KR102306692B1 - 인간 및 대형-포유류 폐 생물반응기 - Google Patents

인간 및 대형-포유류 폐 생물반응기 Download PDF

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톰 레어돈
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예일 유니버시티
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Abstract

본 발명은 대형-포유류 폐 조직용 생물반응기를 제공한다. 생물반응기는 유압식으로 구동되는 음압 및 양압 관류 및 통기를 할 수 있다. 관류 및 통기는 생리학적 속도로 전달되며 용이하게 제어 가능하다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 대형-포유류 폐 조직의 크기를 지지하기 위한 지지 스캐폴드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 생물반응기는 엔지니어링된 폐를 둘러싸고 있어 요구되는 배양 배지의 양을 최소화하는, 작은 분리된 유체 챔버를 제공하는 흉막 주머니를 포함한다. 본 발명은 또한 시험 제제의 기능을 조사하기 위한 시험관 내 모델과 대형-포유류에서 폐 결손을 완화하는 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

인간 및 대형-포유류 폐 생물반응기{HUMAN AND LARGE-MAMMAL LUNG BIOREACTOR}
[관련 출원의 교차-참조]
본 출원은, 그의 전체 내용이 참고로서 본원에 포함되는, 2013년 1월 8일자로 출원된 미국 가출원 제61/750,088호의 우선권을 주장한다.
[연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술]
본 발명은 미국 국립보건원 (National Institutes of Health, NIH)에 의해 인가된 허가 번호 제 HL111016호 하의 미국 정부 보조에 의해 완성되었다. 미국 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
조직 공학은 이식 및 실험실 연구에 적합한 대체 조직을 생성하기 위하여 세포적, 분자적, 공학적 및 의학적 진보의 조합을 추구하는 성장 중인 분야이다. 전도 유망한 연구가 혈관, 방광, 심장 판막, 및 심장 조직을 비롯한 다양한 조직에서 수행되어져 왔다 (Nichols et al,. 2008, Proc Am Thor Soc 5: 723-30; Satchell et al., 2004, J Am Soc Nephrol 15: 566-74; Atala et al., 2006, Lancet 367: 1241-6; Orfanos et al., 2004, Intensive Care Med 30: 1702-14). 그러나, 폐는 실험실에서 엔지니어링 (engineering) 하기 어려운 조직이다. 폐는 호흡의 기계적 압력을 견딜 수 있고, 내피, 상피, 및 간엽 세포의 성장을 지지할 수 있으며, 매우 상이하지만 밀접하게 병치된 (juxtaposed) 2개의 구획들 사이의 가스 교환을 위한 수단을 제공하는 복합 매트릭스를 요구한다. 또한, 인간 폐를 비롯한 대형-포유류 폐의 엔지니어링은 장기의 큰 크기에 의해 방해된다. 인간-규모 폐의 효과적인 배양에 있어서의 난점은 충분한 살균 환경을 제공하고, 크고 다루기 어려운 장기의 구조적 지지를 제공해야 한다는 것이다. 나아가, 이렇게 큰 조직에 대한 배양 배지를 제공하는 비용은 예비적일 수 있다.
따라서, 당해 분야에서 대형-포유류 폐 조직의 배양을 위한 생물반응기 시스템의 개발이 요구된다. 본 발명은 당해 분야의 이러한 요구를 충족시킨다.
본 발명은 대형-포유류 폐 조직의 배양을 위한 생물반응기 시스템을 포함한다. 일 실시형태에서, 생물반응기 시스템은 엔지니어링된 인간 폐의 탈세포화 (decellularization), 재세포화 (recellularization), 및 배양을 위한 살균 환경을 제공한다. 일 실시형태에서, 생물반응기 시스템은 엔지니어링된 폐의 고도로 제어가능한 관류 및 통기를 제공한다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 생리적 속도 및 압력에서 혈관 관류 및 통기를 제공할 뿐만 아니라 유압식으로 구동되는 음압을 통해 다양한 유체 및 가스로 폐를 통기하고 관류할 수 있다. 생물반응기는 무엇보다도 특히 혈관계를 통한 유체의 관류, 기도 안팎으로의 유체 또는 공기의 이동, 및 음압 (뿐만 아니라 양압)을 통한 폐의 통기를 가능케 한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 생물반응기 시스템에서 배양된, 엔지니어링된 대형-포유류 폐를 포함한다. 따라서, 본 발명은 재생 의약품의 형태로서 혈관 형성된 폐 조직의 생성을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 일 실시형태에서, 엔지니어링된 폐 조직은 탈세포화된 천연 폐 조직으로부터 유래한다. 탈세포화된 조직은 실질적으로 세포 및 DNA가 결여되어 있다. 바람직하게는, 탈세포화된 조직은 또한 면역원성 분자가 결여되어 있다. 더욱 바람직하게는, 탈세포화된 조직은 세포 부착 및 증식에 중요한 몇몇 주요 세포외 기질 분자를 보유한다.
일 실시형태에서, 엔지니어링된 대형-포유류 폐는, 예를 들어 폐 발달 생물학을 연구하는데 유용한, 시험관 내 3차원 모델을 포함한다. 또한, 상기 모델은 무엇보다도 약물 발견, 독성 검사, 질환 병리학 등에 유용하다. 일 실시형태에서, 시험관 내 모델은 숙주 순환계와 밀접하게 결부된 도관 상피로 이루어진 폐포 형성 단위 (alveolar forming unit)를 연상시키는 구조의 형성을 반복한다.
본 발명은 또한 포유류, 바람직하게는 인간에서 폐 결손을 완화 또는 치료하는 방법을 포함한다. 본 방법은 이를 필요로 하는 포유류에 본 발명의 3차원 구조물을 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 투여하여 상기 포유류에서 폐 결손을 완화 또는 치료하는 것을 포함한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 명명법 및 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학 및 핵산 화학과 혼성화에서의 실험실 절차는 당해 분야에 잘 알려져 있고 통상적으로 이용되는 것이다.
본원에서 부정관사 "a" 및 "an"은 이 부정관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
양, 일시적 기간 등과 같은 측정가능한 값을 지칭할 때 본원에 사용된 바와 같은 "약"은 이러한 변동이 기술된 방법을 수행하기에 적합한 바와 같이, 특정된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 더욱 바람직하게는 ±5%, 더 더욱 바람직하게는 ±1%, 및 여전히 더욱 바람직하게는 ±0.1%의 변동을 포함한다.
용어 "전구 세포", "조상 세포" 및 "줄기 세포"는 당해 분야에서 호환가능하게 사용되며, 본원에서 사용되는 바와 같이 만능 또는 계통-미결정 (lineage-uncommitted) 조상 세포 중 어느 하나를 지칭하는데, 이는 잠재적으로 무제한 회수의 유사 분열을 할 수 있어서 그 자신을 재생하거나 요망되는 세포 유형으로 분화될 자손 세포를 생성한다. 만능 줄기 세포와는 달리, 계통-결정 조상 세포는 일반적으로 표현형이 서로 상이한 다수의 세포 유형을 발생시킬 수 없는 것으로 간주된다. 대신, 조상 세포는 하나 또는 아마도 2가지의 계통-결정 세포 유형을 발생시킨다.
본원에 사용된 바와 같이, "인간 만능 줄기 세포" (hPS)는 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있고 적합한 조건 하에서, 3종의 배아층 (내배엽, 중배엽, 및 외배엽) 모두의 유도체인 상이한 세포 유형의 인간 자손을 생산할 수 있는 세포를 지칭한다. hPS 세포는 8-12주령 SCID 마우스에서 기형종을 형성할 수 있는 능력 및/또는 조직 배양에서 모든 3종의 배엽층의 식별가능한 세포를 형성할 수 있는 능력을 가질 수 있다. 종종 문헌에 인간 배아 줄기 (hES) 세포로 언급되는 인간 주머니배 유래 줄기 (hBS) 세포, [예컨대, Thomson et al. (1998), Heins et. al. (2004) 참고], 뿐만 아니라 유도성 만능 줄기 세포 [예컨대, Yu et al., (2007) Science 318: 5858; Takahashi et al., (2007) Cell 131(5): 861 참고]를 포함하는 다양한 유형의 배아 세포가 인간 만능 줄기 세포의 정의에 포함된다. 본원에 기술된 다양한 방법 및 기타 실시형태는 다양한 공급원으로부터의 hPS 세포를 요구하거나 사용할 수 있다. 예를 들어, 사용하기에 적합한 hPS 세포는 발생 중인 배아로부터 수득될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 적합한 hPS 세포는 확립된 세포주 및/또는 인간 유도 만능 줄기 (hiPS) 세포로부터 수득될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "hiPS 세포"는 인간 유도 만능 줄기 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "스캐폴드" 및 "조직 스캐폴드"는 세포의 부착 및 증식에 적합한 표면을 제공하는 생체적합성 재료를 포함하는 구조물을 지칭한다. 스캐폴드는 기계적 안정성 및 지지를 추가로 제공할 수 있다. 스캐폴드는 증식하는 세포의 집단에 의해 취해지는 3차원 형상 또는 형태에 영향을 주거나 그의 한계가 정해지도록 특정한 형상 또는 형태로 존재할 수 있다. 그러한 형상 또는 형태는 필름 (예를 들어, 실질적으로 3차원보다 큰 2차원을 갖는 형태), 리본, 코드, 시트, 평평한 디스크, 원통, 구체, 3차원 무정형 형상 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "지지 스캐폴드(support scaffold)"는 조직 스캐폴드를 기계적으로 위치시키거나 고정시키기 위한 더 큰, 거시적 시스템을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "생체적합성"은 포유류 내로 이식될 때 포유류에서 유해 반응을 유발하지 않는 임의의 재료를 지칭한다. 생체적합성 재료는, 개체 내로 도입될 때, 그 개체에 독성을 나타내거나 해롭지 않으며, 포유류에서 그 재료의 면역 거부를 유발하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "자가 (autologous)"는 생물학적 재료가 이후에 재-도입되는 동일한 개체로부터 유래되는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "동종 (allogeneic)"은 생물학적 재료가 도입되는 개체와 동일한 종의 유전적으로 상이한 개체로부터 유래되는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "이식편"(graft)은 개체 또는 구조 내로 이식되어, 전형적으로 결손을 대체하거나, 보정하거나, 다르게는 이를 극복하는 세포, 조직 또는 장기를 지칭한다. 이식편은 스캐폴드를 더 포함할 수 있다. 상기 조직 또는 장기는 동일한 개체로부터 기원하는 세포로 이루어질 수 있고; 이 이식편은 본원에서 하기의 호환가능한 용어로 지칭된다: "자가이식편", "자가 트랜스플란트 (transplant)", "자가 임플란트 (implant)" 및 "자가 이식편". 동일한 종의 유전적으로 상이한 개체로부터의 세포를 포함하는 이식편은 본원에서 하기의 호환가능한 용어로 지칭된다: "동종이식편", "동종 트랜스플란트", "동종 임플란트" 및 "동종 이식편". 한 개체로부터 그의 동일한 쌍둥이로의 이식편은 본원에서 "동계이식편 (isograft)", "동계 트랜스플란트", "동계 임플란트", 또는 "동계 이식편"으로 지칭된다. "이종이식편", "이종 트랜스플란트" 또는 "이종 임플란트"는 한 개체로부터 상이한 종의 또 다른 대상체로의 이식편을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조직 이식 (grafting)" 및 "조직 재건 (reconstructing)"은 모두 조직 결손, 예컨대 폐 결손 또는 연조직 결손을 치료하거나 완화하기 위해 개체 내로 이식편을 임플란트하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환, 결손, 장애 또는 상태를 "완화하는" 것은 질환, 결손, 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상의 중증도의 감소를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환, 결손, 장애 또는 유해한 상태를 "치료하는" 것은 질환, 결손, 장애 또는 유해한 상태의 증상을 환자가 경험하는 빈도를 감소시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료학적 유효량"은 조성물이 투여되는 개체에게 유익한 효과를 제공하기에 충분한 본 발명의 조성물의 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "성장 배지"는 세포의 성장을 촉진하는 배양 배치를 지칭하는 것으로 의도된다. 성장 배지는 일반적으로 동물 혈청을 포함할 것이다. 일부 예에서, 성장 배지는 동물 혈청을 포함하지 않을 수 있다. 일부 예에서, 상징 배지는 세포 증식을 촉진할 것이다.
"분화 배지"는 충분히 분화되지 않은 줄기 세포, 태아 폐 세포, 또는 기타 그러한 조상 세포가 배지 중에서 인큐베이션될 때 분화된 세포의 특징 일부 또는 모두를 갖는 세포로 발생하도록 하는, 첨가제를 포함하거나 첨가제가 결여된 세포 성장 배지를 지칭하도록 본원에 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "성장 인자"는 세포에 성장, 증식, 분화, 또는 영양적 영향을 미치는 단백질, 펩티드, 미토겐, 또는 기타 분자를 지칭한다. 성장 인자에는 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자 (aFGF), 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-T), 인슐린-유사 성장 인자-II (IGF-II), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 액티빈-A, 골 형태형성 단백질 (BMP), 인슐린, 성장 호르몬, 에리쓰로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인터루킨 3 (IL-3), 인터루킨 6 (IL-6), 인터루킨 7 (IL-7), 대식구 콜로니 자극 인자, c-kit 리간드/줄기 세포 인자, 오스테오프로테게린 리간드, 인슐린, 신경 성장 인자, 섬모체 신경영양 인자, 사이토카인, 케모카인, 중화 항체, 기타 단백질, 및 소분자가 포함되지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, FGF는 FGF2, FGF7, FGF10, 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 군으로부터 선택된다.
"단리된 세포"는 조직 또는 포유류에서 단리된 세포를 자연적으로 동반하는, 다른 성분 및/또는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "태아 폐 세포" (FPC)는 배아의 폐 조직으로부터 단리된 세포를 지칭한다. FPC의 혼합 집단은 상피, 간엽, 및 내피 세포를 포함할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, "상피 세포"는 신체의 외부 표면을 형성하며 장기, 공동 및 점막 표면을 라이닝하는 세포를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "내피 세포"는 혈관 및 림프관과 다양한 기타 신체 공동을 라이닝하는 세포를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "실질적으로 정제된" 세포는 본질적으로 다른 세포 유형이 결여된 세포이다. 따라서, 실질적으로 정제된 세포는 그의 자연-발생적인 상태에서 보통 연관되어 있는 다른 세포 유형으로부터 정제된 세포를 지칭한다.
"확장성"은 세포가 증식할 수 있는 능력, 예를 들어, 수적인 면에서 확장하거나, 세포 집단의 경우에 집단 배가를 거치는 능력을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
"증식"은 유사한 형태, 특히 세포의 번식 또는 증가를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 즉, 번식은 더 많은 수의 세포의 생산을 포함하고, 무엇보다도 특히, 단순히 세포 수를 계수하고, 3H-티미딘의 세포 내로의 도입을 측정하는 등에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "조직 공학"은 조직 대체 또는 재건에 사용하기 위하여 생체 외에서 조직을 생성하는 공정을 지칭한다. 조직 공학은 "재생성 의약품"의 예로서 생체공학 재료 및 기술과 함께, 세포, 유전자 또는 기타 생물학적 빌딩 블록의 도입에 의해 조직 및 장기의 복구 또는 대체에 대한 접근을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "내인성"은 유기체, 세포 또는 시스템 유래의 또는 그의 내부에서 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
"외인성"은 유기체, 세포 또는 시스템 내로 도입되거나 그의 외부로부터 생산된 임의의 물질을 지칭한다.
"코딩하는"은 생물학적 과정에서 뉴클레오티드 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 규정된 서열 또는 아미노산의 규정된 서열의 어느 하나와 그로부터 생성되는 생물학적 특성을 갖는 생물학적 공정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로 제공하기 위하여, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드의 특정 서열의 내재적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는 그 유전자 생성물에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 기타 생물학적 시스템에서 단백질을 생성할 경우 단백질을 코딩한다. 그의 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열 목록에 제공된 코딩 가닥과, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 둘 모두는 그 단백질 또는 그 유전자 또는 cDNA의 기타 생성물을 코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
달리 특정하지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
"단리된 핵산"은 자연 발생적 상태에서 그의 측면에 위치하는 서열로부터 분리된 핵산 절편 또는 단편, 즉, 보통 DNA 단편에 인접한 서열, 즉, 그 단편이 자연적으로 발생하는 게놈 내의 상기 단편에 인접한 서열로부터 제거된 DNA 단편을 지칭한다. 상기 용어는 또한 핵산, 즉, RNA 또는 DNA, 또는 단백질을 자연적으로 동반하는 다른 성분으로부터 실질적으로 정제된 핵산에 적용되는데, 상기 핵산 또는 단백질은 세포 내에서 상기 다른 성분을 자연적으로 동반한다. 따라서, 상기 용어는 예를 들어 벡터 내로, 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스 내로, 또는 원핵 또는 진핵 생물의 게놈 DNA 내로 도입된, 또는 다른 서열과 관계없이 별도의 분자로서 (즉, PCR 또는 제한 효소 절단에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 또는 DNA 단편으로서) 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한 상기 용어는 추가의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
용어 "조직"은 본원에 사용된 바와 같이, 뼈, 신경 조직, 건 및 인대를 포함하는 섬유성 결합 조직, 연골, 경뇌막, 심낭, 근육 폐, 심장 판막, 정맥 및 동맥과, 기타 혈관계, 진피, 지방 조직, 또는 선조직을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
"벡터"는 단리된 핵산을 포함하고, 세포의 내부에 단리된 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 다수의 벡터가 당해 분야에 공지되어 있으며, 이는 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연관된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 따라서 용어 "벡터"는 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 또한 상기 용어는 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포좀 등과 같이 세포 내로의 핵산 전달을 용이하게 하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예에는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등이 포함되지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 호환가능하게 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 대상체는 바람직하게는 비-영장류 (예컨대, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 및 영장류 (예컨대, 원숭이 및 인간)와 같은 포유류이고, 가장 바람직하게는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혈관계"는 대상체의 조직, 장기, 또는 신체 일분의 순환계의 임의의 일부를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "음압"은 음압 관류(negative-pressure perfusion) 및/또는 음압 통기(negative-pressure ventilation)와 관련하여 사용된다. 음압 관류/통기에서는, 장기 주변의 압력이 장기 내부 압력에 비해 낮아지기 때문에 유체 또는 공기가 상기 장기 내로 유입된다. 장기 주변의 압력이 장기 내부 압력에 비해 상승하기 때문에 유체 또는 공기는 상기 장기로부터 배출된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "양압"은 양압 관류 및/또는 양압 통기(positive pressure ventilation)와 관련하여 사용된다. 양압 관류/통기에서는, 유체 라인 내 압력이 장기의 유체 구획 내 압력에 비해 증가하기 때문에 유체 또는 공기가 상기 장기 내로 밀려 들어간다. 유체 라인 내 압력이 장기의 유체 구획 내 압력에 비해 감소하기 때문에 유체 또는 공기는 상기 장기로부터 밀려 나온다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유압식"은 압력 하의 한정된 공간에서 이동하는 비압축성 유체에 의해 작동되는, 또는 이를 포함하는, 물건 또는 행위를 지칭한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 음압 통기 및 관류는 유압식 작동에 의해 일어난다.
범위: 이 명세서 전체에서, 발명의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기술은 단지 편의 및 간결함을 위한 것으로 이해되어야 하고 발명의 범주에 대한 불변의 한정으로서 해석되어서는 안 된다. 따라서, 범위의 기술은 상기 범위 내의 개별적인 수치 값뿐만 아니라 모든 가능한 하위범위를 구체적으로 기술하고 있는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기술은 상기 범위 내의 개별적인 숫자, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6뿐만 아니라 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위를 구체적으로 기술하고 있는 것으로 간주되어야 한다. 이는 상기 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
설명
본 발명은 대형-포유류 폐 조직의 배양을 위한 생물반응기 시스템을 제공한다. 바람직하게는, 폐 조직은 허파 조직이다. 일 실시형태에서, 폐 조직은 천연 폐이다. 일 실시형태에서, 생물반응기 시스템은 엔지니어링된 폐의 탈세포화, 재세포화, 및 배양의 적어도 하나를 지지한다. 일 실시형태에서, 엔지니어링된 폐는 인간 허파이다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 양압 또는 음압 관류 및 통기 중 어느 하나를 제공하도록 디자인된다. 본 발명의 생물반응기는 광범위한 생리학적 매개변수에서 엔지니어링된 폐의 살균 통기 및 관류를 허용한다. 일 실시형태에서, 생물반응기의 기능은 고도로 제어가능하고 조절가능하여, 실질적으로 이전 디자인보다 더 우수한 제어를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 생물반응기 시스템은 큰 중량의 대형-포유류 폐 구조물에 대한 지지를 제공하는 지지 스캐폴드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 생물반응기 시스템은 엔지니어링된 폐를 둘러싸는 흉막 주머니(pleural sack)를 포함하는데, 그로써 엔지니어링된 폐를 둘러싸는 작은-부피의 살균 저장소를 제공하고, 이는 폐를 지지하는데 요구되는 배지의 양을 감소시킨다.
본 발명은 부분적으로 독특한 디자인의 유압식 구동 시스템을 기반으로 하는데, 생물반응기 챔버를 채운 유체의 부피에 있어서 유압식으로 매개되는 변화는 음압 통기 및/또는 관류를 유도한다. 본 발명의 일 실시형태에 이용된 유압식 구동 음압 통기/관류는, 생물반응기의 각각의 유체 구획이 비-순응성 또는 강성 벽으로 제조되고 비압축성 유체로 가득 채워지기 때문에 가능해진다. 이 방식에서, 각 유체 구획의 부피에 있어서의 변화는 다양한 경로를 통해 폐 조직으로 들어오고 나가는 특정 부피의 유체를 유도한다. 본 발명의 유압식 구동 생물반응기 시스템은 고도로 제어되고 모니터링된 디자인이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 생물반응기 시스템은 기도 또는 혈관계의 어느 하나를 통한 임의의 유체의 순행성, 역행성, 순환성 및 진동성 유동을 할 수 있다. 또한, 일 실시형태에서, 본 발명의 생물반응기 시스템은 음압 및 양압 통기 둘 모두뿐만 아니라 음압 및 양압 관류 둘 모두를 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 생물반응기는 엔지니어링된 조직으로의 유체 전달의 방식 및 양상에 있어서 매우 유연하다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 본 발명의 생물반응기는 한번에 혈관계의 양측 모두로의 유체의 전달을 가능케 하고, 그 후에 상기 장기의 음압 수축을 통해 밀려 나온다.
본 발명은 또한 본 발명의 생물반응기에서 배양된 엔지니어링된 대형-포유류 폐 조직을 제공한다. 일 실시형태에서, 엔지니어링된 폐 조직은 천연 폐 조직에 의해 예시되는 분지 형태형성을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 천연 폐 조직을 모방하는 시험관 내 모델을 제공한다. 시험관 내 3차원 폐 조직 모델은 무엇보다도 특히 약물 발견, 독성 시험, 질환 병리학 등에 유용하다.
일부 예에서, 엔지니어링된 3차원 폐 조직은 조직 상에서 배양된 세포를 포함한다. 임의의 적합한 세포가 본 발명의 탈세포화된 조직 상에서의 배양에 사용될 수 있다. 적합한 세포에는 인간 iPS 세포, 인간 iPS-유도 상피, 인간 iPS-유도 호흡 상피, 인간 iPS-유도 내배엽 등이 포함되지만, 이로 한정되지는 않는다. 일부 예에서, iPS 세포는 폐 조직의 재생을 위해 탈세포화된 조직 상에서 배양된다. 일부 예에서, iPS 세포는 탈세포화된 조직 상에서 배양된다.
접종 후, 스캐폴드 상의 세포는 임의로 확장 배지 또는 분화 배지에 적용되거나 조직-특이적 성장 인자의 존재 하에서 배양된다. 본 조성물은 그 후에 이를 필요로 하는 대상체에 이식된다. 대상체는 포유류일 수 있지만, 바람직하게는 인간이고, 성장 및 이식을 위한 세포의 공급원은 임의의 포유류, 바람직하게는 인간이다. 이식된 조성물은 생체 내에서 추가의 세포를 지지하며, 그로써 조직 재건을 제공한다. 따라서, 본 발명은 조직 그라프팅 요법을 위한 엔지니어링된 3차원 폐 조직의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 생체 내 폐 조직의 생성을 포함한다. 바람직하게는, 혈관 형성된 폐 조직이 생체 내에서 생성된다. 일 측면에서, 태아 폐 세포는 탈세포화된 조직 맥락에서 투여되어 생체 내 폐 조직 형성을 용이하게 한다.
본 발명에서, 본 발명의 생물반응기 시스템이 시험관 내 전임상적인 약리학적, 생리학적, 및 과학적 시험을 위한 혈관 형성된 3차원 폐 조직 모델을 생산할 수 있음이 입증된다. 또한, 폐 조직은 신생아 폐 세포 또는 자가 폐 세포와 같은 적합한 세포와 함께 접종될 수 있고, 그 결과 조성물은 생체 내에서 조직 재건을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 무수하고 유용한 응용을 갖는다. 본 조성물은 개체에서 조직 결손을 완화 또는 치료하는 치료적 방법에서 사용될 수 있다. 본 조성물은 또한 시험과 내 또는 생체 내에서 치료 화합물을 확인하기 위해 사용될 수 있으며, 따라서 치료적 잠재력을 가질 수 있다.
생물반응기 - 개요
본 발명은 폐 조직을 배양하기 위한 시스템 (예컨대, 생물반응기)을 제공한다. 생물반응기는 세포 생존력, 세포 분화 상태, 및 폐 형태의 유지를 가능케 한다. 일 실시형태에서, 탈세포화된 스캐폴드는, 적합한 세포 공급원과 함께 생물반응기에서 배양될 때, 폐 내피, 상피, 및 간엽 세포를 비롯한 광범위한 세포 유형의 부착 및 증식을 지지할 수 있다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 대형-포유류 엔지니어링된 폐에 구조적 지지 및 온전성을 제공하도록 구성된다. 다른 실시형태에서, 생물반응기는 엔지니어링된 폐를 둘러싸는 흉막 주머니를 포함하고, 그로써 배양에 필요한 배지의 양을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 부착되는 폐 조직의 살균 조작을 가능케 하는 2-부분 유압식 챔버를 포함한다.
본 발명의 생물반응기는 생체 내 환경의 주요 특징을 포함한다. 생물반응기는 탈세포화 및/또는 재세포화 과정의 최적화 및 맞춤화를 위한 변형이 허용되도록 디자인된다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 사용자에 의해 특정된 속도로 그리고 바람직하게는 포유류의 생리학적 유동 및 압력 수준 내에서 엔지니어링된 폐 조직의 혈관계를 통해 배지를 관류시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 양압 및 음압 관류를 할 수 있다. 다른 실시형태에서, 생물반응기는 기관을 통해 공기 또는 배지로 조직 (예컨대, 폐)을 통기시킬 수 있다. 바람직하게는, 양압을 이용한 통기가 또한 행해질 수 있지만, 보통의 생리학적 조건과 일치시키기 위하여 음압 통기가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기는 상이한 배지 유형이 조직의 혈관 및 기도 구획을 적시는 (bathe) 것을 허용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 생물반응기는 배양 배지 내로의 가스 교환을 허용하고, 동시에 통기를 위한 바람직한 요건을 충족시킨다. 다른 실시형태에서, 생물반응기는 압력 측정, 예를 들어 폐 동맥 및 기관 압력의 측정을 허용하는 포트 (port)를 갖는다. 바람직하게는, 압력은 정상적인 생리학적 값 이내이다. 다른 실시형태에서, 생물반응기는 주기적으로 배지 교환을 허용하는 수단을 갖는다.
본 발명의 생물반응기는 일반적으로 조직의 캐뉼레이션 (cannulation)을 위한 적어도 하나의 캐뉼레이션 기구, 캐뉼러(들)를 통해 배지를 공급하기 위한 적어도 하나의 회로, 및 장기 또는 조직을 위해 살균 환경을 유지하기 위한 수단 (예컨대, 챔버)을 포함한다. 캐뉼레이션 기구는 일반적으로 조직의 혈관, 도관, 및/또는 공동 내로의 도입을 위한 적당한 크기의 중공 배관 (tubing)을 포함한다. 전형적으로, 하나 이상의 혈관, 도관, 및/또는 공동이 조직에서 캐뉼레이션된다. 유체 회로는 유체 (예컨대, 세포 파괴 배지)를 위한 저장소 및 하나 이상의 캐뉼러에 의해 장기를 통과하는 유체의 이동을 위한 메카니즘 (예컨대, 유압식 작동, 펌프, 공기 압력, 중력)을 포함할 수 있다. 탈세포화, 재세포화, 및/또는 배양 동안 조직의 살균성은 본원의 다른 곳에서 논의된 방법을 이용하여 유지될 수 있다.
일 실시형태에서, 생물반응기는 본원에 기술된 바와 같이 조직의 탈세포화 및 재세포화를 위하여 사용될 수 있다. 본 방법은 특정한 관류 특징 (예컨대, 압력, 부피, 유동 양상, 온도, 가스, pH), 기계적 힘 (예컨대, 심실벽 운동 및 응력), 및 전기적 자극 (예컨대, 페이싱 (pacing))에 대해 모니터링될 수 있다. 관류의 유효성은 유출물 및 조직 항목에서 평가될 수 있다. 관류 부피, 유동 양상, 온도, O2 및 CO2 분압 및 pH는 표준 방법을 이용하여 모니터링될 수 있다.
생물반응기 및/또는 조직을 모니터링하기 위해 센서가 사용될 수 있다. 소노마이크로미터법, 마이크로마노미터법 및/또는 전도성 측정이 압력-부피를 획득하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 센서는 캐뉼레이션된 장기 또는 조직을 관통하여 이동하는 액체의 압력; 시스템에서의 주위 온도 및/또는 장기 또는 조직의 온도; 캐뉼레이션된 장기 또는 조직을 통하여 이동하는 액체의 유동 속도 및/또는 pH; 및/또는 재세포화 조직의 생물학적 활성을 모니터링할 수 있다. 이러한 특징을 모니터링하기 위한 센서를 갖는 것에 더하여, 조직의 탈세포화 및/또는 재세포화를 위한 시스템은 이러한 특징을 유지 또는 조정하기 위한 수단을 또한 포함할 수 있다. 이러한 특징을 유지 또는 조정하기 위한 수단에는 온도계, 온도조절기 (thermostat), 전극, 압력 센서, 넘침 (overflow) 밸브, 액체의 유동 속도를 변화시키는 밸브, 용액의 pH를 변화시키기 위해 사용된 용액에 대해 유체 연결부를 개폐하는 밸브, 벌룬 (balloon), 외부 페이스메이커 및/또는 컴플라이언스 챔버와 같은 구성요소가 포함될 수 있다. 안정한 조건 (예컨대, 온도)의 보장을 보조하기 위하여, 챔버, 저장부 및 배관이 워터-자켓화될 (water-jacketed) 수 있다.
생물반응기는 세포 생존 및 분화를 지지하기 위하여 폐 조직에 충분한 영양분 공급 및 기계적 자극을 제공할 수 있다. 생물반응기는 시험관 내 폐 조직 배양 및 엔지니어링된 폐 조직 배양에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 생물반응기는 탈세포화된 폐 스캐폴드를 사용해 엔지니어링된 폐 조직을 배양하기 위해 사용된다.
폐 조직의 실제 3차원 절편의 시험관 내 배양을 할 수 있는 생물반응기의 개발은 임상적으로 유용한 엔지니어링된 폐 조직의 개발에 있어 중요한 단계이다. 예를 들어, 엔지니어링된 폐 조직의 성장 및 성숙은 엔지니어링된 폐의 수용자 내로의 이식 전에 생물반응기 내에서 일어날 수 있고, 그로써 생체 내에서 최종 이식된 폐 조직의 기능성을 향상시킬 수 있다. 또한, 시험관 내 폐 배양을 위한 생물반응기는 폐 생물학, 생리학 및 발생의 연구를 보조하는데 사용될 수 있다. 즉, 폐포-모세관 장벽을 형성하기 위한 폐 내피 세포 및 상피 세포의 상호작용이 본 발명의 엔지니어링된 폐 조직 및 생물반응기를 사용하여 연구될 수 있다. 통상의 기술자는 현재 사용되는 다양한 동물 모델보다 더 제어된 환경에서 폐 거동을 연구할 수 있을 것이다. 엔지니어링된 폐 조직 및 생물반응기는 또한 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 인간 또는 동물 실험에 착수하기 전에 인간 또는 동물 조직에서 약리학적 시험 및 조사를 위해 사용될 수 있다.
생물반응기 - 상세 설명
본 발명은 기계적 및 화학적 조건부 하에서 장시간에 걸쳐서 엔지니어링된 폐를 배양하도록 디자인된 생물반응기 시스템을 제공한다. 일부 예에서, 생물반응기 시스템은 반응기로서 언급된다. 일 실시형태에서, 엔지니어링된 폐는 예를 들어 인간을 비롯한 대형-포유류의 탈세포화된 폐이다. 일 실시형태에서, 엔지니어링된 폐는 세포와 함께 접종된다. 반응기는 광범위한 생리학적 속도에서, 살균 방식으로 장기를 호흡 (breathing)시킬 수 있고, 고도의 호흡 제어 및 조정을 허용한다. 일 실시형태에서, 엔지니어링된 폐는 양압 통기에 의해 통기된다. 다른 실시형태에서, 엔지니어링된 폐는 음압 통기에 의해 통기된다. 반응기는 또한 광범위한 생리학적 속도에서, 또한 고도로 제어된, 자체-내장된 (self-contained), 살균 방식으로, 장기의 혈관 관류를 할 수 있다. 일 실시형태에서, 배지 중에서 접촉되도록 디자인된 상기 반응기의 모든 구성요소는 오토클레이브 가능 (autoclavable)하고, 생체적합성 재료로 만들어진다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 반응기의 구성요소는 USP 클래스 VI 재료로 만들어진다. 일 실시형태에서, 반응기는 밀봉된 챔버 내에서 엔지니어링된 폐를 위치시키고 배양시키기 위한 스캐폴딩을 포함한다. 다른 실시형태에서, 반응기는 이 스캐폴드 내부에서 엔지니어링된 폐를 캐뉼레이션하고 장착하기 (mounting) 위한 시스템을 포함한다. 일 실시형태에서, 반응기는 장기 배양에 요구되는 유체 부피를 상당히 감소시키고, 장기의 모양, 위치 및 배향을 유지하며, 살균 손상 없이 후드의 외부에서 반응기의 분해 및 유지를 허용하는 살균 장벽으로 작용하는 인공 흉막을 포함한다. 반응기는 사용하기 용이하게 디자인되고 매우 유연하여, 다수의 매개변수의 변형 및 표준 감지 장치 및 모니터링 기술의 용이한 통합을 허용한다. 다양한 셋업 (setups)은 가스 및 영양분 수준, pH, 압력, 및 각 유체 저장소의 유동 속도의 실시간 측정을 허용한다.
본 발명의 생물반응기는 엔지니어링된 인간 또는 대형-포유류 폐 구조물의 탈세포화, 재접종, 및 성장을 목표로 하여 디자인되고 구성되었다. 예시적인 생물반응기의 디자인 기준은 하기와 같다:
i. 탈세포화 및 배양의 모든 단계 동안에 구조물에 살균 환경을 제공함.
ii. 반응기 내부에서 엔지니어링된 폐의 용이한 캐뉼레이션 및 장착, 뿐만 아니라 폐가 반응기 내에 장착되는 동안 외과적 캐뉼레이션의 용이한 관찰을 허용함.
iii. 반응기 내부에서 폐를 신뢰할 수 있게 위치시키고 배향시키는 방식을 제공함.
iv. 폐 자체의 살균성을 손상하지 않으면서, 살균 환경의 외부에서 반응기의 분해 및 벤치-탑 (bench-top) 유지를 허용함.
v. 전체-폐 배양에 요구되는 배지 부피를 감소시킴. 큰 부피의 세포-특이적 배지 (10-30 리터)는 이와 같은 적용 시 주당 수만 달러의 비용이 들기 때문에 이는 매우 중요한 기준임.
vi. 장기가 생체 내에서 경험하는 것과 매우 유사한 속도 및 부피로 장기가 음압 호흡을 하기 (필요하다면 여전히 양압 호흡을 허용하면서) 위한 방법을 제공하여, 다양한 호흡 부피, 압력, 및 속도를 허용함. 이는 어떠한 경우에도 살균성을 손상하지 않는 방식으로 수행되어야 함.
vii. 장기가 생체 내에서 경험하는 것과 매우 유사한 박동 방식으로 장기의 혈관계를 통해 유체를 관류시키는 방법을 제공하여, 다양한 박동 부피, 압력 및 속도를 허용함. 이는 어떠한 경우에도 살균성을 손상하지 않는 방식으로 수행되어야 함.
viii. 제3자 모니터링/지각 장치 또는 기술의 용이한 통합을 허용함.
ix. 사용하기 용이하고, 콤팩트하며, 자체-내장되고, 워크스테이션 사이의 수송을 위해 이동하기 쉬운 시스템을 디자인함.
일부 예에서, 본 발명의 생물반응기는 이들 기준의 일부, 대부분, 또는 전부를 만족하고, 그로써 대형-포유류 엔지니어링된 폐의 배양에 유용한 생물반응기 시스템을 제공한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 예시적인 생물반응기 시스템 (100)은 일반적으로 장기 챔버 (10), 유압식 구동장치 (hydraulic drive)(30), 혈관 회로 (40), 및 기관 회로 (60)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 장기 챔버 (10)는 엔지니어링된 폐 (11)를 위한 살균된 하우징 (housing)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 장기 챔버 (10)는 유체로 완전히 채워진다. 유압식 구동장치 (30)는 장기 챔버 (10)의 유체 부피를 변화시키기 위해 유압식 저장소 (12) 내부 및 외부로 유체를 펌핑하고, 그로써 폐 (11)의 내부 및 외부로 유체를 이동시킨다. 혈관 회로 (40)는 폐 (11)의 동맥으로 동맥 라인 (41)을 통해 유체를 제공하면서, 또한 정맥 라인 (42)에 의해 폐 (11)의 정맥으로부터 유체를 수집한다. 기관 회로 (60)는 폐 (11)의 기관/기관지로 흡입 라인 (61)을 통해 유체를 공급하면서, 또한 발산 라인 (62)에 의해 폐 (11)로부터 유체를 수집한다. 일 실시형태에서, 기관 회로 (60)는 추가로 흉막 배출 라인 (63)을 포함한다.
도 2는 엔지니어링된 폐 (11)를 수용하는, 장기 챔버 (10)의 분리된 도면이다. 도 6은 폐 (11)를 포함하는 예시적인 챔버 (10)를 나타내는 이미지이다. 본원에서 고려되는 바와 같이, 챔버 (10)는 대형 포유류 (예컨대, 인간)의 폐를 수용하는 임의의 적당한 크기 및/또는 모양을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 챔버 (10)는 한 쌍의 대형-포유류 폐를 수용하도록 크기와 모양을 갖는다. 일 실시형태에서, 챔버 (10)는, 예를 들어, 플라스틱, 유리 등을 비롯한 임의의 강성 재료로 제작된다. 일부 실시형태에서, 챔버 (10)는 적어도 부분적으로 유체로 채워진다. 일 실시형태에서, 챔버 (10)는 완전히 유체로 채워진다. 유체가 채워진 챔버 (10)는, 유압식 챔버 (12)의 부피 변화가 1:1의 고정비에 의해, 폐 (11)의 확장 및 수축에 직접적으로 반영되는 것을 허용한다. 일 실시형태에서, 챔버 (10)는 배양 배지로 부분적으로 또는 완전히 채워진다. 다른 실시형태에서, 챔버 (10)는, 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 흉막 주머니 (15)에 수용된 배양 배지에 폐 (11)가 적셔지는 동안, 임의의 적합한 유체로 부분적으로 또는 완전히 채워진다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 챔버 (10)는 물, 식염수 등으로 채워진다. 본원의 다른 곳에 논의된 바와 같이, 특정 실시형태에서, 흉막 주머니 (15)의 포함은 상대적으로 소량의 배지의 사용을 허용하고, 따라서 챔버 (10)는 저렴한 유체 (예컨대, 물)로 채워질 수 있다. 일 실시형태에서, 챔버 (10)는 최대 10 psi의 압력을 견디도록 제작된다. 다른 실시형태에서, 챔버 (10)는 최대 100 psi의 압력을 견디도록 제작된다. 요구되지 않더라도, 일부 실시형태에서, 챔버 (10)는 광학적으로 투명한 재료로 제작된다. 일 실시형태에서, 챔버 (10)는 그의 내용물이 살균 상태로 유지되도록 밀봉된다. 일 실시형태에서, 챔버 (10)는 폐 (11) 및 흉막 주머니 (15)뿐만 아니라 내부 구성요소에의 접근을 허용하도록 용이하고 가역적으로 조립되고 분해된다.
챔버 (10)는 유압식 저장소 (12) 및/또는 격리 격벽 (isolation diaphragm)(14)을 포함할 수 있는, 상판 (top plate)(13)을 포함한다. 일 실시형태에서, 상판 (13)은 챔버 (10)의 내부 및 외부로의 유체 유동을 허용하는 몇몇 유체 포트를 포함한다. 유체 포트는 당해 분야에 공지된 임의의 유형일 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 유체 포트는 ½ 인치 NPT 암 (female) 포트인데, 이는 광범위한 장치의 부착 및 도입을 허용한다. 일 실시형태에서, 유체 포트는 신속-분리 배관 피팅 (fitting)을 포함하는데, 이는 상판 (13)으로부터 배관의 살균 분리를 허용한다. 유압식 저장소 (12)는 유압식 구동장치 (30)와 유체 연통하는데, 이는 유압식 저장소 (12)의 내부 및 외부로 유체를 펌프한다. 유압식 저장소 (12)의 내부 및 외부로의 유체의 펌핑은 유압식 저장소 (12)의 부피를 변경한다. 일 실시형태에서, 격리 격벽 (14)은 챔버 (10)의 나머지로부터 유압식 저장소 (12)를 분리하는 순응성 막이다. 격리 격벽 (14)은 유압식 저장소 (12)의 적어도 하나의 벽을 형성하고 유압식 저장소 (12)의 부피 변화가 챔버 (10)의 부피를 직접적으로 변화시키는 것을 허용하며, 그로써 폐 (11)의 음압 통기 및 관류를 허용한다. 이 유압식-구동 방법은 폐 (11)의 내부 및 외부로의 유체의 양이 정확하게 공지되고 제어되는 것을 허용한다. 격리 격벽 (14)은 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 순응성 재료로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 격리 격벽 (14)은 실리콘 막이다. 격리 격벽 (14)은 챔버 (10) 내 유체를 유압식 저장소 (12) 내 유체로부터 분리하고, 그로써 살균 음압 통기 및 관류를 허용한다. 전체 챔버 (10)가 배양 배지로 채워진 실시형태에서, 격리 격벽 (14)은 유압식 저장소 (12)의 배지 및 유체 사이에 살균 장벽을 제공한다. 일 실시형태에서, 상판 (13)은 챔버 (10)와 유압식 챔버 (12)의 유체 사이에 막 장벽의 파괴 없이 살균 유체 유동을 허용하는 격리 격벽 (14) 아래에 밀봉 고리를 더 포함한다.
도 2에 도시된 바와 같이, 장기 챔버 (10)는 또한 살균 흉막 주머니 (15), 캐뉼레이션 포트 (16), 지지 스캐폴드 (17), 및 고정점 (18)을 포함할 수 있다. 흉막 주머니 (15)는 폐 (11)를 둘러싼 살균 장벽을 제공하는 모양의 구조이고, 그로써 폐 (11)와 흉막 주머니 (15) 사이의 분리된 유체 저장소를 제공한다. 도 8은 챔버 (10)가 흉막 주머니 (15)를 포함하는 본 발명의 일 실시형태를 나타낸다. 따라서, 일 실시형태에서, 흉막 주머니 (15)는 챔버 (10)의 유체로부터 흉막 주머니 (15) 내부의 배양 배지를 분리한다. 임의의 유형의 적합한 배양 배지가 흉막 주머니 (15) 내부에 사용될 수 있다. 적합한 배양 배지의 비제한적인 예시에는 최소 필수 이글 배지 (Minimum Essential Medium Eagle), ADC-1, LPM (소 혈청 알부민 부재), F10 (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지 (핏톤-잭슨 변형 (Fitton-Jackson Modification) 존재 및 부재), 기본 배지 이글 (Basal Medium Eagle) (BME-얼 염 (Earle's salt) 베이스 첨가), 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (DMEM-혈청 부재), 야만 (Yamane), IMEM-20, 글래스고 (Glasgow) 변형 이글 배지 (GMEM), 레이보비츠 (Leibovitz) L-15 배지, 맥코이 (McCoy's) 5A 배지, 배지 M199 (M199E-얼 염 베이스 함유), 배지 M199 (M199H-행크 염 (Hank's salt) 베이스 함유), 최소 필수 배지 이글 (MEM-E-얼 염 베이스 함유), 최소 필수 배지 이글 (MEM-H-행크 염 베이스 함유) 및 최소 필수 배지 이글 (MEM-NAA-비필수 아미노산 함유) 등이 포함되지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 흉막 주머니 (15)의 존재는 폐 (11)의 효과적인 배양에 필요한 배양 배지의 양을 상당히 감소시킨다. 일 실시형태에서, 흉막 주머니 (15)는 탈세포화, 통기, 및 관류 동안에 생리학적 배향 및 형상으로 폐를 수용하기 위한 방식으로 모양이 지어진다. 흉막 주머니 (15)는 임의의 적합한, 생체적합성 탄성 재료로 제작될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 흉막 주머니 (15)는 고-탄성 실리콘으로 제작된다. 따라서, 흉막 주머니 (15)는 폐 (11)의 통기 동안에 용이하게 확장 및 수축하도록 디자인되고 제작된다. 폐 (11)의 케뉼러 삽입이 캐뉼레이션 포트 (16)의 일 측면에 부착되고, 캐뉼레이션 포트 (16)의 다른 측면이 상판 (13)으로 이어지는 배관 라인에 연결되도록 캐뉼레이션 포트 (16)는 폐 (11)에 부착된다 (도 7). 예를 들어, 일 실시형태에서, 캐뉼레이션 포트 (16)는 동맥 라인 (41), 정맥 라인 (42), 흡입 라인 (61), 발산 라인 (62), 흉막 배출 라인 (63), 또는 이들의 조합에 부착된다. 일 실시형태에서, 캐뉼레이션 포트 (16)는 또한 흉막 주머니 (15)를 위한 밀봉 고리로 기능하고, 그로써 폐 (11)와 흉막 주머니 (15) 사이에 분리된 배지 챔버를 형성하는 것을 보조한다. 캐뉼레이션 포트 (16)는, 예를 들어, 플라스틱, 유리, 실리콘 등을 비롯한 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 재료로 제작된다. 흉막 주머니 (15)와 캐뉼레이션 포트 (16)는, 함께, 챔버 (10)의 외부에서 폐 (11)의 살균 분리, 저장, 및 운송을 허용한다.
생물반응기 시스템 (100) 내 흉막 주머니 (15) 및 캐뉼레이션 포트 (16)의 포함은 조직 엔지니어링된 배양물과 연관된 감염 및 비용을 감소시키기 위한 독특한 메커니즘을 제공한다. 흉막 주머니 (15)와 캐뉼레이션 포트 (16)는, 함께, 챔버 (10)와는 별개로, 폐 (11) 주변에 살균 장벽을 제공한다. 유체는, 챔버 (10) 내부에서 주변의 유체와 접촉하지 않으면서, 여전히 폐 (11)의 내부 및 외부로 유동할 수 있다. 이는 감염의 위험성을 유의미하게 감소시키면서, 살균 후드의 외부에서 폐 (11)의 용이한 취급, 장착, 및 조작을 허용한다. 나아가, 흉막 주머니 (15)와 캐뉼레이션 포트 (16)는 폐 (11) 주변에 작은 분리된 배지 챔버를 형성하는데, 이는 배양에 요구되는 배지 부피를 유의미하게 감소시키면서 여전히 폐 (11)가 생리학적 기능으로 확장하고 수축하는 것을 허용한다. 흉막 주머니 (15)와 캐뉼레이션 포트 (16)는 또한 지지 스캐폴드 (17)의 부착을 위한 고정점 (anchor point)을 제공한다. 이는 챔버 (10) 내부에서 폐 (11)의 적절한 위치를 허용한다. 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 흉막 주머니 (15) 및 캐뉼레이션 포트 (16)와 함께, 지지 스캐폴드 (17)는 폐 (11)의 무게를 안정화시키는데 필요한 지지를 제공하고, 이는 챔버 (10)가 유체로 채워지지 않을 때 특히 중요할 수 있다.
지지 스캐폴드 (17)는 챔버 (10) 내부에서 폐 (11)의 위치 및 배향을 허용하는 강성 스캐폴드를 챔버 (10)에 제공한다. 대형-포유류의 폐는 매우 무거울 수 있고, 따라서 지지 스캐폴드 (17)는 챔버 (10) 내부에서 폐 (11)를 지지하는 것을 보조한다. 인간-크기의 장기로의 조직 공학의 스케일 업의 결과, 구조물은 작은-포유류 모델에 비해 훨씬 더 무겁고 더 다루기 어려워졌다. 따라서, 소-포유류 장기를 사용하는 생물반응기 시스템은, 이들 조직이 캐뉼레이션만으로도 그들 자신의 무게 (또는 부력)를 지지하기에 충분히 강하기 때문에 내부 스캐폴딩을 요구하지 않는다. 그러나, 대형-포유류 (예컨대, 인간) 장기를 이용하여 작업하는 경우, 생물반응기 시스템 내로 스캐폴드의 도입이 필요하다는 것이 현재 발견되었다. 일 실시형태에서, 본 발명의 지지 스캐폴드 (17)는 폐 (11)의 위치 및 방향을 정하기 위해 제공된다. 일 실시형태에서, 지지 스캐폴드 (17)는 유체 중에 부유되지 않을 때 폐 (11)를 지지한다. 일 실시형태에서, 지지 스캐폴드 (17)는 공기가 통기될 때 폐 (11)를 고정한다. 일 실시형태에서 지지 스캐폴드 (17)는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 플라스틱 및 유리를 비롯한 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 강성 재료로 제작된다. 일 실시형태에서, 지지 스캐폴드 (17)는 생체적합성 재료로 제작된다. 지지 스캐폴드 (17)는 고정점 (18)에 의해 흉막 주머니 (15)에 연결된다. 고정점 (18)의 개수는 폐 (11)의 구조적 요구에 따라 달라질 것이다. 일 실시형태에서, 지지 스캐폴드 (17)는 또한 캐뉼레이션 포트 (16)에 연결된다. 지지 스캐폴드 (17)는 폐 (11), 흉막 주머니 (15), 및 캐뉼레이션 포트 (16)의 셋업 및 챔버 (10) 내로 그리고 그로부터의 이동을 허용한다. 또한, 일 실시형태에서, 폐 (11) 및 흉막 주머니 (15)가 여전히 장착된 상태로, 살균성을 손상하지 않으면서, 지지 스캐폴드 (17)는 챔버 (10)로부터 가역적으로 제거되고, 그로써 부착되는 폐 (11)에 대한 자립형 (free-standing) 지지로 작용한다. 이러한 방식으로, 지지 스캐폴드 (17)는 라인 연결의 용이한 살균성 부착과 폐 (11) 위치를 허용한다. 따라서, 일 실시형태에서, 지지 스캐폴드 (17)는 배양 기간 동안에 작업대 상부 유지를 위한 스탠드로서 작용한다. 함께, 지지 스캐폴드 (17)와 흉막 주머니 (15)의 연결은, 챔버 (10)가 유체로 채워지지 않거나, 챔버 (10)가 분해된 경우에도, 폐 (11)의 무게를 지지하는 것을 허용한다.
일 실시형태에서, 챔버 (10)는 추가로 압력 해제 (relief) 시스템 (19)을 포함한다. 일 실시형태에서, 압력 해제 시스템 (19)은 적어도 하나의 압력 해제 밸브를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 압력 해제 시스템 (19)은 2개의 압력 해제 밸브를 포함한다. 다른 실시형태에서, 압력 해제 시스템 (19)은 압력 모니터 및/또는 압력 센서를 포함한다. 당해 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 챔버 (10) 내부 압력의 지속적 또는 주기적 측정을 허용하는 당해 분야에 공지된 임의의 압력 모니터가 본 발명에 사용하기에 적당하다. 압력 해제 시스템 (19)과 함께 사용될 수 있는 일 예시적인 압력 모니터는 펜도테크 압력 MAT 모니터/송신기 (PendoTECH Pressure MAT Monitor/Transmitter) (PendoTech, Princeton, NJ)이다. 적어도 하나의 압력 해제 밸브는 챔버 (10) 내부의 압력이 프로그래밍된 최대 압력을 초과하거나 프로그래밍된 최저 압력 미만이 되지 않는 것을 보장한다. 따라서 압력 해제 시스템 (19)은, 유체 라인이 막히거나 다르게는 제대로 작동하지 않는, 챔버 (10) 및 생물반응기 시스템 (100)에 대한 손상을 방지한다.
일 실시형태에서, 챔버 (10)는 적어도 하나의 충전/배출 라인 (fill/drain line) (20)을 더 포함한다. 일 실시형태에서, 챔버 (10)는 2개의 충전/배출 라인 (20)을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 챔버 (10)는 챔버 (10)의 상부에서 끝나는 하나의 충전/배출 라인 (20)과 챔버 (10)의 바닥에서 끝나는 다른 하나의 충전/배출 라인 (20)을 포함한다. 충전/배출 라인 (20)은 살균 밀봉된 상태를 유지하면서, 챔버 (10)가 신속하게 채워지고 배출되게 하는 것을 허용한다.
일 실시형태에서, 챔버 (10)는 열적 (thermal) 조절 시스템 (21)을 더 포함하는데, 이는 챔버 (10) 내 유체의 온도를 유지한다. 일 실시형태에서, 열적 조절 시스템 (21)은 인큐베이터 내부에서 챔버 (10)의 위치에 대한 요구를 필요 없게 하고, 그로써 생물반응기 시스템 (100)의 벤치탑 작동을 허용한다. 이는, 일부 실시형태에서, 챔버 (10)가 통상적인 인큐베이터 내로 맞춰지기에 너무 큰 경우에 매우 중요하다. 일 실시형태에서, 열적 조절 시스템 (21)은 열원, 예를 들어, 침지형 가열 코일을 포함한다. 다른 실시형태에서, 열적 조절 시스템 (21)은 챔버 (10) 내부에서 온도의 측정을 지속적으로 또는 주기적으로 제공하는 온도 센서를 포함한다. 일 실시형태에서, 열적 조절 시스템 (21)은 챔버 (10) 내부의 온도가 프로그래밍된 최대 온도 또는 프로그래밍된 최저 온도를 벗어나지 않는 것을 보장한다.
도 3은 챔버 (10)에 연결된 유압식 구동장치 (30)의 분리된 도면이다. 유압식 구동장치 (30)는 일반적으로 부피 조절기 (31), 순환 속도 조절기 (32), 구동 모터 (33), 유압식 호흡 부피 펌프 (34), 및 유압식 라인 (35)을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 구동 모터 (33)는 기어 모터를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 순환 속도 조절기 (32)는 변속 구동장치를 포함한다. 일 실시형태에서, 부피 조절기 (31)는 가변 오프셋 구동-아암 (variable offset drive-arm)을 포함한다. 일 실시형태에서, 유압식 호흡 부피 펌프는 유압식 피스톤을 포함한다. 유압식 라인 (35)을 통한, 유압식 저장소 (12) 내부 및 외부로의 유체의 펌핑은 격리 격벽 (14)의 순응성에 의해 허용되는 바와 같이, 유압식 저장소 (12)의 확장 및 수축을 발생시킨다. 유압식 저장소 (12)의 확장 및 수축은 챔버 (10)의 부피를 변화시키고, 이는 이어서 흉막 주머니 (15) 및 폐 (11)의 확장 및 수축을 구동한다. 이러한 방식으로, 유압식 구동장치 (30)는, 본원의 다른 곳에 추가로 기술된 바와 같이, 음압 관류 및/또는 통기를 제공한다. 유압식 라인 (35)은 유압식 호흡 부피 펌프 (34)와 유압식 저장소 (12) 사이의 유체 연통을 제공한다. 일 실시형태에서, 유압식 라인 (35)은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 표준 배관으로 이루어진다. 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 유압식 구동장치 (30)는 유압식 저장소 (12)의 내부 및 외부로의 유체의 펌핑을 허용하는 임의의 부가적인 구성요소를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 유압식 구동장치 (30)는 분당 0-15 사이클 사이로 통기를 할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 유압식 구동장치 (30)는 분당 0-30 사이클 사이로 통기를 할 수 있다. 일 실시형태에서, 유압식 구동장치 (30)는 약 10-1000 mL의 박동 부피를 생성한다. 바람직한 실시형태에서, 유압식 구동장치 (30)는 약 20-750 mL의 박동 부피를 생성한다. 예시적인 유압식 구동장치 (30)가 도 9에 도시된다.
도 4는 혈관 회로 (40)의 분리된 도면으로서, 이는 동맥 라인 (41), 정맥 라인 (42), 혈관 유체 저장소 (43), 조정가능 수축 압력 해제 밸브 (44), 혈관 구동장치 (45), 및 혈관 저장소 가스 교환 메커니즘 (46)을 포함한다. 일 실시형태에서, 혈관 구동장치 (45)는 벨로우즈 구동장치(bellows bellows drive)이다. 일부 실시형태에서, 혈관 구동장치 (45)는 순환 속도 조절기 (47), 부피 조절기 (48), 구동 모터 (49), 및 유압식 혈관 부피 펌프 (50)를 포함한다. 일 실시형태에서, 구동 모터 (49)는 기어 모터를 포함한다. 일 실시형태에서, 순환 속도 조절기 (47)는 변속 구동장치를 포함한다. 일 실시형태에서, 부피 조절기 (48)는 가변 오프셋 구동-아암을 포함한다. 일 실시형태에서, 유압식 혈관 부피 펌프 (50)는 주기적 순응성 챔버를 포함한다. 일 실시형태에서, 유압식 혈관 부피 펌프 (50)는 생리학적 "덕빌 (duckbill)" 밸브를 구비한, 벨로우즈 펌프를 포함한다. 혈관 구동장치 (45)는 동맥 라인 (41)을 통해 폐 (11)의 동맥으로 혈관 유체를 펌핑한다. 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 혈관 구동장치 (45)는 폐 (11)의 동맥으로 혈관 유체를 펌핑하는 것을 허용하는 임의의 부가적인 구성요소를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 혈관 구동장치 (45)는 분당 0-50 사이클 사이의 맥박수를 생성할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 혈관 구동장치 (45)는 분당 0-94 사이클 사이의 맥박수를 생성할 수 있다. 일 실시형태에서, 혈관 구동장치 (45)는 약 0-100 mL의 박동 부피를 생성한다. 바람직한 실시형태에서, 혈관 구동장치 (45)는 약 0-55 mL의 박동 부피를 생성한다. 예시적인 혈관 구동장치 (45)가 도 10에 도시된다.
특정 실시형태에서, 혈관 저장소 (43)는 폐 (11)의 혈관계로의 전달을 위한 혈관 유체를 포함한다. 일 실시형태에서, 혈관 유체는 액체이다. 일 실시형태에서, 혈관 유체는 탈세포화 용액이다. 다른 실시형태에서, 혈관 유체는 재세포화 용액으로, 상기 용액은 세포를 포함하고 폐 스캐폴드의 재세포화 동안에 폐 (11)로 전달된다. 다른 실시형태에서, 혈관 유체는 배양 배지를 포함한다. 다른 실시형태에서, 혈관 유체는 혈장, 혈청, 및/또는 혈액을 포함한다. 다른 실시형태에서, 혈관 유체는 물, 식염수 등을 포함한다. 혈관 회로 (40)는 혈관 유체를 폐 (11)의 혈관계로 전달한다. 동맥 라인 (41)은 혈관 저장소 (43)로부터 폐 (11)의 동맥으로 혈관 유체를 운반하고, 정맥 라인 (42)은 폐 (11)의 정맥으로부터 혈관 저장소 (43)로 혈관 유체를 운반한다. 특정 실시형태에서, 동맥 라인 (41)과 정맥 라인 (42)은 유체 전달을 할 수 있는 임의의 유형의 표준 배관을 포함한다.
일 실시형태에서, 혈관 회로 (40)는 부피 계량된 박동성 관류(pulsatile perfusion)를 폐 (11)로 제공한다. 이러한 방식의 관류에서, 혈관 구동장치 (45)는 상기 회로 전체에서 혈관 유체를 펌핑한다. 본 발명에서 혈관 회로 (40)에 의해 수행된 부피 계량된 박동성 관류는 이전 시스템에서보다 관류 박동 부피, 속도, 및 특성에 있어 상당히 더 높은 정도의 제어, 정밀성, 및 정확성을 제공한다.
다른 실시형태에서, 혈관 회로 (40)는 압력 계량된 박동성 관류를 폐 (11)에 제공한다. 이러한 방식에서, 조정가능 수축기 압력 해제 밸브 (44)는 동일한 회로도 구성요소를 사용하면서 혈관 유동에 대해 압력이 계량되는 것을 허용한다. 일 실시형태에서, 조정가능 수축기 압력 해제 밸브 (44)는 제한 수축 압력으로 설정된다. 이 실시형태에서, 동맥 라인 (41) 내 압력이 이 설정 값보다 더 높은 경우, 혈관 유체의 유동은 혈관 저장소 (43)로 되돌아가고, 그로써 폐 (11)로의 전달을 우회한다. 이러한 압력 계량된 박동성 관류 방식에서, 혈관 저장소 (43) 내부의 혈관 유체의 높이는 확장 압력을 결정한다. 일 실시형태에서, 혈관 저장소 (43) 그 자체는 항상 대기압 상태이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 혈관 저장소 (43)는 외부 환경으로 배출된다. 다른 실시형태에서, 혈관 저장소 (43)는 순응성 재료로 제작된다. 압력 계량된 박동성 관류 방식에서, 맥박은 여전히 혈관 구동장치 (45)의 설정에 의해 결정되지만, 박동 부피는 상기 압력에 좌우된다. 이 압력 계량된 박동성 관류 방식은 이전의 생물반응기 시스템에는 존재하지 않는 가능성이다.
다른 실시형태에서, 혈관 회로 (40) 및 유압식 구동장치 (30)는 생물반응기 시스템 (100) 내 유압식-구동되는 음압 관류를 제공하기 위해 함께 작동한다. 이러한 유압식-구동 음압 관류 방식에서, 유압식 구동장치 (30)는 유압식 저장소 (12)의 내부 및 외부로 유체를 펌핑하고, 그로써 유압식 저장소 (12) 및 챔버 (10) 내부에 압력 변화를 조성한다. 챔버 (10)가 유체로 가득 채워지고, 챔버 (10)의 벽이 강성이고, 다른 캐뉼러가 뚜껑이 닫힌 실시형태에서, 혈관 유체는 결과적으로 혈관 저장소 (43)로부터 폐로 흘러 들어오고 나간다. 일 실시형태에서, 유도된 음압은 박동성 순환 유동을 촉진하는데, 여기서 혈관 유체는 폐 혈관계의 동맥 측면으로 유입되고 정맥 측면을 통해 배출된다. 다른 실시형태에서, 유도된 음압은 진동성, 비-순환 유동을 생성하는데, 여기서 혈관 트리의 일 측면으로 유입되는 혈관 유체는 모세혈관계를 통해 강제되지 않으면서 동일한 캐뉼레이션을 통해 배출된다. 유압식으로 구동되는 음압 관류는 양압 관류보다 더 미세하게-조율되고 조정될 가능성을 갖는다. 이 가능성은 폐 탈세포화, 세포 접종, 및 배양의 특정 부분에 특히 유용하다.
도 5에 도시된 바와 같이, 기관 회로 (60)는 흡입 라인 (61), 발산 라인 (62), 흉막 배출 라인 (63), 기관 저장소 (64), 및 기관 저장소 가스 교환 메커니즘 (65)을 포함한다. 기관 회로 (60)는 폐 (11)의 기도 내로 기관 유체를 제공한다. 흡입 라인 (61)은 기관 저장소 (64)로부터 폐 (11)의 기도로 기관 유체를 운반하고, 발산 라인 (62)은 폐 (11)의 기도로부터 기관 (64)으로 기관 유체를 운반한다. 흉막 배출 라인 (63)은 기관 저장소 (64)를 흉막 주머니 (15) 내부의 분리된 저장소에 연결하여, 폐 (11)와 흉막 주머니 (15) 사이의 공간 내로 가속될 수 있는 유체의 배출을 허용한다. 본원에서 고려되는 바와 같이, 흡입 라인 (61), 발산 라인 (62), 및 흉막 배출 라인 (63)은 유체 전달을 할 수 있는 임의의 유형의 표준 배관으로 제작될 수 있다.
특정 실시형태에서, 기관 저장소 (64)는 폐 (11)의 기도로의 전달을 위한 기관 유체를 포함한다. 일 실시형태에서, 기관 유체는 액체이다. 다른 실시형태에서, 기관 유체는 가스이다. 예를 들어, 일 실시형태에서 기관 유체는 공기이다. 일 실시형태에서, 기관 유체는 탈세포화 용액이다. 다른 실시형태에서, 기관 유체는 재세포화 용액으로, 상기 용액은 세포를 포함하고 폐 스캐폴드의 재세포화 동안에 폐 (11)로 전달된다. 다른 실시형태에서, 기관 유체는 배양 배지를 포함한다. 다른 실시형태에서, 기관 유체는 혈장, 혈청, 및/또는 혈액을 포함한다. 다른 실시형태에서, 기관 유체는 물, 식염수 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 기관 저장소 (64) 그 자체는 항상 대기압 상태이다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 기관 저장소 (64)는 외부 환경으로 배출된다. 다른 실시형태에서, 기관 저장소 (64)는 순응성 재료로 제작된다.
일 실시형태에서, 기관 회로 (60)와 유압식 구동장치 (30)는 생물반응기 시스템 (100) 내 유압식-구동 음압 통기를 제공하기 위해 함께 작동한다. 이러한 유압식-구동 음압 통기 방식에서, 유압식 구동장치 (30)는 유압식 저장소 (12)의 내부 및 외부로 유체를 펌핑하고, 그로써 유압식 저장소 (12)와 챔버 (10) 내부에 부피 변화를 조성한다. 챔버 (10)가 유체로 가득 채워지고, 챔버 (10)의 벽이 강성인 실시형태에서, 기관 유체는 결과적으로 기관 저장소 (64)로부터 폐로 흘러 들어오고 나간다. 일 실시형태에서, 유도된 음압은 박동성 순환 유동을 촉진하는데, 여기서 기관 유체는 흡입 라인 (61)을 통해 기도로 유입되고 발산 라인 (62)을 통해 배출된다. 다른 실시형태에서, 유도된 음압은 진동성, 비-순환 유동을 생성하는데, 여기서 유입된 혈관 유체는 동일한 캐뉼레이션을 통해 폐 (11)의 기도를 빠져 나간다. 유압식으로 구동되는 음압 통기는 다른 생물반응기 시스템보다 호흡 부피, 속도, 및 메커니즘에 대해 훨씬 우수한 정도의 제어, 정밀성, 및 정확도를 제공한다.
특정 실시형태에서, 생물반응기 시스템 (100)은 음압 통기 및 음압 관류를 동시에 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기관 회로 (60)의 흡입 라인 (61)과 발산 라인 (62)이 밀봉되고, 그로써 혈관 회로 (40)로부터 오로지 음압 관류만을 허용한다. 다른 실시형태에서, 혈관 회로 (40)의 동맥 라인 (41)과 정맥 라인 (42)이 밀봉되고, 그로써 기관 회로 (60)로부터 오로지 음압 통기만을 허용한다. 다른 실시형태에서, 음압 통기는 압력-구동 또는 부피-계량된 관류와 조합된다.
일 실시형태에서, 혈관 저장소 (43) 및/또는 기관 저장소 (65)는 생물반응기 시스템 (100) 내부에서 배양 동안에 가스 조절된다. 일 실시형태에서, 혈관 회로 (40)는 혈관 저장소 가스 교환 메커니즘 (46)을 포함한다. 일 실시형태에서, 기관 회로 (60)는 기관 저장소 가스 교환 메커니즘 (65)을 포함한다. 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 혈관 저장소 가스 교환 메커니즘 (46) 및/또는 기관 저장소 가스 교환 메커니즘 (65)은 혈관 저장소 (43) 및/또는 기관 저장소 (64)에서 가스 교환을 조절하는 임의의 공지된 메커니즘을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 혈관 저장소 가스 교환 메커니즘 (46) 및/또는 기관 저장소 가스 교환 메커니즘 (65)은 상업적으로 이용가능한 생물공정 가스 조절 시스템을 포함한다. 일 실시형태에서, 혈관 저장소 (43) 및/또는 기관 저장소 (64)의 벽은 고도의-가스 투과성 재료로 제작된다. 다른 실시형태에서, 혈관 저장소 (43) 및/또는 기관 저장소 (64)는 인큐베이터 내에 위치된다. 일 실시형태에서, 혈관 저장소 가스 교환 메커니즘 (46)과 기관 저장소 가스 교환 메커니즘 (65)은 저장소 내에서 적당한 가스 교환을 허용하는 살균 필터를 포함한다.
특정 실시형태에서, 생물반응기 시스템 (100)의 저장소는 배양 동안 열적으로 제어되어야 한다. 상기에 기술된 바와 같이, 일 실시형태에서, 챔버 (10)는 챔버 (10) 내부의 온도를 측정하고 제어하는 온도 조절 시스템 (21)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 챔버 (10)는 워터 자켓으로 둘러싸이고, 그로써 챔버 (10)는 단열된다. 특정 실시형태에서, 챔버 (10)의 워터 자켓화는 벤치탑 조작을 허용한다. 다른 실시형태에서, 챔버 (10), 혈관 저장소 (43), 및/또는 기관 저장소 (64)는 온도 제어된 인큐베이터 내에 위치한다. 다른 실시형태에서, 챔버 (10), 혈관 저장소 (43), 및/또는 기관 저장소 (64)는 온도 제어된 수조 내에 위치한다.
특정 실시형태에서, 생물반응기 시스템 (100)은 100 파운드 초과의 무게를 갖는다. 따라서, 일 실시형태에서, 생물반응기 시스템 (100)의 구성요소는 완성된 시스템의 무게를 지지할 수 있는 바퀴 달린 카트와 연합된다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 구성요소가 상기 카트 내로 통합된다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 구성요소가 별도로 휴대 가능하지만, 카트 내부에 위치한다.
탈세포화
일부 실시형태에서, 본 발명의 생물반응기 시스템은 대형-포유류 폐의 탈세포화를 지지한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 출발원으로서 탈세포화된 조직, 바람직하게는 대형 포유류 (예컨대, 인간)로부터 유래된 탈세포화된 천연 조직을 사용하여 엔지니어링된 조직 스캐폴드를 제조하는 방법을 제공한다.
당해 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 탈세포화의 임의의 공정이 본 발명의 생물반응기와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 그의 개시가 온전히 참고로서 본원에 포함되는, 미국 특허출원공개 제US2012/0064050호는 폐 조직의 탈세포화에 사용되는 예시적인 탈세포화 방법을 기술한다.
일 실시형태에서, 탈세포화 공정은 화학적 방법에 의존한다. 일 측면에서, 화학적 용액 (또는 다르게는 탈세포화에 사용되는 탈세포화 용액으로 언급됨)은 일반적으로 적어도 고장성 용액, 세제 및 킬레이팅제를 포함한다. 바람직하게는 고장성 용액은 고장성 염화 나트륨 용액이다. 바람직하게는, 세제는 CHAPS와 같은 쯔비터이온성 세제이다. 바람직하게는, 킬레이팅제는 EDTA이다.
일 실시형태에서, 탈세포화 용액은 세포와의 삼투압적 양립가능성을 위해 완충액 (예컨대, PBS)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 탈세포화 용액은 또한, 제한 없이, 하나 이상의 콜라게나제, 하나 이상의 디스파제, 하나 이상의 DNase, 또는 트립신과 같은 프로테아제를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 탈세포화 용액은 하나 이상의 효소의 저해제 (예컨대, 프로테아제 저해제, 뉴클리아제 저해제, 및/또는 콜라게나제 저해제)를 또한 포함하거나 대안적으로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조직을 탈세포화하는 방법은 조직을 탈세포화 용액으로 관류하는 것을 포함한다. 탈세포화 용액이 조직을 통해 관류되기 위한 압력은 바람직한 압력으로 조정될 수 있다. 바람직하게는, 탈세포화 용액은 약 30 mmHg 미만의 관류 압력에서 조직을 통해 관류된다. 더욱 바람직하게는, 탈세포화 용액은 약 20 mmHg 미만의 압력에서 조직을 통해 관류된다. 일 실시형태에서, 탈세포화 용액은 9와 18 mmHg 사이의 압력에서 조직을 통해 관류된다
일 실시형태에서, 탈세포화 용액은 세포 제거를 행하기 위해 폐 조직의 기도 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 생물반응기는 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 유체 유동의 수많은 상이한 방식 및 패턴을 용이하게 하고, 이는 탈세포화 용액의 전달에 활용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 탈세포화된 조직은 혈관 트리의 세포외 기질 (ECM) 성분을 비롯한, 조직의 모든 또는 대부분 영역의 ECM 성분으로 본질적으로 이루어진다. ECM 성분은 하기 중 임의의 하나 또는 모두를 포함할 수 있다: 피브로넥틴, 피브릴린, 라미닌, 엘러스틴, 콜라겐 패밀리의 구성원 (예컨대, 콜라겐 I, III, 및 IV), 글리코사미노글리칸, 기저 물질, 망상 섬유 및 트롬보스폰딘 (이는 기저판과 같은 규정된 구조로 조직화된 상태로 남아있을 수 있음). 성공적인 탈세포화는 조직학적 표준 염색 절차를 이용한 조직 절편에서 검출가능한 근필라멘트, 내피 세포, 평활근 세포, 상피 세포 및 핵의 부재로 정의된다. 바람직하게는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 잔여 세포 잔사는 탈세포화된 조직으로부터 또한 제거되었다.
일 실시형태에서, 천연 조직의 탈세포화 공정은 상기 조직의 천연 3차원 구조를 보존한다. 즉, ECM 성분을 포함하는, 조직의 형태 및 뼈대가 탈세포화의 공정 동안 및 상기 공정 이후에 유지된다. ECM의 형태 및 뼈대는 시각적으로 및/또는 조직학적으로 조사될 수 있다. 예를 들어, 실질 장기의 외부 표면 상에 또는 장기 또는 조직의 혈관계 내의 기저판은 탈세포화로 인해 제거되지 않아야 하거나 유의미하게 손상되지 않아야 한다. 또한, ECM의 피브릴은 탈세포화되지 않은 장기 또는 조직의 것과 유사하거나 유의미하게 변화되지 않아야 한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 화합물이, 예를 들어, 탈세포화된 조직의 보존, 또는 재세포화를 위한 탈세포화된 조직의 제조 및/또는 재세포화 공정 동안에 세포의 보조 또는 자극을 위하여 탈세포화된 조직 내에 또는 그 위에 적용될 수 있다. 이러한 화합물에는 하나 이상의 성장 인자 (예컨대, VEGF, DKK-1, FGF, BMP-1, BMP-4, SDF-1, IGF, 및 HGF), 면역 조절제 (예컨대, 사이토카인, 글루코코르티코이드, IL2R 길항제, 류코트리엔 길항제), 및/또는 응고 캐스케이드를 변형시키는 인자 (예컨대, 아스피린, 헤파린-결합 단백질, 및 헤파린)가 포함되지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 또한, 탈세포화된 장기 또는 조직은 탈세포화된 조직 상에 또는 그 내에 잔존하는 임의의 유형의 미생물의 존재를 감소 또는 제거하기 위해 예를 들어, 조사 (예컨대, UV, 감마)로 추가로 처리될 수 있다.
탈세포화된 조직을 생성하기 위한 본 발명의 탈세포화 용액의 사용은 혈관 형성을 비롯한 하부 ECM 및 원래 조직의 기타 총체적인 형태학적 특징을 온전하게 유지하면서, 조직의 세포를 파괴하는 제어된, 정확한 방식을 제공한다. 그 후에 탈세포화된 스캐폴드는 적절한 세포의 접종에 적합해진다. 상기 공정이 시험관 내에서 수행되는 경우, 접종된 조직은 대체 조직으로서 수용자 내로의 이식에 적합하다. 탈세포화된 조직 자체에 더하여, 본 발명은 이러한 스캐폴드로부터 생성된 엔지니어링된 조직의 제작 방법을 포함한다.
본 발명은 조직 공학에 사용하기 위한 조직 스캐폴드를 생성하는데 적합한 방법을 제공한다. 조직 공급원은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 예시적인 실시형태에서, 조직은 돼지, 소, 말, 원숭이, 또는 유인원과 같이 (관심 조직과 관련하여) 인간과 유사한 해부적 구조를 갖는 것으로 인식되는 상대적으로 큰 동물 또는 동물로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 조직의 공급원은 인간이며, 이의 사용은 스캐폴드를 기반으로 한 엔지니어링된 조직의 거부 가능성을 감소시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 방법은 폐포 중격이 보존된 폐포 뼈대뿐만 아니라, 조직의 온전한 혈관 구조를 유지한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "온전한"은 요소가 그의 원래 기능을 상당한 정도까지 수행할 수 있는 상태를 지칭한다.
일 실시형태에서, 탈세포화된 폐는 정상 폐 기질의 몇몇 주요 특징을 보유한다. 예를 들어, 탈세포화된 폐는 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥팀, 및 프로테오글리칸의 적어도 하나 이상을 포함한다.
탈세포화된 조직은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 또는 II 항원의 어느 하나를 포함하지 않으며, 따라서 조직은 수용자에게 투여될 때 유해한 면역 반응을 촉발하지 않는다.
탈세포화된 조직은 정상적인 천연 폐의 기계적 특성을 보유한다. 탈세포화된 조직은 또한 천연 폐의 장벽 기능의 일부를 보유한다.
조성물
본 발명의 조성물은 엔지니어링된 대형-포유류 폐 조직을 포함한다. 바람직하게는, 엔지니어링된 폐 조직은 하기 특성 중 임의의 하나 이상을 나타낸다: 1) 혈관계 및 기도 - 통기될 수 있는 개방된 (patent), 관류된 혈관계 및 개방된 기도 트리가 있음; 2) 가스 교환 - 수용자의 생리학적 요구를 지지하도록 엔지니어링된 폐가 기도 구획과 혈관 구획 사이에서 가스를 충분히 교환할 수 있음; 가장 바람직하게는, 폐 정맥에서 산소의 분압은 적어도 50 mmHg임; 3) 기계적 특성 - 엔지니어링된 조직은 모든 필요한 움직임, 특히 호흡 운동 및 혈관 관류뿐만 아니라 외과적 이식 동안의 조작을 견디기에 충분히 강함; 4) 면역원성 - 엔지니어링된 폐 조직은 수용자 내로 이식될 때 면역 반응을 일으키지 않음.
본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 적합한 세포를 사용하여 실시될 수 있다. 바람직하게는, 적합한 세포 또는 세포들은 재생성이며 본 발명의 탈세포화된 조직의 재세포화에 사용될 수 있다. 재생성 세포의 예시에는, 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 제대혈 세포, 유도성 다능성 줄기 세포 (iPSC), 조직-유래된 줄기 또는 조상 세포, 골수-유래된 줄기 또는 조상 세포, 혈액-유래된 줄기 또는 조상 세포, 간엽 줄기 세포 (MSC), 골격근-유래된 세포, 다능성 성체 조상 세포 (MAPC), 태아 폐 세포, 분화된 폐 상피 세포, 폐 조상 세포, 혈관 조상 세포, 분화된 혈관 세포 등이 포함되지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 추가의 재생성 세포에는 골수-유래된 줄기 세포, 예컨대 골수 단핵 세포 (BM-MNC), 내피 또는 혈관 줄기 또는 조상 세포, 및 말초 혈액-유래된 줄기 세포, 예컨대 내피 조상 세포 (EPC)가 포함된다.
바람직하게는, 적합한 세포는 포유류, 더욱 바람직하게는 유인원, 더욱 더 바람직하게는 인간으로부터 단리된다. 본 발명의 방법에 유용한 세포는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 단리된다. 단리 후에, 적합 세포는 배양 배지에서 배양된다.
비-제한적인 예시로서, 유도성 다능성 줄기 세포 (iPSC)는 세포를 배양하는 것과 관련하여 더욱 상세히 기술된다. 그러나, 통상의 기술자는 배양 조건이 적합한 세포에 대해 변경될 수 있음을 인식할 것이다. iPSC의 성장을 지지하는 배지 제형에는, 최소 필수 이글 배지, ADC-1, LPM (소 혈청 알부민 부재), F10 (HAM), F12 (HAM), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지 (핏톤-잭슨 변형 존재 및 부재), 기본 배지 이글 (BME-얼 염 베이스 첨가), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM-혈청 부재), 야만, IMEM-20, 글래스고 변형 이글 배지 (GMEM), 레이보비츠 L-15 배지, 맥코이 5A 배지, 배지 M199 (M199E-얼 염 베이스 함유), 배지 M199 (M199H-행크 염 베이스 함유), 최소 필수 배지 이글 (MEM-E-얼 염 베이스 함유), 최소 필수 배지 이글 (MEM-H-행크 염 베이스 함유) 및 최소 필수 배지 이글 (MEM-NAA-비필수 아미노산 함유) 등이 포함되지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 스캐폴드를 "접종하는" 세포를 제공한다. 이러한 문맥에서, 탈세포화된 장기 또는 조직은 분화된 (성숙 또는 일차) 세포, 줄기 세포 (예컨대, iPS 세포), 또는 부분적으로 분화된 세포의 어느 하나인, 세포의 집단과 접촉한다. 따라서, 세포는 전능성 세포, 만능성 세포, 또는 다능성 세포일 수 있고, 비수임되거나 수임될 수 있으며, 단일-계통 세포일 수 있다. 세포는 미분화된 세포, 부분적으로 분화된 세포, 또는 태아 유래된 세포를 비롯한 완전히 분화된 세포일 수 있다.
장기 또는 조직을 생성하기 위하여 탈세포화된 장기 내로 및 그 위에 도입되는 세포의 수는 장기 (예컨대, 장기 종류, 장기의 크기 및 무게) 또는 조직과, 재생성 세포의 유형 및 발달 상태 모두에 좌우된다. 상이한 유형의 세포는 그 세포가 도달할 집단의 밀도에 대해 상이한 경향을 가질 수 있다. 유사하게, 상이한 장기 또는 조직은 상이한 밀도로 세포화될 수 있다. 예로서, 탈세포화된 장기 또는 조직은 적어도 약 1,000개 (예컨대, 적어도 10,000개, 100,000개, 1,000,000개, 10,000,000개, 또는 100,000,000개) 재생성 세포로 접종될 수 있고; 또는 그에 부착되는 약 1,000 세포/mg 조직 (건조 중량, 즉, 탈세포화 전) 내지 약 10,000,000 세포/mg 조직 (건조 중량)을 가질 수 있다.
세포는 하나 이상의 위치 내로의 주입에 의해 탈세포화된 장기 또는 조직에 도입될 수 있다. 또한, 하나 이상의 유형의 세포 (즉, 세포의 칵테일)가 탈세포화된 장기 또는 조직 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 세포의 칵테일은 탈세포화된 장기 또는 조직 내의 다수의 위치에 주입될 수 있거나 상이한 세포 유형이 탈세포화된 장기 또는 조직의 상이한 위치 내로 주입될 수 있다. 주입에 대해 대안적으로, 또는 그에 더하여, 재생성 세포 또는 세포의 칵테일이 캐뉼레이션된 탈세포화된 장기 또는 조직 내로 관류에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, 세포는 관류 배지를 사용하여 탈세포화된 장기 내로 관류될 수 있는데, 그 후 상기 관류 배지는 재생성 세포의 성장 및/또는 분화를 유도하기 위해 확장 및/또는 분화 배지로 교환될 수 있다. 폐 조직의 경우에, 세포는 기관을 통해 기도 구획, 또는 폐 동맥 또는 정맥을 통해 혈관 구획의 어느 하나 또는 이들 모두로 도입될 수 있다. 본 발명의 생물반응기의 일 실시형태에서, 세포는 혈관 저장소 및/또는 기관 저장소에 세포 현탁액의 첨가에 의해 엔지니어링된 폐 내로 도입된다.
재세포화 동안, 장기 또는 조직은 재생성 세포 중 적어도 일부가 탈세포화된 장기 또는 조직 내부에서 그리고 그 위에서 번식 및/또는 분화할 수 있는 조건 하에서 유지된다. 그러한 조건에는, 제한 없이, 적절한 온도 및/또는 압력, 전기적 및/또는 기계적 활동, 힘, 적절한 양의 O2 및/또는 CO2, 적절한 양의 습도, 및 살균 또는 거의-살균 조건이 포함된다. 재세포화 동안, 탈세포화된 장기 또는 조직 및 그에 부착된 세포는 적합한 환경에서 유지된다. 예를 들어, 세포는 영양 공급 (예컨대, 영양분 및/또는 글루코스와 같은 탄소원), 외인성 호르몬 또는 성장 인자, 및/또는 특정 pH를 요구할 수 있다.
세포는 탈세포화된 장기 또는 조직에 대해 동종 (예컨대, 인간 세포가 접종된 인간 탈세포화된 장기 또는 조직)일 수 있고, 또는 재생성 세포는 탈세포화된 장기 또는 조직에 이종 (예컨대, 인간 세포가 접종된 돼지 탈세포화된 장기 또는 조직)일 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 장기 또는 조직은 환자 내로 이식되는 것이다. 그러한 경우에, 탈세포화된 장기 또는 조직을 재세포화하는데 사용된 세포는 상기 재생성 세포가 환자에 대해 자가가 되도록 환자로부터 수득될 수 있다. 환자 유래의 세포는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 일생의 상이한 단계에서 (예컨대, 출생 전, 신생 또는 주산기, 청소년기, 또는 성년기 동안) 예를 들어, 혈액, 골수, 조직, 또는 장기로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 탈세포화된 장기 또는 조직을 재세포화하기 위해 사용된 세포는 환자에 대해 동계 (즉, 일란성 쌍둥이 유래)일 수 있고, 또는 세포는 예를 들어, 환자의 친척 또는 환자와 무관한 인간 림프구 항원 (HLA)-매칭된 개체 유래의 HLA-매칭된 세포일 수 있으며, 또는 세포는 환자에 대해 동종, 예를 들어 비-HLA-매칭된 공여자 유래일 수 있다.
세포의 공급원과 상관 없이 (예컨대, 자가 유래이거나 그렇지 않음), 탈세포화된 실질 장기는 환자에 대해 자가, 동종 또는 이종일 수 있다.
특정 예에서, 탈세포화된 조직은 생체 내에서 세포로 재세포화될 수 있다 (예컨대, 조직이 개체 내로 이식된 후). 생체 내 재세포화는 상기에 기술된 바와 같이 (예컨대, 주입 및/또는 관류), 예를 들어 본원에 기술된 임의의 세포를 이용해 수행될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 내인성 세포로의 탈세포화된 장기 또는 조직의 생체 내 접종은 자연적으로 일어날 수 있거나 재세포화된 조직에 전달된 인자에 의해 매개될 수 있다.
투여
본 발명은 시험관 내 및 생체 내 설정 모두에서 엔지니어링된 대형-포유류 조직의 사용을 고려한다. 따라서, 본 발명은 연구 목적 및 치료 또는 의료/수의학적 목적을 위한 엔지니어링된 조직의 용도를 제공한다. 연구 설정에 있어서, 수많은 실제적인 응용이 상기 기술을 위해 존재한다. 이러한 응용의 일례는 생체 외 암 모델에서 엔지니어링된 조직의 용도, 예컨대 실험실에서 다양한 절제술 (anlation) (예를 들어, 방사선 치료, 화학요법적 치료, 또는 이의 조합을 포함함)의 유효성을 시험하고, 그에 따라 아픈 환자의 이용을 회피하여 치료 방법을 최적화하는 것이다. 예를 들어, 최근에 제거된 폐를 생물반응기에 부착하고 폐를 처리하여 조직을 절제할 수 있다. 생체 내 용도의 또 다른 예시는 조직 공학을 위한 것이다.
본 발명의 엔지니어링된 조직은 생체 내에서의 용도를 갖는다. 다양한 용도 중에서, 대상체 (본원에서 "환자"와 호환 가능하게 사용되며, 인간 및 동물 모두를 포함하는 것으로 의도됨)의 생체 내 치료 방법에 대한 언급이 이루어질 수 있다. 특정 실시형태에 있어서 일반적으로, 대상체를 치료하는 방법은 본 발명에 따라 엔지니어링된 조직을 대상체의 표면 내로 또는 그 위에 이식하는 것을 포함하고, 여기서 상기 조직의 이식은 대상체에서 검출 가능한 변화를 가져온다. 검출 가능한 변화는 자연적인 감각을 이용하거나 인공 기구를 사용하여 검출될 수 있는 임의의 변화일 수 있다. 임의의 유형의 치료가 본 발명에 의해 구상된다고 하더라도 (예컨대, 질환 또는 장애의 치료적 치료, 피부 결점의 미용적 치료 등), 다수의 실시형태에서, 상기 처리는 대상체의 질환, 장애, 또는 기타 고통의 치료적 처리이다. 이와 같이, 검출 가능한 변화는 대상체에 영향을 미치는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 임상적 증상의 변화, 바람직하게는 개선의 검출일 수 있다. 예시적인 생체 내 치료 방법에는 종양 치료 후 장기의 재생, 의료 기구의 이식을 위한 수술 부위의 준비, 피부 그래프팅, 및 조직 또는 장기, 예컨대 질환 또는 장애에 의해 손상되거나 파괴된 것과 같은 조직 또는 장기의 일부 또는 전부의 대체가 포함된다. 예시적인 장기 또는 조직에는: 심장, 폐, 간, 신장, 방광, 뇌, 귀, 눈 또는 피부가 포함된다. 대상체가 인간 또는 동물일 수 있다는 사실을 고려하면, 본 발명은 의료적 및 수의학적 응용 모두를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 방법은 조직을 본 발명의 탈세포화 방법에 노출시켜 처리된 조직의 세포를 사멸시키고 조직 스캐폴드를 생성하는 것을 포함한다. 본 방법은 조직 스캐폴드에 세포를 접종하고, 접종된 세포를 조직 스캐폴드 내에서 그리고 그 위에서 증식시키는 것을 더 포함할 수 있다. 증식은 건강하고 기능적인 세포를 포함하는 재생된 조직을 생성한다.
본 발명은 또한 엔지니어링된 폐 조직을 이를 필요로 하는 포유류 내로 이식함으로써 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 엔지니어링된 폐 조직은 적합한 세포, 예를 들어 iPS 세포를 포함한다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정 유형의 세포로 한정되어서는 안 된다. 이식 후, 그래프팅된 세포는 상기 세포가 내인성 조직의 특성을 발현하게 할 환경적 신호에 대해 반응할 수 있다. 바람직하게는, 세포는 관 구조를 형성하는 분화된 원위 상피 세포 (proSpC 발현)로 이루어진 조직구 폐포-유사 구조를 형성한다. 따라서, 이식된 세포는 상기 세포가 주위 조직과 견주는 특성을 나타내게 할 것이다. 이들 방법을 이용하여, 생물학적 스캐폴딩은 조직을 증대시킬 수 있고; 본 발명의 생물학적 스캐폴딩은 조직 공학을 위해 그리고 임의의 통상적인 조직 공학 설정에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 조직 재생 응용을 포함한다. 조직 재생 요법 접근법의 목적은 고밀도의 복구-적격성 (repair-competent) 세포 (또는 국소적 환경에 의해 영향을 받을 때 적격성으로 될 수 있는 세포)를 초기 창상 역학 및 궁극적인 신조직 생성 둘 모두를 최적화하기 위한 포맷으로 결손 부위에 전달하는 것이다. 본 발명의 조성물은 개체에 있어서 폐 조직 결손을 완화 또는 치료하기 위한 방법에서 특히 유용하다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 개선된 폐 조직 재생을 위해 제공한다. 구체적으로, 조직 재생은 본 발명의 조성물의 결과로서 더욱 신속하게 달성된다.
유리하게는, 본 발명의 조성물 및 방법은 종래 기술의 방법에 비해 개선을 나타낸다. 일 실시형태에서, 폐 조직 결손을 치료하는데 사용하기 위한 조성물은, 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 3차원 배양을 생성하기 위해 스캐폴드 상에 접종되고 시험관 내에서 배양된 줄기 세포, 바람직하게는 iPS 세포를 포함한다.
약물 발견을 위한 모델
본 발명은 폐 질환 또는 장애와 관련하여 시험 화합물의 치료적 활성에 대한 평가를 허용하기에 적합한 시험관 내 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 방법은 엔지니어링된 3차원 폐 조직의 사용을 포함한다.
본 발명은 대형-포유류 폐 조직의 배양을 위한 생물반응기의 개발을 기반으로 한다. 일부 예에서, 폐 조직은 탈세포화된 폐 스캐폴드로부터 생산되고, 이는 적합한 세포로 접종될 수 있다. 일부 예에서, 상피, 간엽, 및 내피 세포를 포함하는 iPS 세포의 혼합된 집단이 3차원 엔지니어링된 폐 조직을 생성하기 위해 사용된다. 예를 들어, iPS 세포는 3차원 탈세포화된 폐 조직 내부에 위치된다. 따라서, 본 모델은 세포 성장 및 이웃하는 세포와의 세포-세포 통신에 대한 iPS 세포의 영향을 통합한다. 3차원 폐 조직은 천연 폐 조직을 모방하는데, 예를 들어 엔지니어링된 폐 조직은 천연 폐 조직에 의해 예시되는 분지 형태형성을 나타낸다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 생물반응기에서 성장한 엔지니어링된 폐 조직은 다양한 조성물의 특성을 평가하기 위한 모델로서 제공된다.
본 모델은 폐 조직의 병리에 대한 약물의 검사에 유용하다. 또한, 본 모델은 폐 조직의 병리에 대한 치료제의 특정한 전달 비히클의 효과를 조사하거나, 예를 들어, 상이한 전달 시스템을 통해 투여된 동일한 제제의 효과를 비교하거나, 전달 비히클 그 자체 (예컨대, 바이러스 벡터)가 폐 병리에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 단순히 평가하기 위해 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 폐 조직의 건강을 조정하는 시험 제제의 능력에 대해 시험 제제를 스크리닝하기 위한 시험관 내 방법을 제공한다. 본 방법은 엔지니어링된 3차원 폐 조직 모델에 시험 제제를 접촉시키고 상기 시험 제제가 그 폐 조직 모델에 미치는 효과를 측정하는 것을 포함한다. 시험 제제의 존재 하에서 모델에 대한 임의의 변경은 상기 시험 제제가 폐 조직의 건강을 조정할 수 있는 것임을 나타내는 것이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 시험 제제가 폐 조직에 미치는 효과를 관찰하는 시험관 내 방법을 제공한다:
a) 정상적인 폐 조직을 모델링하도록 의도된 적어도 하나의 3차원 폐 조직 모델을 제공하는 단계;
b) 시험 제제를 폐 조직 모델과 접촉시키는 단계; 및
c) 시험 제제가 폐 조직 모델에 미치는 효과를 관찰하는 단계.
본 조직 모델은 스캐폴드, 예를 들어 콜라겐 매트릭스 상의 세포의 3차원 어레이, 및 적어도 하나의 시험 세포를 포함하는 구조물이다. 본 방법은 폐 조직의 병리에 대한 시험 제제의 효과를 관찰하는 것을 포함한다. 그러나, 본 방법은 폐 조직의 개개의 세포 유형에 대한 시험 제제의 효과를 관찰하는 단계를 더 포함할 수 있다.
시험 제제는 화학적 제제 (예컨대, 독소), 의약품, 펩티드, 단백질 (예컨대, 항체, 사이토카인, 효소 등), 및 단백질과 같은 치료제를 코딩할 수 있는, 유전자 약물 및 도입된 유전자를 포함하는 핵산, 안티센스 제제 (즉, 표적 세포 유형에서 발현되는 표적 RNA에 상보적인 서열을 포함하는 핵산, 예컨대 RNAi 또는 siRNA), 리보자임 등을 포함하는 임의의 제제일 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 시험 제제는 방사선 (예컨대, 이온화 방사선, UV-광 또는 열)과 같은 물리적 제제일 수 있으며; 이들은 단독으로 또는 화학적 및 기타 제제와 조합하여 사용될 수 있다.
본 모델은 또한 전달 비히클을 시험하는데 사용될 수 있다. 이들은 통상적인 의약품 제형으로부터 유전자 전달 비히클까지의 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 본 모델은 2 이상의 상이한 전달 시스템 (예컨대, 데포 (depot) 제형 및 제어 방출 제형)에 의해 투여되는 동일한 제제의 치료적 효과에 대한 효과를 비교하기 위해 사용될 수 있다. 이는 또한 특정 비히클이 폐 조직에 대해 그 자체의 효과를 가질 수 있는지 여부를 조사하기 위해 사용될 수 있다. 유전자-기반 치료제의 사용이 증가함에 따라, 다양한 가능한 전달 시스템과 결부된 안정성 이슈가 점점 더 중요해지고 있다. 따라서, 본 발명의 모델은 핵산 치료제, 예컨대 네이키드 DNA 또는 RNA, 바이러스 벡터 (예컨대, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 벡터), 리포좀 등을 위한 전달 시스템의 특성을 조사하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 시험 제제는 임의의 결부된 치료제를 포함하거나 포함하지 않는 임의의 적합한 유형의 전달 비히클일 수 있다.
시험 제제는 임의의 적합한 수단을 이용하여 시험되는 모델에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 시험 제제는 본 모델의 표면 상에 적가되어 본 모델 내로 확산되거나 본 모델 내로 유입되는 것이 허용될 수 있으며, 또는 시험 제제는 영양 배지에 첨가되어 장기를 통해 관류되는 것이 허용될 수 있다. 본 모델은 또한 단독 또는 화학적 제제 (예를 들어, 광역학적 요법에서)와 조합된 이온화 방사선, UV-광 또는 열과 같은 물리적 제제의 효과를 시험하기에 적합한다.
본 모델에 대한 시험 제제의 효과를 관찰하는 것은 다양한 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 특정 제제의 세포가 아폽토시스에 진입하도록 유도할 수 있다. 세포에 있어서의 검출 가능한 변화는 세포 면적, 부피, 모양, 형상, 마커 발현 (예컨대, 세포 표면 마커 발현) 또는 기타 적합한 특성, 예컨대 염색체 단편화에서의 변화를 포함할 수 있다. 세포 수가 또한 세포 증식에 대한 시험 제제의 효과를 관찰하기 위하여 모니터링될 수 있는데; 이는 직접적으로, 예컨대 존재하는 특정 세포 유형의 개수를 계수하거나, 간접적으로, 예컨대 특정 세포 덩어리의 크기를 측정함으로써 분석될 수 있다. 이는, 예를 들어 적합한 형광 세포 염색을 이용하여 온전한 모델에서 직접적으로 또는 간접적으로 관찰될 수 있다. 이는 살아있는 모델의 연속 분석을 위해 생체 염료 또는 유전적으로 도입된 형광 마커 (예를 들어, 녹색 형광 단백질)를 이용한 세포의 사전-표지에 의한 것이거나, 고정 및 요오드화프로피디움 또는 형광 표지된 항체와 같은 형광 물질을 이용한 사후-표지에 의한 것일 수 있다. 대안적으로, 모델은 특정 mRNA 종의 발현에 대해 시험하기 위해, 적합한 세포 표적에 대해 유도된 항체를 사용하여 면역조직화학과 같은 통상의 조직화학적 방법, 또는 인 시튜 혼성화에 의해 처리될 수 있다. 더욱이, 이는 다양한 시점에서 세포를 이미지화하고, 예를 들어, 세포 밀도, 위치, 및/또는 형상에 있어서의 임의의 변화를 검출하기 위하여 컴퓨터 시스템 및 소프트웨어를 이용하는, 자동화/로봇 또는 반-자동화 방식으로 수행될 수 있다. 공초점 레이저 주사 현미경은 특히 온전한 모델의 3차원 분석을 가능케 한다. 따라서, 온전한 3차원 폐 조직 모델에, 일반적으로는 통상적인 2차원 배양에서의 세포에 대해서만 가능한 세포 거동의 정량적 분석을 직접적으로 적용할 수 있다. 이러한 수단에 의해 특히 세포 증식, 아폽토시스, 괴사, 이동 및 매트릭스 침윤의 정량적, 연속 분석이, 통상적인 2차원 세포 배양과 살아있는 동물 모델 사이의 갭을 좁히는 3차원 폐 조직 모델에서 수득된다.
본 발명을 예시할 목적으로, 본 발명의 특정 실시형태가 도면에 묘사되어 있다. 그러나, 본 발명은 도면에 묘사된 실시형태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 예시적인 생물반응기 시스템에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 생물반응기의 일 실시형태의 예시적인 챔버에 대한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 생물반응기의 일 실시형태의 예시적인 유압식 구동장치에 대한 모식도이다.
도 4는 본 발명의 생물반응기의 일 실시형태의 예시적인 혈관 구동장치 및 혈관 회로에 대한 모식도이다.
도 5는 본 발명의 생물반응기의 일 실시형태의 예시적인 기관 회로에 대한 모식도이다.
도 6은 본 발명의 생물반응기의 일 실시형태의 예시적인 챔버 및 엔지니어링된 폐를 나타내는 이미지이다.
도 7은 예시적인 캐뉼레이션 (cannulation) 포트를 이용한 폐의 연결을 나타내는 이미지이다.
도 8은 본 발명의 생물반응기의 일 실시형태의 예시적인 챔버 및 흉막 주머니를 나타내는 이미지이다.
도 9는 본 발명의 생물반응기의 일 실시형태의 예시적인 챔버, 유압식 구동장치, 및 혈관 구동장치를 나타내는 이미지이다.
도 10은 본 발명의 일 실시형태의 예시적인 혈관 구동장치를 나타내는 이미지이다.
실험 실시예
본 발명은 하기 실험 실시예를 참고로 하여 상세히 추가로 기술된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 달리 특정되지 않는 한 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 어떠한 방식으로도 하기 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 변형 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 설명 없이, 당해 분야의 통상의 기술자는, 전술한 설명 및 하기의 예시적인 실시예를 이용하여, 본 발명의 화합물을 제조하고 사용할 수 있으며, 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 이해된다. 그러므로, 하기 작용 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 구체적으로 지시하지만, 어떠한 방식으로도 명세서의 나머지 부분을 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1: 생물반응기
엔지니어링된 인간 또는 대형-포유류 폐 구조물의 탈세포화, 재접종, 및 성장을 목표로 하여 본 발명의 생물반응기를 디지인하고 제작하였다. 예시적인 생물반응기의 디자인 기준은 하기와 같다:
● 탈세포화 및 배양의 모든 단계 동안에 구조물에 살균 환경을 제공함.
● 반응기 내부에서 엔지니어링된 폐의 용이한 캐뉼레이션 및 장착, 뿐만 아니라 폐가 반응기에서 장착되는 동안 외과적 캐뉼레이션의 용이한 관찰을 허용함.
● 반응기 내부에서 폐를 신뢰할 수 있게 위치시키고 배향시키는 방식을 제공함.
● 폐 자체의 살균성을 손상하지 않으면서, 살균 환경의 외부에서 반응기의 분해 및 벤치-탑 (bench-top) 유지를 허용함.
● 전체-폐 배양에 필요한 배지 부피를 감소시킴. 큰 부피의 세포-특이적 배지 (10-30 리터)는 이와 같은 적용 시 주당 수만 달러의 비용이 들기 때문에 이는 매우 중요한 기준임.
● 장기가 생체 내에서 경험하는 것과 매우 유사한 속도 및 부피로 장기가 음압 호흡을 하기 (필요하다면 여전히 양압 호흡을 허용하면서) 위한 방법을 제공하여, 다양한 호흡 부피, 압력, 및 속도를 허용함. 이는 어떠한 경우에도 살균성을 손상하지 않는 방식으로 수행되어야 함.
● 장기가 생체 내에서 경험하는 것과 매우 유사한 박동 방식으로 장기의 혈관계를 통해 유체를 관류시키는 방법을 제공하여, 다양한 박동 부피, 압력 및 속도를 허용함. 이는 어떠한 경우에도 살균성을 손상하지 않는 방식으로 수행되어야 함.
● 제3자 모니터링/지각 장치 또는 기술의 용이한 통합을 허용함.
● 사용하기 용이하고, 콤팩트하며, 자체-내장되고, 워크스테이션 사이의 수송을 위해 이동하기 쉬운 시스템을 디자인함.
본 발명의 생물반응기의 비-제한적인 예시가 도 1-10에 도시된다.
본원에 언급된 각각 및 모든 특허, 특허출원, 및 공개의 개시는 이에 의하여 그 전체가 참고로서 본원에 포함된다.
본 발명이 특정 실시형태를 참고로 하여 기술되었다고 하더라도, 본 발명의 다른 실시형태 및 변형이 발명의 실제 요지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 통상의 기술자에 의해 고안될 수 있음이 명백하다. 첨부된 특허청구범위는 모든 그러한 실시형태 및 등가의 변형을 포함하는 것으로 해석되는 것으로 의도된다.

Claims (28)

  1. 대형-포유류 폐 조직용 생물반응기로서, 상기 생물반응기는,
    돼지, 소, 말 및 영장류로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 대형 포유류로부터 유래된 적어도 하나의 대형-포유류 폐를 수용하기 위한 크기를 갖는 밀봉 가능한 강성(sealable rigid) 챔버,
    캐뉼레이션 포트를 포함하는 밀봉 가능한 탄성 흉막 주머니(pleural sack)로서, 상기 밀봉 가능한 탄성 흉막 주머니는 상기 강성 챔버 내에 장착되도록 구성되고, 상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐를 둘러싸는 격리된 살균 유체 챔버를 규정하는, 탄성 흉막 주머니,
    상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐의 혈관계로 유체를 전달하도록 구성되는 혈관 회로,
    상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐의 기도로 유체를 전달하도록 구성되는 기관 회로, 및
    상기 밀봉 가능한 강성 챔버 내의 유체의 압력을 조정함으로써, 상기 밀봉 가능한 탄성 흉막 주머니의 부피를 조정하고 상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐의 팽창 및 수축을 유도하도록 구성된 유압식 구동장치(hydraulic drive)를 포함하는 대형-포유류 폐 조직용 생물반응기.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 밀봉 가능한 강성 챔버는 폐에 대한 지지를 제공하는 지지 스캐폴드(support scaffold)를 포함하는, 생물반응기.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 밀봉 가능한 강성 챔버는 격리 격벽(isolation diaphragm)에 의해 상기 챔버의 나머지 부분으로부터 분리되는 유압식 저장소를 포함하는, 생물반응기.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 유압식 구동장치는 상기 유압식 저장소의 안팎으로 유체를 펌핑하여 상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐의 팽창 및 수축을 발생시키는, 생물반응기.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 생물반응기는 유압식으로 구동되는 음압 통기(negative-pressure ventilation)하도록 구성되는, 생물반응기.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 생물반응기는 양압 통기(positive pressure ventilation)하도록 구성되는, 생물반응기.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 생물반응기는 유압식으로 구동되는 음압 관류(negative-pressure perfusion)하도록 구성되는, 생물반응기.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 생물반응기는 양압 관류하도록 구성되는, 생물반응기.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 생물반응기는 박동성 관류(pulsatile perfusion)하도록 구성되는, 생물반응기.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 생물반응기는 상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐의 기도 및 혈관계로 유체의 순행성, 역행성, 순환성 및 진동성 흐름을 투여하도록 구성되는, 생물반응기.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 생물반응기는 유압식으로 구동되는 음압 통기 및 양압 통기 둘 모두를 통해 혈관계 내로 유체를 전달할 수 있고, 추가로 유압식으로 구동되는 음압 통기 및 양압 통기 둘 모두를 통해 기도로 유체를 전달하도록 구성되는, 생물반응기.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 생물반응기는 폐 혈관계의 동맥측 및 정맥측으로의 유체의 동시 전달에 이어서 상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐의 음압 수축을 통해 유체를 방출(expulsion)하도록 구성되는, 생물반응기.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 혈관 회로는 벨로우즈 구동장치(bellows drive)를 포함하는, 생물반응기.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 혈관 회로는 상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐를 탈세포화(decellularization)하기 위해 탈세포화 용액을 폐로 전달하는, 생물반응기.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 기관 회로는 상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐를 탈세포화하기 위해 탈세포화 용액을 폐로 전달하는, 생물반응기.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 혈관 회로가 세포 함유 용액을 상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐로 전달하는, 생물반응기.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 기관 회로가 세포 함유 용액을 상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐로 전달하는, 생물반응기.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 생물반응기는 상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐를 탈세포화하도록 구성되는, 생물반응기.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 생물반응기는 상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐를 재세포화(recellularization)하도록 구성되는, 생물반응기.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 생물반응기는 폐세포의 성장 및 생존을 지지하도록 구성되는, 생물반응기.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 대형-포유류 폐는 세포 집단으로 접종된 것인, 생물반응기.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 세포 집단은 줄기세포를 포함하는, 생물반응기.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 폐 조직의 건강을 조절할 수 있는 능력에 대해 시험 제제를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 시험 제제를 제1항의 생물반응기에서 배양되고, 돼지, 소, 말 및 영장류로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 대형 포유류로부터 유래된 엔지니어링된 대형-포유류 폐와 접촉시키는 것과 폐의 기능에 대한 시험 제제의 효과를 측정하는 것을 포함하며, 폐의 기능 상의 변경은 상기 시험 제제가 폐 조직의 건강을 조절할 수 있는 것임을 지시하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 시험 제제는 생물반응기의 혈관 회로 또는 기관 회로를 통해 엔지니어링된 폐로 투여되는, 방법.
  28. 삭제
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