JP2536851B2 - 多型ｈｌａ決定基−ｂ２７に対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents
多型ｈｌａ決定基−ｂ２７に対するモノクロ−ナル抗体Info
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- JP2536851B2 JP2536851B2 JP61190688A JP19068886A JP2536851B2 JP 2536851 B2 JP2536851 B2 JP 2536851B2 JP 61190688 A JP61190688 A JP 61190688A JP 19068886 A JP19068886 A JP 19068886A JP 2536851 B2 JP2536851 B2 JP 2536851B2
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56977—HLA or MHC typing
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、HLA−B27抗原と特異的に反応する受容体を
分泌できる細胞系の増殖に関し、そして一層具体的に
は、ヒトHLA−B27抗原を認識するが、しかし、他のヒト
HLA抗原と最小の交差反応性を示すモノクローナル抗体
の産生に関する。
分泌できる細胞系の増殖に関し、そして一層具体的に
は、ヒトHLA−B27抗原を認識するが、しかし、他のヒト
HLA抗原と最小の交差反応性を示すモノクローナル抗体
の産生に関する。
HLA（ヒト白血球抗原）又はいわゆる“組織適合性抗
原”は、人体中におけるすべての核保有体細胞及びすべ
ての白血球細胞の表面上で見出される糖タンパク質分子
である。HAL抗原はヒト染色体６上で４つの遺伝子座に
よってコードされる。おのおのの遺伝子座で高率の多型
現象が存在する。初めに、これらの抗原は、器官の移植
のために調和する供与体−受容体に主として使用され
た。これらの抗原はいくらかは、種々の疾患に対する感
受性に関係することもまたすでに知られている。
原”は、人体中におけるすべての核保有体細胞及びすべ
ての白血球細胞の表面上で見出される糖タンパク質分子
である。HAL抗原はヒト染色体６上で４つの遺伝子座に
よってコードされる。おのおのの遺伝子座で高率の多型
現象が存在する。初めに、これらの抗原は、器官の移植
のために調和する供与体−受容体に主として使用され
た。これらの抗原はいくらかは、種々の疾患に対する感
受性に関係することもまたすでに知られている。
特に、リウマチ疾患はHLA系にひじょうに関係してい
ると思われる。明らかに、仙腸骨関節炎及び血清陰性末
梢性関節炎によって特徴づけられる多くの疾患は、１つ
の抗原、すなわちHLA−B27抗原との，報告されている明
確な関係を有する。細胞がB27抗原を示す固体に関して
は，これらの疾患の１つを明示するための相対的危険度
は、B27抗原を有さない固体の30〜200倍の危険度であ
る。また、強直性脊椎炎にかかる相対的危険度は、B27
−陰性固体におけるよりもB27−陽性固体において約200
倍高い。
ると思われる。明らかに、仙腸骨関節炎及び血清陰性末
梢性関節炎によって特徴づけられる多くの疾患は、１つ
の抗原、すなわちHLA−B27抗原との，報告されている明
確な関係を有する。細胞がB27抗原を示す固体に関して
は，これらの疾患の１つを明示するための相対的危険度
は、B27抗原を有さない固体の30〜200倍の危険度であ
る。また、強直性脊椎炎にかかる相対的危険度は、B27
−陰性固体におけるよりもB27−陽性固体において約200
倍高い。
現在、HLA系は、ヒト白血球とアロ抗血清との反応に
よって定義される。それらの反応は、おのおのの遺伝子
座の生成物に対する複数特異性を定義すると解釈されて
きた。これらはHLA−Ｂ抗原に対する47個の既知特異性
（１つはHLA−B27に対してである）である。さらに、HL
A抗原は、種属グループの間のそれらの分布で異なる。
従って、HLA表現型を割り当てる場合、固体の種属が考
慮されるべきである。
よって定義される。それらの反応は、おのおのの遺伝子
座の生成物に対する複数特異性を定義すると解釈されて
きた。これらはHLA−Ｂ抗原に対する47個の既知特異性
（１つはHLA−B27に対してである）である。さらに、HL
A抗原は、種属グループの間のそれらの分布で異なる。
従って、HLA表現型を割り当てる場合、固体の種属が考
慮されるべきである。
一般的に、HLA抗原に対する血清学的試験は、試薬血
清と該抗原との交差反応性に関して極度の注意を必要と
する。これは、特定の抗原の存在を決定するために利用
されるほとんどの抗血清がしばしば、他の抗原と交差反
応し、そして／又は他の抗原に対する抗体を含んでいる
という事実による。
清と該抗原との交差反応性に関して極度の注意を必要と
する。これは、特定の抗原の存在を決定するために利用
されるほとんどの抗血清がしばしば、他の抗原と交差反
応し、そして／又は他の抗原に対する抗体を含んでいる
という事実による。
HLA−B27に対する血清学的試験の場合、この抗原と反
応する抗血清はまた、しばしばHLA−B7,HLA−B22,HLA−
B40及び他の抗原と交差反応する。従って、現在、すべ
ての検出可能なHLA−Ａ抗原及びHLA−Ｂ抗原の完全な抗
原性プロフィールが、HLA−B27抗原の発現を正確に決定
するために行なわれることがしばしば勧められる。
応する抗血清はまた、しばしばHLA−B7,HLA−B22,HLA−
B40及び他の抗原と交差反応する。従って、現在、すべ
ての検出可能なHLA−Ａ抗原及びHLA−Ｂ抗原の完全な抗
原性プロフィールが、HLA−B27抗原の発現を正確に決定
するために行なわれることがしばしば勧められる。
このシステムを、モノクローナル抗原に基づくシステ
ムと交換する試みが行なわれた。モノクローナル抗体の
純粋且つ制限された特異性の点から、それらは、存在す
るHLA型の知識を洗練し、そして新規のHLA抗原関係を定
義するための可能性を有するであろうと思われる。しか
しながら、多くのモノクローナル抗体は実際、異なった
対立遺伝子及び時折、異なった遺伝子座の抗原によって
共有される，認識された超典型的な特異性を作り出す。
従って、B27抗原と反応する、いくらかの抗体が単離さ
れたが、それらはまた、多くの他のＢ抗原対立遺伝子と
交差反応する。一層制限された特異性を有するモノクロ
ーナル抗体が最近報告されているが、しかし既知のB27
変異体のすべてを結合する、相伴う能力の損失を示す。
ムと交換する試みが行なわれた。モノクローナル抗体の
純粋且つ制限された特異性の点から、それらは、存在す
るHLA型の知識を洗練し、そして新規のHLA抗原関係を定
義するための可能性を有するであろうと思われる。しか
しながら、多くのモノクローナル抗体は実際、異なった
対立遺伝子及び時折、異なった遺伝子座の抗原によって
共有される，認識された超典型的な特異性を作り出す。
従って、B27抗原と反応する、いくらかの抗体が単離さ
れたが、それらはまた、多くの他のＢ抗原対立遺伝子と
交差反応する。一層制限された特異性を有するモノクロ
ーナル抗体が最近報告されているが、しかし既知のB27
変異体のすべてを結合する、相伴う能力の損失を示す。
従って、受容体、たとえばモノクローナル抗体を産生
することができ，ヒトHLA−B27抗原に対して特異的であ
るが、しかし他のHLA抗原、特に他のＢ遺伝子座の対立
遺伝子と有意に交差反応しない細胞系が必要である。さ
らに、その受容体又はモノクローナル抗体は、種々の人
種にわたってヒトHLA−B27抗原の多型エピトープ部位を
認識できるべきである。本発明はこの要求を満たす。
することができ，ヒトHLA−B27抗原に対して特異的であ
るが、しかし他のHLA抗原、特に他のＢ遺伝子座の対立
遺伝子と有意に交差反応しない細胞系が必要である。さ
らに、その受容体又はモノクローナル抗体は、種々の人
種にわたってヒトHLA−B27抗原の多型エピトープ部位を
認識できるべきである。本発明はこの要求を満たす。
HLA−B27抗原及びいくつかの他のＢ遺伝子座の対立遺
伝子と反応することができるいくつかの抗体が報告され
てきた。Ellisなど.,Hum.Immunol.（1982）５:49;Rebai
など．（1983）17:357;Trapaniなど.,Hum.Immunol.（19
83）７:205;Antonelliなど.,AACHT摘要,1983を参照のこ
と。Grumetなど.,Hum.Immunol.（1982）５:61は、HLA−
B27を２つのサブグループに分け、そしてまたB47を認識
するモノクローナル抗体（B27M2）を記載する。従来の
血清又は細胞障害性Ｔリンパ球によりB27のサブタイプ
の可能な同定がde Waalなど.,Histocompatibility Test
ing 1984,E.D.Alberなど.,Springer−Verlag出版，ベル
リン、1984,418ページ及びBreuningなど.,Hum.Immunol.
（1982）５:259〜268に提供されている。Breur及びIvan
yi,Histocompatibility Testing 1984,E.D.Albertな
ど.,Springer−Verlag出版，ベルリン、1984,144ページ
は、４種類の人種にわたって４種の抗−B27単一特異性
タイプの血清の性質を記載している。
伝子と反応することができるいくつかの抗体が報告され
てきた。Ellisなど.,Hum.Immunol.（1982）５:49;Rebai
など．（1983）17:357;Trapaniなど.,Hum.Immunol.（19
83）７:205;Antonelliなど.,AACHT摘要,1983を参照のこ
と。Grumetなど.,Hum.Immunol.（1982）５:61は、HLA−
B27を２つのサブグループに分け、そしてまたB47を認識
するモノクローナル抗体（B27M2）を記載する。従来の
血清又は細胞障害性Ｔリンパ球によりB27のサブタイプ
の可能な同定がde Waalなど.,Histocompatibility Test
ing 1984,E.D.Alberなど.,Springer−Verlag出版，ベル
リン、1984,418ページ及びBreuningなど.,Hum.Immunol.
（1982）５:259〜268に提供されている。Breur及びIvan
yi,Histocompatibility Testing 1984,E.D.Albertな
ど.,Springer−Verlag出版，ベルリン、1984,144ページ
は、４種類の人種にわたって４種の抗−B27単一特異性
タイプの血清の性質を記載している。
ヒトHLA−B27抗原の特異的な検出を可能にする方法及
び組成物が提供される。HLA−B27抗原に対して特異的で
あるがしかし他のHLAアロ抗原と交差反応しないモノク
ローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞系が生成され
る。そのハイブリッド細胞系は、ハイブリッドDNA技法
によってHLA−B27に対して特異的な受容体の製造のため
の又は本発明の抗体の産生のための遺伝子を担持する染
色体をトランスファーするために他の細胞と融合するた
めのDNA源として働き、従って、HLA−B27特異性受容体
を産生するために他の細胞性手段を提供する。HLA−B27
抗原に対して特異的なモノクローナル抗体又は受容体
は、診断法及び療法に有用である。
び組成物が提供される。HLA−B27抗原に対して特異的で
あるがしかし他のHLAアロ抗原と交差反応しないモノク
ローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞系が生成され
る。そのハイブリッド細胞系は、ハイブリッドDNA技法
によってHLA−B27に対して特異的な受容体の製造のため
の又は本発明の抗体の産生のための遺伝子を担持する染
色体をトランスファーするために他の細胞と融合するた
めのDNA源として働き、従って、HLA−B27特異性受容体
を産生するために他の細胞性手段を提供する。HLA−B27
抗原に対して特異的なモノクローナル抗体又は受容体
は、診断法及び療法に有用である。
本発明に従えば、新規細胞及び組成物がヒトアロ抗原
HLA−B27の特異的な認識のために提供される。その対称
細胞は、同一の染色体を有し、そしてここで生殖細胞系
のDNAがアロ抗原HLA−B27上に見出されるが、しかし他
の関連する又は関連しないHLAアロ抗原上には見出され
ないエピトープ部位に対して特異的な結合部位を有する
受容体をコードするために再配列された。これらの受容
体、典型的にはモノクローナル抗体は、診断法及び療法
を含む広範囲の種類の方法に使用され得る。
HLA−B27の特異的な認識のために提供される。その対称
細胞は、同一の染色体を有し、そしてここで生殖細胞系
のDNAがアロ抗原HLA−B27上に見出されるが、しかし他
の関連する又は関連しないHLAアロ抗原上には見出され
ないエピトープ部位に対して特異的な結合部位を有する
受容体をコードするために再配列された。これらの受容
体、典型的にはモノクローナル抗体は、診断法及び療法
を含む広範囲の種類の方法に使用され得る。
モノクローナル抗体の製造は、ヒトHLA−B27プライベ
ートエピトープに対して特異的な受容体を発現できる核
配配列を不滅にし、そのような配列、典型的には該受容
体をコードするcDNAを、培養基中で培養できる宿主中に
導入することによって行なわれ得る。その不滅化された
細胞系は、トランスフェクション、突然変異又は同様の
ものによる発癌により形質転換された哺乳類細胞系であ
る。そのような細胞は、イン ビトロで受容体の発現又
は分泌を支持できる骨髄腫系，リンパ腫系又は他の細胞
系を含む。その受容体は、ハイブリッド細胞系を産生す
るために，リンパ球、特に脾細胞の形質転換によって、
ウィルスによって又は腫瘍細胞、たとえば骨髄腫とリン
パ球との融合によって生成される、人以外の哺乳類の天
然に存在する免疫グロブリンである。典型的には、その
脾細胞は、ヒトＢ−27抗原に対して免疫化された動物又
はエピトープ部位を含むそのフラグメントから得られる
であろう。免疫法は良く知られていて、そして効果を維
持しながら相当変化することができる〔Golding,Monocl
onal Antibodies:Principles and Practice,Academic P
ress、N.Y（1983）（この開示を引用によりこの明細書
中に組み入れる）を参照のこと〕。
ートエピトープに対して特異的な受容体を発現できる核
配配列を不滅にし、そのような配列、典型的には該受容
体をコードするcDNAを、培養基中で培養できる宿主中に
導入することによって行なわれ得る。その不滅化された
細胞系は、トランスフェクション、突然変異又は同様の
ものによる発癌により形質転換された哺乳類細胞系であ
る。そのような細胞は、イン ビトロで受容体の発現又
は分泌を支持できる骨髄腫系，リンパ腫系又は他の細胞
系を含む。その受容体は、ハイブリッド細胞系を産生す
るために，リンパ球、特に脾細胞の形質転換によって、
ウィルスによって又は腫瘍細胞、たとえば骨髄腫とリン
パ球との融合によって生成される、人以外の哺乳類の天
然に存在する免疫グロブリンである。典型的には、その
脾細胞は、ヒトＢ−27抗原に対して免疫化された動物又
はエピトープ部位を含むそのフラグメントから得られる
であろう。免疫法は良く知られていて、そして効果を維
持しながら相当変化することができる〔Golding,Monocl
onal Antibodies:Principles and Practice,Academic P
ress、N.Y（1983）（この開示を引用によりこの明細書
中に組み入れる）を参照のこと〕。
他方、受容体は、ハイブリッドDNA技法（たとえば、
抗−HLA−B27モノクローナル抗体の一方又は両者のＨ鎖
及びＬ鎖をコードするゲノムDNA又はcDNAが前記鎖の発
現のために発現ベクター中に組込まれる）によって生成
される免疫グロブリンである。一般的に、アメリカ特許
第4,172,124;4,350,683;4,363,799;4,381,292;及び4,42
3,147号を参照のこと。また、Kennettなど.,Monoclonal
Antibodies,Plenum、ニューヨーク、（1980）を参照の
こと。この開示のすべてを、引用によりこの明細書中に
組み入れる。
抗−HLA−B27モノクローナル抗体の一方又は両者のＨ鎖
及びＬ鎖をコードするゲノムDNA又はcDNAが前記鎖の発
現のために発現ベクター中に組込まれる）によって生成
される免疫グロブリンである。一般的に、アメリカ特許
第4,172,124;4,350,683;4,363,799;4,381,292;及び4,42
3,147号を参照のこと。また、Kennettなど.,Monoclonal
Antibodies,Plenum、ニューヨーク、（1980）を参照の
こと。この開示のすべてを、引用によりこの明細書中に
組み入れる。
ハイブリッド細胞系は、従来の技法に従ってクローン
化され、そしてスクリーンされ、そしてヒトHLA−B27決
定基の多型部位又はプライベート部位に結合することが
できる抗体が細胞上精液中に検出される。次に、適切な
ハイブリッド細胞系は、イン ビトロで増殖され又は腹
水液の生産のために適切な宿主の腹膜腔内に注入され得
る。B27多型部位に対して特異的であることが知られて
いる本発明の抗体を有することによって、その上精液
を、コンペティティブアッセイにおいて対象のモノクロ
ーナル抗体と競争してスクリーンすることができる。従
って、ハイブリッド細胞系は、特定の多型部位に対して
特異的な本発明の抗体の利用可能性に基づく種々の源か
ら容易に産生され得る。他方、対象の多型部位に対して
特異的な抗体を産生するハイブリッド細胞系が利用でき
る場合、これらのハイブリッド細胞系は、他の新生Ｂ−
細胞（ここで、そのような他のＢ−細胞は、受容体をコ
ードするゲノムDNAのために受容菌として働くことがで
きる）と融合され得る。齧歯類、特に、ネズミの新生Ｂ
−細胞が好ましいけれども、他の哺乳類種、たとえばウ
サギ類、ウシ類、羊類、馬類、豚類、鳥類又は同様のも
のも使用され得、そしてここでこれらの動物は、融合の
ために、リンパ球、特に脾細胞を提供することができ、
そして抗原としてヒトHLA−B27多型部位を認識するであ
ろう。そのモノクローナル抗体は、免疫グロブリンのク
ラス又はサブクラス，たとえばIgM,IgD,IgA,IgG１〜４
又はIgEのいずれかである。IgGは、診断アッセイに使用
される最っとも日常のアイソタイプであるので、そのIg
Gが好ましい。
化され、そしてスクリーンされ、そしてヒトHLA−B27決
定基の多型部位又はプライベート部位に結合することが
できる抗体が細胞上精液中に検出される。次に、適切な
ハイブリッド細胞系は、イン ビトロで増殖され又は腹
水液の生産のために適切な宿主の腹膜腔内に注入され得
る。B27多型部位に対して特異的であることが知られて
いる本発明の抗体を有することによって、その上精液
を、コンペティティブアッセイにおいて対象のモノクロ
ーナル抗体と競争してスクリーンすることができる。従
って、ハイブリッド細胞系は、特定の多型部位に対して
特異的な本発明の抗体の利用可能性に基づく種々の源か
ら容易に産生され得る。他方、対象の多型部位に対して
特異的な抗体を産生するハイブリッド細胞系が利用でき
る場合、これらのハイブリッド細胞系は、他の新生Ｂ−
細胞（ここで、そのような他のＢ−細胞は、受容体をコ
ードするゲノムDNAのために受容菌として働くことがで
きる）と融合され得る。齧歯類、特に、ネズミの新生Ｂ
−細胞が好ましいけれども、他の哺乳類種、たとえばウ
サギ類、ウシ類、羊類、馬類、豚類、鳥類又は同様のも
のも使用され得、そしてここでこれらの動物は、融合の
ために、リンパ球、特に脾細胞を提供することができ、
そして抗原としてヒトHLA−B27多型部位を認識するであ
ろう。そのモノクローナル抗体は、免疫グロブリンのク
ラス又はサブクラス，たとえばIgM,IgD,IgA,IgG１〜４
又はIgEのいずれかである。IgGは、診断アッセイに使用
される最っとも日常のアイソタイプであるので、そのIg
Gが好ましい。
本発明の１つの特定の態様は、B27−陽性ヒトリンパ
系細胞により免疫化されたCB6F1マウスからの脾臓細胞
とNS−１骨髄腫細胞とを融合することによって生成され
たGS145.2と名命されたハイブリッド細胞系である。そ
の融合は、Nowinskiなど.,virology（1979）93:111及び
Hansonなど.,Immunogenetics（1980）10:247に記載して
いるようにして行なわれた。制限希釈法による第１次ス
クリーニング及びクローニングの後、クローンGS145.2
を用いて、BALB/cマウス中に腹水液を産成し、そしてそ
れは、IgG1として特徴づけられ、そしてヒトHLA−B27の
多型決定基に対して特異的である免疫グロブリンを提供
する。
系細胞により免疫化されたCB6F1マウスからの脾臓細胞
とNS−１骨髄腫細胞とを融合することによって生成され
たGS145.2と名命されたハイブリッド細胞系である。そ
の融合は、Nowinskiなど.,virology（1979）93:111及び
Hansonなど.,Immunogenetics（1980）10:247に記載して
いるようにして行なわれた。制限希釈法による第１次ス
クリーニング及びクローニングの後、クローンGS145.2
を用いて、BALB/cマウス中に腹水液を産成し、そしてそ
れは、IgG1として特徴づけられ、そしてヒトHLA−B27の
多型決定基に対して特異的である免疫グロブリンを提供
する。
ハイブリッドDNA技法によれば、本発明の受容体は、
種々の宿主中において産生され得（Boss,など.,Nucl.Ac
id.Res.,12:3791及びWoodなど.,Nature 314:446を参照
のこと），そしてこの両者を引用によりこの明細書中に
組み入れる。たとえば、GS145.2細胞系によって産生さ
れたモノクローナル抗体のＬ鎖及びＨ鎖をコードする遺
伝子から転写されたmRNAは、対象のグローブよりも他の
BALB/cリンパ球からのcDNAを用いる分化cDNAハイブリダ
イゼーションによって単離され得る。ハイブリダイズし
ないGS145.2のmRNAは、所望の免疫グロブリン鎖をコー
ドするメッセンジャーに富んでいるであろう。必要なら
ば、この方法はくり返えされ、所望のmRNAレベルをさら
に増すことができる。次に、減じられたmRNA組成物を逆
転写し、所望の配列のために高められたcDNA混合物を提
供することができる。そのRNAを、適切なRNaseにより加
水分解し、そしてそのssDNAを、DNAポリマラーゼＩ及び
ランダムプライマー、たとえばランダムに断片化された
子牛の胸腺DNAにより二重鎖にした。次に、得られるdsD
NAを、適切なベクター，たとえばウィルスベクター，た
とえばλベクター又はプラスミドベクター（たとえば、
pBR322、pACYC184、等）中に挿入することによってクロ
ーン化することができる。Ｌ鎖及びＨ鎖の不変部のため
に、既知配列に基づくプローブを開発することによっ
て、所望のＬ鎖及びＨ鎖をコードする遺伝子を有するcD
NAクローンを、ハイブリダイゼーションによって同定す
ることができる。その後、その遺伝子を、そのプラスミ
ドから切り出し、開始コドンから上流の不必要なDNAを
取り除くために操作し、そして次に、宿主の形質転換及
びその遺伝子の根本的な発現のために適切なベクター中
に挿入することができる。
種々の宿主中において産生され得（Boss,など.,Nucl.Ac
id.Res.,12:3791及びWoodなど.,Nature 314:446を参照
のこと），そしてこの両者を引用によりこの明細書中に
組み入れる。たとえば、GS145.2細胞系によって産生さ
れたモノクローナル抗体のＬ鎖及びＨ鎖をコードする遺
伝子から転写されたmRNAは、対象のグローブよりも他の
BALB/cリンパ球からのcDNAを用いる分化cDNAハイブリダ
イゼーションによって単離され得る。ハイブリダイズし
ないGS145.2のmRNAは、所望の免疫グロブリン鎖をコー
ドするメッセンジャーに富んでいるであろう。必要なら
ば、この方法はくり返えされ、所望のmRNAレベルをさら
に増すことができる。次に、減じられたmRNA組成物を逆
転写し、所望の配列のために高められたcDNA混合物を提
供することができる。そのRNAを、適切なRNaseにより加
水分解し、そしてそのssDNAを、DNAポリマラーゼＩ及び
ランダムプライマー、たとえばランダムに断片化された
子牛の胸腺DNAにより二重鎖にした。次に、得られるdsD
NAを、適切なベクター，たとえばウィルスベクター，た
とえばλベクター又はプラスミドベクター（たとえば、
pBR322、pACYC184、等）中に挿入することによってクロ
ーン化することができる。Ｌ鎖及びＨ鎖の不変部のため
に、既知配列に基づくプローブを開発することによっ
て、所望のＬ鎖及びＨ鎖をコードする遺伝子を有するcD
NAクローンを、ハイブリダイゼーションによって同定す
ることができる。その後、その遺伝子を、そのプラスミ
ドから切り出し、開始コドンから上流の不必要なDNAを
取り除くために操作し、そして次に、宿主の形質転換及
びその遺伝子の根本的な発現のために適切なベクター中
に挿入することができる。
便利には、完全な免疫グロブリンを生成し、そしてさ
らに、所望により、リーダー配列を含まない免疫グロブ
リンを分泌するために、Ｈ鎖及びＬ鎖を連結するような
鎖を正しくプロセスすることができる哺乳類宿主を使用
することができる。他方、２つの鎖を生成するために単
細胞微生物を使用することができ、そしてここで、Ｈ鎖
をコードする配列の５′末端で開始コドンを提供しなが
ら、分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコードす
るDNA配列を取り除くために、さらに操作が要求され
る。この方法においては、ネズミ細胞よりも他の細胞中
でアセンブリィされ、そしてグリコシル化さえるよう
に、免疫グロブリンを調製し、そしてプロセスすること
ができる。所望により、おのおのの鎖を、可変部を少な
くとも保持するように切断し、そして次に、その領域を
操作し，ヒトHLA−B27多型決定基に対して特異的な他の
受容体を提供することができる。
らに、所望により、リーダー配列を含まない免疫グロブ
リンを分泌するために、Ｈ鎖及びＬ鎖を連結するような
鎖を正しくプロセスすることができる哺乳類宿主を使用
することができる。他方、２つの鎖を生成するために単
細胞微生物を使用することができ、そしてここで、Ｈ鎖
をコードする配列の５′末端で開始コドンを提供しなが
ら、分泌リーダー及びプロセシングシグナルをコードす
るDNA配列を取り除くために、さらに操作が要求され
る。この方法においては、ネズミ細胞よりも他の細胞中
でアセンブリィされ、そしてグリコシル化さえるよう
に、免疫グロブリンを調製し、そしてプロセスすること
ができる。所望により、おのおのの鎖を、可変部を少な
くとも保持するように切断し、そして次に、その領域を
操作し，ヒトHLA−B27多型決定基に対して特異的な他の
受容体を提供することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、現在既知のすべての
B27変異細胞にわたって、ヒトHLA−B27抗原に体するそ
れらの特異性のために特に有用である。他の従来のモノ
クローナル抗体は、いくつかの定位供与体の細胞上で及
びおよそ20％のカウカジマン（Caucasian）供与体の細
胞上でB27を認識しない。また、GS145.2細胞系によって
分泌されたモノクローナル抗体は、診断アッセイ及び他
の利用に容易に導入されるIgGアイソタイプのものであ
る。
B27変異細胞にわたって、ヒトHLA−B27抗原に体するそ
れらの特異性のために特に有用である。他の従来のモノ
クローナル抗体は、いくつかの定位供与体の細胞上で及
びおよそ20％のカウカジマン（Caucasian）供与体の細
胞上でB27を認識しない。また、GS145.2細胞系によって
分泌されたモノクローナル抗体は、診断アッセイ及び他
の利用に容易に導入されるIgGアイソタイプのものであ
る。
本発明のモノクローナル抗体は、広範囲の種類の使
用、すなわちイン ビボ及びイン ビトロの両者で使用
される。イン ビトロ使用に関しては，例によって、モ
ノクローナル抗体が、細胞型を検出するために、B27陽
性細胞を単離するために、不均質混合物の細胞において
B27陽性細胞を選択的に殺すために又は同様のために使
用され得る。診断目的のためには、モノクローナル抗体
を、標識又は非標識のいずれかにすることができる。典
型的には、診断アッセイは、B27抗原へのモノクローナ
ル抗体の結合による複合体の形成の検出を伴う。標識さ
れていない場合、抗体は、凝集アッセイ又は補体−仲介
の細胞毒性アッセイに、又はモノクローナル抗体、たと
えば対象のモノクローナル抗体の特定の宿主種の免疫グ
ロブリンに対して特異的な抗体と反応する他の標識され
ている抗体（第二抗体）と一緒に使用される。広範囲の
種類の標識、たとえば放射性核種，フルオレサー（fluo
rescers）、酸素、酸素基質、酸素補因子、酸素阻害物
質、リガンド（特にヘプテン）、等を使用することがで
きる。多くのタイプの免疫アッセイが利用でき、そして
いくらかはアメリカ特許第3,817,827;3,850,752;3,901,
654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;及び4,
098,876号に記載され、そしてこれらの開示を引用によ
りこの説明書に組み入れる。
用、すなわちイン ビボ及びイン ビトロの両者で使用
される。イン ビトロ使用に関しては，例によって、モ
ノクローナル抗体が、細胞型を検出するために、B27陽
性細胞を単離するために、不均質混合物の細胞において
B27陽性細胞を選択的に殺すために又は同様のために使
用され得る。診断目的のためには、モノクローナル抗体
を、標識又は非標識のいずれかにすることができる。典
型的には、診断アッセイは、B27抗原へのモノクローナ
ル抗体の結合による複合体の形成の検出を伴う。標識さ
れていない場合、抗体は、凝集アッセイ又は補体−仲介
の細胞毒性アッセイに、又はモノクローナル抗体、たと
えば対象のモノクローナル抗体の特定の宿主種の免疫グ
ロブリンに対して特異的な抗体と反応する他の標識され
ている抗体（第二抗体）と一緒に使用される。広範囲の
種類の標識、たとえば放射性核種，フルオレサー（fluo
rescers）、酸素、酸素基質、酸素補因子、酸素阻害物
質、リガンド（特にヘプテン）、等を使用することがで
きる。多くのタイプの免疫アッセイが利用でき、そして
いくらかはアメリカ特許第3,817,827;3,850,752;3,901,
654;3,935,074;3,984,533;3,996,345;4,034,074;及び4,
098,876号に記載され、そしてこれらの開示を引用によ
りこの説明書に組み入れる。
抗体は種々の市販のシステム、たとえば流動微小蛍光
測定器（ここで、螢光接合抗体が単独で又はHLA−抗原
に対して特異的な他の抗体と一緒に使用される）に使用
され得る。典型的には、それらの組織適合性タイプにつ
いて細胞を、計数し、そして選別する。対象のフルオレ
サーは，フルオレセイン，テキサスレッド（Texas re
d），ローダミン，ウンベリフェロン，フィコビリプロ
ティン、ダンシル及び同様のものを含む。
測定器（ここで、螢光接合抗体が単独で又はHLA−抗原
に対して特異的な他の抗体と一緒に使用される）に使用
され得る。典型的には、それらの組織適合性タイプにつ
いて細胞を、計数し、そして選別する。対象のフルオレ
サーは，フルオレセイン，テキサスレッド（Texas re
d），ローダミン，ウンベリフェロン，フィコビリプロ
ティン、ダンシル及び同様のものを含む。
一般的に、本発明のモノクローナル抗体は、酵素免疫
アッセイ（ここで、対象抗体又は異なった種から第二抗
体は酵素に接合される）に使用される。ヒト細胞、たと
えばヒト血液又はその溶解物を含むサンプルが対象の抗
体と共に混合される場合、該抗体とB27抗原を示すそれ
らの細胞（又はタンパク質）との間で結合が生じる。次
に、そのような細胞を、結合材料から分離することがで
き、そして第二抗体（酵素により標識された）を添加す
る。その後、前記細胞に特異的に結合した抗体−抗原接
合体の存在を決定する。当業者に良く知られている他の
従来の技法もまた使用することができる。
アッセイ（ここで、対象抗体又は異なった種から第二抗
体は酵素に接合される）に使用される。ヒト細胞、たと
えばヒト血液又はその溶解物を含むサンプルが対象の抗
体と共に混合される場合、該抗体とB27抗原を示すそれ
らの細胞（又はタンパク質）との間で結合が生じる。次
に、そのような細胞を、結合材料から分離することがで
き、そして第二抗体（酵素により標識された）を添加す
る。その後、前記細胞に特異的に結合した抗体−抗原接
合体の存在を決定する。当業者に良く知られている他の
従来の技法もまた使用することができる。
キットがまた、ヒトHLA細胞タイプの検出に又はB27抗
原の存在のために対象抗体を使用するのに供給され得
る。従って、普通、凍結乾燥形の本発明の対象のモノク
ローナル抗体組成物は、単独で又は他のHLAアロ抗原に
対して特異的な追加抗体と一緒に提供され得る。標識に
接合され得る又は接合され得ない抗体は、緩衝液、たと
えばTris,リン酸塩、炭酸塩、等，安定剤，殺生剤、不
活性タンパク質、たとえば牛血清アルブミン又は同様の
ものを含むキットに含まれる。一般的に、これらの材料
は、活性抗体の量を基準に約５重量％よりも少ない量
で、そして抗体濃度を再び基準に少なくとも約0.001重
量％の合計量で普通存在するであろう。しばしば、活性
成分を希釈するために不活性増量剤又は付形剤（ここで
該付形剤は、合計組成物の約１〜99重量％で存在するこ
とができる）を含むことが好ましいであろう。モノクロ
ーナル抗体と結合できる第二抗体が使用される場合、こ
れは普通別々のバイアル中に存在するであろう。その第
二抗体は、典型的には標識に接合され、そして上に記載
された抗体配合と類似する方法で配合される。
原の存在のために対象抗体を使用するのに供給され得
る。従って、普通、凍結乾燥形の本発明の対象のモノク
ローナル抗体組成物は、単独で又は他のHLAアロ抗原に
対して特異的な追加抗体と一緒に提供され得る。標識に
接合され得る又は接合され得ない抗体は、緩衝液、たと
えばTris,リン酸塩、炭酸塩、等，安定剤，殺生剤、不
活性タンパク質、たとえば牛血清アルブミン又は同様の
ものを含むキットに含まれる。一般的に、これらの材料
は、活性抗体の量を基準に約５重量％よりも少ない量
で、そして抗体濃度を再び基準に少なくとも約0.001重
量％の合計量で普通存在するであろう。しばしば、活性
成分を希釈するために不活性増量剤又は付形剤（ここで
該付形剤は、合計組成物の約１〜99重量％で存在するこ
とができる）を含むことが好ましいであろう。モノクロ
ーナル抗体と結合できる第二抗体が使用される場合、こ
れは普通別々のバイアル中に存在するであろう。その第
二抗体は、典型的には標識に接合され、そして上に記載
された抗体配合と類似する方法で配合される。
前もって示されたように、HLA−B27に関する個人のタ
イプを検出することは、種々のリウマチ疾患の可能性を
診断するためにひじょうに有用である。当業者は、本発
明のモノクローナル抗体がまた、多くの追加方法、たと
えばアフィニティークロマトグラフィー,B27抗原の精
製，そのような抗原を欠く細胞からB27抗原を含む細胞
の分離（典型的には細胞障害性反応を含む）及び同等の
ものに使用されるであうことを理解するであろう。Immu
nological Methods,第Ｉ及びII巻,Lefkovits,I.及びPer
nis,V.,Academic Press,ニューヨーク（1979及び198
1）；及びHandbook of Experimental Immunology,Weir,
D.,Blackwell Scientific Publications,セントルイ
ス，ミズリィ（1978）を一般的に参照のこと。そしてこ
の両者を、引用により明細書中に組み入れる。
イプを検出することは、種々のリウマチ疾患の可能性を
診断するためにひじょうに有用である。当業者は、本発
明のモノクローナル抗体がまた、多くの追加方法、たと
えばアフィニティークロマトグラフィー,B27抗原の精
製，そのような抗原を欠く細胞からB27抗原を含む細胞
の分離（典型的には細胞障害性反応を含む）及び同等の
ものに使用されるであうことを理解するであろう。Immu
nological Methods,第Ｉ及びII巻,Lefkovits,I.及びPer
nis,V.,Academic Press,ニューヨーク（1979及び198
1）；及びHandbook of Experimental Immunology,Weir,
D.,Blackwell Scientific Publications,セントルイ
ス，ミズリィ（1978）を一般的に参照のこと。そしてこ
の両者を、引用により明細書中に組み入れる。
本発明の他の特徴及び利点は、次の実験記載（これ
は、例によって本発明を説明する）から明らかになるで
あろう。この例は制限的でなく例示的に示されている。
は、例によって本発明を説明する）から明らかになるで
あろう。この例は制限的でなく例示的に示されている。
実 験 モノクローナル抗体GS145.sの製造 CB6F1マウスを、強直性脊椎炎の患者から確立された
Ｂリンパ芽球細胞上のHLA B27抗原により免疫化する。
マウスを、一定の32日間別々にアジュバンドなしで２回
の皮下注射によって免疫化した。最後の注射の後３日間
で脾臓を取り出した。
Ｂリンパ芽球細胞上のHLA B27抗原により免疫化する。
マウスを、一定の32日間別々にアジュバンドなしで２回
の皮下注射によって免疫化した。最後の注射の後３日間
で脾臓を取り出した。
免疫化したマウスからの脾性Ｂリンパ球を、40％（W/
V）ポリエチレングリコールを用いてMS1−１骨髄腫細胞
と融合した〔Kohler及びMiLstein、Nature,256:495（19
75）〕。融合の後、その細胞混合物を、ハイブリッド細
胞の増殖について選択するためにHAT培地（20％牛血清,
1×10-4Mのヒポキサンチン,4×10-7Mのアミノタンパク
質及び1.6×10-5Mのチミジンにより補足されたRPMI−16
40培地）中に再懸濁し、そして次に１〜３×106細胞/ml
の濃度で96−ウェルマイクロ培養トレイ中に分配した。
V）ポリエチレングリコールを用いてMS1−１骨髄腫細胞
と融合した〔Kohler及びMiLstein、Nature,256:495（19
75）〕。融合の後、その細胞混合物を、ハイブリッド細
胞の増殖について選択するためにHAT培地（20％牛血清,
1×10-4Mのヒポキサンチン,4×10-7Mのアミノタンパク
質及び1.6×10-5Mのチミジンにより補足されたRPMI−16
40培地）中に再懸濁し、そして次に１〜３×106細胞/ml
の濃度で96−ウェルマイクロ培養トレイ中に分配した。
B27に対する抗体を産生する細胞を、ヒト白血球への
結合を測定する酵素結合のマイクロ免疫アッセイによっ
て同定した（下を参照のこと）。そのハイブリッド細胞
系を、支持細胞として同系の胸腺細胞を用いて、限界希
釈法による３循環のクローニング（three cycles of cl
oning）によって確立した。その細胞系を1985年６月28
日A.T.C.C.に寄託して、そして寄託番号HB8856を得た。
結合を測定する酵素結合のマイクロ免疫アッセイによっ
て同定した（下を参照のこと）。そのハイブリッド細胞
系を、支持細胞として同系の胸腺細胞を用いて、限界希
釈法による３循環のクローニング（three cycles of cl
oning）によって確立した。その細胞系を1985年６月28
日A.T.C.C.に寄託して、そして寄託番号HB8856を得た。
モノクローナル抗体タンパク質を、イオン交換してク
ロマトグラフィーを用いて腹水液から従来の方法によっ
て単離した。１〜４週早くプリスタンの腹膜内注入によ
り感作された有性生殖マウスの腹水腔にハイブリドーマ
細胞を増殖することによって腹水液を、得た。モノクロ
ーナル抗体のアイソタイプは標準方法に従ってELISAに
よって決定された。
ロマトグラフィーを用いて腹水液から従来の方法によっ
て単離した。１〜４週早くプリスタンの腹膜内注入によ
り感作された有性生殖マウスの腹水腔にハイブリドーマ
細胞を増殖することによって腹水液を、得た。モノクロ
ーナル抗体のアイソタイプは標準方法に従ってELISAに
よって決定された。
細胞パネル GS145.2の特異性を、40人の正常な人からのＴリンパ
球のパネル並びに10人の強直性脊椎炎患者及び15人の正
常な人からのＢリンパ芽球細胞系のパネルに対する反応
性を検定することによって測定した。個々の供与体のHL
Aタイプを、通常のマイクロ細胞毒性アッセイ（microcy
totcxicity assay）を用いて、インディペンデントリフ
ァーレンスHLAラボラトリィ（independent reference H
LA laboratory）で決定した。Ｔリンパ球を、Ficoll−H
ypaque及びナイロンウールによる通過を含む密度勾配遠
心法によって末梢血液から得た〔Danilovsなど.,8th In
ternational Histocompatibility Workshop Newsletter
（1978）６:3〕。Ｂリンパ芽球系を、Epstein−Barrウ
ィルスにより形質転換された末梢Ｂリンパ球から得た。
球のパネル並びに10人の強直性脊椎炎患者及び15人の正
常な人からのＢリンパ芽球細胞系のパネルに対する反応
性を検定することによって測定した。個々の供与体のHL
Aタイプを、通常のマイクロ細胞毒性アッセイ（microcy
totcxicity assay）を用いて、インディペンデントリフ
ァーレンスHLAラボラトリィ（independent reference H
LA laboratory）で決定した。Ｔリンパ球を、Ficoll−H
ypaque及びナイロンウールによる通過を含む密度勾配遠
心法によって末梢血液から得た〔Danilovsなど.,8th In
ternational Histocompatibility Workshop Newsletter
（1978）６:3〕。Ｂリンパ芽球系を、Epstein−Barrウ
ィルスにより形質転換された末梢Ｂリンパ球から得た。
HLA抗原に結合するモノクローナル抗体を検出するため
のマイクロ−酸素−結合のイムノソルベントアッセイ
（ELISA） このアッセイは、HLA−B27抗原に対する抗体を分泌す
るハイブリドーマを同定するするために間接的な方法で
使用された。テラサキマイクロトレイを、リン酸緩衝溶
液（PBS）中１μg/mlのポリ−Ｌ−リシン溶液の５μ
をおのおののウェルに添加することによって調整した。
そのプレートを１時間37℃でインキュベートし、そして
浸し、そしてデカントすることによってPBSにより洗浄
した。ヒトリンパ球を、おのおののウェル中に分配し
た。：核ウェルは、血清を含まないRPMI−1640培地の1m
l当り１〜５×106の細胞の懸濁液の１μを含む。その
プレートを90gで３分間遠心分離した。0.2％アジ化物を
含むPBS中１％牛血清アルブミン（BSA）の溶液を、プレ
ートに添加し、そして次にそれを４℃で１〜48時間貯蔵
した。抗体を添加する前、そのプレートを３度洗浄し
た。
のマイクロ−酸素−結合のイムノソルベントアッセイ
（ELISA） このアッセイは、HLA−B27抗原に対する抗体を分泌す
るハイブリドーマを同定するするために間接的な方法で
使用された。テラサキマイクロトレイを、リン酸緩衝溶
液（PBS）中１μg/mlのポリ−Ｌ−リシン溶液の５μ
をおのおののウェルに添加することによって調整した。
そのプレートを１時間37℃でインキュベートし、そして
浸し、そしてデカントすることによってPBSにより洗浄
した。ヒトリンパ球を、おのおののウェル中に分配し
た。：核ウェルは、血清を含まないRPMI−1640培地の1m
l当り１〜５×106の細胞の懸濁液の１μを含む。その
プレートを90gで３分間遠心分離した。0.2％アジ化物を
含むPBS中１％牛血清アルブミン（BSA）の溶液を、プレ
ートに添加し、そして次にそれを４℃で１〜48時間貯蔵
した。抗体を添加する前、そのプレートを３度洗浄し
た。
ウェル当り１μのモノクローナル抗体を添加した。
室温で１時間後、そのプレートを５度洗浄し、そしてホ
ースラディシュペルオキシダーゼ（HRP）により結合さ
れた抗−免疫グロブリンのＦ（ab′）２フラグメントの
溶液をウェル当り５μで添加した。次に、そのプレー
トを室温で30〜60分間インキュベートした。
室温で１時間後、そのプレートを５度洗浄し、そしてホ
ースラディシュペルオキシダーゼ（HRP）により結合さ
れた抗−免疫グロブリンのＦ（ab′）２フラグメントの
溶液をウェル当り５μで添加した。次に、そのプレー
トを室温で30〜60分間インキュベートした。
抗体による処理の後、そのトレイを５度洗浄した。ウ
ェル中におけるHRP−抗体複合体の存在を、pH4.2で0.1M
クエン酸ナトリウム中基質、過酸化水素及びクロマゲ
ン、すなわちABTS （Boehringer−Mannheim Biochemic
als、インディアナポリス，インディアナ）の溶液の添
加によって見えるようにした。室温で30〜60分のインキ
ュベーションの後、ウェル中の色の進展が、これらのウ
ェル中において白血球へのモノクローナル抗体の結合を
示した。
ェル中におけるHRP−抗体複合体の存在を、pH4.2で0.1M
クエン酸ナトリウム中基質、過酸化水素及びクロマゲ
ン、すなわちABTS （Boehringer−Mannheim Biochemic
als、インディアナポリス，インディアナ）の溶液の添
加によって見えるようにした。室温で30〜60分のインキ
ュベーションの後、ウェル中の色の進展が、これらのウ
ェル中において白血球へのモノクローナル抗体の結合を
示した。
標識されたHLA抗原の免疫沈殿法によるモノクローナル
抗体の特異性の分析 リンパ芽球細胞の膜タンパク質を、ラクトペルオキシ
ダーゼを用いて125Iにより標識した〔Vitettaなど.,J.E
xp.Med.（1971）134:242〕。細胞を、0.5％Nonidet P−
40（Sigma Chemical Compang）を含む緩衝液により破壊
し、そして対照抗体及び固相免疫吸着剤の添加の前及び
後で、遠心分離することによって透明にした。モノクロ
ーナル抗体を、溶解物のアリコート及び固相に結合され
たマウス免疫グリブリンに対するウサギ抗体を用いて沈
殿された標識抗原と抗体との複合体のアリコートに添加
した。広範囲にわたって洗浄した後、その標識された抗
原を、ポリアクリルアミドゲルのLaemmli電気泳動法〔N
ature,227:680〜685（1970）〕のために要求されるよう
な又はYangなど.,Immunogenetics,19:217〜231（1984）
のエレクトロフォーカシングゲル電気泳動法のために規
定されるようないづれかのサンプル電気泳動緩衝液の添
加によって離した。電気泳動を、おのおのの方法に従っ
て行なった。乾燥ゲル中の標識されたタンパク質を、オ
ートラジオグラフィーによって同定した。
抗体の特異性の分析 リンパ芽球細胞の膜タンパク質を、ラクトペルオキシ
ダーゼを用いて125Iにより標識した〔Vitettaなど.,J.E
xp.Med.（1971）134:242〕。細胞を、0.5％Nonidet P−
40（Sigma Chemical Compang）を含む緩衝液により破壊
し、そして対照抗体及び固相免疫吸着剤の添加の前及び
後で、遠心分離することによって透明にした。モノクロ
ーナル抗体を、溶解物のアリコート及び固相に結合され
たマウス免疫グリブリンに対するウサギ抗体を用いて沈
殿された標識抗原と抗体との複合体のアリコートに添加
した。広範囲にわたって洗浄した後、その標識された抗
原を、ポリアクリルアミドゲルのLaemmli電気泳動法〔N
ature,227:680〜685（1970）〕のために要求されるよう
な又はYangなど.,Immunogenetics,19:217〜231（1984）
のエレクトロフォーカシングゲル電気泳動法のために規
定されるようないづれかのサンプル電気泳動緩衝液の添
加によって離した。電気泳動を、おのおのの方法に従っ
て行なった。乾燥ゲル中の標識されたタンパク質を、オ
ートラジオグラフィーによって同定した。
フルオレセンス−活性化細胞ソーター（FACS）を用い
て、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）により
標識されたモノクローナル抗体の特異性の分析 腹水から単利されたモノクローナル抗体を、Godingの
方法〔Goding,J.Immunol.Methods（1976）13:215〕に従
ってFITCに接合した。分析されるべき細胞を、FITC−接
合の抗体の飽和量と共に混合し、そして４℃で30分間イ
ンキュベートした。処理された細胞を洗浄し、そして対
数増幅器を装置したFACS IV（Becton−Dicknson）上で
試験抗体及び対照抗体と共にインキュベートされた細胞
のフルオレセンス度（平均法）を比較することによっ
て，その結合した抗体の量を査定した。
て、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）により
標識されたモノクローナル抗体の特異性の分析 腹水から単利されたモノクローナル抗体を、Godingの
方法〔Goding,J.Immunol.Methods（1976）13:215〕に従
ってFITCに接合した。分析されるべき細胞を、FITC−接
合の抗体の飽和量と共に混合し、そして４℃で30分間イ
ンキュベートした。処理された細胞を洗浄し、そして対
数増幅器を装置したFACS IV（Becton−Dicknson）上で
試験抗体及び対照抗体と共にインキュベートされた細胞
のフルオレセンス度（平均法）を比較することによっ
て，その結合した抗体の量を査定した。
結 果 一連の免疫化及び融合を、上に記載しているようにし
て行ない、HLA−B27に対するモノクローナル抗体を生成
した。GS145.2を、スクリーンされたおよそ8000のうち
の１つのウェルから選択した。GS145.2によって産生さ
れた抗体は、IgG1アイソタイプのものであることが決定
された。
て行ない、HLA−B27に対するモノクローナル抗体を生成
した。GS145.2を、スクリーンされたおよそ8000のうち
の１つのウェルから選択した。GS145.2によって産生さ
れた抗体は、IgG1アイソタイプのものであることが決定
された。
GS145.2の特異性は、マイクロエリサアッセイ（micro
elisa assay）を用いて決定した。それが、強直性脊椎
炎患者又は正常な人からの25のＢ−リンパ芽球細胞系
に、及びＢ−27又はB27と交差反応することが知られて
いる対立遺伝子の発現のために選択された40人の正常な
人からのＴ細胞に試験された。GS145.2は、B27を発現す
るすべての細胞と反応した。25のＴ細胞に対するマイク
ロエリサアッセイの効果を第１表に示す。
elisa assay）を用いて決定した。それが、強直性脊椎
炎患者又は正常な人からの25のＢ−リンパ芽球細胞系
に、及びＢ−27又はB27と交差反応することが知られて
いる対立遺伝子の発現のために選択された40人の正常な
人からのＴ細胞に試験された。GS145.2は、B27を発現す
るすべての細胞と反応した。25のＴ細胞に対するマイク
ロエリサアッセイの効果を第１表に示す。
GS145.2は、HLA−B27を発現する７人のうちの７人か
らのＴ細胞と反応した。他の細胞は陽性を示さなかっ
た。陰性の細胞は、B7（３）,B47（１）,B60（３）,B17
（６）,B22（２）又はA32（４）を発現する細胞を包含
した。これらのHLA−Ｂ対立遺伝子は、いくらかのアロ
抗血清又はB27に対する他のモノクローナル抗体により
陽性として試験をもたらす。
らのＴ細胞と反応した。他の細胞は陽性を示さなかっ
た。陰性の細胞は、B7（３）,B47（１）,B60（３）,B17
（６）,B22（２）又はA32（４）を発現する細胞を包含
した。これらのHLA−Ｂ対立遺伝子は、いくらかのアロ
抗血清又はB27に対する他のモノクローナル抗体により
陽性として試験をもたらす。
GS145.2の特異性をまた、間接的免疫螢光アッセイで
試験した。使用される細胞は、１つのハプロタイプに対
してB27を発現するＢ−リンパ芽球細胞系（T51），低レ
ベルのB27を発現するＢ−リンパ芽球細胞系に由来した
突然変異細胞系（4.59.8）及びB27を発現しない無関係
な細胞系（MRO）であった。GS145.2又は対照抗体の結合
を、マウス免疫グロブリンに対する螢光化された抗体を
用いて検出し、そして対数増幅器を装置されたFACS IV
細胞ソーター（Becton−Dickinson、マウンテンヴィュ
ウ、カリフォルニア）により分析した。その結果を第２
表に示す。その陽性細胞は、１つの不均斉ピークに分布
された。GS145.2と反応される場合、B27陽性細胞は、低
レベルのB27を発現する突然変異細胞よりも100チャンネ
ル明るかった。
試験した。使用される細胞は、１つのハプロタイプに対
してB27を発現するＢ−リンパ芽球細胞系（T51），低レ
ベルのB27を発現するＢ−リンパ芽球細胞系に由来した
突然変異細胞系（4.59.8）及びB27を発現しない無関係
な細胞系（MRO）であった。GS145.2又は対照抗体の結合
を、マウス免疫グロブリンに対する螢光化された抗体を
用いて検出し、そして対数増幅器を装置されたFACS IV
細胞ソーター（Becton−Dickinson、マウンテンヴィュ
ウ、カリフォルニア）により分析した。その結果を第２
表に示す。その陽性細胞は、１つの不均斉ピークに分布
された。GS145.2と反応される場合、B27陽性細胞は、低
レベルのB27を発現する突然変異細胞よりも100チャンネ
ル明るかった。
GS145.2がB27に結合したという確証は、放射性免疫沈
殿法、次にポリアクリルアミドケル中での等電点分画電
気泳動によって提供され、そしてそれによって標識され
たタンパク質を見えるようにした。HLA抗原の源として
使用されるＢ細胞系は、AS4（B27,38）及びAS6（B27,4
0）であった。B27に対応するバンドのみがGS145.2沈殿
物中に存在した。
殿法、次にポリアクリルアミドケル中での等電点分画電
気泳動によって提供され、そしてそれによって標識され
たタンパク質を見えるようにした。HLA抗原の源として
使用されるＢ細胞系は、AS4（B27,38）及びAS6（B27,4
0）であった。B27に対応するバンドのみがGS145.2沈殿
物中に存在した。
前記から、本発明の細胞系がヒトHLA−B27抗原に対し
て特異的であるが、しかし他のHLA抗原と実質的に交差
反応しないモノクローナル抗体及び他の受容体を提供す
ることが所望される。これは、密接に関係する他の抗原
（たとえば、対立遺伝子）の存在下で細胞上でこの抗原
を検出することができる感受性アッセイの開発を可能に
する。さらに、その細胞系は、多量の受容体を容易に且
つ経済的に産生する方法を提供し、そしてそれはイムノ
アッセイ、免疫組織化学的染色法、免疫吸着法及び細胞
別法に使用される。
て特異的であるが、しかし他のHLA抗原と実質的に交差
反応しないモノクローナル抗体及び他の受容体を提供す
ることが所望される。これは、密接に関係する他の抗原
（たとえば、対立遺伝子）の存在下で細胞上でこの抗原
を検出することができる感受性アッセイの開発を可能に
する。さらに、その細胞系は、多量の受容体を容易に且
つ経済的に産生する方法を提供し、そしてそれはイムノ
アッセイ、免疫組織化学的染色法、免疫吸着法及び細胞
別法に使用される。
前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ例的
にいくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の
範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。
にいくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の
範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/395 (Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ
Claims (16)
- 【請求項１】ヒトHLA−B27抗原に対して特異的で且つ他
のHLA抗原と実質的に交差反応しないモノクローナル抗
体、又は検出できるシグナルを提供できるラベルに接合
されている前記抗体の誘導体。 - 【請求項２】前記モノクローナル抗体がマウスからであ
る特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】前記モノクローナル抗体をATCC寄託番号HB
−8856と指定された細胞系から得る特許請求の範囲第２
項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】ATCC寄託番号HB−8856由来のモノクローナ
ル抗体と交差反応する特許請求の範囲第１項記載のモノ
クローナル抗体。 - 【請求項５】前記抗体がIgGクラスからである特許請求
の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項６】前記モノクローナル抗体が、ATCC寄託番号
HB−8856と指定されたハイブリッド細胞系に由来し、そ
してマウスIgG1イソタイプからである特許請求の範囲第
１項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項７】前記ラベルがフルオレサー（蛍光体）であ
る特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項８】前記ラベルが酵素である特許請求の範囲第
６項記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項９】HLA−B27抗原を有するヒト細胞の存在を検
出するための方法であって、ヒトHLA−B27抗原に対して
特異的で且つ他のHLA抗原と実質的に交差反応しないモ
ノクローナル抗体、又は検出できるシグナルを提供でき
るラベルに接合されている前記抗体の誘導体とヒト細胞
とを組み合せ、そして複合形成体を検出することを含ん
で成る方法。 - 【請求項１０】前記複合形成体を補体仲介の溶菌によっ
て検出する特許請求の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１１】HLA−B27抗原を有するヒト細胞の存在を
検出することに使用のためのキットであって、ヒトHLA
−B27抗原に対して特異的で且つ他のHLA抗原と実質的に
交差反応しないモノクローナル抗体を含んで成り、そし
てここで該モノクローナル抗体又は該モノクローナル抗
体と反応する第二抗体のいずれかを、検出可能なシグナ
ルを提供するラベルに接合することを含んで成るキッ
ト。 - 【請求項１２】ヒトHLA−B27抗原に対して特異的なモノ
クローナル抗体を調整するための方法であって、抗−ヒ
トHLA−B27抗原抗体産生細胞及び融合パートナー細胞を
融合し、ハイブリッド細胞系を形成し、該ハイブリッド
細胞系を増殖し、そして該ハイブリッド細胞系によって
産生された抗体を集め、ここで、前記抗体は他のヒトHL
A抗原と実質的に交差反応しないことを特徴とする方
法。 - 【請求項１３】前記抗体産生細胞が脾臓又はリンパ節か
ら得られたＢリンパ球である特許請求の範囲第12項記載
の方法。 - 【請求項１４】前記ハイブリッド細胞系をイン ビボ又
はイン ビトロにより増殖する特許請求の範囲第12項記
載の方法。 - 【請求項１５】前記融合パートナー細胞が骨髄腫細胞又
はハイブリッド細胞である特許請求の範囲第12項記載の
方法。 - 【請求項１６】前記ハイブリッド細胞系が、ATCC寄託番
号HB−8856と指定されたハイブリッド細胞系である特許
請求の範囲第12項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US76673985A | 1985-08-16 | 1985-08-16 | |
| US766739 | 1985-08-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6240297A JPS6240297A (ja) | 1987-02-21 |
| JP2536851B2 true JP2536851B2 (ja) | 1996-09-25 |
Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2536851B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340610C (ja) |
| DE (1) | DE3650327T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104169302A (zh) * | 2012-04-02 | 2014-11-26 | 瑞泽恩制药公司 | 抗-hla-b*27抗体及其用途 |
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|---|---|---|---|---|
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| US5633132A (en) * | 1994-04-28 | 1997-05-27 | Immunova Ltee | Determination of the presence of an antigen, particularly HLA-B27 antigen, at the surface of a cell, particularly lymphocytes, by cytotoxicity test combined with fluorescent staining |
| CN101775372B (zh) * | 2009-12-02 | 2012-01-11 | 桂耀庭 | 一种抗睾丸hT279蛋白的抗体或抗体片段及其应用 |
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| JPS6225994A (ja) * | 1985-05-30 | 1987-02-03 | ジエネテイツク システムズ コ−ポレイシヨン | Ｈｌａタイプ分け用モノクロ−ナル抗体 |
| DE3545576A1 (de) * | 1985-11-28 | 1987-07-02 | Behringwerke Ag | Hla-b 27, dafuer codierende genomische dna und ihre verwendung |
| AU590405B2 (en) * | 1986-02-26 | 1989-11-02 | University Of Melbourne, The | Hla-b27 testing |
-
1986
- 1986-08-11 DE DE19863650327 patent/DE3650327T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-11 EP EP86306175A patent/EP0213824B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-11 CA CA 515682 patent/CA1340610C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-08-15 JP JP61190688A patent/JP2536851B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104169302A (zh) * | 2012-04-02 | 2014-11-26 | 瑞泽恩制药公司 | 抗-hla-b*27抗体及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0213824A3 (en) | 1989-03-22 |
| DE3650327T2 (de) | 1996-01-04 |
| JPS6240297A (ja) | 1987-02-21 |
| CA1340610C (en) | 1999-06-29 |
| DE3650327D1 (de) | 1995-06-29 |
| EP0213824B1 (en) | 1995-05-24 |
| EP0213824A2 (en) | 1987-03-11 |
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