CN107312843A - Krba1基因突变在制备乳腺癌检测试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于乳腺癌检测的KRBA1突变基因,所述KRBA1突变基因为NM_001290187:exon8:c.875‑3‑>T剪切位点突变。本发明利用KRBA1基因的突变位点开发评估乳腺癌风险的检测试剂盒,该试剂盒具有敏感性强,准确率高等优点,且方法简单、快速,对乳腺癌的早期筛查、预后评估具有重要的意义,也为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了重要依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体涉及KRBA1基因突变在制备乳腺癌检测试剂盒中的应用。
背景技术
乳腺癌是一种全身性疾病、其发生和发展是一个涉及多因素、多环节的复杂过程,包括癌基因的激活以及抑癌基因的失活等。因此,基因突变在乳腺癌的发生、发展过程中起着非常重要的作用。
乳腺癌是一个多因素遗传变异性疾病,只有不足10%是由于单基因缺陷引起的。随着高通量基因技术的发展,越来越多与乳腺癌相关基因被发现,这些基因上潜在的遗传变异(单核苷酸多态和拷贝数变异)可能引起乳腺癌药物治疗效果的差异。由于遗传变异的存在使抗肿瘤药物的代谢途径以及药物作用的目标基因可能受到影响,进而影响疗效以及预后。
突变位点的存在被认为赋予个体不同表型性状,以及对环境暴露、药物治疗等的不同反应,因此突变位点可能是导致个体疾病发生发展差异的重要遗传基础。将疾病易感的突变谱用于疾病的辅助诊断,具有广泛的应用前景。近年来,利用突变位点对疾病进行辅助诊断已经成为临床和科研工作者的研究热点,在肿瘤、先天性疾病和心脑血管疾病等常见重大疾病上的应用价值已初见端倪。
然而,目前还没有将KRBA1基因的突变位点应用于乳腺癌诊断和预后的报道,若能筛选出与乳腺癌诊断和预后相关的突变作为预测指标,并研制相应的试剂盒,将对乳腺癌个体化治疗产生重要指导意义,并为其药物筛选及药效评价开辟新的途径。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题,提供一种用于乳腺癌检测的KRBA1基因的新突变位点。
本发明的第二个目的是提供一种检测乳腺癌的试剂盒。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的:
本发明首先提供了一种用于乳腺癌检测的KRBA1突变基因,所述KRBA1突变基因为NM_001290187:exon8:c.875-3->T剪切位点突变。
进一步地,本发明提供了所述KRBA1突变基因在制备乳腺癌检测试剂或检测设备中的应用。
优选的,所述的检测设备优选包括含有检测KRBA1:NM_001290187:exon8:c.875-3->T突变位点的基因芯片的检测平台。
优选的,所述的检测试剂选自:引物、探针、抗体、或核酸芯片中的一种或多种。
进一步地,本发明还提供了一种检测乳腺癌的试剂盒,所述试剂盒包括引物组和与该引物组配合使用的探针。
优选的,所述引物组序列为:
正向引物:如SEQ ID No.1所示;
反向引物:如SEQ ID No.2所示。
优选的,所述探针包括野生型探针和突变型探针,野生型探针如SEQ ID No.3所示,突变型探针如SEQ ID No.4所示;所述探针5’端标记有报告荧光基团,3’端标记有淬灭基团。
优选的,扩增KRBA1:NM_001290187:exon8:c.875-3->T突变位点的特异性引物和探针是通过上海生工设计合成,所述引物和探针特异性强,扩增效果好。
优选的,所述报告荧光基团为FAM或VIC,淬灭基团为NFQ。
优选的,所述试剂盒还包括含Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和ddH2O。
优选的,所述试剂盒还包括阴性对照组,所述阴性对照组为正常人的DNA。
进一步地,本发明还提供了一种检测乳腺癌KRBA1:NM_001290187:exon8:c.875-3->T突变的方法,包括以下步骤:
1)分离受试者外周血的DNA;
2)用本发明所述的试剂盒进行TaqMan-MGB PCR扩增;
3)对步骤2)的扩增产物进行KRBA1基因的等位基因鉴别分析,若用于标记SEQ IDNO:3的荧光染料发出的荧光强度呈S型增长,同时用于标记SEQ ID NO:4的荧光染料发出的荧光强度无增长,表示野生型基因型;反之,表示纯合突变基因型;若两种荧光染料发出的荧光强度同时呈S型增长,则表示杂合突变基因型;
4)根据步骤3)的基因型分析结果进行判断,具有纯合突变基因型或杂合突变基因型的受试者的KRBA1突变检测结果为阳性。
本发明有益效果:
本发明利用KRBA1基因的突变位点开发评估乳腺癌风险的检测试剂盒,该试剂盒具有敏感性强,准确率高等优点,且方法简单、快速,对乳腺癌的早期筛查、预后评估具有重要的意义,也为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了重要依据。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明的技术方案具体包括:系统收集完整的人口学资料和临床资料,采集符合标准的血液样本进行DNA提取;突变位点筛选:选择乳腺癌病例、与乳腺癌病例年龄匹配的健康女性对照,利用高通量测序,找出与乳腺癌相关的突变;突变位点的验证:Sanger测序进一步验证,鉴定致病基因;剪切位点改变预测:借助一系列剪切位点预测网站对可能产生的剪切位点改变进行了预测;乳腺癌检测试剂盒的制备:利用上述突变位点开发乳腺癌检测试剂盒。
实施例1外周血DNA的提取和纯化
1、样品收集
发明人于2015年1月至2016年12月在深圳市第二人民医院收集了大量的新发乳腺癌患者血标本,通过对样品资料的整理,发明人从中选择了35例符合下列标准的样本,同时选择10例年龄在25-55岁健康女性作对照进行全外显子芯片检测,样本选择标准如下:
(1)经病理学明确诊断的乳腺癌病例,其中有3例病人具有癌症家族史并分别标记为X1、X2、X3;
(2)采血前未接受过放疗或化疗、无既往肿瘤病史;
(3)与病例年龄匹配的健康女性对照并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
2、DNA的提取
在上述符合条件的35例乳腺癌患者和10例健康女性对照中,两组年龄均衡可比。
具体步骤为:
(1)向储存于2mL冻存管中的外周血加入溶血试剂(即裂解液,40份量配置方法如下:蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco0694)20mL混合后,用TrisHcl溶液定容至2000mL,下同),颠倒混匀后完全转入。
(2)去除红细胞:用溶血试剂将5mL离心管补至4mL,颠倒混匀,4000rpm离心10分钟,弃上清。向沉淀中加入4mL溶血试剂,再次颠倒混匀清洗一次,4000rpm离心10分钟,弃上清。
(3)抽提DNA:向沉淀中加1mL抽提液(每300mL中含有122.5mL0.2M氯化钠,14.4mL0.5M乙二胺四乙酸,15mL10%十二烷基硫酸钠,148.1mL双蒸水,下同)和8μL蛋白酶K,振荡器上充分振荡混匀,37℃水浴过夜。
(4)去除蛋白质:加1mL饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟),4000rpm离心10分钟,取上清转入新的5mL离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿:异戊醇=24:1,v/v,下同),充分混匀后(手摇15分钟),4000rpm离心10分钟,取上清(分入两个1.5mL的离心管)。
(5)DNA沉淀:在上清液中加入3M的醋酸钠60μL,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇,上下轻摇,可见白色絮状沉淀物,再以12000rpm离心10min。
(6)DNA洗涤:在沉淀中加入冰无水乙醇1mL,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
(7)测量浓度:通常能得到20-50ng/μLDNA,纯度(紫外2600D:2800D)在1.8-2.0。
实施例2高通量二代测序挖掘患者的致病突变
将实施例1中两组人群经全外显子芯片检测获得相关结果。
1、文库构建
北京诺禾致源科技股份有限公司采用Agilent的液相芯片捕获系统,对人的全外显子区域DNA进行高效富集,然后在Illumina Hiseq平台上进行高通量、高深度测序。建库和捕获实验采用Agilent SureSelect Human All ExonV5试剂盒,严格使用说明书推荐的试剂和耗材,并参照最新的经过优化的实验流程进行操作。
实验基本流程:将基因组DNA经Covaris破碎仪随机打断成长度为180-280bp的片段,经末端修复和加A尾后在片段两端分别连接上接头制备DNA文库。带有特异index的文库pooling后与多达543,872个生物素标记的探针进行液相杂交,再使用带链霉素的磁珠将20,965个基因的334,378个外显子捕获下来,经PCR线性扩增后进行文库质检,合格即可进行上机测序。
2、库检
文库构建完成后,先使用Qubit2.0进行初步定量,稀释文库至1ng/μL,随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测,insert size符合预期后,使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2nM),以保证文库质量。
3、上机测序
库检合格,根据文库的有效浓度及数据产出需求进行Illumina Hiseq平台测序。
4、数据分析与处理
外显子组测序后获得原始数据,经过去污染等数据过滤、与人类参考基因组进行比对分析,检测个体携带的变异,包括SNP(单核苷多态性)、Indels(插入、缺失片段),并完成相应的注释和统计分析工作;保留位于编码区可能影响蛋白功能以及位于侧翼区可能影响转录本剪接的突变,包括无义突变、错义突变、移码突变、插入缺失以及剪切突变,将获得的突变与公共数据库dbSNP144、千人基因组计划1000genome、Hapmap、YanHuang project进行比对,滤除人群中的高频突变,筛除已知的SNP及Indel位点,筛选出新的致病性突变位点。
最终确定“乳腺癌病例”组和“健康女性对照”组中发现的基因型分布频率有显著差异的53个突变位点为优选敏感级位点;其中,KRBA1基因NM_001290187:exon8:c.875-3->T的剪切体突变,该位点经过生物信息学分析,可以确认为乳腺癌候选标志物。
实施例3 Sanger测序验证,鉴定致病基因
1、在实施例1中35例乳腺癌患者和10例健康女性的样本进行Sanger测序验证,提取血液DNA样本同实施例1;
2、分别针对KRBA1基因的8号外显子及其侧翼设计引物,所用引物由上海生工设计合成。所用PCR的反应体系(25μL体系)为:Taq Buffer2.5μL,DNA 1μL,正向引物0.5μL,反向引物0.5μL,10mM dNTP 0.5μL,Taq酶0.2μL,ddH2O 19.8μL。PCR反应程序:95℃3min,35个循环(94℃30s,60℃30s,72℃1min),72℃10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测,与紫外线切胶仪下切取PCR产物凝胶并纯化。对所有的PCR产物分别以正、反向引物序列测序,并对测序结果进行进一步分析。其中检测KRBA1:NM_001290187:exon8:c.875-3->T突变位点的正向引物序列为SEQ ID NO.5所示,反向引物序列为SEQ ID NO.6所示。
3、结果分析
通过Chromas序列分析软件,将测序结果与标准序列进行比对,并结合“健康女性对照”组序列,寻找突变位点。结果显示:患者KRBA1基因NM_001290187:exon8:c.875-3位点插入了碱基T,使得序列由CTT变成CTTT与全外外显子测序结果相符合。
从而进一步确认所述突变位点可用于乳腺癌的检测、治疗、诊断、预后评估等辅助诊断。
实施例4剪切位点改变预测
针对实施例1中所检测出的KRBA1基因NM_001290187:exon8:c.875-3->T位点突变可能引起的剪切异常进行预测。
1、实验方法:借助一系列剪切位点预测网站对可能产生的剪切位点改变进行了预测,包括:
(1)NetGene2 Server,网址:http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/;
(2)Human Splicing Finder,网址:http://www.umd.be/HSF3/HSF.html。
2、剪切位点改变预测结果
(1)NetGene2 Server软件预测结果提示该突变能够引起正常剪切位点的消失,引起KRBA1基因所编码的KRBA1蛋白结构的改变;
(2)Human Splicing Finder软件预测结果提示该突变能够引起正常受体剪切位点的消失,并产生新的异常受体剪切位点,从而引起KRBA1基因所编码的KRBA1蛋白结构的改变。
实施例5乳腺癌检测试剂盒组装
组装本发明所述的用于乳腺癌检测试剂盒,所述试剂盒包括包含引物及其对应的Taqman-MGB探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、ddH2O和阴性对照的正常人DNA。
根据KRBA1(GenBank号:NG_029620.1)序列,通过Primer Express3.0软件设计扩增KRBA1:NM_001290187:exon8:c.875-3->T突变位点的特异性引物和探针,并由上海生工设计合成,引物及探针序列见表1所示。
表1引物和探针序列
编号 | 序列 |
正向引物SEQ ID NO.1 | ACACTGAGCTCCAGGTGAAAACA |
反向引物SEQ ID NO.2 | CAGGGTCTGCTACACTGTCTGA |
野生型探针SEQ ID NO.3 | VIC-TTCCTTAGTGAAGAC-NFQ |
突变型探针SEQ ID NO.4 | FAM-TTCCTTTAGTGAAGAC-NFQ |
每个PCR扩增的反应体系为20μL,包含10×PCR反应缓冲液2.0μL、25mM MgCl2溶液2.4μL、2.5mM的dNTP混合液1.6μL、5U/μL Taq酶0.1μL、DNA模板1μL(50ng左右)、20μM上下游引物各0.5μL、10μM突变野生探针各0.5μL,ddH2O补至20μL。
实施例6检测试剂盒的使用
1、取45例临床确诊为乳腺癌患者的血液样本,提取DNA方法同实施例1;
2、荧光PCR检测
将配置好的20μL PCR体系放入荧光PCR仪器中,进行荧光PCR扩增检测;PCR扩增程序为:50℃2min;95℃10min;95℃15s,60℃1min,进行40个循环。
荧光PCR仪器:罗氏LightCycler@480型实时荧光定量PCR仪。
3、基因分型
通过荧光定量PCR仪上显示的FAM和VIC探针的Ct值,确定所检测的SNP位点的基因型。基因型判读:只在FAM频道中有扩增信号产生的样本为纯合突变基因型;只在VIC频道中有扩增信号产生的样本为野生基因型;在FAM和VIC频道中都有扩增信号产生的样本为杂合突变基因型;具有纯合突变基因型和杂合突变基因型的受试者的KRBA1基因突变检测结果均为阳性。
在45例乳腺癌血液样本中,本试剂盒共检测到KRBA1突变为25例,其中有16例为杂合突变基因型,有9例为纯合突变基因型,突变率为55.6%。
本试剂盒可为评估乳腺癌风险提供有效参考依据。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京大学深圳医院(北京大学深圳临床医学院) 安徽医科大学
<120> KRBA1基因突变在制备乳腺癌检测试剂盒中的应用
<130> P16rxa96
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acactgagct ccaggtgaaa aca 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagggtctgc tacactgtct ga 22
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttccttagtg aagac 15
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttcctttagt gaagac 16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tccatggctt ccctctttgc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atccggatcc tcttcccgac 20
Claims (7)
1.一种用于乳腺癌检测的KRBA1突变基因,其特征在于,所述KRBA1突变基因为NM_001290187:exon8:c.875-3->T剪切位点突变。
2.权利要求1所述KRBA1突变基因在制备乳腺癌检测试剂或检测设备中的应用。
3.根据权利要求2所述应用,其特征在于,所述的检测试剂选自:引物、探针、抗体、或核酸芯片中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述应用,其特征在于,所述的检测设备包括含有检测权利要求1所述KRBA1突变基因的基因芯片的检测平台。
5.一种检测乳腺癌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括引物组和与该引物组配合使用的探针,所述引物组为正向引物如SEQ ID No.1所示,反向引物如SEQ ID No.2所示;所述探针包括野生型探针和突变型探针,野生型探针如SEQ ID No.3所示,突变型探针如SEQID No.4所示;所述探针5’端标记有报告荧光基团,3’端标记有淬灭基团。
6.如权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述报告荧光基团为FAM或VIC,淬灭基团为NFQ。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括含Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和ddH2O。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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