CN102154527A - 一种快速检测耐多药结核病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测耐多药结核病的方法，包括如下步骤：痰标本的前处理；提取DNA；多重PCR及产物标记；制备载有常见耐药菌株特异性核酸探针的低密度核苷酸薄膜；筛选出15个特异的针对rpoB基因、katG基因的野型及突变型的寡核苷酸探针，这种探针在5’末端含有一个氨基；一个人类基因组探针β-globin，一个生物素探针Biotin；核酸薄膜导流杂交；结果分析：计算所有n/a点的平均密度作为背景密度，B1的密度为阳性密度，按照公式0.12×（阳性密度-背景密度）+背景密度计算密度临界值；低于该临界值的密度判断为杂交阴性，高于该临界值的密度判断为杂交阳性。本方法操作简单、快速、经济、敏感且特异性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种检测耐药结核菌株的方法。
背景技术
结核病（Tuberculosis, TB）是严重危害人类健康的传染病，已成为全球重大公共卫生问题和社会问题。迄今为止，全世界已有三分之一的人口感染结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis，M.tb），仅2007年就有927万新发病例。全球每年新增耐多药结核病（Multi-drug Resistant Tuberculosis, MDR-TB） 患者超过50万人，但被检测出来的仅有不到5%，获得规范治疗的不到3%。此外，MDR-TB在治疗过程中也可能衍生成更难治疗的广泛耐药结核病（Extremely Drug Resistant Tuberculosis, XDR-TB）。MDR-TB和XDR-TB的出现与传播，使TB治疗难度加大，疫情加重，已成为全球TB控制工作中最为棘手的难题之一。
对MDR-TB的早发现、早诊断、早治疗能够提高患者治愈率，减少传染源，较好地控制结核分枝杆菌的传播与扩散，从而降低结核病对社会及国家产生的危害。 MDR-TB是指结核病患者感染的结核分枝杆菌体外被证实至少对异烟肼、利福平同时耐药，因此，检测结核分枝杆菌对异烟肼和利福平的耐药性对MDR-TB的诊断尤为重要，常用的方法有：1）传统培养法：操作繁琐且耗时长，从临床标本分离出结核分枝杆菌的时间通常≥6周，而要获得菌型鉴别和药敏结果则须再耗时4周，因此不利于MDR-TB的早发现及早诊断；2）自动化快速培养法：快速（1～2周）、可靠、安全，但是需要昂贵的仪器设备；3）聚合酶链式反应-单链构想多态性分析法（PCR-SSCP法）：其影响因素较多（DNA片段长度、凝胶浓度等），可重复性较差，且不能确定突变的位置及形式，在临床工作中也未得到广泛应用；4）RT-PCR法：检测位点单一，对检测条件要求高，限制其推广；5）DNA测序法：是目前判断基因突变及突变类型的金标准，结果可靠，可重复性好，操作快速简洁，可作为判断M.tb耐药基因突变型的方法之一供临床使用，但是该方法需要DNA序列测定仪，使得很多医院无法把该方法作为临床鉴定M.tb是否耐药的常规检查手段，且DNA序列分析图谱结果不够直观，需要专业人员对图谱分析后才能获得结果，耗费人力物力；6）寡核苷酸探针杂交法：是检测耐药基因突变的一种快速简洁的方法，但结果存在一定得假阴性率和假阳性率，且试剂价格相对昂贵，目前已有该方法检测M.tb耐药性的研究，但尚未得到临床推广；7）基因芯片法：虽然具有时限短、所需样本少、热循环和冷却效率高等优点，但因分析软件要求高，芯片的制作成本高等缺点极大地限制其应用；8）基于PCR的斑点杂交方法：已报道用来检测耐异烟肼、利福平、链霉素、和乙胺丁醇结核菌6个基因中的8个密码子，结果表明基于PCR的斑点杂交方法可以有效的检测耐药菌的突变，并且成本很低，但敏感性较低。
总之，以杂交技术为基础的检测方法较其他方法更有应用前景，但传统的或逆向的杂交技术退火效率较低，造成的原因有：（1）大量的杂交液需要覆盖于一个完整的膜上，因此，结合到目标DNA的探针浓度很低。由于杂交过程是各个分子相互碰撞的过程，这样的稀释将极大的影响探针在膜上结合到靶片段的效率。（2）在孵育期间，溶液中的探针没有接触到膜会增加其他游离的片段自身打折形成DNA互补链，因此，有效浓度的进一步减小和杂交时间延长导致了杂交DNA的减少，这使得杂交率下降。（3）在杂交过程中，容易结合的往往是那些固定在膜表面的片段，并且，实际上仅有很小的一部分靶DNA的片段是朝向外部的，由于膜上有孔，孔的直径大小一般是0.1-0.45微米，因此在固定过程中许多的DNA片段被固定在膜的孔里面。由于探针进入膜孔的弥散能力降低，因此靶DNA片段退火效率进一步降低，即使延长孵育的时间，上述这些因素仍导致其敏感性降低。除此之外，此类方法通常需要在玻璃管或塑料容器中反应，并且需要将其放在水浴或杂交箱内使其保持适宜的温度，往往需要数小时到数天的时间来完成杂交过程。
导流杂交技术是一种低密度微阵序列的发展，具有快速、价廉及操作简便等特点。导流杂交技术的主要原理是主动地将目标分子穿过薄膜载体上的小孔，加速两条互补链形成双链分子，从而提高杂交效率，将杂交时间从数小时缩短为数分钟，比传统的杂交方法速度提高了数百倍。互补的核酸分子产生杂交复合物的同时，游离的DNA分子则穿过薄膜后被清除，增加了杂交的敏感性和特异性。该技术既省时又节约反应物，在成本上远低于基因芯片，在操作上远优于传统杂交法，具有在临床上广泛推广与应用的前景。
在结核病疫情加重尤其是MDR-TB日益增多的今天，结核病的预防控制工作面临严峻的挑战，寻求和发展一种可靠易行、成本低廉，且能快速检测M.tb及其耐药性的实验方法已迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种操作简单、快速、经济、敏感且特异性高的快速检测耐多药结核病的方法。
一种快速检测耐多药结核病的方法，包括如下步骤：
（1）痰标本的前处理
采用碱处理—直接法；
（2）DNA提取
将前处理后的痰标本于80℃水浴30min, 12000rpm离心5min,弃上清，留取沉淀备用；CTAB法提取DNA；用核酸蛋白测定仪检测浓度，将DNA稀释至2.5ng/ml 置于0.5ml EP管中，-20℃保存备用；
（3）多重PCR及产物标记
在单一PCR反应试管里同时加入多对引物，在同一时间内扩增出多个产物的PCR；扩增rpoB基因的上下游引物为5’- CCAGGACGTGGAGGCGATCAC -3’, 5’- CTAACCACGCCGTCGACCACC -3’;扩增katG基因的上下游引物为：5’- TATGGGCCTGATCTACGT -3’, 5’- CGGTGCCCTGCGCCATCGGT -3’； 引物合成时在5’端进行生物素化；反应体系：5×PCR缓冲液，5μl；25mM MgCl，2μl；10mM dNTPs，0.5μl；25uM Biotin-KatG-F及Biotin-RpoB-F，各0.5μl；25uM Biotin-KatG-R及Biotin-RpoB-R，各0.5μl；Go-Taq DNA聚合酶，0.25μl；2.5ng/μL TB DNA模板，1μl；ddH2O，14.25μl；扩增程序：94℃5 min； 94℃1 min，60℃1 min，72℃1 min，共35个循环；72℃10 min；
（4）制备载有常见耐药菌株特异性核酸探针的低密度核苷酸薄膜
筛选出15个特异的针对rpoB基因、katG基因的野型及突变型的寡核苷酸探针，这种探针在5’末端含有一个氨基；一个人类基因组探针β-globin，一个生物素探针Biotin； 除外生物素探针外的16种探针序列为：WT513，5’-TC CAT GAA TTG GCT CAG CT-3’； Q513E，5’-TC CAT GAA TTC GCT CAG CT-3’； WT516，5’-AA TTC ATG GTC CAG AAC AA-3’； D516V，5’-AA TTC ATG GAC CAG AAC AA-3’； WT526，5’-GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA-3’；H526Y，5’-GGG TTG ACC TAC AAG CGC CGA-3’； H526D，5’-GGG TTG ACC GAC AAG CGC CGA-3’； WT531，5’-CGC CGA CTG TCG GCG CTG GGG-3’； S531L，5’-CGC CGA CTG TTG GCG CTG GGG-3’； S531W，5’-CGC CGA CTG TGG GCG CTG GGG-3’； WT315，5’-TC GAT GCC GCT GGT GAT CG-3’； S315T①，5’-TC GAT GCC GGT GGT GAT CG-3；S315T②，5’-TC GAT GCC TGT GGT GAT CG-3’； FWT505，5’-GT GCC GAA GAA CTC CTT GA-3’； NWT518，5’-AG CGG GTT GTT CTG GTC CA-3’； β-Globin，5’-AC CAC CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC-3’；
膜的微阵序列制备过程如下：裁剪出0.5cm×0.5cm大小的不带电荷的尼龙膜，用铅笔按表1行标记；将标记好的尼龙膜浸入6×SSC中10分钟，备用；将合成的探针稀释为2.5-5.0μM,按表1用加样器进行点样，每个探针上样量为0.5-1.5μl；小心取下膜，置于TE缓冲液饱和的滤纸上，DNA面向上，10cm紫外灯下固定3-7min；立即用于杂交或在蒸馏水中浸洗，晾干后室温保存备用；
（5）核酸薄膜导流杂交
将标记的PCR产物与构建的载有常见耐药菌株特异性核酸探针的低密度薄膜进行分子杂交来检测结核菌及耐药菌株MDR-TB；
（6）结果分析：用计算机采集薄膜上的图像以jpg格式保存；用ImageJ软件打开图像；将图像放大至400%后进行反色处理；测量图中各个点（共30个点，如表1所示）的密度，所得数据另存为.xls格式；计算所有n/a点的平均密度作为背景密度，B1的密度为阳性密度，按照公式0.12×（阳性密度-背景密度）+背景密度计算密度临界值；低于该临界值的密度判断为杂交阴性，高于该临界值的密度判断为杂交阳性。
上述的一种快速检测耐多药结核病的方法，其中核酸薄膜导流杂交方法如下：
a.所需试剂配制：
1）1×杂交液：5×SSC、5×Denhardts、1% SDS、使用前加入100μg·mL-1鲑鱼精子DNA；
2）封闭液：5%SDS、17 mmol·L-1Na2HPO4、8mmol·L-1NaH2PO4，室温保存；
3）洗涤液：临用前用H2O按1:10稀释封闭液制备而成；
4）链亲和素溶液：PBS含1%BSA、0.1%Tween20、3μg·mL-1链亲和素，新鲜配制；
5）生物素酰化辣根过氧化物酶溶液：PBS含1%BSA、0.1%Tween20、3μg·mL-1生物素酰化辣根过氧化物酶；
6）酶耦合物溶液：链亲和素溶液/生物素酰化辣根过氧化物酶溶液，比例为1:100；
7）TBS:在800ml蒸馏水中加入8gNacl、0.38gkcl、0.1g无水Cacl2、0.1gMgcl2、0.1g Na2HPO4，加入25ml1 mol·L-1PH7.4的Tris·cl，加水至1L；
8）封闭缓冲液：含10%脱脂奶的TBS，定容至1L后备用；
9）检测液：A 液，将 TMB 粉剂溶解于DMSO中使最终浓度为 11 mg·mL-1 ,然后加入 1： 10 体积的甘油 ,再加入终浓度为 0. 5 mg·mL-1的L - 半胱氨酸盐酸盐，所有操作要避光进行 ；配好后的 A 液置于深色玻璃瓶中并保存于 4℃；B 液，用去离子水配制 ,使各成分的终浓度如下:0. 15 %柠檬酸、 0. 25 %磷酸氢二钠、 0. 01 %亚硫酸钠、 0. 002 %EDTA、0. 001 %吐温 20、 0. 02 %过氧化氢脲；将配好的溶液于121 ℃高压灭菌 30 min ,0. 22μm滤膜过滤 ,置于深色塑料瓶中于4 ℃保存；使用时 ,将 A液用B 液稀释 50 倍 ,混匀后即为检测液；
10）终止液：2 mol·L-1硫酸；
b.步骤如下：
1）在45℃水浴中预热1×杂交液和0.5×杂交液；用镊子将导流杂交所需的薄膜装入杂交仪，确保薄膜与反应孔对应整齐，以防止反应不完全，将温度设置在50℃；在每个反应孔中加入750μL 1×杂交液浸泡2~3min 进行预杂交；将杂交仪温度设置为45℃；
2) 在PCR仪内95℃、5min使PCR产物变性成为DNA单链；迅速将高温变性后的PCR产物置于冰上2min 使DNA继续保持单链状态，预先将冰块与适量水混合增加与离心管的接触面积；在1.5mL 离心管中加入500μL已预热的1×杂交液；在500μL 1×杂交液中加入20μL 变性后的PCR产物，上下颠倒彻底混匀溶液；
3）打开抽吸泵吸除反应孔内的杂交液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；将稀释后的PCR产物加入反应孔中，45℃ 孵育10~20min；开抽吸泵让样本混合液流过杂交薄膜，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；向每个反应孔中加入750μL 1×杂交液用于洗涤杂交薄膜，打开抽吸泵吸除杂交溶液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵;再用750μL 0.5×杂交液洗涤杂交薄膜，打开抽吸泵吸除杂交溶液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵,重复二次或更多次；将温度设置到25℃,在反应孔中加入600μL 洗涤液，孵育5min；打开抽吸泵吸除洗涤液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；反应孔内加入500μL 酶耦合物 溶液，25℃ 孵育5min；打开抽吸泵吸除酶耦合物溶液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；向每个反应孔内加入750μL 1×TBS 溶液；将温度设置在36℃，当温度开始升高时打开抽吸泵吸除TBS溶液；用750μL的 1×TBS 溶液洗涤杂交薄膜2次或更多次；当温度达到36℃时关闭抽吸泵；向每个反应孔内加入500μL封闭缓冲液，孵育1~2min；打开抽吸泵吸除封闭缓冲液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；在反应孔内加入500μL的检测液；关闭杂交仪顶盖孵育直到显色为止，约5min；打开抽吸泵吸除检测液；用750μL 的1×TBS溶液洗涤杂交薄膜3次，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；在反应孔内加入500μL 终止液，孵育1分钟；打开抽吸泵吸除终止液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；将杂交薄膜放置在60-80℃干燥箱中30min，待完全干燥后取出。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：针对利福平耐药的结核分枝杆菌发生rpoB基因突变率为90%-95%，而90~95%耐利福平的菌株同时也耐异烟肼，因此在设计探针的时候以rpoB基因的突变位点为主，辅以katG基因的一个突变位点（含两种突变类型）来检测结核分枝杆菌对利福平及异烟肼的耐药性。由于设计的探针包括有结核分枝杆菌rpoB基因及katG基因的野生型，因此可以将结核分枝杆菌与牛结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌鉴别开来，从而降低误诊率。
通过构建载有常见耐药相关基因特异性核酸探针的低密度薄膜，再应用导流杂交技术检测结核分枝杆菌及耐药性。由于导流杂交技术为分子杂交提供了一个三维空间杂交的平台, 比传统的二维平面杂交提高了分子之间的相互作用力，因此降低了杂交时间并增加了杂交效率，杂交过程仅需1小时便可完成。该方法若直接检测临床标本，收到标本的第二天就可出报告。核酸薄膜导流杂交是一种快速、简便、价廉及可靠的方法，它比较容易被引进临床实验室，只需装备thermocycler和一个R2M DNA分析杂交装置。
低密度核苷酸薄膜和导流杂交技术两者结合能同时对多个待测样本的目的基因和一个样本的多个目的基因进行快捷而有效的测定。本发明利用二者的结合（简称为核酸薄膜导流杂交）快速检测与耐多药结核分枝杆菌有关的两个基因（rpoB, katG）的突变。本发明根据薄膜上核酸探针分布及杂交信号判断病人痰标本中有无结核分枝杆菌，并提示有无耐药、单一耐药或耐多药（MDR-TB，即至少对INH和RFP同时耐药)。其操作简单，耗时短，敏感、特异性好，能快速检测耐药结核菌株，可为临床上结核病（包括耐多药结核病）的早诊断与早治疗提供参考依据。亦可开发耐多药结核病(MDR-TB)诊断试剂盒。在全球范围内针对于每年数百万的结核分枝杆菌培养将有很大的竞争潜力，将会带来显著的商业和社会效益。
附图说明
图1结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因经扩增后凝胶电泳图；
图2 结核分枝杆菌临床分离株katG基因扩增后凝胶电泳图；
图3核酸薄膜导流杂交检测M.tb对利福平的耐药性（阳性对照：TA克隆GAC516GTC即D516V）；
图4核酸薄膜导流杂交检测M.tb对异烟肼的耐药性（阳性对照：TA克隆AGC315ACA即S315T2）；
图5核酸薄膜导流杂交检测M.tb对利福平及异烟肼的耐药性（双蒸水作为阴性对照）；
图6核酸薄膜导流杂交检测M.tb对利福平及异烟肼的耐药性（野生型，对利福平和异烟肼均敏感）；
图7核酸薄膜导流杂交检测M.tb对利福平及异烟肼的耐药性（对利福平耐药，TCG531TTG即S531L；对异烟肼耐药AGC315ACA即S315T1 ）；
图8核酸薄膜导流杂交检测M.tb对利福平及异烟肼的耐药性（对利福平耐药，GAC516GTC即D516V；对异烟肼敏感 ）
具体实施方式
一种快速检测耐多药结核病的方法，包括如下步骤：
（1）痰标本的前处理
采用碱处理—直接法。
（2）DNA提取
将前处理后的痰标本于80℃水浴30min, 12000rpm离心5min,弃上清，留取沉淀备用；CTAB法提取DNA；用核酸蛋白测定仪检测浓度，将部分DNA稀释至2.5ng/ml 置于0.5ml EP管中，-20℃保存备用，原液-80℃冻存；
（3）多重PCR及产物标记
多重（multiplex）PCR是指在单一PCR反应试管里同时加入多对引物，在同一时间内扩增出多个产物的PCR方法；多重PCR将大大简化核酸扩增的过程；扩增rpoB基因的上下游引物为5’- CCAGGACGTGGAGGCGATCAC -3’, 5’- CTAACCACGCCGTCGACCACC -3’;扩增katG基因的上下游引物为：5’- TATGGGCCTGATCTACGT -3’, 5’- CGGTGCCCTGCGCCATCGGT -3’。 引物合成时在5’端进行生物素化。反应体系：5×PCR缓冲液，5μl；25mM MgCl，2μl；10mM dNTPs，0.5μl；25uM Biotin-KatG-F及Biotin-RpoB-F，各0.5μl；25uM Biotin-KatG-R及Biotin-RpoB-R，各0.5μl；Go-Taq DNA聚合酶，0.25μl；2.5ng/μL TB DNA模板，1μl；ddH2O，14.25μl；扩增程序：94℃5 min； 94℃1 min，60℃1 min，72℃1 min，共35个循环；72℃10 min。
（4）制备低密度核苷酸薄膜（Macroarray）
筛选出15个特异的针对rpoB基因、katG基因的野型及突变型的寡核苷酸探针，这种探针在5’末端含有一个氨基(CH2)。除此之外，还设计有一个人类基因组探针（β-globin），用于检测的结核分枝杆菌是否来源于人标本；选用一个生物素探针（Biotin），用于质量控制。除外生物素探针外的16种探针序列为：WT513，5’-TC CAT GAA TTG GCT CAG CT-3’； Q513E，5’-TC CAT GAA TTC GCT CAG CT-3’； WT516，5’-AA TTC ATG GTC CAG AAC AA-3’； D516V，5’-AA TTC ATG GAC CAG AAC AA-3’； WT526，5’-GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA-3’；H526Y，5’-GGG TTG ACC TAC AAG CGC CGA-3’； H526D，5’-GGG TTG ACC GAC AAG CGC CGA-3’； WT531，5’-CGC CGA CTG TCG GCG CTG GGG-3’； S531L，5’-CGC CGA CTG TTG GCG CTG GGG-3’； S531W，5’-CGC CGA CTG TGG GCG CTG GGG-3’； WT315，5’-TC GAT GCC GCT GGT GAT CG-3’； S315T①，5’-TC GAT GCC GGT GGT GAT CG-3；S315T②，5’-TC GAT GCC TGT GGT GAT CG-3’； FWT505，5’-GT GCC GAA GAA CTC CTT GA-3’； NWT518，5’-AG CGG GTT GTT CTG GTC CA-3’； β-Globin，5’-AC CAC CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC-3’。
膜的微阵序列是按照预定的程序由固定的共价H2N-探针结合到不带电荷的尼龙膜制成；制备过程如下：裁剪出0.5cm×0.5cm大小的具有阴性电荷的尼龙膜，用铅笔按表1进行标记；将标记好的尼龙膜浸入6×SSC中10分钟，备用；将合成的探针稀释为2.5-5.0μM,按表1用加样器进行点样，每个探针上样量为0.5-1.5μl；小心取下膜，置于TE缓冲液饱和的滤纸上，DNA面向上，紫外灯下（10cm）固定3-7min；可立即用于杂交，也可以在蒸馏水中浸洗，晾干后室温保存备用；
表1 薄膜上的微阵序列
（5）核酸薄膜导流杂交
将标记的PCR产物与构建的载有常见耐药菌株特异性核酸探针的低密度薄膜进行分子杂交来检测结核菌及耐药菌株（MDR-TB）；
a.所需试剂配制：
1）1×杂交液：5×SSC、5×Denhardts、1% SDS、使用前加入100μg·mL-1鲑鱼精子DNA；
2）封闭液：5%SDS、17 mmol·L-1Na2HPO4、8mmol·L-1NaH2PO4，室温保存；
3）洗涤液：临用前用H2O按1:10稀释封闭液制备而成；
4）链亲和素溶液：PBS含1%BSA、0.1%Tween20、3μg·mL-1链亲和素，新鲜配制；
5）生物素酰化辣根过氧化物酶溶液：PBS含1%BSA、0.1%Tween20、3μg·mL-1生物素酰化辣根过氧化物酶；
6）酶耦合物溶液：链亲和素溶液/生物素酰化辣根过氧化物酶溶液，比例为1:100；
7）TBS:在800ml蒸馏水中加入8gNacl、0.38gkcl、0.1g无水Cacl2、0.1gMgcl2、0.1g Na2HPO4，加入25ml1 mol·L-1PH7.4的Tris·cl，加水至1L；
8）封闭缓冲液：含10%脱脂奶的TBS，定容至1L后备用；
9）检测液：A 液，将 TMB 粉剂溶解于DMSO中使最终浓度为 11 mg·mL-1 ,然后加入 1： 10 体积的甘油 ,再加入终浓度为 0. 5 mg·mL-1的L - 半胱氨酸盐酸盐，所有操作要避光进行 。配好后的 A 液置于深色玻璃瓶中并保存于 4℃。B 液，用去离子水配制 ,使各成分的终浓度如下:0. 15 %柠檬酸、 0. 25 %磷酸氢二钠、 0. 01 %亚硫酸钠、 0. 002 %EDTA、0. 001 %吐温 20、 0. 02 %过氧化氢脲。将配好的溶液于121 ℃高压灭菌 30 min ,0. 22μm滤膜过滤 ,置于深色塑料瓶中于4 ℃保存。使用时 ,将 A液用B 液稀释 50 倍 ,混匀后即为检测液。
10）终止液：2 mol·L-1硫酸；
b.步骤如下：
1）在45℃水浴中预热1×杂交液和0.5×杂交液；用镊子将导流杂交所需的薄膜装入杂交仪，确保薄膜与反应孔对应整齐，以防止反应不完全，将温度设置在50℃；在每个反应孔中加入750μL 1×杂交液浸泡2~3min 进行预杂交；将杂交仪温度设置为45℃；
2) 在PCR仪内95℃、5min使PCR产物变性成为DNA单链；迅速将高温变性后的PCR产物置于冰上2min 使DNA继续保持单链状态，预先将冰块与适量水混合增加与离心管的接触面积；在1.5mL 离心管中加入500μL已预热的1×杂交液；在500μL 1×杂交液中加入20μL 变性后的PCR产物，上下颠倒彻底混匀溶液；
3）打开抽吸泵吸除反应孔内的杂交液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；将稀释后的PCR产物加入反应孔中，45℃ 孵育10~20min；开抽吸泵让样本混合液流过杂交薄膜，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；向每个反应孔中加入750μL 1×杂交液用于洗涤杂交薄膜，打开抽吸泵吸除杂交溶液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵;再用750μL 0.5×杂交液洗涤杂交薄膜，打开抽吸泵吸除杂交溶液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵,重复二次或更多次；将温度设置到25℃,在反应孔中加入600μL 洗涤液，孵育5min；打开抽吸泵吸除洗涤液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；反应孔内加入500μL 酶耦合物 溶液，25℃ 孵育5min；打开抽吸泵吸除酶耦合物溶液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；向每个反应孔内加入750μL 1×TBS 溶液；将温度设置在36℃，当温度开始升高时打开抽吸泵吸除TBS溶液；用750μL的 1×TBS 溶液洗涤杂交薄膜2次或更多次；当温度达到36℃时关闭抽吸泵；向每个反应孔内加入500μL封闭缓冲液，孵育1~2min；打开抽吸泵吸除封闭缓冲液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；在反应孔内加入500μL的检测液；关闭杂交仪顶盖孵育直到显色为止，约5min；打开抽吸泵吸除检测液；用750μL 的1×TBS溶液洗涤杂交薄膜3次，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；在反应孔内加入500μL 终止液，孵育1分钟；打开抽吸泵吸除终止液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；将杂交薄膜放置在60~80℃干燥箱中30min，待完全干燥后取出；
（6）结果分析：用计算机采集薄膜上的图像以jpg格式保存；用ImageJ软件打开图像；将图像放大至400%后进行反色处理；测量图中各个点（共30个点，如表1所示）的密度，所得数据另存为.xls格式；计算所有n/a点的平均密度作为背景密度，B1的密度为阳性密度，按照公式0.12×（阳性密度-背景密度）+背景密度计算密度临界值；低于该临界值的密度判断为杂交阴性，高于该临界值的密度判断为杂交阳性。
试验例：以下通过试验例来证明本发明的有益效果
（1）结核病人痰标本的收集、结核分枝杆菌的分离培养及鉴定。
在2007年6月1日至2008年7月31日期间，我们在中国贵州遵义医学院附属医院呼吸内科共收集到来自开放性结核病人痰中的81份抗酸染色阳性标本。所有样本经L-J固体培养基培养，再经TCH 和PNB选择培养基对其鉴定。这81株均被鉴定为结核分枝杆菌。
（2）利福平、异烟肼的药物敏感试验。
结果：实验菌株中有27株对利福平耐药，54株对利福平敏感；28株耐异烟肼，53株对异烟肼敏感。
（3）rpoB基因\katG基因扩增及测序。
结果：见图1结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因经扩增后凝胶电泳图、图2 结核分枝杆菌临床分离株katG基因扩增后凝胶电泳图，表2、3。
表2 结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因突变类型
表3 结核分枝杆菌临床分离株katG基因突变类型
（4）核酸薄膜导流杂交检测M.tb及其耐药性的结果，见图3-8。
（5）对本发明的综合评价指标及结果。见表4。
表4 核酸薄膜导流杂交检测M.tb耐药性与传统方法比较
| 敏感性 | 特异性 | 准确性 | 阳性预测值 | 阴性预测值 | |
| 利福平 | 91% | 100% | 94% | 100% | 86% |
| 异烟肼 | 85% | 72.7% | 78.6% | 73.9% | 84.2% |
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (3)
1.一种快速检测耐多药结核病的方法，包括如下步骤：
（1）痰标本的前处理
采用碱处理—直接法；
（2）DNA提取；
（3）多重PCR及产物标记
在单一PCR反应试管里同时加入多对引物，在同一时间内扩增出多个产物的PCR；扩增rpoB基因的上下游引物为5’- CCAGGACGTGGAGGCGATCAC -3’, 5’- CTAACCACGCCGTCGACCACC -3’;扩增katG基因的上下游引物为：5’- TATGGGCCTGATCTACGT -3’, 5’- CGGTGCCCTGCGCCATCGGT -3’； 引物合成时在5’端进行生物素化；反应体系：5×PCR缓冲液，5μl；25mM MgCl，2μl；10mM dNTPs，0.5μl；25uM Biotin-KatG-F及Biotin-RpoB-F，各0.5μl；25uM Biotin-KatG-R及Biotin-RpoB-R，各0.5μl；Go-Taq DNA聚合酶，0.25μl；2.5ng/μL TB DNA模板，1μl；ddH2O，14.25μl；扩增程序：94℃5 min； 94℃1 min，60℃1 min，72℃1 min，共35个循环；72℃10 min；
（4）制备载有常见耐药菌株特异性核酸探针的低密度核苷酸薄膜
筛选出15个特异的针对rpoB基因、katG基因的野型及突变型的寡核苷酸探针，这种探针在5’末端含有一个氨基；一个人类基因组探针β-globin，一个生物素探针Biotin； 除外生物素探针外的16种探针序列为：WT513，5’-TC CAT GAA TTG GCT CAG CT-3’； Q513E，5’-TC CAT GAA TTC GCT CAG CT-3’； WT516，5’-AA TTC ATG GTC CAG AAC AA-3’； D516V，5’-AA TTC ATG GAC CAG AAC AA-3’； WT526，5’-GGG TTG ACC CAC AAG CGC CGA-3’；H526Y，5’-GGG TTG ACC TAC AAG CGC CGA-3’； H526D，5’-GGG TTG ACC GAC AAG CGC CGA-3’； WT531，5’-CGC CGA CTG TCG GCG CTG GGG-3’； S531L，5’-CGC CGA CTG TTG GCG CTG GGG-3’； S531W，5’-CGC CGA CTG TGG GCG CTG GGG-3’； WT315，5’-TC GAT GCC GCT GGT GAT CG-3’； S315T①，5’-TC GAT GCC GGT GGT GAT CG-3；S315T②，5’-TC GAT GCC TGT GGT GAT CG-3’； FWT505，5’-GT GCC GAA GAA CTC CTT GA-3’； NWT518，5’-AG CGG GTT GTT CTG GTC CA-3’； β-Globin，5’-AC CAC CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC-3’；
膜的微阵序列制备过程如下：裁剪出0.5cm×0.5cm大小的不带电荷的尼龙膜，用铅笔按表1进行标记；将标记好的尼龙膜浸入6×SSC中10分钟，备用；将合成的探针稀释为2.5-5.0μM,按表1用加样器进行点样，每个探针上样量为0.5-1.5μl；小心取下膜，置于TE缓冲液饱和的滤纸上，DNA面向上，10cm紫外灯下固定3-7min；立即用于杂交或在蒸馏水中浸洗，晾干后室温保存备用；
（5）核酸薄膜导流杂交
将标记的PCR产物与构建的载有常见耐药菌株特异性核酸探针的低密度薄膜进行分子杂交来检测结核分枝杆菌及耐药菌株MDR-TB；
（6）结果分析：用计算机采集薄膜上的图像以jpg格式保存，用ImageJ软件打开图像，将图像放大至400%后进行反色处理；测量图中如表1所示的30个点的密度，所得数据另存为.xls格式；计算所有n/a点的平均密度作为背景密度，B1的密度为阳性密度，按照公式0.12×（阳性密度-背景密度）+背景密度计算密度临界值；低于该临界值的密度判断为杂交阴性，高于该临界值的密度判断为杂交阳性。
2.如权利要求1所述的一种快速检测耐多药结核病的方法，其中核酸薄膜导流杂交方法如下：
a.所需试剂配制：
1）1×杂交液：5×SSC、5×Denhardts、1% SDS、使用前加入100μg·mL-1鲑鱼精子DNA；
2）封闭液：5%SDS、17 mmol·L-1Na2HPO4、8mmol·L-1NaH2PO4，室温保存；
3）洗涤液：临用前用H2O按1:10稀释封闭液制备而成；
4）链亲和素溶液：PBS含1%BSA、0.1%Tween20、3μg·mL-1链亲和素，新鲜配制；
5）生物素酰化辣根过氧化物酶溶液：PBS含1%BSA、0.1%Tween20、3μg·mL-1生物素酰化辣根过氧化物酶；
6）酶耦合物溶液：链亲和素溶液/生物素酰化辣根过氧化物酶溶液，比例为1:100；
7）TBS:在800ml蒸馏水中加入8gNacl、0.38gkcl、0.1g无水Cacl2、0.1gMgcl2、0.1g Na2HPO4，加入25ml1 mol·L-1PH7.4的Tris·cl，加水至1L；
8）封闭缓冲液：含10%脱脂奶的TBS，定容至1L后备用；
9）检测液：A 液，将 TMB 粉剂溶解于DMSO中使最终浓度为 11 mg·mL-1 ,然后加入 1： 10 体积的甘油 ,再加入终浓度为 0. 5 mg·mL-1的L - 半胱氨酸盐酸盐，所有操作要避光进行 ；配好后的 A 液置于深色玻璃瓶中并保存于 4℃；B 液，用去离子水配制 ,使各成分的终浓度如下:0. 15 %柠檬酸、 0. 25 %磷酸氢二钠、 0. 01 %亚硫酸钠、 0. 002 %EDTA、0. 001 %吐温 20、 0. 02 %过氧化氢脲；将配好的溶液于121 ℃高压灭菌 30 min ,0. 22μm滤膜过滤 ,置于深色塑料瓶中于4 ℃保存；使用时 ,将 A液用B 液稀释 50 倍 ,混匀后即为检测液；
10）终止液：2 mol·L-1硫酸；
b.步骤如下：
1）在45℃水浴中预热1×杂交液和0.5×杂交液；用镊子将导流杂交所需的薄膜装入杂交仪，确保薄膜与反应孔对应整齐，以防止反应不完全，将温度设置在50℃；在每个反应孔中加入750μL 1×杂交液浸泡2~3min 进行预杂交；将杂交仪温度设置为45℃；
2) 在PCR仪内95℃、5min使PCR产物变性成为DNA单链；迅速将高温变性后的PCR产物置于冰上2min 使DNA继续保持单链状态，预先将冰块与适量水混合增加与离心管的接触面积；在1.5mL 离心管中加入500μL已预热的1×杂交液；在500μL 1×杂交液中加入20μL 变性后的PCR产物，上下颠倒彻底混匀溶液；
3）打开抽吸泵吸除反应孔内的杂交液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；将稀释后的PCR产物加入反应孔中，45℃ 孵育10~20min；开抽吸泵让样本混合液流过杂交薄膜，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；向每个反应孔中加入750μL 1×杂交液用于洗涤杂交薄膜，打开抽吸泵吸除杂交溶液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵;再用750μL 0.5×杂交液洗涤杂交薄膜，打开抽吸泵吸除杂交溶液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵,重复二次或更多次；将温度设置到25℃,在反应孔中加入600μL 洗涤液，孵育5min；打开抽吸泵吸除洗涤液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；反应孔内加入500μL 酶耦合物 溶液，25℃ 孵育5min；打开抽吸泵吸除酶耦合物溶液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；向每个反应孔内加入750μL 1×TBS 溶液；将温度设置在36℃，当温度开始升高时打开抽吸泵吸除TBS溶液；用750μL的 1×TBS 溶液洗涤杂交薄膜2次或更多次；当温度达到36℃时关闭抽吸泵；向每个反应孔内加入500μL封闭缓冲液，孵育1~2min；打开抽吸泵吸除封闭缓冲液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；在反应孔内加入500μL的检测液；关闭杂交仪顶盖孵育直到显色为止，约5min；打开抽吸泵吸除检测液；用750μL 的1×TBS溶液洗涤杂交薄膜3次，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；在反应孔内加入500μL 终止液，孵育1分钟；打开抽吸泵吸除终止液，待反应孔内无水珠后关闭抽吸泵；将杂交薄膜放置在60-80℃干燥箱中30min，待完全干燥后取出。
3.如权利要求1或2所述的一种快速检测耐多药结核病的方法，其中DNA提取是将前处理后的痰标本于80℃水浴30min, 12000rpm离心5min,弃上清，留取沉淀备用；CTAB法提取DNA；用核酸蛋白测定仪检测浓度，将DNA稀释至2.5ng/ml 置于0.5ml EP管中，-20℃保存备用。
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