CN101575647B

CN101575647B - 一种y染色体微缺失的基因检测方法

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Publication number: CN101575647B
Application number: CN2009100946188A
Authority: CN
Inventors: 叶峻杰; 郭海; 李宗芳; 王跃力; 阎慧; 李江川; 途昕明; 王磊; 张雨龙; 沈君
Original assignee: KUNMING GENERAL HOSPITAL OF CHENGDU MILITARY REGION
Current assignee: KUNMING GENERAL HOSPITAL OF CHENGDU MILITARY REGION
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2029-06-19
Also published as: CN101575647A

Abstract

本发明公开了一种Y染色体微缺失的基因检测方法。该方法提取人外周血基因组DNA后，采用多重PCR引物设计，多重PCR反应体系包含N对特异扩增Y染色体AZF片断中STSs位点的嵌合引物对和1对通用引物对。多重PCR反应在N+1对引物的参与下，在同一个反应体系中经过变性、退火、延伸循环扩增目的DNA模板的反应；取10ulPCR产物，EB染色，经3％琼脂糖电泳。电泳电压4V/cm，电泳时间20分钟；然后紫外透射仪下观察电泳图谱对结果作出判断。从而建立了一种简化PCR反应条件，扩增效率高，易于临床实验操作的检测方法。

Description

一种Y染色体微缺失的基因检测方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说，本发明涉及一种用于检测Y染色体微缺失的方法。

背景技术

根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的1997年的研究报告指出，在发达国家中不育夫妇占已婚育龄夫妇的15％，其中男性不育又占不育夫妇总数的50％。对于这50％的男性不育症患者，从临床资料统计来看，可将其不育的病因大体分为以下四类：生精障碍、输精管道梗阻、性腺器官附属异常、及性功能异常。其中又以精子发生障碍最为常见。引起精子发生障碍的因素主要包括两个方面：遗传因素和非遗传因素。遗传因素导致生精障碍而不育的比率约占不育症患者的30％，因此有关原发性无精子症及严重少精子症的遗传因素日益受到重视。

Tiepolo和Zuffardi在1976年对6个无精子患者在显微镜下发现长臂1区1带(Yq11.1)远端缺失，因而推测在Yq11区上存在着Y染色体精子生成基因，提出了与精子生成密切相关的无精子因子区(azoospermia factorregion，AZF)的概念。Vogt等人1996年的研究进一步将AZF区分为AZFa、AZFb和AZFc。Y染色体上AZF的微缺失可以造成生精障碍，导致无精症或严重少精子症。临床上利用PCR扩增的序列标签位点(STS)技术来检测Y染色体AZF微缺失，用于诊断因基因缺陷导致的无精症或严重少精子症，检出率在1％～55％之间不等。由于AZF区的部分缺失的不育男性可以通过“试管婴儿”技术生育后代，造成男性后代更为严重的Y染色体微缺失及不育，所以目前男科学要求Y染色体微缺失基因检测作为男性不育的常规检查，特别是在实行卵细胞浆内单精子注射(ICSI)和其他人工辅助生殖治疗时必须做该项检查。因此，建立一种简单、稳定的分子遗传学检测方法，对明确男性不育的病因和采取相应的治疗方案，具有重要的临床价值。

AZF区长度约为7.5Mb，利用STSs对AZF片段微缺失的定位常常需要选择多个STS位点来检测。多重PCR技术可以在同一个反应体系同时扩增多对引物(每一个位点扩增需要一对引物)，以达到简单、快速、高通量和经济地复合扩增多个基因片断的目的，是Y染色体微缺失采用的较好的方法。但多重PCR技术相对于常规PCR方法技术含量更高。因为多重PCR要求多对引物在同一个反应条件下复合扩增，每对引物达到最适扩增效率的反应条件不一致，这就要求对复合扩增反应体系的引物使用浓度、PCR缓冲液的浓度、镁离子浓度、dNTP浓度、PCR循环数、PCR循环中的各阶段的温度、不同厂家Taq酶及用量、模板DNA用量等因素进行调整，优化复合扩增反应条件，达到最大扩增目的片断效率，同时减少非特异扩增的目的(Henegariu O.，etal.1997，BioTechniques 23：504-511)。

现有技术中，这一过程操作繁琐、失败率高，尤其是扩增效率低下导致目的片断检测不到，以及引物二聚体大量产生干扰结果判断，对临床快速诊断带来较大麻烦。有的技术要么选择较少的引物对，要么选择添加某种化合物，以达到降低引物二聚体的目的。这样造成不能完全检测AZF片段微缺失(中国发明专利申请200410043918.0)，或增加试剂成本(中国发明专利申请200710074317.X)。这是本领域一个亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种操作简单、高效、通过一次性扩增多个基因片断用于检测Y染色体微缺失的方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

本发明提供了一种Y染色体微缺失的基因检测方法，该方法包括以下步骤：

1.提取人外周血基因组DNA

常规煮沸裂解法或柱洗脱法提取抗凝全血250ul中的DNA，可得预期DNA产量约4-12ug，作为模板DNA；

2.PCR扩增

采用多重PCR引物设计，多重PCR反应体系包含N对特异扩增Y染色体AZF片断中STSs位点的嵌合引物对和1对通用引物对；多重PCR反应在N+1对引物对的参与下，在同一个反应体系中经过变性、退火、延伸循环扩增目的DNA模板的反应；

3.检测扩增产物

取10ulPCR产物，EB染色，经3％琼脂糖电泳。电泳电压4V/cm，电泳时间20分钟；

4.结果判断

a.紫外透射仪下观察电泳图谱，SRY基因作为男性性别决定基因，在实验中作为内参对照；男性标本都应扩增出内参对照条带，使用一女性样本用于监控实验的特异性和污染情况；水空白对照用来监控试剂是否被污染；

b.如与正常生育男性对照相比出现一个或多个位点条带缺失，判断为其对应的AZF片断缺失；如A管的MsY254和B管的MsY255条带丢失，判断为AZFc缺失；如A管的MsY254、MsY127和B管的MsY255、MsY134条带丢失，判断为AZFb+c缺失。

其中，

所述的通用引物对：

YUP1：5’-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3’

YUP2：5’-TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C-3’

所述的Y染色体AZF片断STSs位点的嵌合引物对为：

sY84位点嵌合引物对：

MsY84-F：5’-YUP1-AGA AGG GTC TGA AAG CAG GT-3’

MsY84-R：5’-YUP2-GCC TAC TAC CTG GAG GCT TC-3’

sY86位点嵌合引物对：

MsY86-F：5’-YUP1-AGA CTA TGC TTC AGC AGG TC-3’

MsY86-R：5’-YUP2-GAA CCG TAT CTA CCA AAG CAG C-3’

sY127位点嵌合引物对：

MsY127-F：5’-YUP1-GGC TCA CAA ACG AAA AGA AA-3’

MsY127-R：5’-YUP2-CTG CAG GCA GTA ATA AGG GA-3’

sY134位点嵌合引物对：

MsY134-F：5’-YUP1-GTC TGC CTC ACC ATA AAA CG-3’

MsY134-R：5’-YUP2-ACC ACT GCC AAA ACT TTC AA-3’

sY254位点嵌合引物对：

MsY254-F：5’-YUP1-GGG TGT TAC CAG AAG GCA AA-3’

MsY254-R：5’-YUP2-GAA CCG TAT CTA CCA AAG CAG C-3’

sY255位点嵌合引物对：

MsY255-F：5’-YUP1-GTT ACA GGA TTC GGC GTG AT-3’

MsY255-R：5’-YUP2-CTC GTC ATG TGC AGC CAC-3’

SRY位点嵌合引物对：

MSRY-F：5’-YUP1-GAA TAT TCC CGC TCT CCG GA-3’

MSRY-R：5’-YUP2-GCT GGT GCT CCA TTC TTG AG-3’

所述的通用引物对为一对非人类同源序列的寡核苷酸链，不能与人基因组序列特异结合。

所述的通用引物对中至少一条引物链的解链温度Tm大于65℃。通用引物对的退火温度范围从52℃～65℃。

所述嵌合引物对的3’端为能与人类组基因序列互补的特异序列；嵌合引物对的正反引物5’端分别与通用引物YUP1和YUP2相同。嵌合引物5’端ΔG值大于3’端ΔG，所有嵌合引物的解链温度Tm大于70℃。

所述多重PCR反应条件为1×PCR buffer(50mmol/L KCl，10mmol/LTris-HCl，pH 9.0)，1.5mM MgCl₂，200uM dNTP，5～10ng模板DNA，和1U Taq DNA聚合酶(Promega)，50-200nM各嵌合引物浓度，200nM-1uM通用引物浓度。PCR循环条件为95℃预变性5min，然后95℃变性40s，54℃退火40s，72℃延伸40s，反应30个循环后，72℃再延伸10min。

所述多重PCR方法应可用于Y染色体微缺失的任何STS位点的检测。

本发明的工作原理：

PCR技术，全称聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)，是在很短时间内体外酶促合成(扩增)特异模板DNA片断的生化反应。其过程以变性-退火-延伸三个基本反应步骤为一个循环，反复重复循环20-40次，使DNA得以扩增。PCR扩增的基本原理是半保留复制的原理：在变性温度下，双链DNA解开成两条单链，利用人工合成的一对与模板DNA特异结合的寡核苷酸链作为引物，在退火温度下正、反引物分别与目标DNA的两条链结合，通过DNA聚合酶的作用在引物的3’端合成互补DNA，合成的起点是引物结合位点，方向为5’→3’，按模板DNA序列合成互补片断。根据PCR扩增原理，本发明选择一对非人类同源序列的寡核苷酸链作为通用引物，取名为YUP1和YUP2。在检测AZF片段微缺失的每个STS位点序列两端设计一对特异引物。此对特异引物的正向引物的5’端加上一段非人类同源序列的寡核苷酸链YUP1，反向引物的5’端加上一段非人类同源序列的寡核苷酸链YUP2，合成一对新的嵌合引物。多个STSs位点的每对特异引物均在其正向引物寡核苷酸链的5’端加上YUP1，反向引物寡核苷酸链的5’端加上YUP2，形成嵌合引物组合。在检测AZF片段微缺失的多重PCR反应体系中，包含N个STSs位点的嵌合引物对，另外加上一对通用引物对，形成N+1引物对。整个PCR反应过程可以分为两个阶段。第一阶段包括PCR反应的前三个循环，使用嵌合引物对模板DNA进行扩增。嵌合引物对的3’端为人类基因组特异序列，能与模板DNA特异结合从而扩增目的DNA片断。扩增产物包含目的DNA片断和目的DNA片断5’端的非人类同源序列的寡核苷酸序列。第二阶段反应使用一对通用引物YUP1和YUP2对第一阶段的扩增产物进行扩增。经过第一阶段的扩增，最初多对特异性引物与不同STSs模板结合后的扩增产物的5’端均含有非人类同源序列的寡核苷酸序列。使用一对通用引物YUP1和YUP2与扩增产物的非人类同源序列结合并进行扩增，可以让多对引物的反应条件统一为一对通用引物的反应条件，最终达到稳定多对特异性引物的扩增效率。

与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：

1.应用本发明，只需简单调整嵌合引物之间的引物浓度，无需优化其它复合扩增反应条件就能得到满意的扩增产物，同时扩增产物能够应用普通琼脂糖电泳观察，满足国内大多数分子生物学实验室的实验条件。

2.通过一次性扩增多个基因片断，在常规引物5’端加上一段非人类同源序列的嵌合引物设计方法，以达到保证多对引物扩增效率相当，同时减少引物二聚体的形成。建立了一种简化PCR反应条件，扩增效率高，易于临床实验操作的检测Y染色体微缺失的方法。

附图说明

图1为本发明Y染色体微缺失基因检测结果的电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，对发明作进一步的说明。通过实施例和附图可以对本发明有更清楚地了解，但值得强调的是，它们并不是对本发明保护范围的限定。

实施例1

人基因组DNA提取——常规煮沸裂解法或柱洗脱法提取抗凝全血250ul中的DNA，可得预期DNA产量约4-12ug，作为模板DNA。

PCR扩增——多重PCR扩增分成A管和B管进行。30ul的PCR反应体系为：1×PCR buffer(50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl，pH 9.0)，1.5mMMgCl₂，200uM dNTP，5～10ng模板DNA，和1U Taq DNA聚合酶(Promega)；A管加入5对引物的浓度为：MSRY 0.12uM，MsY254 0.1uM，MsY127 0.05uM，MsY86 0.1uM，YUP 0.4uM；B管加入5对引物的浓度为：MSRY 0.1uM，MsY1340.12uM，MsY84 0.12uM，MsY255 0.05uM，YUP 0.4uM，反应在ABI公司9700型PCR反应仪中进行。每次检测同时设立阳性对照(正常生育男性基因组DNA)、阴性对照(女性基因组DNA)和水空白对照。

PCR循环条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性40s，54℃复性40s，72℃延伸40s，反应30个循环后，72℃再延伸10min。PCR产物于4℃冰箱中储存。

扩增产物检测——取10ulPCR产物，EB染色，经3％琼脂糖电泳。电泳电压4V/cm，电泳时间20分钟。3％琼脂糖电泳反应产物条带位置，如表1所示。

表1.

结果判断——紫外透射仪下观察电泳图谱。

SRY基因作为男性性别决定基因，在实验中充当内参对照。男性标本都应扩增出内参对照条带。使用一女性样本用于监控实验的特异性和污染情况。此外，水空白对照用来监控试剂是否被污染。

如果与正常生育男性对照相比出现一个或多个位点条带缺失，可判断为其对应的AZF片断缺失。如A管的MsY254和B管的MsY255条带丢失，可判断为AZFc缺失；如A管的MsY254、MsY127和B管的MsY255、MsY134条带丢失，可判断为AZFb+c缺失，见图1。

图1中，混和引物A管1道：AZFc区缺失患者(MsY254缺失)；6道：AZFb+c区缺失患者(MsY254，MsY127缺失)；3，8道：正常男性对照；混和引物B管2道：AZFc区缺失患者(MsY255缺失)；7道：AZFb+c区缺失患者(MsY255，MsY134缺失)；4，9道：正常男性对照；5道：Mark

实施例2

AZF片段STS位点的选择根据欧洲男科学会EAA(临床层面)和欧洲分子遗传实验室质量控制协会EMQN(具体实验操作层面)发布的《欧洲Y染色体微缺失分子诊断指南2004版本》推荐的标准进行(SIMONI M.，etal.2004，International Journal of Andrology，27，240-249)。AZFa区选择sY84和sY86位点：

特异性扩增AZFa区sY84的引物碱基序列为：

sY84-F：5’-AGA AGG GTC TGA AAG CAG GT-3’

sY84-R：5’-GCC TAC TAC CTG GAG GCT TC-3’

特异性扩增AZFa区sY86的引物碱基序列为：

sY86-F：5’-AGA CTA TGC TTC AGC AGG TC-3’

sY86-R：5’-GAA CCG TAT CTA CCA AAG CAG C-3’

AZFb区选择sY127和sY134位点：

特异性扩增AZFb区SY127的引物碱基序列为：

sY127-F：5’-GGC TCA CAA ACG AAA AGA AA-3’

sY127-R：5’-CTG CAG GCA GTA ATA AGG GA-3’

特异性扩增AZFb区sY134的引物碱基序列为：

sY134-F：5’-GTC TGC CTC ACC ATA AAA CG-3’

sY134-R：5’-ACC ACT GCC AAA ACT TTC AA-3’

AZFc区选择sY254和sY255位点：

特异性扩增AZFc区sY254的引物碱基序列为：

sY254-F：5’-GGG TGT TAC CAG AAG GCA AA-3’

sY254-R：5’-GAA CCG TAT CTA CCA AAG CAG C-3’

特异性扩增AZFc区sY255的引物碱基序列为：

sY255-F：5’-GTT ACA GGA TTC GGC GTG AT-3’

sY255-R：5’-CTC GTC ATG TGC AGC CAC-3’

设置男性性别决定基因SRY(sex determining region Y)作为内对照特异性扩增Y染色体SRY基因的引物碱基序列为：

SRY-F：5’-GAA TAT TCC CGC TCT CCG GA-3’

SRY-R：5’-GCT GGT GCT CCA TTC TTG AG-3’

根据所述方法，Y染色体微缺失检测的各STS位点嵌合引物的碱基序列设计如下：

非人类同源序列通用引物YUP的引物碱基序列为：

YUP1：5’-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAG-3’

YUP2：5’-TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C-3’

在每个特异性扩增STS位点的正、反引物5’端分别加上YUP1或YUP2寡核苷酸序列，合成嵌合引物的碱基序列，如表2所示。

表2.

嵌合引物名称	嵌合引物碱基序列
		MsY84	MsY84-F：5’-YUP1-AGA AGG GTC TGA AAG CAG GT-3’MsY84-R：5’-YUP2-GCC TAC TAC CTG GAG GCT TC-3’
MsY86	MsY86-F：5’-YUP1-AGA CTA TGC TTC AGC AGG TC-3’MsY86-R：5’-YUP2-GAA CCG TAT CTA CCA AAG CAG C-3’
		MsY127	MsY127-F：5’-YUP1-GGC TCA CAA ACG AAA AGA AA-3’MsY127-R：5’-YUP2-CTG CAG GCA GTA ATA AGG GA-3’
MsY134	MsY134-F：5’-YUP1-GTC TGC CTC ACC ATA AAA CG-3’MsY134-R：5’-YUP2-ACC ACT GCC AAA ACT TTC AA-3’
		MsY254	MsY254-F：5’-YUP1-GGG TGT TAC CAG AAG GCA AA-3’
	MsY254-R：5’-YUP2-GAA CCG TAT CTA CCA AAG CAG C-3’
		MsY255	MsY255-F：5’-YUP1-GTT ACA GGA TTC GGC GTG AT-3’MsY255-R：5’-YUP2-CTC GTC ATG TGC AGC CAC-3’
MSRY	MSRY-F：5’-YUP1-GAA TAT TCC CGC TCT CCG GA-3’MSRY-R：5’-YUP2-GCT GGT GCT CCA TTC TTG AG-3’

实施例3

提取人外周血基因组DNA。PCR反应，多重PCR以15ul的PCR反应体系为例。反应体系(pH 8.5)包括以下试剂：PCR反应液，Taq酶，dATP，dGTP，dCTP，dTTP，MgCl₂，引物，模板DNA。dNTP反应终浓度均为200uM；MgCl₂反应终浓度为1.5mM。PCR扩增分成两管进行：A管复合扩增5对引物；B管复合扩增5对引物，两管均设计MSRY引物作为内对照。引物对分组如下：

A组：MSRY，MsY254(AZFc)，MsY127(AZFb)，MsY86(AZFa)，YUP

B组：MSRY，MsY134(AZFb)，MsY84(AZFa)，MsY255(AZFc)，YUP

PCR循环条件：95℃预变性5min，然后95℃变性40s，54℃退火40s，72℃延伸40s，反应30个循环后，72℃再延伸10min。3％琼脂糖电泳检测扩增产物。

通用引物设计遵循以下条件：1.通用引物为非人类同源序列，不能与人基因组序列特异结合；2.引物长度通常为18-30bp，通用引物富含GC，嵌合引物5’端ΔG值大于3’端ΔG，所有嵌合引物的解链温度Tm＞70℃；3.通用引物不能有二级结构和3’端互补碱基数尽量少。本发明设计的通用引物除具备上述条件外，其退火温度范围从52℃至65℃，适合于大多数特异扩增人基因组序列引物的退火温度条件，简化了最初引物设计的难度。

Claims

1.一种基因检测Y染色体微缺失的多重PCR反应体系，其特征在于：

多重PCR反应体系为15ul，反应体系的pH值为8.5，包括以下试剂：PCR反应液，Taq酶，dATP，dGTP，dCTP，dTTP，MgCl₂，引物，模板DNA；dNTP反应终浓度均为200uM；MgCl₂反应终浓度为1.5mM；PCR扩增分成两管进行：A管复合扩增5对引物；B管复合扩增5对引物，两管均设计MSRY引物作为内对照；引物对分组如下：

A组：MSRY，MsY254，MsY127，MsY86，YUP

B组：MSRY，MsY134，MsY84，MsY255，YUP

其中所述的多重PCR反应体系中非人类同源序列通用引物YUP的引物碱基序列为：

YUP1：5’-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3’

YUP2：5’-TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C-3’

在每个特异性扩增基因STS位点的正、反引物5’端分别加上YUP1或YUP2寡核苷酸序列，合成嵌合引物的碱基序列，分别对应：

MsY84嵌合引物对：

MsY84-F：5’-YUP1-AGA AGG GTC TGA AAG CAG GT-3’

MsY84-R：5’-YUP2-GCC TAC TAC CTG GAG GCT TC-3’

MsY86嵌合引物对：

MsY86-F：5’-YUP1-AGA CTA TGC TTC AGC AGG TC-3’

MsY86-R：5’-YUP2-GAA CCG TAT CTA CCA AAG CAG C-3’

MsY127嵌合引物对：

MsY127-F：5’-YUP1-GGC TCA CAA ACG AAA AGA AA-3’

MsY127-R：5’-YUP2-CTG CAG GCA GTA ATA AGG GA-3’

MsY134嵌合引物对：

MsY134-F：5’-YUP1-GTC TGC CTC ACC ATA AAA CG-3’

MsY134-R：5’-YUP2-ACC ACT GCC AAA ACT TTC AA-3’

MsY254嵌合引物对：

MsY254-F：5’-YUP1-GGG TGT TAC CAG AAG GCA AA-3’

MsY254-R：5’-YUP2-GAA CCG TAT CTA CCA AAG CAG C -3’

MsY255嵌合引物对：

MsY255-F：5’-YUP1-GTT ACA GGA TTC GGC GTG AT-3’

MsY255-R：5’-YUP2-CTC GTC ATG TGC AGC CAC-3’

MSRY嵌合引物对：

MSRY-F：5’-YUP1-GAA TAT TCC CGC TCT CCG GA-3’

MSRY-R：5’-YUP2-GCT GGT GCT CCA TTC TTG AG-3’。