CN102796819A - 一种y染色体微缺失检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Y染色体微缺失检测试剂盒，所述试剂盒包括：(i)PCR扩增反应试剂；(ii)扩增Y染色体AZFa区域SY84序列的引物；扩增Y染色体AZFa区域SY86序列的引物；扩增Y染色体AZFb区域SY127序列的引物；扩增Y染色体AZFb区域SY134序列的引物；扩增Y染色体AZFc区域SY254序列的引物；扩增Y染色体AZFc区域SY255序列的引物；扩增SRY基因的引物。它可以简便、高效、特异的检测Y染色体缺失。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，主要涉及染色体缺失检测领域，更具体地说，是一种用降落式PCR（touchdown PCR）检测Y染色体缺失的方法。
背景技术
Y染色体是男性特有的染色体，其上有精子发生相关基因，对睾丸决定和睾丸分化过程起重要作用的基因和基因家族。当前男性不孕育的越来越多，影响男性不育的因素较多，如内分泌紊乱、遗传缺陷、环境因素或全身疾病等。其中由遗传因素引起的不育占整个影响因素的30％。
Y染色体缺失是造成男性不育的主要遗传学因素之一，对Y染色体缺失进行检测具有重要的临床指导意义。Tiepolo等首先提出Y染色体上有多个基因参与生精过程。SIMONI等研究发现，在男性特有的Y染色体长臂存在一个与生育相关的因子的关键区域，称为无精子因子(AZF)。现已明确有3个与精子缺失直接相关的基因片段：AZFa、AZFb、AZFc（在AZFb与AZFc之间还存在AZFd座位，中等程度的少精子和精子数目正常却形态异常多会与该区域的缺失有关)，分别位于Yql 1.23的近、中、远端，其缺失可导致无精子症或严重的少精子症，约占无精子症或严重少精子症总数的10％~15％。这些亚区所包含的位点在男性生殖过程的不同时期起着不同的作用，其中任何一个座位的微缺失都可导致生精障碍，可使患者表现为少弱精症甚至无精症，从而造成不育。AZFa缺失表现为唯支持细胞综合症为主的严重生精障碍，AZFb缺失表现为生精阻滞，AZFc缺失的表现可从正常到无精子，AZFd的缺失表现同AZFc缺失。但AZF并不是单一的基因，而是在功能上相互关联的基因家族，在精子发生、发育和成熟中发挥重要作用。研究显示，Y染色体微缺失机制可能与其内部同源重复序列间的重组有关。AZFa缺失是由HERV15重复序列之间的重组引起的；AZFb和AZFc区主要由5种具有回文结构的不同序列家族组装而成，而同源序列间的重组是导致他们缺失的主要原因；尤其是在AZFc区，大约94％是重复片段，长度介于115--700kb，这可能与AZFc区具有较高的缺失率有关。此外，Y染色体AZF区以外的重复序列之间的同源重组也可能造成一些缺失。
运用降落式PCR（touchdown PCR，TD-PCR）技术，对Y染色体AZF基因片段序列标签位点(STS)进行检测分析，从而达到AZF基因微缺失的筛查，诊断Y染色体微缺失，找到不育的真正原因。从而避免不必要的药物及手术治疗，如一些激素的应用及精索静脉曲张的手术治，为男性不育的临床诊断和治疗提供指导。本方法亦适用于胞质内单精子注射(ICSI)技术辅助生育治疗前的检测、少精子症与无精子症男性患者遗传学检测、精子库的入库前筛查等。
当前Y染色体微缺失检测的主要方法有：Southern blot印记杂交，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）以及荧光定量PCR。其中普通PCR电泳技术是应用最为广泛。然而，普通PCR扩增后经常出现两种情况：①未扩增出任何产物导致假阴性结果。②未找到最佳扩增条件，产生大量非特异产物。在影响普通PCR扩增的众多因素中（如PCR仪器性能、反应体系、反应条件等），退火温度的影响最大。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供用一种对Y染色体微缺失进行诊断的试剂，它可以简便、高效、特异的检测Y染色体缺失。
一种Y染色体微缺失检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(i)PCR扩增反应试剂；
(ii)扩增Y染色体AZFa区域SY84序列的引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；其碱基序列为：SEQ ID NO.1：TCAGCAAAGAGAAGGGTCT，SEQ ID NO.2：TGAAGCCTACTACCTGGAGGCT；
扩增Y染色体AZFa区域SY86序列的引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；其碱基序列为：SEQ ID NO.3：CTCAGCACATGGGTGACACACAGA，SEQ ID NO.4：CACAGACACACACAGAGGGACAA；
扩增Y染色体AZFb区域SY127序列的引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；其碱基序列为：SEQ ID NO.5：ATAGAGGCTAGGCTCACAA，SEQ ID NO.6：TAATCAAGCTGCAGGCAG；
扩增Y染色体AZFb区域SY134序列的引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；其碱基序列为：SEQ ID NO.7：TACAAAACTGTCTGCCTCACC，SEQ ID NO.8：CTGTTATAACAACCACTGCCAA；
扩增Y染色体AZFc区域SY254序列的引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；其碱基序列为：SEQ ID NO.9：AGGCTGGGTGTTACCAGAAG，SEQ ID NO.10：TCACTTCTTTCACTGAACCGT；
扩增Y染色体AZFc区域SY255序列的引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；其碱基序列为：SEQ ID NO.11：TGAACGTGCTGAGTTAC，SEQ ID NO.12：AGTTATGTGCTCGTCATG；
扩增SRY基因的引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，其碱基序列为SEQ ID NO.13：GTGCAAGAGAATATTCCCG，SEQ ID NO.14：CCTAGCTGGTGCTCCATTC。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、10*PCR缓冲液、Mg2+、高效Tag酶。Mg2+反应终浓度优选为1.25mM；dNTP反应终浓度优选为2.5mM。
所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(i)采集待测血液样本，提取DNA；
(ii)以该DNA为模板，用权利要求1所述引物SEQ ID NO.1～12进行TD-PCR扩增，得到PCR反应产物；
(ⅲ)琼脂糖凝胶电泳分析结果。
优选地，步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增：
扩增优选分为两管完成，第一管包含8条引物，分别为SEQ ID NO.1、2、7、8、11、12、13、14；第二管包含8条引物，分别为SEQ ID NO.3、4、5、6、9、10、13、14。
进一步的，第一管引物浓度分别为：扩增SY84序列的引物为2uM、扩增SY134序列的引物为4uM、扩增SY255序列的引物为2uM、扩增SRY序列的引物为2uM。第二管引物浓度分别为：扩增SY86序列的引物为4uM、扩增SY127序列的引物为4uM、扩增SY254序列的引物为0.5uM、扩增SRY序列的引物为0.5uM。
本发明采用TD-PCR（Touchdown PCR）对Y染色体AZFa、AZFb、AZFc及SRY四个基因区域进行多重PCR扩增。具体而言，在AZFa区域，检测SY84、SY86基因；在AZFb区域，检测SY127、SY134基因；在AZFc区域，检测SY254、SY255基因。
本发明采用了Touchdown PCR技术对Y染色体AZFa、AZFb、AZFc及SRY四个基因区域进行多重PCR。通过设定一系列退火温度从较高温度开始逐步降低的循环反应程序，从而达到最佳扩增条件，减少非特异性扩增和假阴性结果的产生。该发明可保障引物与模板杂交发生在最互补的反应物(目的扩增片段)之间，即产生目的扩增产物的反应物之间，因此大大提高了特异性目的产物的扩增效率。因此该发明较之前常规PCR具有更高的特异性；由于采用的是单管多重Touchdown-PCR技术，因此能最大限度的满足多重PCR中各引物的退火温度，较之前的发明更为快捷、简便。
附图说明
图1Y染色体缺失检测PCR电泳结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
用于体外诊Y染色体微缺失的试剂盒，包括：dNTP、10*PCR缓冲液、MgCl2、高效Tag酶；按一定比例混合的多重引物A液和B液；使用说明书。
其中，MgCl2反应终浓度为1.25mM，dNTP反应终浓度为2.5mM。
A液（α管）包括：1）扩增Y染色体AZFa区域SY84序列的引物SEQ ID NO.1和SEQID NO.2；其碱基序列为：SEQ ID NO.1：TCAGCAAAGAGAAGGGTCT，SEQ ID NO.2：TGAAGCCTACTACCTGGAGGCT；
2）扩增Y染色体AZFb区域SY134序列的引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；其碱基序列为：SEQ ID NO.7：TACAAAACTGTCTGCCTCACC，SEQ ID NO.8：CTGTTATAACAACCACTGCCAA；
3）扩增Y染色体AZFc区域SY255序列的引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；其碱基序列为：SEQ ID NO.11：TGAACGTGCTGAGTTAC，SEQ ID NO.12：AGTTATGTGCTCGTCATG；
4）扩增SRY基因的引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，其碱基序列为SEQ ID NO.13：GTGCAAGAGAATATTCCCG，SEQ ID NO.14：CCTAGCTGGTGCTCCATTC
B液（β管）包括：1）扩增Y染色体AZFa区域SY86序列的引物SEQ ID NO.3和SEQID NO.4；其碱基序列为：SEQ ID NO.3：CTCAGCACATGGGTGACACACAG A，SEQ ID NO.4：CACAGACACACACAGAGGGACAA；
2）扩增Y染色体AZFb区域SY127序列的引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；其碱基序列为：SEQ ID NO.5：ATAGAGGCTAGGCTCACAA，SEQ ID NO.6：TAATCAAGCTGCAGGCAG；
3）扩增Y染色体AZFc区域SY254序列的引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；其碱基序列为：SEQ ID NO.9：AGGCTGGGTGTTACCAGAAG，SEQ ID NO.10：TCACTTCTTTCACTGAACCGT；
4）扩增SRY基因的引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，其碱基序列为SEQ IDNO.13：GTGCAAGAGAATATTCCCG，SEQ ID NO.14：CCTAGCTGGTGCTCCATTC。
α管预混液中引物的终浓度：SY84为2uM、SY134为4uM、SY255为2uM、SRY为2uM。
β管预混液中引物的终浓度：SY86为4uM、SY127为4uM、SY254为0.5uM、SRY为0.5uM。
实施例1：试剂盒的使用方法
1）样本抽提：
1.1抽取300uL血液加入900uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1分钟（若离心机最高转速不允许，可3000rpm离心5min），吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
1.2加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
1.3加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
1.4加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
1.5将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
1.6向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
1.7向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
1.8向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。
1.9将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
1.10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
2）实验过程
2.1引物混合液配制
α管引物反应液中引物的终浓度：SY84为2uM、SY134为4uM、SY255为2uM、SRY为2uM；β管引物反应液中引物的终浓度：SY86为4uM、SY127为4uM、SY254为0.5uM、SRY为0.5uM。配置好的引物混合液放置4℃待用，若长期不使用请置于-20℃,如有可能请分装成小包装。
2.2按样品数n=待测样本数+阴性对照1个（正常男性样本）+空白对照1个；取预混PCR反应液每管23ul分装于反应管中。
2.3将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照各取2ul分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，具体反应体系如下：
2.4PCR条件：
2.5电泳
取5ul PCR产物进行鉴定；3%琼脂糖凝胶电泳，90V，80min，凝胶成像系统观察。具体电泳结果见附图1。
2.6实验结果
lane1-5：A组引物扩增受检样本,其中4为AZFc型缺失，5为AZFb型缺失；lane9-13：B组引物扩增受检样本，其中12为AZFc型缺失，13为AZFb型缺失；lane 6，7,，14，15：阴性对照；lane8：100bp marker。
SEQUENCE LISTING
<110> 南昌艾迪康临床检验所有限公司
<120> 一种Y染色体微缺失检测试剂盒
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcagcaaaga gaagggtct 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgaagcctac tacctggagg ct 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctcagcacat gggtgacaca caga 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cacagacaca cacagaggga caa 23
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atagaggcta ggctcacaa 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
taatcaagct gcaggcag 18
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tacaaaactg tctgcctcac c 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctgttataac aaccactgcc aa 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aggctgggtg ttaccagaag 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcacttcttt cactgaaccg t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgaacgtgct gagttac 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agttatgtgc tcgtcatg 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gtgcaagaga atattcccg 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cctagctggt gctccattc 19
Claims (7)
1.一种Y染色体微缺失检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(i)PCR扩增反应试剂；
(ii)扩增Y染色体AZFa区域SY84序列的引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；其碱基序列为：SEQ ID NO.1：TCAGCAAAGAGAAGGGTCT，SEQ ID NO.2：TGAAGCCTACTACCTGGAGGCT；
扩增Y染色体AZFa区域SY86序列的引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；其碱基序列为：SEQ ID NO.3：CTCAGCACATGGGTGACACACAGA，SEQ ID NO.4：CACAGACACACACAGAGGGACAA；
扩增Y染色体AZFb区域SY127序列的引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；其碱基序列为：SEQ ID NO.5：ATAGAGGCTAGGCTCACAA，SEQ ID NO.6：TAATCAAGCTGCAGGCAG；
扩增Y染色体AZFb区域SY134序列的引物SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；其碱基序列为：SEQ ID NO.7：TACAAAACTGTCTGCCTCACC，SEQ ID NO.8：CTGTTATAACAACCACTGCCAA；
扩增Y染色体AZFc区域SY254序列的引物SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；其碱基序列为：SEQ ID NO.9：AGGCTGGGTGTTACCAGAAG，SEQ ID NO.10：TCACTTCTTTCACTGAACCGT；
扩增Y染色体AZFc区域SY255序列的引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；其碱基序列为：SEQ ID NO.11：TGAACGTGCTGAGTTAC，SEQ ID NO.12：AGTTATGTGCTCGTCATG；
扩增SRY基因的引物SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，其碱基序列为SEQ ID NO.13：GTGCAAGAGAATATTCCCG，SEQ ID NO.14：CCTAGCTGGTGCTCCATTC。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTP、10*PCR缓冲液、Mg2+、高效Tag酶。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，Mg2+反应终浓度为1.25mM；dNTP反应终浓度为2.5mM。
4.如权利要求1-3之一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(i)采集待测血液样本，提取DNA；
(ii)以该DNA为模板，用权利要求1所述引物SEQ ID NO.1~12进行TD-PCR扩增，得到PCR反应产物；
(ⅲ)琼脂糖凝胶电泳分析结果。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增：
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于扩增分为两管完成，第一管包含8条引物，分别为SEQ ID NO.1、2、7、8、11、12、13、14；第二管包含8条引物，分别为SEQ ID NO.3、4、5、6、9、10、13、14。
7.如权利要求6所述试剂盒，其特征在于第一管引物浓度分别为：扩增SY84序列的引物为2uM、扩增SY134序列的引物为4uM、扩增SY255序列的引物为2uM、扩增SRY序列的引物为2uM。第二管引物浓度分别为：扩增SY86序列的引物为4uM、扩增SY127序列的引物为4uM、扩增SY254序列的引物为0.5uM、扩增SRY序列的引物为0.5uM。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20121128 |