CN113388678A - 一种强直性脊柱炎易感基因的检测引物和探针及检测方法 - Google Patents

一种强直性脊柱炎易感基因的检测引物和探针及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种强直性脊柱炎易感基因的检测引物和探针，该易感基因位于TNF基因的rs1799724位点，本发明还提供一种强直性脊柱炎易感基因的检测方法，包括以下步骤：(1)采集样品并提取基因组DNA；(2)配制扩增与检测反应体系；(3)上荧光定量PCR仪，采用上述引物进行目的基因的PCR扩增，同时采用上述探针检测等位基因特异性荧光信号；(4)对SNP检测结果进行分析。该引物和探针特异性好，操作简便，有助于对强直性脊柱炎预防工作的开展，并为家族遗传性疾病的早期筛查提供工具。

Description

一种强直性脊柱炎易感基因的检测引物和探针及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测强直性脊柱炎易感基因位点的引物、探针及检测方法。
背景技术
强直性脊柱炎是一种常见的炎症性关节炎，并侵犯骶髂关节、脊柱及外周关节，破坏软骨和骨骼。目前，我国强直性脊柱炎的发病率为0.25％～0.3％，多发于年轻人群，一旦患病将严重降低患者的生活质量，给患者家庭和社会都造成巨大负担。研究证明强直性脊柱炎的发生与HLA-B27基因紧密相关。流行病统计调查研究表明，90％以上的强直性脊柱炎患者HLA-B27基因阳性，但总人群中只有1％～5％的HLA-B27阳性个体会发展为强直性脊柱炎。因此，还存在其他的遗传学因素影响着强直性脊柱炎的发生。
已有文献表明肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)基因上的rs1799724多态性位点可能与强直性脊柱炎的发生风险相关。通过对rs1799724位点基因分型将有助于预测强直性脊柱炎的发病风险，为临床疾病的早期筛查提供指导。目前已报道的文献中检测rs1799724多态性位点的方法主要包括基因芯片技术(Gene chip)、序列特异性引物PCR技术(Sequence specific primer-PCR，SSP-PCR)、等位基因特异性PCR技术(Allelespecific-PCR，AS-PCR)、PCR限制性片段长度多态性技术(PCR-restrictionfragmentlength polymorphism，PCR-RFLP)及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(Matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectroscopy，MALDI-TOF MS)。尽管检测技术很多，但操作繁琐，多为开管处理PCR扩增产物的技术，存在产物交叉污染的风险，影响检测结果的准确性。因此，需要一种简便、准确、特异性检测rs1799724位点的方法，为临床强直性脊柱炎的筛查和预防工作提供工具。
TaqMan-MGB技术是一种基于荧光共振能量转移探针和Taq聚合酶5’-3’外切酶活性，特异性检测等位基因的实时荧光扩增技术。针对基因位点设计一对公用的引物和一对等位基因特异性荧光共振能量转移探针，且两个等位基因的探针分别标记两种不同的荧光基团。当进行扩增反应时，等位基因探针识别检测模板，只有存在能与等位基因探针特异性结合的模板时，Taq聚合酶才能切割荧光共振能量转移探针，释放荧光基团，产生荧光信号。因此，该技术能够在闭管情况下实时检测基因位点，检测操作简便，且检测特异性好，结果易于判读，适合用于强直性脊柱炎易感基因位点检测方法的研发。然而，该技术的成功运用对检测位点的序列、引物和探针设计、反应条件均有一定要求。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种强直性脊柱炎易感基因的检测引物和探针及检测方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种强直性脊柱炎易感基因的检测引物和探针，所述引物序列为：
rs1799724-F：5’-GGGCTATGGAAGTCGAGTATGG-3’；
rs1799724-R：5’-TGGAGGTCCTGGAGGCTCTT-3’；
所述探针序列为：
rs1799724-wC：5’-VIC-CCCCCCTTAACGAA-MGB-NFQ-3’；
rs1799724-mT：5’-FAM-CCCCCTTAATGAAG-MGB-NFQ-3’。
进一步地，所述引物和探针均以TNF基因的rs1799724位点为靶基因。
进一步地，所述探针rs1799724-wC特异性检测等位基因C，所述等位基因C检测位点核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
进一步地，所述探针rs1799724-mT特异性检测等位基因T，所述等位基因T检测位点核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
第二方面，本发明还提供一种强直性脊柱炎易感基因的检测方法，包括如下步骤：
S1、采集样品并提取基因组DNA；
S2、配制扩增与检测反应体系；
S3、上荧光定量PCR仪，利用引物rs1799724-F和rs1799724-R进行目的基因的PCR扩增，利用探针rs1799724-wC和rs1799724-mT检测等位基因特异性荧光信号；
S4、对SNP检测结果进行分析。
进一步地，步骤S2所述反应体系包括：10μL 2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)，1μL10μmol/L rs1799724-F，1μL 10μmol/L rs1799724-R，1μL 10μmol/L rs1799724-wC，1μL10μmol/L rs1799724-mT，0.4μL 50×Rox Reference Dye或0.2μL 50×Rox ReferenceDye II，1-150ng基因组DNA，ddH2O补齐至20μL。
进一步地，步骤S3所述荧光定量PCR扩增条件为：95℃预变性10min；依次按以下条件循环40次：95℃15s，55℃20s，60℃1min，采集荧光信号。
第三方面，本发明还提供一种用于检测强直性脊柱炎易感基因的试剂盒，所述试剂盒包含引物rs1799724-F和rs1799724-R，以及探针rs1799724-wC和rs1799724-mT。
进一步地，所述试剂盒还包含缓冲液、DNA聚合酶、对照品。
进一步地，所述对照品包括阴性对照品和阳性对照品。
本发明的有益效果为：
本发明基于TaqMan-MGB技术，提供一种用于检测强直性脊柱炎易感基因位点的引物、探针及检测方法，该引物和探针特异性好，操作简便，有助于强直性脊柱炎预防工作的开展，并为家族遗传性疾病的早期筛查提供工具。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1为本发明人工合成质粒rs724-C的rs1799724位点多态性检测结果图；
图2为本发明人工合成质粒rs724-T的rs1799724位点多态性检测结果图；
图3为本发明人工合成质粒rs724-C和rs724-T同时存在时rs1799724位点多态性检测结果图；
图4为本发明患者样本No.006的rs1799724位点多态性检测结果图；
图5为本发明患者样本No.006的PCR偶联实时荧光Invader方法的验证结果图；
图6为本发明患者样本No.008的rs1799724位点多态性检测结果图；
图7为本发明患者样本No.008的PCR偶联实时荧光Invader方法的验证结果图；
图8为本发明患者样本No.001的rs1799724位点多态性检测结果图；
图9为本发明患者样本No.001的PCR偶联实时荧光Invader方法的验证结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
合成强直性脊柱炎易感基因rs1799724位点的人工质粒作为模拟样本，序列如下：
rs1799724位点包含C等位基因(W型)的人工质粒序列rs724-C(SEQ ID No.5)为：5’-GGGAAGCAAAGGAGAAGCTGAGAAGATGAAGGAAAAGTCAGGGTCTGGAGGGGCGGGGGTCAGGGAGCTCCTGGGAGATATGGCCACATGTAGCGGCTCTGAGGAATGGGTTACAGGAGACCTCTGGGGAGATGTGACCACAGCAATGGGTAGGAGAATGTCCAGGGCTATGGAAGTCGAGTATGGGGACCCCCCCTTAACGAAGACAGGGCCATGTAGAGGGCCCCAGGGAGTGAAAGAGCCTCCAGGACCTCCAGGTATGGAATACAGGGGACGTTTAAGAAGATATGGCCACACACTGGGGCCCTGAGAAGTGAGAGCTTCATGAAAAAAATCAGGGACCCCAGAGTTCCTTGGAAGCCAAGACTGAAACCAGCATTATGAGTCTCCGGGTCAGAATG-3’
rs1799724位点包含T等位基因(M型)的人工质粒序列rs724-T(SEQ ID No.6)为：5’-GGGAAGCAAAGGAGAAGCTGAGAAGATGAAGGAAAAGTCAGGGTCTGGAGGGGCG GGGGTCAGGGAGCTCCTGGGAGATATGGCCACATGTAGCGGCTCTGAGGAATGGGTTACAGGAGACCTCTGGGGAGATGTGACCACAGCAATGGGTAGGAGAATGTCCAGGGCTATGGAAGTCGAGTATGGGGACCCCCCCTTAATGAAGACAGGGCCATGTAGAGGGCCCCAGGGAGTGAAAGAGCCTCCAGGACCTCCAGGTATGGAATACAGGGGACGTTTAAGAAGATATGGCCACACACTGGGGCCCTGAGAAGTGAGAGCTTCATGAAAAAAATCAGGGACCCCAGAGTTCCTTGGAAGCCAAGACTGAAACCAGCATTATGAGTCTCCGGGTCAGAATG-3’
基于TaqMan-MGB探针反应，设计rs1799724位点的引物和检测探针，引物序列包括正向引物rs1799724-F：5’-GGGCTATGGAAGTCGAGTATGG-3’(SEQ ID No.1)和反向引物rs1799724-R：5’-TGGAGGTCCTGGAGGCTCTT-3’(SEQ ID No.2)。探针序列包括检测等位基因C的特异性检测探针rs1799724-wC：5’-VIC-CCCCCCTTAACGAA-MGB-NFQ-3’(SEQ ID No.3)和检测等位基因T的特异性检测探针rs1799724-mT：5’-FAM-CCCCCTTAATGAAG-MGB-NFQ-3’(SEQ ID No.4)。
采用上述引物及探针检测强直性脊柱炎易感基因rs1799724位点，配制反应体系：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)加入10μL，10μmol/L正向引物加入1μL，10μmol/L反向引物加入1μL，10μmol/L等位基因C和T的特异性检测探针各加入1μL，50×Rox Reference Dye加入0.4μL或50×Rox Reference Dye II加入0.2μL，1000拷贝合成质粒，ddH2O补齐至20μL反应体系。
上荧光定量PCR仪，采用上述引物进行目的基因的PCR扩增，同时采用上述探针检测等位基因特异性荧光信号。扩增条件为95℃预变性10min；95℃15s，55℃20s，60℃1min，采集荧光信号，共40个循环。反应结束后，对荧光检测结果进行SNP分型分析。VIC荧光通道信号的有无对应rs1799724位点等位基因C的有无，FAM荧光通道信号的有无对应rs1799724位点等位基因T的有无。
图1为只有人工合成质粒rs724-C存在时rs1799724位点多态性检测的荧光结果图，对应SNP基因型为CC型；图2为只有人工合成质粒rs724-T存在时rs1799724位点多态性检测的荧光结果图，对应SNP基因型为TT型；图3为人工合成质粒rs724-C和rs724-T都存在时rs1799724位点多态性检测的荧光结果图，对应SNP基因型为CT型。其中，CT型和TT型具有较高的强直性脊柱炎发生风险。
实施例2
采用本发明的检测方法检测40例强直性脊柱炎患者和40例健康对照的外周血样本。
首先对外周血样本提取基因组DNA，然后配制反应体系：2×Premix Ex Taq(ProbeqPCR)加入10μL，10μmol/L正向引物加入1μL，10μmol/L反向引物加入1μL，10μmol/L等位基因C和T的特异性检测探针各加入1μL，50×Rox Reference Dye加入0.4μL或50×RoxReference Dye II加入0.2μL，1-150ng基因组DNA，ddH2O补齐至20μL反应体系。
上荧光定量PCR仪，采用上述引物进行目的基因的PCR扩增，同时采用上述探针检测等位基因特异性荧光信号。扩增条件为95℃预变性10min；95℃15s，55℃20s，60℃1min，采集荧光信号，40个循环。反应结束后，对荧光检测结果进行SNP分型分析。VIC荧光通道信号的有无对应rs1799724位点等位基因C的有无，FAM荧光通道信号的有无对应rs1799724位点等位基因T的有无。同时，采用PCR偶联实时荧光Invader方法对所有样本进行检测验证。
本发明检测方法的检测结果与验证方法的检测结果完全一致，40例强直性脊柱炎患者和40例健康对照在rs1799724位点的基因多态性检测具体结果如表1所示。结果表明，T等位基因与强直性脊柱炎疾病易感相关，携带T等位基因的个体患病风险是携带C等位基因的6.788倍(95.0％CI:2.987～15.428)。
表1 40例强直性脊柱炎患者和健康对照在rs1799724位点的基因多态性
Figure BDA0003141859280000051
图4为患者样本No.006在rs1799724位点使用本发明检测方法检测的荧光结果图，只有对应等位基因C的VIC荧光信号通道有高于阈值的检测信号，因此本发明检测方法对该样本在rs1799724位点的基因型检测结果为CC型；图5为患者样本No.006的验证结果图，结果显示该样本rs1799724位点基因型为CC型，与本发明图4的检测结果一致；图6为患者样本No.008在rs1799724位点使用本发明检测方法检测的荧光结果图，只有对应等位基因T的FAM荧光信号通道有高于阈值的检测信号，因此本发明方法对该样本在rs1799724位点的基因型检测结果为TT型；图7为患者样本No.008的验证结果图，结果显示该样本rs1799724位点基因型为TT型，与本发明图6的检测结果一致；图8为患者样本No.001在rs1799724位点使用本发明检测方法检测的荧光结果图，结果显示对应等位基因C的VIC荧光信号通道和对应等位基因T的FAM荧光信号通道均有高于阈值的检测信号，因此本发明方法对该样本在rs1799724位点的基因型检测结果为CT型；图9为患者样本No.001的验证结果图，结果显示该样本rs1799724位点基因型为CT型，与本发明图8的检测结果一致。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序 列 表
<110>南通市第一人民医院
<120>一种强直性脊柱炎易感基因的检测引物和探针及检测方法
<160>6
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gggctatgga agtcgagtat gg 22
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tggaggtcct ggaggctctt 20
<210>3
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ccccccttaa cgaa 14
<210>4
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cccccttaat gaag 14
<210>5
<211>401
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gggaagcaaa ggagaagctg agaagatgaa ggaaaagtca gggtctggag gggcgggggt 60
cagggagctc ctgggagata tggccacatg tagcggctct gaggaatggg ttacaggaga 120
cctctgggga gatgtgacca cagcaatggg taggagaatg tccagggcta tggaagtcga 180
gtatggggac ccccccttaa cgaagacagg gccatgtaga gggccccagg gagtgaaaga 240
gcctccagga cctccaggta tggaatacag gggacgttta agaagatatg gccacacact 300
ggggccctga gaagtgagag cttcatgaaa aaaatcaggg accccagagt tccttggaag 360
ccaagactga aaccagcatt atgagtctcc gggtcagaat g 401
<210>6
<211>401
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gggaagcaaa ggagaagctg agaagatgaa ggaaaagtca gggtctggag gggcgggggt 60
cagggagctc ctgggagata tggccacatg tagcggctct gaggaatggg ttacaggaga 120
cctctgggga gatgtgacca cagcaatggg taggagaatg tccagggcta tggaagtcga 180
gtatggggac ccccccttaa tgaagacagg gccatgtaga gggccccagg gagtgaaaga 240
gcctccagga cctccaggta tggaatacag gggacgttta agaagatatg gccacacact 300
ggggccctga gaagtgagag cttcatgaaa aaaatcaggg accccagagt tccttggaag 360
ccaagactga aaccagcatt atgagtctcc gggtcagaat g 401

Claims (10)

1.一种强直性脊柱炎易感基因的检测引物和探针，其特征在于，所述引物序列为：
rs1799724-F：5’-GGGCTATGGAAGTCGAGTATGG-3’；
rs1799724-R：5’-TGGAGGTCCTGGAGGCTCTT-3’；
所述探针序列为：
rs1799724-wC：5’-VIC-CCCCCCTTAACGAA-MGB-NFQ-3’；
rs1799724-mT：5’-FAM-CCCCCTTAATGAAG-MGB-NFQ-3’。
2.根据权利要求1所述的强直性脊柱炎易感基因的检测引物和探针，其特征在于，所述引物和探针均以TNF基因的rs1799724位点为靶基因。
3.根据权利要求1所述的强直性脊柱炎易感基因的检测引物和探针，其特征在于，所述探针rs1799724-wC特异性检测等位基因C，等位基因C检测位点核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
4.根据权利要求1所述的强直性脊柱炎易感基因的检测引物和探针，其特征在于，所述探针rs1799724-mT特异性检测等位基因T，所述等位基因T检测位点核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。
5.一种非疾病诊断目的强直性脊柱炎易感基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、采集样品并提取基因组DNA；
S2、配制扩增与检测反应体系；
S3、上荧光定量PCR仪，利用引物rs1799724-F和rs1799724-R进行目的基因的PCR扩增，利用探针rs1799724-wC和rs1799724-mT检测等位基因特异性荧光信号；
S4、对SNP检测结果进行分析。
6.根据权利要求5所述的非疾病诊断目的强直性脊柱炎易感基因的检测方法，其特征在于，步骤S2所述反应体系包括：10μL 2×Premix Ex Taq，1μL 10μmol/L rs1799724-F，1μL 10μmol/L rs1799724-R，1μL 10μmol/L rs1799724-wC，1μL 10μmol/L rs1799724-mT，0.4μL 50×Rox Reference Dye或0.2μL 50×Rox Reference Dye II，1-150ng基因组DNA，ddH2O补齐至20μL。
7.根据权利要求5所述的非疾病诊断目的强直性脊柱炎易感基因的检测方法，其特征在于，步骤S3所述荧光定量PCR扩增条件为：95℃预变性10min；依次按以下条件循环40次：95℃15s，55℃20s，60℃1min，采集荧光信号。
8.一种用于检测强直性脊柱炎易感基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的引物和探针。
9.根据权利要求8所述的用于检测强直性脊柱炎易感基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含缓冲液、DNA聚合酶、对照品。
10.根据权利要求9所述的用于检测强直性脊柱炎易感基因的试剂盒，其特征在于：所述对照品包括阴性对照品和阳性对照品。
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Citations (9)

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