JP2021112215A5

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Publication number: JP2021112215A5
Application number: JP2021080955A
Authority: JP
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2036-08-03

Claims

目的の組換えタンパク質の改良された産生のために真核細胞を培養する方法であって、
（ａ）増殖期の間に、真核細胞を、無血清細胞培養培地中で増殖または維持する工程、および
（ｂ）産生期の間に、前記細胞培養培地に、０．１ｍＭ～１０ｍＭのＬ－タウリンを補足し、前記目的の組換えタンパク質を発現させる工程
を含み、
前記Ｌ－タウリンの添加により、前記目的の組換えタンパク質の力価が、０．１ｍＭ未満のＬ－タウリンを含む細胞培養培地中で少なくとも６日間の後に前記目的の組換えタンパク質を発現する細胞と比較して、少なくとも６日間の後に、少なくとも３％増加する、方法。
前記細胞培養培地が、
（ａ）１６ｇ／Ｌ未満の加水分解物を含むか、または
（ｂ）加水分割を含まない、
請求項１に記載の方法。
前記細胞培養培地が、オルニチン、プトレシンまたはこれらの組み合わせを含む、請求項１または２に記載の方法。
前記細胞培養培地が、アミノ酸の混合物、１つまたは複数の脂肪酸、ビタミンおよび補因子、ヌクレオシドの混合物、または、１つまたは複数の二価カチオンを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
請求項４に記載の方法であって、
前記アミノ酸の混合物が、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸を含み、
前記１つまたは複数の脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸、およびオクタン酸からなる群より選択され、
前記ビタミンおよび補因子が、ビオチン、Ｄ－パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ミオ－イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣｌ、およびビタミンＢ１２からなる群より選択され、
前記ヌクレオシドの混合物が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンのうち１つまたは複数を含み、かつ
前記１つまたは複数の二価カチオンが、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋または両方を含む、
方法。
産生期の間に、前記細胞培養培地に０．５～１０ｍＭのＬ－タウリンが補足される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記（ｂ）のＬ－タウリン補足を、産生期の間に１～５回行う、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記（ｂ）のＬ－タウリン補足を、前記産生期の持続時間の間に毎日行う、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記（ｂ）のＬ－タウリン補足を、前記産生期の開始時（０日目）に行う、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
増殖期の間に、前記細胞培養培地に０．１ｍＭ～１０ｍＭのＬ－タウリンを補足することをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
増殖期の間に、前記細胞培養培地に０．５ｍＭ～１０ｍＭのＬ－タウリンを補足することをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫細胞、および酵母細胞からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、網膜細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ１細胞、腎臓細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＷＩ３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ｃｏｌｏ２５細胞、ＨＢ８０６５細胞、ＨＬ－６０細胞、リンパ球、表皮性細胞、ＣＶ－１細胞、Ｕ９３７細胞、３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ－０細胞、ＭＭＴ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および前記細胞に由来する細胞株からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
請求項１３に記載の方法であって、
（ａ）前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯＫ１細胞、ＤＸＢ－１１ＣＨＯ細胞、もしくはＶｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ細胞であるか、
（ａ）前記ＣＯＳ細胞が、ＣＯＳ－７細胞であるか、
（ｂ）前記腎臓細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、２９３ＥＢＮＡ細胞、ＭＳＲ２９３細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨａＫ細胞、もしくはＢＨＫ２１細胞であるか、
（ｃ）前記リンパ球が、Ｊｕｒｋａｔ細胞、もしくはＤａｕｄｉ細胞であるか、または
（ｄ）前記表皮細胞が、Ａ４３１細胞である、
方法。
前記目的の組換えタンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
前記目的の組換えタンパク質がＦｃドメインを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
前記目的の組換えタンパク質が、Ｆｃ－融合タンパク質、受容体－Ｆｃ－融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、抗体、抗体フラグメント、およびＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の方法。
前記抗体が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ－１抗体、抗Ｄｌｌ４抗体、抗ＡＮＧ２抗体、抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、抗Ｅｒｂ３抗体、抗ＰＲＬＲ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＰＣＳＫ９抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＧＣＧＲ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、抗ＩＬ４Ｒ抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＮＧＦ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ４８抗体、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２０二重特異性抗体、抗ＣＤ３／抗ＭＵＣ１６二重特異性抗体、および抗ＣＤ３／抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
前記抗体が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
前記ＴＲＡＰタンパク質が、ＩＬ－１ＴＲＡＰタンパク質またはＶＥＧＦＴＲＡＰタンパク質を含む、請求項１７に記載の方法。
前記ＶＥＧＦＴＲＡＰタンパク質がアフリベルセプトである、請求項２０に記載の方法。
前記Ｌ－タウリン補足を含む前記細胞培養培地中で培養された前記細胞によって産生された前記目的の組換えタンパク質の力価が、少なくとも１．８ｇ／Ｌである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｌ－タウリンの添加により、アンモニア副生成物レベルが、０．１ｍＭ未満のＬ－タウリンを含む細胞培養培地中の前記目的の組換えタンパク質を発現する細胞と比較して、少なくとも４％低下する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
目的の組換えタンパク質を産生する方法であって、
（ａ）目的の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を細胞に導入する工程；
（ｂ）前記目的の組換えタンパク質を発現する前記細胞を選択する工程；
（ｃ）０．１ｍＭ～１０ｍＭのＬ－タウリンを含む無血清細胞培養培地中で選択した前記細胞を培養する工程；および
（ｄ）前記細胞中で前記目的の組換えタンパク質を産生させる工程であって、前記目的の組換えタンパク質が前記細胞培養培地中に分泌される工程
を含み、
前記Ｌ－タウリンの添加により、前記目的の組換えタンパク質の力価が、０．１ｍＭ未満のＬ－タウリンを含む細胞培養培地中で少なくとも６日間の後に前記目的の組換えタンパク質を発現する細胞と比較して、少なくとも６日間の後に、少なくとも３％増加する、方法。
目的の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を細胞に導入する工程が、前記目的の組換えタンパク質をコードする前記核酸を前記細胞に安定的に組み込むことを含む、請求項２４に記載の方法。
前記細胞培養培地が、
（ａ）１６ｇ／Ｌ未満の加水分解物を含むか、または
（ｂ）加水分割を含まない、
請求項２４または２５に記載の方法。
前記細胞培養培地がオルニチン、プトレシンまたはこれらの組み合わせを含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞培養培地が０．５ｍＭ～１０ｍＭのＬ－タウリンを含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＢＨＫ細胞である、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。
前記目的の組換えタンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の方法。
前記目的の組換えタンパク質がＦｃドメインを含む、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の方法。
前記目的の組換えタンパク質が、Ｆｃ－融合タンパク質、受容体－Ｆｃ－融合タンパク質（ＴＲＡＰ）、抗体、抗体フラグメント、およびＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
前記抗体が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
前記ＴＲＡＰタンパク質が、ＩＬ－１ＴＲＡＰタンパク質またはＶＥＧＦＴＲＡＰタンパク質を含む、請求項３２に記載の方法。
前記ＶＥＧＦＴＲＡＰタンパク質がアフリベルセプトである、請求項３４に記載の方法。
前記Ｌ－タウリンの添加により、アンモニア副生成物レベルが、０．１ｍＭ未満のＬ－タウリンを含む細胞培養培地中の前記目的のタンパク質を発現する細胞と比較して、少なくとも４％低下する、請求項２４～３５のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｌ－タウリン補足を含む前記細胞培養培地中で培養された細胞によって産生された前記目的の組換えタンパク質の力価が、少なくとも１．８ｇ／Ｌである、請求項２４～３６のいずれか一項に記載の方法。
デュピルマブを発現する真核細胞を培養する方法であって、
（ａ）約０．１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－タウリンを補足した基礎細胞培養培地を提供する工程、
（ｂ）前記真核細胞を、前記基礎細胞培養培地中で増殖または維持して、細胞培養物を形成する工程、および
（ｃ）前記細胞培養物からデュピルマブを産生させる工程
を含み、
前記基礎細胞培養培地へのＬ－タウリンの補足により、デュピルマブの力価が、０．１ｍＭ未満のＬ－タウリンを含む細胞培養培地中で増殖または維持した細胞からのデュピルマブの力価と比較して少なくとも３％増加する、方法。
前記基礎細胞培養培地が化学的に規定されている、請求項３８に記載の方法。
前記基礎細胞培養培地が血清および加水分解物を含まない、請求項３８または３９に記載の方法。
（ｂ）において、前記基礎細胞培養培地に、オルニチン、プトレシンまたはこれらの組み合わせが補足される、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
前記基礎細胞培養培地に、０．０９ｍＭ～０．９ｍＭのオルニチンが補足される、請求項４１に記載の方法。
前記基礎細胞培養培地が、約０．１ｍＭ～約１ｍＭのＬ－タウリン、約０．５ｍＭ～約１ｍＭのＬタウリン、約１ｍＭ～約５ｍＭのＬ－タウリン、約１ｍＭ～約７ｍＭのＬ－タウリン、または、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－タウリンを含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。
工程（ｂ）の前にさらに増殖期を含み、前記増殖期が、Ｌ－タウリンを補足していない基礎細胞培養培地中で前記真核細胞を増殖または維持することを含む、請求項３８～４３のいずれか一項に記載の方法。
工程（ｂ）の前にさらに増殖期を含み、前記増殖期が、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－タウリンを補足した基礎細胞培養培地中で前記真核細胞を増殖または維持することを含む、請求項３８～４３のいずれか一項に記載の方法。
前記増殖期が、約０．１ｍＭ～約１ｍＭのＬ－タウリン、約０．５ｍＭ～約１ｍＭのＬタウリン、約１ｍＭ～約５ｍＭのＬ－タウリン、約１ｍＭ～約７ｍＭのＬ－タウリン、または、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－タウリンを含む基礎細胞培養培地中で前記真核細胞を増殖または維持することを含む、請求項４５に記載の方法。
（ｂ）の前記タウリンが、工程（ｂ）の間に少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、または少なくとも５回提供される、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の方法。
（ｂ）の前記タウリンが、毎日提供される、請求項３８～４７のいずれか一項に記載の方法。
前記基礎細胞培養培地が、
（ａ）アミノ酸の混合物、
（ｂ）１つまたは複数の脂肪酸、
（ｃ）ビタミンおよび補因子、
（ｄ）ヌクレオシドの混合物、または
（ｅ）１つまたは複数の二価カチオン
を含む、請求項３８～４８のいずれか一項に記載の方法。
請求項４９に記載の方法であって、
（ａ）アミノ酸の混合物が、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸を含む、
（ｂ）前記１つまたは複数の脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸、およびオクタン酸からなる群から選択される、
（ｃ）前記ビタミンおよび補因子が、ビオチン、Ｄ－パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ミオ－イノシトール、ニコチンアミド、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、およびビタミンＢ１２からなる群から選択される、
（ｄ）前記ヌクレオシドの混合物が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサンチンの１つまたは複数を含む、あるいは
（ｅ）前記１つまたは複数の二価カチオンが、Ｃａ ^２＋、Ｍｇ ^２＋または両方を含む、
方法。
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項３８～５０のいずれか一項に記載の方法。
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５１に記載の方法。
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯＤＵＸＢ－１１細胞、ＣＨＯＤＧ－４４細胞、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ細胞、ＧＳ－ＣＨＯ細胞、Ｓ－ＣＨＯ細胞、ＣＨＯｌｅｃ変異株細胞またはこれらの誘導体である、請求項５２に記載の方法。
前記ＣＨＯ細胞がＣＨＯ－Ｋ１細胞である、請求項５２に記載の方法。
デュピルマブを産生する方法であって、
（ａ）デュピルマブをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を細胞に導入する工程、
（ｂ）前記デュピルマブを発現する前記細胞を単離する工程、
（ｃ）約０．１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－タウリンを含む細胞培養培地において前記単離した細胞を培養することにより、細胞の集団を生成する工程、
（ｄ）前記細胞の集団からデュピルマブを発現させる工程であって、前記デュピルマブが前記培地に分泌される、工程、および
（ｅ）前記デュピルマブを回収する工程
を含み、
前記細胞培養培地への約０．１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－タウリンの添加により、デュピルマブの力価が、０．１ｍＭ未満のＬ－タウリンを含む細胞培養培地中で培養した細胞からのデュピルマブの力価と比較して少なくとも３％増加する、方法。
前記デュピルマブの前記力価が、０．１ｍＭ未満のＬ－タウリンを含む細胞培養培地中で培養した細胞と比較して、少なくとも８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％または２０％増加する、請求項５５に記載の方法。
前記細胞の集団が、０．１ｍＭ未満のＬ－タウリンを含む細胞培養培地中でデュピルマブを発現する細胞と比較して、少なくとも８％高いデュピルマブのタンパク質収量が可能である、請求項５５または５６に記載の方法。
Ｌ－タウリンを含む細胞培養培地中で前記細胞の集団を培養することによるデュピルマブの産生が、０．１ｍＭ未満のＬ－タウリンを含む類似の細胞培養培地中で前記細胞の集団を培養した場合と比較して、デュピルマブの収量を、少なくとも０．１ｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．２ｇ／Ｌ、少なくとも１．４ｇ／Ｌ、少なくとも１．６ｇ／Ｌ、少なくとも１．８ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも２．２ｇ／Ｌ、少なくとも２．４ｇ／Ｌまたは少なくとも２．５ｇ／Ｌ増加させることができる、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞培養培地が、約０．１ｍＭ～約１ｍＭのＬ－タウリン、約０．５ｍＭ～約１ｍＭのＬタウリン、約１ｍＭ～約５ｍＭのＬ－タウリン、約１ｍＭ～約７ｍＭのＬ－タウリン、または、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－タウリンを含む、請求項５５～５８のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項５５～５９のいずれか一項に記載の方法。
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６０に記載の方法。
前記ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯＤＵＸＢ－１１細胞、ＣＨＯＤＧ－４４細胞、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ細胞、ＧＳ－ＣＨＯ細胞、Ｓ－ＣＨＯ細胞、ＣＨＯｌｅｃ変異株細胞またはこれらの誘導体である、請求項６１に記載の方法。
（ｃ）において、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭのＬ－タウリンを含む細胞培養培地中で、前記細胞の集団を少なくとも６日間培養することを含む、請求項５５～６２のいずれか一項に記載の方法。
前記デュピルマブをコードする核酸が、前記細胞において安定に組み込まれる、請求項５５～６３のいずれか一項に記載の方法。
前記細胞培養培地に１つまたは複数のユースポイント添加物を添加する工程を含む、請求項５５～６４のいずれか一項に記載の方法。