每天更换一次培养基，使干细胞在微结构体提供的三维环境中稳定扩增。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞为多能干细胞或专能干细胞，优选诱导多能干细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，水凝胶选用天然和/或人工合成的具有生物兼容性的水凝胶材料；

天然水凝胶材料选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、氨基酸、氨基酸衍生物、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白及衍生材料、透明质酸、透明质酸衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白衍生物、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物、玻连蛋白、骨桥蛋白、肽段水凝胶、DNA水凝胶中的至少一种，优选海藻酸钠、明胶、基质胶或胶原；

人工合成的水凝胶材料选自聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯中的至少一种，优选聚乳酸或乳酸-羟基乙酸共聚物。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物打印技术采用喷墨生物打印技术，所述喷墨生物打印技术是基于热气泡法、压电式、阀基式或高压静电法的3D打印技术。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述交联剂为可溶性钙盐溶液。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，细胞培养条件为：35℃～38℃，5％CO₂。

10.iPSC体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)iPSC的2D培养

将iPSC在包被有基质胶和/或玻连蛋白微孔板中进行贴壁培养，当细胞达到80％-90％汇合度时按照1:5-20的比例传代3-8次，每18-24小时更换一次完全培养基，培养4-7天，用于后续消化；

2)单细胞-水凝胶悬液的制备

iPSC消化成单细胞前，加入Rock抑制剂至完全培养基孵育0.5-2小时，培养基中Rock抑制剂的终浓度为5-20uM，然后加入细胞消化液将iPSC细胞团块消化成单细胞，离心收集单细胞沉淀，用基础培养基重悬细胞，然后与水凝胶溶液混合，并加入适量基质胶和/或玻连蛋白，混匀，得到单细胞-水凝胶悬液；

3)采用喷墨生物打印技术获得含有iPSC的微结构体

将单细胞-水凝胶悬液装载到喷墨生物打印设备，打印至装有100-400mM CaCl₂溶液的容器中，得到结构稳定含有iPSC的微结构体；

4)含有iPSC的微结构体的收集

将含有iPSC的微结构体收集至离心管中，微结构体沉降至离心管底部，将上层清液吸走，用基础培养基清洗后，加入完全培养基，将含有iPSC的微结构体接入微孔板，铺满皿底1/3～1/2；

5)iPSC在微结构体中扩增培养

微孔板中接入微结构体后，向培养基中加入Rock抑制剂，培养基中Rock抑制剂的终浓度为5-20uM，培养18-24小时后去除Rock抑制剂，每天更换一次完全培养基，使iPSC在微结构体提供的三维环境中稳定扩增；

优选地，所用完全培养基和基础培养基购自Stemcell Technologies公司；所述水凝胶溶液为1％-10％海藻酸钠溶液或1％-10％海藻酸钠与10％-20％明胶混合溶液；其中用于配制海藻酸钠溶液、混合溶液的试剂均为0.5％-1.5％氯化钠溶液。

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