CN1710107A - 一种预测强直性脊柱炎易感性的方法及试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预测强直性脊柱炎易感性的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的BAT1基因内含子1上第326位碱基多态性位点的基因型，预测受试者对强直性脊柱炎的易感性：BAT1基因第326位碱基的基因型为GG时，受试者的易感性最低；BAT1基因第326位碱基的基因型为GA时，受试者的易感性较高；BAT1基因第326位碱基的基因型为AA时，受试者的易感性最高。本发明的优点是：首次阐明了BAT1基因多态性位点与强直性脊柱炎的相关性，提供了一种预测强直性脊柱炎易感性的方法，该方法可用于强直性脊柱炎的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。

Description

一种预测强直性脊柱炎易感性的方法及试剂

技术领域

本发明涉及一种预测强直性脊柱炎易感性的方法及试剂，更具体地说是通过测定与AS相关基因BAT1的多态性预测受试者对于强直性脊柱炎的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于生物技术领域。

背景技术

强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一种自身免疫性疾病，多发于16-40岁的青壮年，男女患病比例约为4～10∶1。病变常首先发生于骶髂关节，少数重症患者表现为整个脊柱强直。此外，部分患者伴有不同程度的髋关节、眼、肺、心血管、肾等脊柱外病变。AS在白种人群中的发病率约为1％～3％，我国AS患病率约为0.2-0.6％，其中60％以上的患者伴有髋关节受累，致使20％以上AS患者残疾。炎症主要累关节囊、肌腱和韧带的骨附着点，导致局部关节粘连强直，活动受限。临床上至今尚缺乏可明显缓解和控制疾病发展的药物。AS属多基因疾病，具有明显的遗传倾向，虽然通常认为遗传与免疫因素在AS发病中起主导作用，但确切的病因和发病机制仍不清楚。

国内外学者通过疾病基因的关联研究已经初步把AS的易感基因定位在人类基因组的某些区域内，如6p21.3，16q，(LOD＝4.7)；1p，2q，9q，10q，19q与AS存在连锁关系(LOD≥2.0)(Laval SH，Timms A，Edwards S，et al.Whole-genome screening inankylosing spondylitis：evidence of non-MHC genetic-susceptibility loci.Am J Hum Genet.2001，68(4)：918-26.)及11q(Lod＝2.24)(Zhang G，Luo J，Bruckel J，et al.Genetic studiesin familial ankylosing spondylitis susceptibility.Arthritis Rheum.2004，50(7)：2246-54.)各次全基因组扫描的结果均表明HLA基因簇与AS的发生存在强连锁，提示在此区域内的人类白细胞抗原基因复合体(Human Leukocyte Antigen，HLA)内存在AS的易感基因。

疾病基因的关联研究发现在HLA内，与AS的发生呈极强的正关联，提示HLA-B27基因是AS的易感基因。此外在此区域内HLA-B60基因、HLA-DRB1基因、主要组织相容性复合体ATP结合盒转运蛋白基因(Transporter ATP-binding Cassette MajorHistocompatibility Complex，TAP)、多功能蛋白酶2(Large MμLtifunctional Protease 2；LMP2)基因、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNFα)基因、主要组织相容性复合体I类分子相关基因A(Major Histocompatibility Complex Class I Chain-RelatedGene A；MICA)、热休克蛋白70(hot shocking protein 70，HSP70)及人类白细胞抗原B相关转录体1(HLA-B associated transcript-1，BAT1)等基因与AS的发病易感。

BAT1属于HLAIII类基因，定位于6p21.33，距TNF基因家族约28Kb。此基因全长11Kb，包括11个外显子，编码428个氨基酸残基。BAT1基因的编码产物属于包含DEAD结构域的ATP依赖的RNA螺旋酶家族成员，在体内参与RNA的剪接，核糖体的组装以及起动mRNA翻译。研究表明用反义核酸封闭BAT1基因的2-5个外显子后，在抗原的刺激下TNF、IL-1、IL-6等炎症急性期细胞因子的表达水平均降低(Allcock，R.J.N.；Williams，J.H.；Price，P.The central MHC gene，BAT1，may encode a protein thatdown-regμLates cytokine production.Genes Cells 6：487-494，2001.)。由于BAT1与炎症细胞因子表达存在着密切的关系，它可能与AS发生的严重程度有关。

目前进行AS遗传病因研究，多采用SNPs作为基因组标志的关联分析方法，是有效的，已得到证明(Horikawa Y，Oda N，Cox NJ，et al.Genetic variation in the geneencoding calpain-10 is associated with tyre 2 diabetes mellitus.Nat Genet.2000；26：163-175.)。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需＞1％，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1％为同型碱基之间的转换：如G/A或T/C，29.1％为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C(胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T(胸腺嘧啶)，SNPs包含了已知多态性的80-90％，是最常见的遗传变异。

由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个(Brookes AJ.Theessence of SNPs.Gene，1999；234：177-186.)。SNPs以其密度高，平均每1kb就有1个；代表性强，位于基因内部的SNPs可能直接影响蛋白质结构或表达水平；遗传稳定性好，同微卫星多态性比较而言；易于自动化分析，因SNPs在人群中为双等位基因标记，可简单以“+/-或1/0”直接分型，成为很好的遗传标志。(Collins FS，Brooks LD，Chakravarti A.A DNA polymorphism discovery resource for research on human geneticvariation.Genome Res，1998；8：1229-1231)。

经过现有国内外文献检索，未见有BAT1及其多态位点与AS相关联的研究报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种预测强直性脊柱炎易感性的方法。

本发明的第二个目的是提供一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种预测强直性脊柱炎易感性的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的BAT1基因内含子1上第326位碱基多态性位点的基因型，预测受试者对强直性脊柱炎的易感性：BAT1基因第326位碱基的基因型为GG时，受试者的易感性最低；BAT1基因第326位碱基的基因型为AG时，受试者的易感性较高；BAT1基因第326位碱基的基因型为AA时，受试者的易感性最高。

本发明提供了一种分离核酸，具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列，第326位为A。该核酸序列为BAT1第一外显子和部分内含子的序列。图1为BAT1基因结构及其多态性变异位点的示意图，附图中包含有11个外显子，rs2239526位点标在BAT1基因图中内含子1的相应位置。

本发明提供了一组等位基因特异性的引物，具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的碱基序列，长度为21bp，而且可以特异性地扩增出SEQ ID NO.1所示序列中第326位的SNP的扩增产物。

本发明提供了一种检测强直性脊柱炎易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增BAT1基因的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。检测扩增产物与正常BAT1基因第326位SNP相互对比是否存在变异时，所需的化学试剂还包括特异性内切酶等。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下：

本发明试剂盒供10人份检测应用，

其组分、含量和来源包括：

50μL 10PCR缓冲液(Pharmacia)，

50μL 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，

10μL(2unit/μL)Taq DNA聚合酶(Takara)，

各5μL(10pmol/μL)F1(SEQ ID NO.2)和R1(SEQ ID NO.3)引物，

1ml纯水，

20μL 10×M限制性内切酶反应缓冲液(Takara)，

5μL(10u/μL)限制性内切酶HhaI(Takara)。

使用方法：

1)通过PCR扩增BAT1基因的内含子1部分片段，简言之，制备混合液，加入基因组DNA溶液20ng、2μL 10X PCR缓冲液、0.4μL 10mM dNTP、0.5单位Taq DNA聚合酶和2pmol F1和R1有义引物和反义引物，实施例2叙述的每种引物，14.7μL纯水，使总体积为20μL。PCR反应条件为95℃7min预变性，94℃40s、62℃30s、72℃40s、35个循环，72℃延伸7min。反应完成后，将3μL每种PCR反应液在8.0％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测，如扩增了183bp的片段，获得了单一条带，即为扩增成功。

2)通过用限制性内切酶处理PCR反应产物测定BAT1基因第326位SNP多态性。往10μL上述扩增的PCR反应产物中加入1μL限制性内切酶反应缓冲液、0.3μL限制性内切酶HhaI，并在37℃水浴中消化4h之后，在8.0％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。

3)多态性定型：用限制性内切酶HhaI处理片段，在第326个碱基是G等位基因时，出现109bp和74bp的条带。如为A等位基因时，仅出现183bp一个条带。

本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制如，体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。

从基因组DNA中，可扩增含BAT1基因突变点的核酸片段，以获得测定的大量样本。这种通过扩增含BAT1基因突变点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。进行PCR-RFLP方法时，欲扩增的核酸片段被设计成含有特异性酶切位点，能适用于此后RFLP方法。

对此设计无限制，只要用酶切割DNA区获得的片段长度在突变基因和野生型基因的两种情形中不同。因此，根据PCR方法扩增的所需DNA片段，通过上述合理选择的限制性内切酶得以设计。酶切产生的片段通过电泳证实，它们显示特定的条带。根据在上述方法中获得的带型，可测定BAT1基因多态性。

在利用本发明进行基因辅助诊断时，优选使用用于测定根据BAT1基因的突变类型存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定BAT1基因突变类型的方法。特定的试剂按采用的测定方法来适当地选择。试剂的特征是，组成测定由BAT1基因定义的突变类型的手段是必要的，如，DNA片段/和/或作为用于测定的特异限制性内切酶。试剂，例如特定制备的用于PCR扩增步骤的引物，该步骤用于包含BAT1基因的突变点的特定扩增片段，不被认为是本发明辅助诊断试剂的必要成分。

本发明的优点是：本发明首次阐明了BAT1基因多态性位点与强直性脊柱炎的相关性，提供了一种预测强直性脊柱炎易感性的方法，该方法可用于强直性脊柱炎的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以使公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为BAT1基因结构及其多态性变异位点的示意图。

具体实施方式

用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下。

EDTA：乙二胺四乙酸二钠

SDS：十二烷基硫酸钠

TE：10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA(pH8.0)

10×PCR缓冲液：100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM氯化镁(MgCl2)0.01％(W/V)白明胶

dNTP：脱氧核苷三磷酸

APS：过硫酸铵→10×TBE：Tris(108g)，硼酸(55g)，EDTA2Na(9.3g)，溶于纯水中，总体积为1升。

实施例1：血液样本收集和基因组DNA的提取

(1)按纽约1984年的修订诊断标准入选病例，共收取来自广东省汕头地区和银川地区无亲缘关系的AS患者59例，平均年龄24岁，其中男性45例，同地区的健康对照志愿者295例，平均年龄22-24岁，其中男性222例。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了本单位伦理委员会批准。(2)根据下列方法，制备人基因组DNA。用EDTA抗凝剂，将收集的5ml人外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清。加入0.2％NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在2500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2％的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物。将10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16μL和20μL，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37℃过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm进行离心分离10分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟。除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3M NaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70％的乙醇洗涤以获得基因组DNA。使这样获得的DNA，基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液浓度校正至30ng/μL，置-20℃冰箱保存。

实施例2 SNP的识别确定

本发明采用PCR-RFLP和PCR测序技术同时对BAT1基因的内含子1的第326位SNP位点(其等位位点对为A/G)进行检测。

1)引物的确定定位在BAT1基因转录起始点下游+252bp到+435bp，全长183bp，确定了正义链(+252--+272bp)和反义链(+414--+434bp)特异性引物如下：

F1：5′-GGGAGCAAAACGAACACAATG-3′(SEQ ID NO.2)

R1：5′-GTGGGACTGGGAGGAGGAGCT-3′(SEQ ID NO.3)

2)通过PCR扩增BAT1基因的外显子1和内含子1部分片段，简言之，PCR反应体系条件为20μL的反应体系中加入10×buffer 2μL、10mmol/L dNTP0.4μL、上下游引物(20pmol/μL)均为0.2μL、普通Taq酶(2U/μL)0.5μL、DNA基因组模板2μL。PCR反应条件为95℃7min预变性，94℃40s、62℃30s、72℃40s、35个循环，72℃延伸7min。Bio-Rad的Gel Doc 2000凝胶成像仪观察电泳条带。

3)通过用限制性内切酶处理PCR反应产物测定BAT1基因非编码区的多态性简言之BAT1 SNP(rs2239526)的PCR扩增产物通过限制性内切酶Hha I进行RFLP分型，Hha I识别酶切位点为：GCG↓C。酶切反应体系(10μL)如下：Hha I 0.3μL(10u/μL)、10×M buffer 0.7μL、PCR产物4μL以及5μL ddH₂O，37℃4h。酶切产物通过8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，Bio-Rad的Gel Doc 2000凝胶成像仪显示酶切结果。酶切产生109bp和74bp两个片段。

实施例3 BAT1基因SNP与AS的相关

统计方法：利用STATA8.0和SPSS11.0软件中Pearson卡方检验计算BAT1基因多态性的等位位点，基因型频率，AS的患病风险OR值及其95％CI可信区间，Hardy-Weinberg平衡检测，统计学的显著性水平没定为P＜0.05。

结果：位于6p23.3区域的BAT1基因上rs2239526)A/G多态位点的基因型和等位基因频率在病例对照组间的分布详见表1。

表1BAT1基因上rs2239526)A/G多态位点的基因型和等位基因频率在病例对照组间的分布

N	基因型(％)	Allele(％)
			AA            AG           GG	A            G
	AS      59Control 295	53(89.9)      6(10.1)      0(0)196(66.4)     92(31.2)     7(2.4)			112(94.9)    6(5.1)484(82.0)    106(18.0)
x2POR			x2＝13.069， P＝0.001，   df＝212.893        10.848       0.4660.000         0.001        0.4954.462         0.250        1.205	12.253       12.2530.000        0.0004.088        0.245
	95％CI	1.854-10.737  0.104-0.602  1.149-1.264			1.751-9.544  0.105-0.571

HWE AS＝0.696    Control＝0.319

表1可见，BAT1基因第326位的常见SNP位点(rs2239526)的A等位基因，即在其DNA互补链上为T等位位点，在患者群体中的分布频率大大高于在健康正常人群中的频率，(94.9％：82.0％)，有显著性差别(P＝0.000)。而且A位点的OR值为4.088，95％CI下限＞1，均表明A核苷酸位点与AS患病呈正关联，增加了AS的发病风险。与AS显著相关的SNP(rs2239526)位点，位于内含子1靠近外显子1的剪切点侧，可能通过影响DNA的空间结构，从而，这一突变位点影响DNA的转录和剪切。

实施例4检测试剂盒

制备检测AS相关风险的试剂盒，包含有可扩增出BAT1基因SNP(rs2239526)位点的引物对，及其PCR-RFLP相应试剂，如特异性酶等。本发明试剂盒供10人份检测应用，于-20℃保存，其组分、含量和来源包括：

50μL 10PCR缓冲液(Pharmacia)，

50μL 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，

10μL(2unit/μL)Taq DNA聚合酶(Takara)，

各5μL(10pmol/μL)F1(SEQ ID NO.2)和R1(SEQ ID NO.3)引物，

1ml纯水，

20μL 10×M限制性内切酶反应缓冲液(Takara)，

5μL(10u/μL)限制性内切酶Hha I(Takara)。

经PCR-RFLP检测后，可轻易检测出第326位的A→G的SNP。

本发明具有实用性的例证：

1)本发明的BAT1基因多态性的检测方法可用于分析人常染色体6p21.33区的BAT1基因上的常见SNP(rs2239526)的A等位位点，即在其DNA互补链上为T等位位点，应用在对AS的辅助性诊断和评估个体有多大的AS患病风险。以利于开展AS的早期干预和治疗。

2)利用本发明阐述BAT1基因第326位碱基变异，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节BAT1表达的活性分子，促进AS新药开发。

3)本发明建立的检测BAT1基因多态性的核酸序列和AS相关位点，可高灵敏度，特异性地应用于AS基因辅助诊断的试剂盒。

如上所述，得出结论，BAT1基因在第326位碱基的多态性与AS具显著相关性。因此，根据本发明，测定此多态性可用于进行基因辅助诊断。

本发明叙述了BAT1基因AS相关的新突变点，并提供了一种测定BAT1基因多态性的方法。而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定BAT1基因的多态性。结果，本发明提供了一种测定AS相关基因多态性的基因辅助诊断方法。

                             序列表

<110>卫生部北京医院

<120>一种预测强直性脊柱炎易感性的方法及试剂

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>892

<212>DNA

<213>人属，人种(Homo sapiens，human)

<400>1

acgacggcgg tatgcgcgag agggwcaaat ccattcgaaa ccggaagcga tgttaggcaa    60

aggtagacgc gaagaggcgt gggtagggca gtgtacccaa ggactatggg aaaagtgtcc    120

gctaccagac cagcgacccc ggatcaacca agcgataaag gaatcgaacg tagggaaagc    180

tctcgtttct cgaggacccc cttccttccc ttcgattccc ccctgggtta ggttctacca    240

caggagccgc ggtaacacaa gcaaaacgag ggaagaaggt tacccaagaa gagtataacc    300

tccggagtcg tagttactct ccgccacgag ccgcagggaa ccagaaccat aaacgcctcc    360

cgccccgaga agagtggaag gaacargaaa gaactcgaga aaragccggg agccaccctg    420

accctcctcc tcgaccaaag acccgggtca acctaaaaag agtggaactg aacsggttga    480

attaaacctc acggaaggtt cacaaatgct atgctaacca cagtaacata caaagaggtt    540

ttcctcagag tggaagcatc gcattgtcac tacactctgg tgaaccattt ctaggacaat    600

ttcggacccg cccctaacgg aaagagacag tggataatcg aaagaataac atcccacctc    660

tgtacttaaa acaaaaaaac accggctcgg taaacagaac gtggcgggga gggggggtac    720

gattaatgtg ttccgaacga atttgtcgcc ttccctccta tgactcttca ccctccgact    780

ctcgataccc tccacctgcc gccggtatac tacaaaagaa aagctttcca ctcgcgaaac    840

gcgtcactac tgggagtaga tagtgggaac tgactaccga cgactcaatc cg            892

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

gggagcaaaa cgaacacaat g                                              21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gtgggactgg gaggaggagc t                                              21

Claims (4)

1.一种预测强直性脊柱炎易感性的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的BAT1基因内含子1上第326位碱基多态性位点的基因型，预测受试者对强直性脊柱炎的易感性：BAT1基因第326位碱基的基因型为GG时，受试者的易感性最低；BAT1基因第326位碱基的基因型为GA时，受试者的易感性较高；BAT1基因第326位碱基的基因型为AA时，受试者的易感性最高。

2.一种分离核酸，具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，第326位为A。

3.一组预测强直性脊柱炎的引物，其长度为21bp，能特异性地扩增出SEQ IDNO.1所示序列中第326位的SNP的扩增产物，具有序列表SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示的碱基序列。

4.一种预测强直性脊柱炎的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的引物序列和以下试剂，包括：50μL 10X PCR缓冲液(Pharmacia)，50μL 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，10μL(2unit/μL)Taq DNA聚合酶(Takara)，各5μL(10pmol/μL)F1(SEQ ID NO.2)和R1(SEQ ID NO.3)引物，1ml纯水，20μL 10×M限制性内切酶反应缓冲液(Biolab)，5μL(10u/μL)限制性内切酶Hha I(Biolab)，本试剂盒供10人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。

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