CN103502451A

CN103502451A - 强直性脊柱炎相关特异性单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN103502451A
Application number: CN201180067457.9A
Authority: CN
Inventors: 古洁若
Original assignee: Individual
Current assignee: Third Affiliated Hospital Sun Yat Sen University; Sun Yat Sen University
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2031-10-27
Also published as: CN103502451B; WO2013060004A1

Abstract

提供了强直性脊柱炎致病相关性单核苷酸多态性的核苷酸片段。强直性脊柱炎患者中，该核苷酸片段在rs4552569位点上为C的频率显著高于健康对照，该位点上碱基为T的频率则显著低于健康对照，即在rs4552569位点上碱基为C时，能有效帮助AS疾病的诊断。还提供了检测相应强直性脊柱炎致病相关性单核苷酸多态性的方法及其试剂盒，能够对强直性脊柱炎进行早期特异性的辅助诊断。

Description

强直性脊柱炎相关特异性单核苷酸多态性的检测方法及其试剂盒技术领域

本发明申请涉及一种检测强直性脊柱炎相关的特异性单核苷酸多态性

( SNP ) 的方法及专用试剂盒，属于生物医学检测技术领域。

背景技术

强直性脊柱炎 ( ankylosing spondylitis , AS ) 是脊柱关节病 ( spondyloarthropathies, SpA ) 的一种亚型，它主要的临床表现为炎性腰背痛、晨僵、脊柱活动受限等中轴表现，或 /和并发外周关节炎、肌腱末端、韧带附着点炎，至疾病晚期，会出现脊柱强直或畸形。以往的研究中认为遗传因素的作用在 AS的发病机制中占据了更为重要的作用，既往的基于双胞胎的研究表明，在单卵双生和异卵双生的双胞胎中高的一致的发病率提示遗传因素在 AS 的发病机制中的作用超过了 90%。

在有关 AS致病基因的研究过程中， HLA-B27是最早也是被认为与 AS的家族聚集性的遗传相关的重要的基因。但在基因风险方面，研究认为 HLA-B27在疾病的总的遗传风险大约只占了 20-30%, 而整个 MHC占的比例约是 40-50%。 MHC又叫主要组织相容性复合体，是存在于脊推动物某一染色体上编码主要组织相容性抗原的一组紧密连锁的基因群，与免疫应答、免疫调节和移植排斥等有关。研究表明，在单卵双生的双胞胎中， HLA-B27的一致的机率是 63% , 在双卵双生的双胞胎中 HLA-B27的一致的机率是 23%。研究还显示： AS患者的 HLA-B27 阳性的一级亲属患病机率是没有家族史的 HLA-B27 阳性的个体的 6-16倍，这些都提示非 HLA-B27的家族性的因素在疾病的发展中也起到重要的作用。这为研究强直性脊柱炎的发生和发展的机制开辟了全新的思路，通过对全基因组的 SNP芯片全扫并分析，寻找与强直性脊柱炎相关的易感 SNP, 从而探讨强直性脊柱炎的致病或易感基因。

单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA序列多态性，它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的 90%以上。 SNP在人类基因组中广泛存在，平均每 500 ~ 1000个碱基对中就有 1个，估计其总数可达 300万个甚至更多。 SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换 (transition)或颠换 (transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。在基因组 DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此 SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的 SNP(coding SNP, cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的 1/5, 但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此 cSNP的研究更受关注。从对生物的遗传性状的影响上来看， cSNP又可分为 2种：一种是同义 cSNP(synonymous cSNP), 即 SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义 cSNP(non-synonymous cSNP), 指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因， cSNP中约有一半为非同义 cSNP; 此外， SNP也可作为遗传标记，帮助寻找和确定疾病的易感基因。

在 2007年， Brown等就根据自制的密集型 SNP芯片对大样本的 AS患者和健康志愿者对照人群间进行了全扫并验证，同时指出了 IL23R和 ARTS1 这两个基因可能是 AS的新易感基因，随后韩国和中国的研究机构对 ARTS1基因之进行验证，结果认为 ARTS1与 AS存在关联；中国的研究机构还对 IL-23R进行了验证，结果未发现两者之间存在关联，这提示了不同种群间可能存在着差异。而且上述 2007 年的 Brown的研究中虽然采用密集型 SNP芯片，但是该芯片并未对这个基因组都做密集型 SNP的全扫，只是针对感兴趣的位置来定制密集型 SNP芯片，所以会导致芯片在其它未覆盖到的或 SNP标记不够密集全扫的区域出现遗漏。于是在 2010 年 Brown等采用了的 Illumina HumHap 370 芯片对欧洲人种后代的澳大利亚、英国和北美 AS患者和健康志愿者对照人群进行全扫并验证，结果除了发现之前研究提出的 ARTS1和 IL-23R^因可能是 AS的易感基因之外，还提示 ANTXR也可能与 AS相关联，同时还提示了 2pl5和21q22存在与AS相关联的SNP。

随着芯片技术的迅速发展， Illumina HumHap 370 芯片之后又出现了 Illumina Human lM-duo芯片、 Illumina Human610-Quad 芯片和 Illumina OmniExpress芯片提供了更为密集的 SNP标记，覆盖的区域更加广泛。考虑上文提到的研究背景，我们设计了以 Illumina Human lM-duo芯片、 Illumina Human610-Quad 芯片和 Illumina OmniExpress芯片在中国汉族 AS患者和健康志愿者对照人群中进行全扫并进行关联分析，即全基因组关联分析研究（ GWAS ), 以探索是否能发现 AS的相关的易感基因。

由于强直性脊柱炎是较为常见的疾病，病程缠绵，且易造成残疾，故应争取早期诊断、治疗，尤其对于 16-25岁的青年更是如此。为了加强早期诊断强直性脊柱炎，本领域迫切需要寻找出与强直性脊柱炎密切相关的 SNP, 并设计出检测强直性脊柱炎特异性的方法和试剂盒。

目前为止，对于强直性脊柱炎的诊断，除了从临床症状以及影像学资料来进行辅助判断外，还未有特异性的实验室诊断指标和相应的方法以及试剂盒对该疾病进行特异性诊断的报道。发明内容

本发明申请即是针对目前在 AS 的早期诊断中尚缺乏特异性的检测方法及相关试剂盒的不足之处，提供一种特异性强的检查方法，并提供专用的试剂盒。

本发明申请经过深入而广泛的研究，通过密集型的全基因组 SNP芯片对大样本的强直性脊柱炎患者和健康对照人群进行全基因组关联分析，在国际上首次发现并证明了 SNP rs4552569与强直性脊柱炎存在明显相关性（该 SNP碱基是 C (胞嘧啶）时为风险型，是 T (胸腺嘧啶）时为保护型， Ρ=8.77χ 10—¹⁽⁾, 该项研究已经被国际权威杂志 Nature Genetic刊用，将于近期发表），因此， SNP rs4552569可作为检测强直性脊柱炎的特异性 SNP, 是强直性脊柱炎早期重要的辅助诊断指标，并在此基础上完成了本发明。

本发明申请的目的之一是提供一种强直性脊柱炎致病相关性单核苷酸多态性（SNP )的核苷酸片段，该核苷酸片段在 rs4552569位点上，强直性脊柱炎（AS ) 患者碱基为 C的频率显著高于健康对照，相反，该位点上碱基为 T的频率则显著低于健康对照，即在 rs4552569位点上碱基为 C时，能有效帮助 AS疾病的诊断。

本发明申请的目的之一是提供一种对强直性脊柱炎进行早期辅助性诊断的方法，该方法是通过下述方案实现的：从待测样品中得到核苷酸序列，检测位于 rs4552569位点上的碱基是否为 C, 如果该位点的碱基为 C, 则强直性脊柱炎的患病几率显著增大。

进一步的，所述的样品包括血液、体液或组织。

进一步的，所述的方法包括下述的步骤：

1、提取待测样本中的 DNA;

2、以该 DNA为模板，以针对 rs4552569碱基附近的编码区设计 PCR引物进行 PCR反应，得到 PCR反应产物；

3、测出该 PCR反应产物的碱基序列组成；

4、将得到的碱基序列与正常基因序列进行比较，确定 rs4552569位点上的碱基是否为 C。

在上述方法中，从待测样品中得到的核苷酸序列的方法还包括荧光定量 PCR、变性高效液相色谱、限制性片段长度多态性、连接酶检测或 DNA片段测序。

本发明申请的目的之一是提供对上述强直性脊柱炎特异性单核苷酸多态性进行检测的方法，所述的方法包括如下步骤：

1. 引物设计：

使用 Sequenom公司 Genotyping Tools及 MassARRAY Assay Design软件设计 rs4552569位点的 PCR扩增引物及单碱基延伸引物；

2. 组织、细胞及血样 DNA提取：

使用 TIANamp Blood DNA kit血液基因组 DNA提取试剂盒或 NucleoSpin Tissue(MN)提取组织、细胞或血样中的 DNA, 用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，质检合格的 DNA将浓度调整到 5( ig/L, -20 °C储存备用；

3. PCR扩增：

采用多重 PCR扩增技术，每个反应总体积 5μ1, 包含模板 DNA 10 η^ , Hotstar Taq 0.5 U, 扩增引物每条 0.5pmol, 25mM dNTP Ο. ΐμΐ,反应条件为 94 °C 4 分钟； 94 °C20 秒， 56 °C30 秒， 72 °C 1 分钟， 45个循环； 72 °C 3分钟； 4°C∞ ；

4. PCR产物纯化：

PCR反应产物使用 0.5 U SAP ( shrimp alkaline phosphatase )处理，去除体系中游离的 dNTP,反应体系 7 μΐ,其中 PCR产物 5 μΐ, SAP混合液 2 μΐ (SAP 0.5 U, buffer 0.17 μΐ), 反应程序 37°C 20分钟； 85 °C 5分钟； 40 °C ∞;

5. 单碱基延伸：

总体积 9 μΐ反应体系包含 SAP处理后 PCR产物 7 μΐ, 其中各延伸反应引物混合物 0.804 μΐ, iPLEX酶 0.041μ1, 延伸混合物 0.2 μΐ,反应程序为 94°C 30秒； 94 °C 5秒； 52 °C 5秒， 80 °C 5秒 5个循环；返回 94 °C 5秒，共 40个循环； 72 °C 3分钟， 4°C oo;

6. 树脂纯化：

每个延伸反应产物用 6mg Clean Resin树脂纯化；

7. 芯片点样及质语检测：

将纯化产物移至 384 孔 SpectroCHIP (Sequenom)芯片上进行测定， SpectroCHIP 芯片使用 MALDI-TOF ( matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight )基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析，检测结果使用 TYPER 4.0软件 ( sequenom )分型并输出结果；

8. 将 rs4552569位点检出的单碱基进行分析，如果该位点的碱基为胞嘧啶 ( C ) , 则强直性脊柱炎的患病几率显著增大。

本发明申请的目的之一是提供检测强直性脊柱炎特异性单核苷酸多态性的试剂盒，该试剂盒包括：针对 rs4552569碱基附近的区域设计的 PCR扩增引物、延伸引物、 DNA聚合酶、去离子水、 dNTP、 MgC12、 PCR緩沖液、 SAP、 clean resin树月旨。

本发明申请的目的之一是提供上述强直性脊柱炎特异性单核苷酸多态性 ( SNP )在强直性脊柱炎治疗中的应用，即 rs4552569位点上的碱基是 C时为风险型，是 T时为保护型在强直性脊柱炎治疗中的应用。

进一步的，所述强直性脊柱炎特异性单核苷酸多态性相关的易感或致病基因是在 rs4552569位点上的碱基为胞嘧啶 C。

上述的应用包括强直性脊柱炎特异性单核苷酸多态性（ SNP )相关的易感或致病基因在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用。

具体来讲，该应用包括通过干预 rs4552569 的相关的强直性脊柱炎的易感或致病基因的功能，包括翻译、转录及蛋白质合成的过程，制备成治疗药物，改善患者的骨代谢异常以及体内的免疫炎症反应，从而达到治疗目的。

具体实施方式

以下结合具体的实施方式，对本发明申请所述的强直性脊柱炎易感性检测方法及其试剂盒进行描述，目的是为了公众更好的理解本发明申请所述的技术内容，而不是对所述技术内容的限制，事实上，在以相同或近似的原理，对所述方法步骤、试剂、反应条件已经对所述试剂盒做出的任何改进，以实现基本相同的效果为目的，则都在本发明申请所要求保护的技术方案之内。实施例一

SNP rs4552569与强直性脊柱炎的发病相关性研究一

1.1 研究对象

研究中的 1837例散发 AS病例，主要是 2005-2009年于中山大学附属第三医院门诊就诊或住院的 AS患者，这些 AS患者均是由经验丰富的风湿病学专家们根据临床表现和影像学检查结果诊断的符合 1984年纽约修订标准的 AS患者。对于每个 AS患者，在被告知之该研究目的之后同意抽血用于该研究，并签署知情同意书。

4231例健康志愿者对照人群则主要包括了广东、安徽和新加坡的华人三个地方的无 AS症状或病史的健康志愿者对照人群，这些健康志愿者同样在被告知之后同意抽血用于该研究，并签署知情同意书。

收集病例时，同时记录好病例和健康志愿者对照人群的基本情况，包括：性别、年龄和籍贯。抽取全血 4ml, 放于 EDTA管，带回实验室提取 DNA。另外，除了抽血，风湿病专家还仔细询问并记录下每个 AS患者和健康志愿者对照人群的情况，尤其是 AS患者时还记录下基本情况（包括：性别、年龄、发病年龄、病程）和临床表型（包括：腊样指、髋关节受累、外周关节炎、炎性腰背痛）。而对于健康志愿者对照人群，则仔细询问既往病史，包括呼吸系统、心血管系统、内分泌系统、血液系统、消化系统、骨几肉系统、神经系统等各个专科的情况，另外重点排除风湿免疫科的病史，询问是否有腰背痛等既往病史。 1.2 实验方法和结果

1.2.1 DNA的提取

在该研究中，我们使用的是 TIANamp Blood DNA kit血液基因组 DNA提取试剂盒，从人的外周血样本中提取 DNA, 该试剂盒的组成是：细胞裂解夜、緩沖液 GS、緩沖液 GB、緩沖液 GD、漂洗液 PW, 洗脱緩沖液 TB、蛋白酶 K、吸附柱 CB3、收集管（2ml )、 1.5mL无菌收集管。

1.2.2.研究采用的密集型的全基因组的 SNP芯片

研究采用了 Illumina HuamHap 610-Quad SNP 芯片、 Illumina Human lM-duo 芯片和 Illumina OmniExpress芯片对样本进行全基因组 SNP全扫，下面是三种 Illumina芯片的筒介；

1、 Illumina HuamHap 610-Quad SNP 芯片

该芯片筒介：该款芯片在一张芯片上可平行进行 4个样品的检测，显著的增加了样本输出信息量，减少了实验操作中的误差。该芯片广泛地采用了 HumanHap550芯片的内容，以及额外增加了 100,000个遗传标记。 Human 610-quad 涵盖的全基因组信息，对于已知的和新近报道的 CNV区域来说都具有权威性。 Illumina HuamHap 610-Quad SNP 芯片的 SNPs以约 5kb的密度均匀分布在基因组上。针对于基因组中高多态性的 CNV区域（片段复制区和无 SNP的基因组区域）， Illumina HuamHap 610-Quad SNP 芯片设计了一些特异的靶标来进行研究。

Illumina Human lM-duo芯片。

该芯片中包含了超过一百万个探针信息。该款芯片门包含针对基因 SNPs, 标签 SNPs, 拷贝数变化（CNV ), 及其他高价值的基因组区域设计探针，同时还增加了一些新的位点，如：增加了疾病相关的 SNP位点，灵活的选择一些基因组编码区高密度的 SNP位点。

2、 Illumina OmniExpress芯片

该芯片提供了高样品通量和全面的基因组内容， OmniExpress上可容纳 12 个样品，芯片拷问每个样品的 70多万个变异，单张芯片上总共有超过 800万个数据点。 OmniExpress上的标志物是 Illumina的 HumanOmnil-Quad内容的一部分, 它从国际 HapMap计划所有三个阶段中选择的优化 SNP标签组合，有了最高的数据质量和最佳内容，包括对拷贝数变异（CNV )应用的全面支持。

1.2.3研究步骤

我们通过上述三种芯片对所有的散发 AS病例以及健康志愿者对照进行全基因组 SNP分型。然后进行关联分析，分析中对性别、年龄和主成份分析结果的数据分别进行校正，寻找具有统计意义的 SNP(s), 即可能与疾病相关的 SNP(s)。 1.2.3.1 样本准备和基因分型

在从全血样本中提取 DNA后，所有的 DNA均标准化为 50ng/ml的浓缩液。对于高密度 SNP芯片分型，我们根据 Illumina推荐的操作程序，通过芯片，我们使用大约 200ng的 DNA进行样本的基因分型，并利用 Illumina Beadstudio进行数据读取和基因型转换。数据结果中有 272386个 SNP是 3个芯片都均有覆盖，另外有通过统计学分析后推算出 1083964个 SNP也用于分析。

1.2.3.2数据分析的质量监控 ( quality control, QC )

研究对 AS病例、健康志愿者对照人群分别进行 SNP的质量控制和监控，其中包括可读率（ call rate ) <95%, 次等位基因（ MAF , minor allele frequency ) <3%, 以及不符合哈迪 -温伯格平衡 (Hardy- Weinberg Equilibrium, HEW, P < 10-6) , 以尽可能去除分型错误的 SNP; 在得到全扫的样本的基因型数据之后，我们分析并计算杂合度，取杂合度范围从杂合度平均值（Mean ) -3χ标准差（ SD )到杂合度平均值（Mean ) +3χ标准差（ SD ) 区间内的样本资料进行统计学分析，不在这区间的样本将移除。不纳入进一步的统计中。然后，我们利用 PLINK软件和基于 IBS ( identical by state ) 的方法，分别对这些数据进行遗传关系检验；对于那些基于遗传分析的重复或具有亲缘关系的一对标本，我们去除其中一个可读率较低的。我们利用主成份分析 ( principle component analysis, PCA )方法，以及 HapMap数据库 z中人群数据，检测样本中的人群分层现象，并去除显著离群的样本。最后，再取这几个独立数据的交集。

1.2.3.3统计学分析

对于全扫数据进行的分析，由于存在一定程度的人群离散、分层现象，所有成分分析（PCA ) 并得到 3个主成份，分析这 3个组分之间是否存在样本聚类现象，以明确是否需要将这些样本的群体离散度作为校正的参数；然后，我们在根据这些样本的数据绘制百分位图（Quantile-Quantile plot ), 在绘制之前，需要对所有需要校正的因素进行校正，这些因素包括性别、年龄（如果散发病例和健康志愿者对照人群间存在统计学上差异）以及上述 PCA分析后如果存在聚类现象的主成份，结果会得到 GC值，在分析数据结果时，我们用软件将每个散发病例的等位基因的频率与健康志愿者对照人群的基因频率进行卡方检验，会得到卡方值 A , 而 , 如果 QC越接近 1 , 即表示样本的效力越高，如果出现偏移，则提示可能有两种情况：一种是样本存在分层现象即人群离散较为明显；第二种是存在与疾病风险相关的 SNP。

经过上述分析后，如果 PCA分析结果提示主成份之间存在分层现象，即存在人群离散度的差异，我们将该存在差异的离散度也作为协变量进行校正，此外我们将年龄和性别（如果散发病例和健康志愿者对照人群间存在差异）作为协变量，利用 PLINK软件进行 logistic回归分析，寻找与疾病关联的 SNP位点。我们用 Haploview (v4.1)软件进行分析结果的展示，即 SNP染色体位置及其 -loglOP表示的 Manhattan图。

1.2.3.4 SNP的推算及连锁不平衡模式分析

对 3个芯片中的用于分析的推算 SNP是通过 IMPUTE2软件（版本号： 2.1.0 ) 来完成的，使芯片对染色体的覆盖范围达到最大化。

1.2.4结果

SNP rs4552569在 1837例 AS和 4231例健康志愿者对照中存在明显差异， P值

=6.91 x 10— ⁵, 即与强直性脊柱炎存在明显相关性，该 SNP碱基是 C时为风险型， T 时为保护型。

上述结果表明， 36.3Genome Buildde人类组基因图谱中的 5号染色体的 83209349位的 SNP rs4552569中，碱基 T→C改变，增加了 AS的易感性，等位基因型 C与 AS的发生显著相关。 SNP rs4552569与强直性脊柱炎的发病相关性研究二

2.1 研究对象

研究中的 2205例散发 AS病例，主要是 2005-2009年于中山大学附属第三医院门诊就诊或住院的 AS患者及部分其它医院取得的样本，这些 AS患者均是由经验丰富的风湿病学专家们根据临床表现和影像学检查结果诊断的符合 1984年纽约修订标准的 AS患者。对于每个 AS患者，在被告知之该研究目的之后同意抽血用于该研究，并签署知情同意书。

3702例健康志愿者对照人群则主要来自中山大学附属第三医院及中山大学肿瘤防治中心收集的健康志愿者人群，该人群均为无 AS症状或病史的的健康志愿者对照人群，这些健康志愿者同样在被告知之后同意抽血用于该研究，并签署知情同意书。

2.2 实验方法和结果

2.2.1 DNA的提取

在该研究中，我们使用的是 TIANamp Blood DNA kit血液基因组 DNA提取试剂盒从人的外周血样本中提取 DNA, 该试剂盒的组成是：细胞裂解夜、緩沖液 GS、緩沖液 GB、緩沖液 GD、漂洗液 PW,洗脱緩沖液 TB、蛋白酶 K、吸附柱 CB3、收集管（2ml )、 1.5mL无菌收集管。

2.2.2研究步骤

2.2.2.1引物设计

用 Sequenom公司 Massarray® DNA质谱阵列基因分析系统的 iPLEX® Gold snp基因型分析技术进行引物设计（包括扩增引物和延伸引物）。 SNP rs4552569 的引物信息如下：

为区别扩增引物和延伸引物，提高 PCR效率和质语质量，在扩增引物的 5，端加上了一个十个碱基的标记，即 5，-ACGTTGGATG-3，。并在下列实验条件下进行扩增延伸及分析。

2.2.2.2基因组 DNA扩增（聚合酶链式反应 PCR ):

2.2.2.2.1 反应体系如下：

2.2.2.2.2 PCR步骤：

在 384孔板中每孔加入模板 DNAlul, 再加入 4ul上述反应体系，将 384孔板 1000转离心 1分钟，混匀后按照下列程序进行扩增： 94。 C 4 minutes预变性， 94。 C 20 秒， 56° C 30秒， 72° C 1 分钟共 45个循环， 72° C 3 minutes, 4° C 冷却。

2.2.2.3 质谱分析：

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS) 的主要特点是，先通过 PCR扩增目标序列，然后加入 snp序列特异延伸引物，在 SNP位点上，延伸 1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管 , 而后用瞬时纳秒（l(T⁹s) 强激光激发，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达检测器。 MALDI产生的离子常用飞行时间 ( Time-of-Flight,TOF )检测器来检测，离子质量越小，就越快到达。用该方法可快捷方便的检测出上述 PCR反应产物中 SNP的基因型。

2.2.2.4 统计分析

研究对 AS病例、健康志愿者对照人群分别进行 SNP的质量控制和监控，其中包括可读率（ call rate ) <95%, 次等位基因（ MAF, minor allele frequency ) <3%, 以及不符合哈迪 -温伯格平衡 (Hardy- Weinberg Equilibrium, HEW, P < 10-6) 的样本将不用于进一步分析。通过质量控制后， 2,100例患者和 3,496 例健康对照通过了质量控制，用于进一步的统计分析。利用 PLINK软件及 R方法对验证的样本及所有的样本进行 logistic回归分析，寻找与疾病关联的 SNP位点。并用 Haploview (v4.1)软件绘制 SNP位点所在区域的连锁图。

2.2.3 结果

SNP rs4552569在 2205例 AS和 3702例健康志愿者对照中存在明显差异， P值 =2.92χ10"⁰⁶, 即与强直性脊柱炎存在明显相关性，该 SNP碱基是 C时为风险型， Τ 时为保护型。上述结果表明， 36.3Genome Buildde人类组基因图谱中的 5 号染色体的 83209349位的 SNP rs4552569中，碱基 T→C改变，增加了 AS的易感性，等位基因型 C与 AS的发生显著相关。实施例三

3.1.1研究对象

研究中的对象是所有实施例 1和实施例 2中的 AS人群和健康对照人群，这些 AS病例，均是由经验丰富的风湿病学专家们根据临床表现和影像学检查结果诊断的符合 1984年纽约修订标准的 AS患者。对于每个 AS患者，在被告知之该研究目的之后同意抽血用于该研究，并签署知情同意书。最终，共计有 3937例 AS患者和 7727例健康志愿者对照纳入该研究。

3.2.2 DNA的提取

在对待检测的标本，使用 TIANamp Blood DNA kit血液基因组 DNA提取试剂盒，从人的外周血样本中提取 DNA, 该试剂盒的组成是：细胞裂解夜、緩沖液 GS、緩沖液 GB、緩沖液 GD、漂洗液 PW, 洗脱緩沖液 TB、蛋白酶 K、吸附柱 CB3、收集管 ( 2ml )和 1.5mL无菌收集管。

3.2.3 实验步骤

我们将经过数据质量控制后的实施例一中的所有 AS患者和健康对照的有关 SNP rs4552569 的数据提取出来，同时提出经过数据质量控制后的实施例二中的所有 AS患者和健康对照的有关 SNP rs4552569 的数据；经过整理放入同一数据库进行分析。统计学分析则是利用 PLINK软件所有的样本的 SNP rs4552569 的数据进行 logistic回归分析，并且校正了年龄、性别等干扰因素，从而寻找 SNP rs4552569 的数据与疾病间是否存在关联。 3.3 实验结果：

结果 SNP rs4552569在 AS患者和健康志愿者对照中存在明显差异， P值 =8.77χ 10"¹⁰, 即 SNP rs4552569位点上的碱基与强直性脊柱炎存在明显相关性，该 SNP碱基是 C时为风险型， T时为保护型。结果与实施例一和实施例二的研究结果均一致。实施例四

4.1.1 研究对象

所有欲检测是否携带有强直性脊柱炎易感基因的患者及家属。

4.2.2 DNA的提取

在对待检测的标本，使用 TIANamp Blood DNA kit血液基因组 DNA提取试剂盒，从人的外周血样本中提取 DNA, 该试剂盒的组成是：细胞裂解夜、緩沖液 GS、緩沖液 GB、緩沖液 GD、漂洗液 PW, 洗脱緩沖液 TB、蛋白酶 K、吸附柱 CB3、收集管（2ml )、 1.5ml无菌收集管。

4.2.3 实验步骤

4.2.3.1 PCR步骤：

在待检测板中每孔加入模板 DNAlul, 再加入 4ul上述反应体系， 1000转离心 1分钟，混匀后按照下列程序进行扩增： 94。 C 4 minutes预变性， 94。 C 20 秒， 56° C 30秒， 72° C 1 分钟共 45个循环， 72° C 3 minutes, 4° C 冷却。

3.2.3.2质谱分析：

经树脂纯化后，将制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质语仪的真空管 , 而后用瞬时纳秒（10-9s) 强激光激发，用该方法可快捷方便的检测出上述 PCR^应产物中 SNP的基因型。 4.3 实验结果：

检测结果为 C时为风险型，检测结果为 T时为保护型。

该试剂盒包括：针对 rs4552569碱基附近的区域设计的 PCR扩增引物、延伸引物、 DNA聚合酶、去离子水、 dNTP、 MgC12、 PCR緩沖液、 SAP、 clean resin 树脂。其中扩增引物、延伸引物如下表所示：

检测方法步骤如下：

1. 引物设计：

使用 Sequenom公司 Genotyping Tools及 MassARRAY Assay Design软件设计待测 SNP位点的 PCR扩增引物及单碱基延伸引物；

2. 组织、细胞及血样 DNA提取：

3. PCR扩增：

采用多重 PCR扩增技术，每个反应总体积 5μ1, 包含模板 DNA 10 g, Hotstar Taq 0.5 U, 扩增引物每条 0.5pmol, 25mM dNTP Ο.ΐμΐ,反应条件为 94 °C 4 分钟； 94 °C20 秒， 56 °C30 秒， 72 °C 1 分钟， 45个循环； 72 °C 3分钟； 4°C∞ ；

4. PCR产物纯化：

PCR反应产物使用 0.5 U SAP ( shrimp alkaline phosphatase )处理，去除体系中游离的 dNTP,反应体系 7 μΐ,其中 PCR产物 5 μΐ, SAP混合液 2 μΐ (SAP 0.5 U, buffer 0.17 μΐ), 反应程序 37 °C 20分钟； 85 °C 5分钟； 40 °C ∞;

5. 单碱基延伸：

总体积 9 μΐ反应体系包含 SAP处理后 PCR产物 7 μΐ, 其中各延伸反应引物混合物 0.804 μΐ, iPLEX酶 0.041μ1, 延伸混合物 0.2 μΐ, 反应程序为 94°C 30秒； 94 °C 5秒； 52°C 5秒， 80°C 5秒 5个循环；返回 94 °C 5秒，共 40个循环； 72°C 3分钟， 4°C oo;

6. 树脂纯化：

每个延伸反应产物用 6mg Clean Resin树脂纯化；

7. 芯片点样及质语检测：

将纯化产物移至 384孔 SpectroCHIP (Sequenom)芯片上进行测定， SpectroCHIP芯片使用 MALDI-TOF ( matrix-assisted laser desorption/ionization— time of flight )基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析，检测结果使用 TYPER 4.0软件 ( sequenom )分型并输出结果；

8. 将 rs4552569位点检出的单碱基进行分析，如果该位点的碱基为胞嘧啶，则强直性脊柱炎的患病几率显著增大。

Claims

1、一种强直性脊柱炎致病相关性单核苷酸多态性的核苷酸片段, 其特征在于-.该核苷酸片段在 rs4552569位点上，强直性脊柱炎患者碱基为 C的频率显著高于健康对照，相反，该位点上碱基为 T的频率则显著低于健康对照。

2、一种对强直性脊柱炎进行早期辅助性诊断的方法，其特征在于，所述的方法是通过下述方案实现的：从待测样品中得到核苷酸序列，检测位于 rs4552569 位点上的碱基是否为 C,如果该位点的碱基为 C，则强直性脊柱炎的患病几率增大。

3、根据权利要求 2所述的方法，其特征在于：所述的样品包括血液、体液或组织。

4、根据权利要求 2所述的方法，其特征在于：所述的方法包括下述的步骤:

1) 提取待测样本中的 DNA;

2) 以该 DNA为模板，以针对 rs4552569碱基附近的编码区设计 PCR引物进行 PCR反应，得到 PCR反应产物；

3) 测出该 PCR反应产物的碱基序列组成；

4) 将得到的碱基序列与正常基因序列进行比较，确定 rs4552569位点上的碱基是否为（。

5、根据权利要求 2所述的方法，其特征在于：所述的从待测样品中得到的核苷酸序列的方法还包括荧光定量 PCR、变性高效液相色谱、限制性片段长度多态性、连接酶检测或 DNA片段测序。 '

6、一种强直性脊柱炎特异性单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：所述的检测方法包括如下步骤：

1 ) 引物设计：

使用 Sequenom公司 Genotyping Tools及 MassAR AY Assay Design软件设更正页（细则第 91条）计 rs4552569位点的 PCR扩增引物及单碱基延伸引物；

2 ) 组织、细胞及血样 DNA提取：

使用 TIANamp Blood DNA kit血液基因组 DNA提取试剂盒或 NucleoSpin Tissue(M )提取组织、细胞或血样中的 DNA，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，质检合格的 DNA将浓度调整到 5( ig/L, - 20°C储存备用；

3 ) PCR扩增：

采；多重 PCR扩增技术,每个反应总体积 5μ1, 包含模板 DNA 10 η^, Hotstar Taq 0.5 U, 扩增引物每条 0.5pmol, 25mM dNTP 0.1 μΐ ,反应条件为 94 °C 4分钟； 94 °C20秒， 56 "C30秒， 72 °C 1 分钟， 45个循环； 72°C 3分钟； 4°C∞ ；

4 ) PCR产物纯化：

PCR反应产物使用 0.5 U SAP ( shrimp alkaline phosphatase )处理，去除体系中游离的 dNTP,反应体系 7 μΐ，其中 PCR产物 5 μΐ, SAP混合液 2 μΐ (SAP 0.5 U， buffer 0.17 μ1)，反应程序 37°C 20分钟； 85°C 5分钟； 40 °G ∞;

5 ) 单碱基延伸 ··

总体积 9 μΐ反应体系包含 SAP处理后 PCR产物 7 μΐ, 其中各延伸反应引物混合物 0.804 μΐ, iPLEX酶 0.041μ1,延伸混合物 0.2 μΐ, 反应程序为 94°C 30秒； 94V 5秒； 52°C 5秒， 80°C 5秒 5个循环；返回 94°C 5秒，共 40个循环； 72°C 3分钟， 4°C oo;

6 ) 树脂纯化： '

每个延伸反应产物用 6mg Clean Resin树脂纯化；

7 ) 芯片点样及质谱检测：

将纯化产物移至 384 孔 SpectroCfflP (Sequenom)芯片上进行测定， SpectroCfflP 芯片使用 MALDI-TOF ( matrix-assisted laser 更正页（细则第 91条） desorption/ionization-time of flight )基质辅助激光解吸附电离飞行时间质普分析，检测结果使用 TYPER 4.0软件 ( sequenom )分型并输出结果；

8 )将 rs4552569位点检出的单碱基进行分析，如果该位点的碱基为胞嘧啶，则强直性脊柱炎的患病几率显著增大。

7、一种强直性脊柱炎特异性单核苷酸多态性检测的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括：针对 rs4552569碱基附近的区域设计的 PCR扩增引物、延伸引物、 DNA聚合酶、去离子水、 dNTP、 MgC12、 PCR緩冲液、 SAP和 clean resin 树脂。

8、权利要求 1所述的强直性脊柱炎致病相关性单核苷酸多态性在强直性脊柱炎治疗中的应用。

9、根据权利要求 8所述的应用，其特征在于：所述的应用包括强直性脊柱炎特异性单核苷酸多态性相关的易感或致病基因在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用。

10、根据权利要求 9所述的应用，其特征在于：所述强直性脊柱炎特异性单核苷酸多态性相关的易感或致病基因为 rs4552569位点上的碱基为胞嘧啶。

11、根据权利要求 8 所述的应用，其特征在于：所述的应用包括通过干预 rs455256.9的相关的强直性脊柱炎的易感或致病基因的功能，包括翻译、转录及蛋白质合成的过程，制备成治疗药物，改善患者的骨代谢异常以及体内的免疫炎症反应，从而达到治疗 PJ的。

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