CN107299144A - 一种用于检测TNF‑a基因SNP位点rs1799724基因型的扩增引物、试剂盒、方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种用于检测TNF‑a基因SNP位点rs1799724基因型的扩增引物、试剂盒、方法及其应用，本发明属于基因检测领域，本发明提供一种如下的技术方案：一种用于检测TNF‑a基因SNP位点rs1799724基因型的扩增引物，所述的扩增引物的序列为：正向引物：CAGCAATGGGTAGGAGA；反向引物：CTTCTCAGGGCCCCAG。本发明的有益效果在于：使用荧光定量PCR技术，对rs1799724突变位点，设计PCR引物和探针进行基因型检测，灵敏度高，特异性好；利用标记荧光的探针能和模板特异性结合，PCR反应时可以产生对应的荧光信号的原理，通过荧光信号类型分辨不同样本的基因型。

Description

一种用于检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型的扩增引 物、试剂盒、方法及其应用
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体来说是一种用于检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型的扩增引物、试剂盒、方法及其应用。
背景技术
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种常见的慢性炎症性风湿性疾病，主要侵犯人体中轴骨关节系统以及外周大关节，特征性病理改变是肌腱和韧带附着点的慢性炎症，多见于10～40岁的青壮年，20-30岁为发病高峰。一般男性发病较早，病情较重，是导致青壮年致残和丧失劳动力的重要病因之一。
研究表明TNF-α基因启动子转录调控元件位于基因上游-863位点至-857位点之间，在此区域单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)差异可能与TNF-α基本表达相关，而TNF-α基因表达可能与TNF-α拮抗剂的治疗的有效性相关。已有研究表明rs1799724(-857C/T)单核苷酸多态性与AS有显着关联,-857T是中国南方人群AS发病的危险因素，-857TT纯合子较CT杂合子对TNF-a拮抗剂6周治疗后的AS病人的炎症指标、BASFI改善更显著，因此，有效的确定TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型很有必要。
近年来，随着TNF–α拮抗剂在临床上的应用，可使临床症得到AS状迅速缓解，然而此类制剂费用昂贵，部分患者初次治疗，临床疗效不佳甚至无反应，而且接受治疗的患者有出现结核、真菌、细菌感染等并发症的风险。因此，寻找能预测AS患者对TNF-α拮抗剂治疗有效性的标志物显得十分重要。
发明内容
为解决上述提出问题，本发明提供一种如下的技术方案：
一种用于检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型的扩增引物，所述的扩增引物的序列为：
正向引物Primer-F：CAGCAATGGGTAGGAGA；
反向引物Primer-R：CTTCTCAGGGCCCCAG。
一种用于检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型的试剂盒，所述的试剂盒包括有上述的引物对和特异探针，所述的特异探针序列Probe-C：CCCCTTAACGAAGACAG，序列5’段使用FAM标记，3’端用MGB标记；特异探针序列Probe-T:CCCCTTAATGAAGACAG,序列5’段使用VIC标记，3’端用MGB标记。
一种检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型的方法，所述的方法包括如下步骤：
1)、提取待测样本的外周血基因组DNA；
2)、PCR扩增：所使用的扩增引物序列为：正向引物Primer-F：CAGCAATGGGTAGGAGA，反向引物Primer-R：CTTCTCAGGGCCCCAG；特异探针序列Probe-C：CCCCTTAACGAAGACAG，其中序列5’段使用FAM标记，3’端用MGB标记，特异探针序列Probe-T:CCCCTTAATGAAGACAG,其中序列5’段使用VIC标记，3’端用MGB标记；
PCR扩增反应组分：
扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火20s；65℃延伸40s；40个循环；
4)、荧光信号的收集：选择FAM和VIC，数据的采集定在65℃；
5)、通过收集的FAM和VIC的荧光信号进行结果分析，对基因型进行判定。
进一步的，步骤5)中的判定方法为：进行Allelic Discrimination(等位基因的检测)分析，X轴为Allele 1信号,Y轴为Allele 2，进行散点图判读：
如果位置靠近X轴，判读为CC样品为CC型；
如果位置靠近Y轴，判读为TT样品为TT型；
如果位置靠近对角线，判读为CT样品为CT型。
进一步的，步骤5)中的判定方法为采用曲线分析判读：
如果只有一条扩增曲线，判读为CC或者TT型；
如果有2条扩增曲线，判读为CT样品为CT型；
如果无扩增曲线，样本基因型无法判读，需要重新检测。
一种检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型的应用，通过检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型预测AS患者对TNF-α拮抗剂的治疗有效性。
本发明的有益效果在于：创新性地检测TNF-a基因SNP位点rs1799724(-857C/T)基因型，使用荧光定量PCR技术，对TNF-a基因的rs1799724突变位点，设计PCR引物和探针进行基因型检测，灵敏度高，特异性好，检测迅速；利用标记荧光的探针能和模板特异性结合，根据特异结合的探针类型，PCR反应时可以产生对应的荧光信号的原理，通过荧光信号类型分辨不同样本的基因型，应用本发明对TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型的分型与测序结果完全一致，能够用于AS患者TNF-a拮抗剂治疗效果的预测。
附图说明
图1为rs1799724基因分型散点图结果判读模式；
图2为rs1799724基因分型扩增曲线结果判读模式。
具体实施方式
一、样本DNA提取质检
使用常规的血液DNA提取试剂盒进行样本提取：样本满足10-100ng/μl、纯度OD260/280＝1.7-2.0。
二、PCR扩增
所使用的扩增引物序列为：正向引物Primer-F：CAGCAATGGGTAGGAGA；反向引物Primer-R：CTTCTCAGGGCCCCAG。特异探针序列Probe-C：CCCCTTAACGAAGACAG，序列5’段使用FAM标记，3’端用MGB标记；特异探针序列Probe-T:CCCCTTAATGAAGACAG,序列5’段使用VIC标记，3’端用MGB标记。
PCR扩增反应组分：
3.PCR扩增(在PCR扩增区进行)
将上述20μl PCR反应管放入荧光定量PCR仪(ABI7500)中，设置扩增程序如下：
荧光信号的收集选择FAM和VIC，数据的采集定在65℃。
三、检测结果的解释
扩增反应完成后，通过收集的FAM和VIC的荧光信号进行结果分析，ABI荧光PCR仪进行Allelic Discrimination分析，X轴为Allele 1信号,Y轴为Allele 2。
请参照图1，以下以Allele 1是设置为FAM(代表基因C)，Allele 2是设置为VIC(代表基因T)为例分析。按照上述设置在基因分型散点图中，CC型样本聚集在靠近X轴位置，TT型样本聚集在靠近Y轴位置，CT型样本聚集在X和Y轴靠近对角线位置，阴性对照靠近原点。
(1)、散点图判读
1.位置靠近X轴，结果判读为CC样品为CC型(纯和突变)；
2.位置靠近Y轴，结果判读为TT样品为TT型(野生型)；
3.位置靠近对角线，结果判读为CT样品为CT型(杂合突变)；
(2)、Amplification plot模式判读
如果只有一条扩增曲线，根据设置的Allele，结果判读为CC或者TT型(纯合样本)；如果有2条扩增曲线，结果判读为CT样品为CT型(杂合突变)；如果无扩增曲线，样本基因型无法判读，需要重新检测(图2为组合图)。

Claims (6)

1.一种用于检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物的序列为：
正向引物Primer-F：CAGCAATGGGTAGGAGA；
反向引物Primer-R：CTTCTCAGGGCCCCAG。
2.一种用于检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括有如权利要求1所述的引物对和特异探针，所述的特异探针序列Probe-C：CCCCTTAACGAAGACAG，序列5’段使用FAM标记，3’端用MGB标记；特异探针序列Probe-T:CCCCTTAATGAAGACAG,序列5’段使用VIC标记，3’端用MGB标记。
3.一种检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
1)、提取待测样本的外周血基因组DNA；
2)、PCR扩增：所使用的扩增引物序列为：正向引物Primer-F：CAGCAATGGGTAGGAGA，反向引物Primer-R：CTTCTCAGGGCCCCAG；特异探针序列Probe-C：CCCCTTAACGAAGACAG，其中序列5’段使用FAM标记，3’端用MGB标记，特异探针序列Probe-T:CCCCTTAATGAAGACAG,其中序列5’段使用VIC标记，3’端用MGB标记；
PCR扩增反应组分：
扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火20s；65℃延伸40s；40个循环；
4)、荧光信号的收集：选择FAM和VIC，数据的采集定在65℃；
5)、通过收集的FAM和VIC的荧光信号进行结果分析，对基因型进行判定。
4.如权利要求3所述的一种检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型的方法，其特征在于，步骤5)中的判定方法为：以Allele 1是设置为FAM，Allele 2是设置为VIC，X轴为Allele1信号,Y轴为Allele 2，进行散点图判读：
如果位置靠近X轴，判读为CC样品为CC型；
如果位置靠近Y轴，判读为TT样品为TT型；
如果位置靠近对角线，判读为CT样品为CT型。
5.如权利要求3所述的一种检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型的方法，其特征在于，步骤5)中的判定方法为：采用曲线分析判读：
如果只有一条扩增曲线，判读为CC或者TT型；
如果有2条扩增曲线，判读为CT样品为CT型；
如果无扩增曲线，样本基因型无法判读，需要重新检测。
6.一种检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型的应用，其特征在于，通过检测TNF-a基因SNP位点rs1799724基因型预测AS患者对TNF-α拮抗剂的治疗有效性。
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