CN101619350A - 用于恶性肿瘤个体化用药相关基因突变检测的基因芯片及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因分析检测产品，具体地说是涉及一种基因检测芯片及其配套的试剂，更具体地说是用于检测与恶性肿瘤治疗药物反应性密切相关的一系列基因突变的基因检测芯片和配套的试剂及其应用。本发明通过选择合适的突变位点以及设计合适的引物和探针，全面、系统、高通量地检测已知的与抗肿瘤药物反应个体差异密切相关的基因突变，并可针对不同药物制定出相应的调整方案。
Description
技术领域
本发明涉及基因分析检测产品，具体地说是涉及一种基因检测芯片及其配套的试剂，更具体地说是用于检测与恶性肿瘤治疗药物反应性密切相关的一系列基因突变的基因检测芯片和配套的试剂及其应用。
背景技术
恶性肿瘤作为困扰人类身心健康的重大疾病，已成为全球性的公共卫生问题：据世界卫生组织2007年度报道，2006年全球因癌症死亡的有630万人，约占总死亡人数的12％，是仅次于心血管疾病的第2大死因。从1996年以来全球每年新确诊的肿瘤患者均在1030万以上，到1999年底全球肿瘤患者总数已逾4000万人。世界卫生组织2001年报道，世界癌症发病率和死亡率比1990年上升了22％，今后20年还将上升大约50％。2005年我国卫生部的统计资料表明：我国每年新生肿瘤患者总数约212.7万人左右，其中，每年有106万左右的恶性肿瘤新生患者；同时，全国约有268.5万左右的肿瘤现有患者，其中，恶性肿瘤现有患者约148.5万左右。
抗肿瘤药物是当前和今后相当长的时间内用于治疗恶性肿瘤及其并发症的重要手段。抗肿瘤药主要指直接杀灭肿瘤细胞而起作用的药物，大多数抗肿瘤药物的作用机制主要是阻止脱氧核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或蛋白质的合成，或直接对这些大分子发生作用，从而抑制肿瘤细胞的分裂增殖，使之死亡，有些药物也可以通过改变体内激素平衡而抑制肿瘤生长。这些药物在使用过程中的一个突出问题是药物反应(包括疗效和不良反应)的个体差异，接受药物治疗的患者中有相当一部分病情未得到良好控制，另有相当数量的患者由于不能耐受抗肿瘤药物的强烈毒副反应而放弃治疗，有的甚至死于强烈的毒副反应。因此根据药物反应的个体差异针对每个癌症患者的具体情况选择合适种类和剂量的抗肿瘤药物，在提高药物有效性的同时最大限度地减少药物毒副反应的发生，成为未来医学的发展趋势。
药物反应的个体差异是临床上极其普遍的现象，产生这种差异的原因有许多，包括性别、年龄、体重、疾病状况在内的多种因素都可以导致不同病人对同一种药物的反应出现量与质的差别，然而20多年来的遗传药理学研究结果表明其中最重要、最根本的因素是遗传因素，即药物代谢酶、转运体和受体(药物作用靶点)的基因多态性导致了其编码蛋白的功能改变，进一步使血药浓度和药物敏感性显著不同，一言以蔽之，遗传变异导致了药物反应个体差异。
经过长期研究，目前国内外已发现多个基因突变与相应抗肿瘤药物的反应性(疗效和毒副反应)密切相关，其中主要包括下列内容(表1)：
以上所述的基因突变均与抗肿瘤药物在人体内的反应性密切相关，这里所说的反应性包括了药物的疗效和安全性两个方面，同种同剂量的药物作用于拥有不同基因型的患者，有的人恰好有效，有的人根本无效，还有的人会出现药物的毒副反应，因此利用各种基因检测技术在治疗之前先确定肿瘤以及病人的上述基因突变位点的基因型，根据检测的结果调整患者的用药种类与剂量，指导和优化肿瘤的化疗方案，可以使药物发挥最佳的疗效，最大限度地防止毒副反应发生，这就是基因导向性的个体化用药新模式。目前该种用药模式已被越来越多的科研人员、临床医生及患者所接受，2006年在我国举行的第15届“国际遗传药理学大会”(IUPHAR会议)上，来自27个国家的数百名代表共同探讨了基因导向个体化用药的发展现状和在各国的推广情况，预测了全面“个体化用药”时代的到来。
目前国内外已有实验室或医疗机构开展了对CYP2D6和TPMT等与抗肿瘤药物反应性密切相关的基因位点的检测工作，最常用的检测方法有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP法)、序列特异性PCR、手工或自动测序等方法，这些方法不仅操作繁琐、检测周期长、无法做到高通量，而且影响检测结果的因素众多，不易控制，难以满足临床实际检测的要求，目前只在科研领域进行。
基因芯片(gene chip)，又称DNA芯片，是近些年在生物高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一，它将能反映样本中大量基因信息的基因探针(寡核苷酸探针、cDNA克隆、PCR产物等)有序地固定在固相支持物(如醛基、氨基、巯基、羧基等活性基团修饰的载玻片或硅片、尼龙膜、硝酸纤维素膜)上形成阵列，通过与实际样本或扩增产物进行杂交反应和对荧光等杂交信号的检测，只需一次试验，就可高通量地获得所有待检基因的信息。与其他方法相比较，基因芯片的检测方法有多样品并行处理能力、分析速度快、所需样品量少、污染少、操作简单、价格低廉等优点。因此利用基因芯片技术检测与高血压药物反应个体差异密切相关的基因突变，是当下最好的选择，具有重要的现实意义。
目前尚未有对上述抗肿瘤药物反应相关基因突变位点进行检测的基因芯片及其技术方案被披露。
发明内容
本发明的目的在于针对目前恶性肿瘤化疗药物使用过程中普遍存在由于药物反应个体差异所导致的药物有效性低、毒副反应严重的现象，提供一种用于检测与这些药物的反应性密切相关的基因突变的基因芯片，本发明的另一目的在于提供一种可方便、快捷、系统地检测上述基因突变，确定药物反应性的检测试剂。本发明的检测结果可以辅助临床医生制定个体化的恶性肿瘤化疗方案。
根据本发明的一方面，本发明提供的基因芯片包括固相支持物和有序固定在固相支持物上的寡核苷酸探针。
所述的固相支持物可采用基因芯片领域常用的各种材料，如但不限于经活性基团修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片、各种纤维膜、尼龙膜等，用于修饰的活性基团如但不限于醛基、氨基、巯基、羧基等，本发明优选醛基化修饰的玻片。
所述固定于固相支持物上的寡核苷酸探针可与抗肿瘤药物治疗反应相关基因片段特异性杂交，从而确定基因突变的类型；所述基因探针和PCR引物均是针对下列任意两个或多个基因突变位点设计：GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突变(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突变(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突变(DelE746-A750insS)、EGFR L858R、EGFR L861Q。
优选的方案是所述基因探针和PCR引物均是针对下列突变位点或位点组合设计的：GSTP1*B；MTHFR 677C＞T；CAD*3；TPMT*3C；UGT1A1*6和UGT1A1*28的组合；EGFR缺失突变(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突变(Del L747-T751insS)和EGFR缺失突变(DelE746-A750insS)的组合；EGFR L858R和EGFR L861Q的组合；EGFR缺失突变(DelL747-P753insS)、EGFR缺失突变(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突变(DelE746-A750insS)、EGFR L858R和EGFR L861Q的组合。
更优选的方案是所述基因探针和PCR引物均是针对GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突变(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突变(DelL747-T751insS)、EGFR缺失突变(Del E746-A750insS)、EGFR L858R、EGFR L861Q这11个突变位点的组合设计。
本发明所述的寡核苷酸探针序列如表3所示。
表3
表3中，每一突变位点针对未发生突变(野生型)和发生突变(突变型)两种情况各设计了正反两条用于合成探针的序列，正向探针序列对应于目标寡核苷酸片段的正义链，反向探针序列对应于目标寡核苷酸片段的反义链，在实际使用时可选择上述序列中的任意连续14～25个碱基作为检测探针的序列，如果序列中包含基因突变位点(用方框标注)，则选择的连续14～25个碱基中必须包含该突变位点。针对每个待检测的基因突变，实验人员需根据表3的序列合成至少一条野生型探针和一条突变型探针，正向或反向均可。上述某一个或某几个或全部的突变位点的检测探针组成探针组，经合成后固定于固相支持物上。
在上述设计的各探针序列的基础上，本领域技术人员可通过本领域熟知的方法进行探针合成，并对探针3′端或5′端增加间隔臂(如：聚胸腺苷酸、聚四乙二醇等)，来增加杂交容量；以及对其3′端或5′端进行化学基团修饰(比如氨基化修饰)，使探针能通过化学键结合在相应的片基上(如醛基化片基)；优选对探针的3′端进行氨基修饰，其相较5′端修饰的探针具有更好的杂交效果。
在上述设计的探针序列的基础上，为了获得各个位点准确的杂交信号，必需针对每个位点合成的探针来分别设计相应的阴性质控探针以及阳性质控探针，来控制杂交过程中非特异杂交对信号值的干扰以及杂交过程的评估，本发明涉及的恶性肿瘤药物治疗相关基因(见表4)的阴性质控探针和阳性质控探针序列如下：
表4
表4中，针对每一突变位点设计了正反两条用于合成阴性质控探针的序列，正向序列对应于目标寡核苷酸片段的正义链，反向序列对应于目标寡核苷酸片段的反义链，在实际使用时可选择上述序列中的任意连续14～25个碱基作为检测探针的序列，如果序列中包含基因突变位点(用方框标注)，则选择的连续14～25个碱基中必须包含该突变位点。
根据表4序列合成的阴性质控探针应当与根据表3序列合成的检测探针在序列和方向的选择上保持一致。例如当根据表3序列设计合成UGT1A1*6的野生型检测探针为5’-gtacatcagagac
gagcatt-3’(正向探针)，突变型检测探针为5’-gtacatcagagac
gagcatt-3’(正向探针)时，根据表4序列设计合成UGT1A1*6的阴性质控探针为5’-gtacatcagagacgagcatt-3’(正向探针)；当根据表3序列设计合成UGT1A1*6的野生型检测探针为5’-gtacatcagagac
gagcatt-3’(正向探针)，突变型检测探针为5’-gtgtaaaatgctc
gtct-3’(反向探针)时，根据表4序列设计合成的UGT1A1*6的阴性质控探针为两条，分别为5’-gtacatcagagac
gagcatt-3’(正向探针)和5’-gtgtaaaatgctc
gtct-3’(反向探针)。本发明优选根据表3和表4的序列设计同向的野生型检测探针、突变型检测探针和阴性质控探针。
本发明的各基因检测位点共用一条阳性质控探针，该阳性质控探针根据表4中SEQ IDNO.71设计。
在上述设计的各探针序列的基础上，本领域技术人员可通过本领域熟知的方法进行探针合成，并对探针3′端或5′端增加间隔臂(如：聚胸腺苷酸、聚四乙二醇等)，来增加杂交容量；以及对其3′端或5′端进行化学基团修饰(比如氨基化修饰)，使探针能的通过化学键结合在相应的片基上(如醛基化片基)；优选对探针的3′端进行氨基修饰，其相较5′端修饰的探针具有更好的杂交效果。
本发明所涉及的野生型检测探针、突变型检测探针、阴性质控探针、阳性质控探针的用途及其设计方法和修饰方法均是本领域一般技术人员所熟知的，详细技术细节可参阅《基因芯片技术》(李瑶编，化学工业出版社，2004年5月出版)。
根据本发明的另一方面，用于检测样本中上述基因突变发生情况的检测试剂至少包括用于扩增样本中这些基因的PCR引物以及上述本发明的基因芯片。本发明的PCR引物根据抗肿瘤药物治疗相关基因的序列特点设计，通过PCR反应可扩增一种或几种突变基因。在本发明中，设计了如下序列用于合成这些PCR引物(表5)。
表5
表5中针对每个待检测的基因突变设计了F和R两条序列，在实际使用时，可选择F序列和R序列上的任意连续17～25个碱基作为该基因突变位点的F引物(前引物)和R引物(后引物)的序列。在上述设计的各引物序列的基础上，本领域技术人员可通过本领域熟知的方法进行引物合成。为便于进行结果检测，可以在上述引物合成时进行适当的标记，所述标记基团包括：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等，这些标记及其标记方法以及各标记物的检测方法都已是本领域众所周知的常规技术。本发明优选利用不对称PCR技术进行基因扩增，其目的是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA，所有探针(包括检测探针和阴性质控探针)均是针对该单链DNA设计合成，同时对非限制性引物(高浓度引物)进行标记，本发明优选对对非限制性引物(高浓度引物)进行5′端的Cy5标记，使得合成的单链PCR产物的5′端带有荧光标记，以便在后继的扫描过程中读取结果。
本发明的探针和引物可以针对一个基因突变进行检测，也可以组合使用检测多个基因突变。例如：以SEQ ID NO.9-16所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.76-79所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于检测与抗癌药依立替康的反应性密切相关的UGT1A1*6和UGT1A1*28两种基因突变，确定患者对依立替康的个体反应性；以SEQ ID NO.25-48所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.84-89所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于检测与吉非替尼和埃罗替尼的药物反应性密切相关的EGFR缺失突变、EGFR L858R和EGFR L861Q三种基因突变，确定患者对吉非替尼和埃罗替尼的个体反应性；较为优选的实施方案为，以SEQ ID NO.1-48所示的序列作为探针序列制备基因芯片，以SEQ ID NO.72-89所示的序列作为扩增样本的引物序列，这样组成的检测试剂，可用于检测与多种抗肿瘤药物反应性密切相关的基因突变，确定患者对大部分常用化疗药物的个体反应性。
本发明的基因芯片可以根据点样区域的数目分为1人份、2人份和多人份不等，本发明根据实际应用的需要优选2人份的设计方案，即在基片上设置2个点样区域，分别点上所需的探针，一次可检测2份生物样品。
根据本发明的另一方面，提供一种用于系统检测样本中抗肿瘤药物治疗相关基因突变的试剂盒，其至少包括本发明的上述检测试剂，本发明的试剂盒还可进一步包含下述试剂中的一种或几种：样本处理类试剂；(2)PCR扩增类试剂：(3)杂交类试剂(4)显色类试剂。
上述样本处理类试剂、PCR扩增类试剂、杂交类试剂、显色类试剂均可使用本领域技术人员所熟知的在这些操作过程中需使用的各种具体试剂，这些试剂必要时可以包括在试剂盒中，也可以将其配方列明在试剂盒的说明书中由使用者按照说明书中的提示自行配制。
本发明的试剂盒还可包括相应的阴性对照和/或阳性对照样本。
在本发明试剂盒的操作方法为：1.将标记后的待测产物与固定在芯片上的探针进行杂交，其杂交原理与普通核酸杂交相同。杂交条件与探针和标记后的待测PCR产物的长度、GC含量、盐浓度、甲酰胺等有关，我们通过严谨的实验设计逐一确定最适合的各组分条件。优选的是在本发明的试剂盒体系中43℃孵育2小时后可获得具有良好特异性和灵敏度的杂交结果。2.利用不同的洗脱条件，例如温度、盐浓度等最大限度地去除非特异性杂交。3.对样本检测结果进行评估：通过样本中恶性肿瘤药物治疗相关基因的突变发生情况评估样本提供者对抗肿瘤药物的反应性。详细操作过程见实施例。
本发明的优点是：
1.本发明全面、系统、高通量地检测已知的与抗肿瘤药物反应个体差异密切相关的基因突变，并可针对不同药物制定出相应的调整方案。
2.准确、灵敏、特异性地对上述基因突变进行检测。
3.操作简便快捷，对样品的需要量少，人力投入少，大大降低人为误差，可避免不同实验人员操作带来的结果差异。
5.与PCR-RFLP和测序法相比较，本发明污染轻、成本较低。
6.可同时检测多份生物样本，多个基因突变。
附图说明：
图1：恶性肿瘤药物治疗相关基因检测芯片平面图；
图2：芯片A(野生型探针I+突变型探针I)扫描图；
图3：芯片B(野生型探针II+突变型探针II)扫描图；
图4：芯片C(野生型探针III+突变型探针III)扫描图；
图5：恶性肿瘤药物治疗相关基因检测芯片扫描图；
图6：恶性肿瘤个体化用药相关基因突变芯片检测系统的制备流程图。
具体实施方式
实施例1：恶性肿瘤个体化用药相关基因突变芯片检测系统的制备
1.制备用的主要原辅材料及仪器设备(如表5所示)
表5
| 试剂和仪器设备 | 产地 | 试剂纯度/浓度 |
| 空白超平片 | 上海百傲科技有限公司 | / |
| 氨基硅烷试剂 | Acros(美国) | 99wt.％ |
| 戊二醛 | Acros(美国) | 25wt.％ |
| 95％乙醇 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| 冰乙酸 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| NaBH4 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| Na2HPO4 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| KH2PO4 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| Na2CO3 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| NaHCO3 | 上海化工厂 | 分析纯 |
| 氨基修饰寡核苷酸探针 | 湖南宏灏生物医药有限公司 | ≥99％ |
| Cy5荧光标记引物 | 湖南宏灏生物医药有限公司 | ≥99％ |
| 其它引物 | 湖南宏灏生物医药有限公司 | ≥95％ |
| rTaq DNA多聚酶 | 大连宝生物工程有限公司 | 5u/μl |
| dNTPs | 大连宝生物工程有限公司 | ＞98％ |
| 2.5mM | ||
| dUTP | Promega | ＞98％100mM |
| 尿嘧啶糖基化酶(UNG) | Promega | ＞98％1u/μl |
| DNA纯化试剂盒 | Promega | / |
| PCR仪 | 德国Biometra T1 Thermocycle | / |
| DNA合成仪 | ABI公司EXPEDITE8909 | / |
| 点样仪 | 德国GeSIM公司Nano-plotter 1.2 | / |
| 扫描仪 | Axon GenePix4100A | / |
| 台式离心机 | 德国Heraeus Legent Mach 1.6R | / |
| 低温恒温槽 | 上海精宏公司DKB-2015型 | / |
| 纯水仪 | 台湾艾科浦AML-1-10-S | / |
2.制备流程
见附图6。
3.详细制备过程
3.1.基片处理：基片采用玻璃介质，表面处理方式采用醛基化修饰。具体步骤为：
1、空白超平片的选择：选用76mm×25mm×1mm超平片，其长宽误差不超过0.2mm，厚度误差不超过0.1mm，无破损、表面无划痕；
2、超平片预处理：将超平片浸于新配的重铬酸钾洗液中，放置7天后，用去离子水清洗，晾干；
3、超平片氨基化：配制氨基硅烷的乙醇溶液，浓度分别为2％，将玻片浸入上述溶液中分别作用15分钟，取出用去离子水洗净，晾干；
4、超平片醛基化：将上述氨基化处理的超平片分别浸入5％的戊二醛PBS(0.2mol/lM，pH8.0)溶液中，分别作用30分钟，PBS溶液清洗晾干；
3.2.探针制备：探针序列设计如SEQ ID 1～48所示，按照本领域技术人员熟知的方法合成。
(1)在DNA合成仪上合成所需序列的寡核苷酸(包括5’端的10～15个碱基的polyT)；
(2)在DNA序列合成仪上，将寡核苷酸poly(T)分子臂引入活泼的脂族氨基臂。
(3)以HPLC纯化5’端氨基修饰的寡核苷酸，离心干燥后，溶于100mmol/LNa2CO3/NaHCO3溶液(PH9.0)，浓度为2mmol/L。
3.3.基因芯片的制备：
按图所示的恶性肿瘤个体化用药相关基因检测芯片平面结构图，在一块玻璃介质的基片上划分为两个基因探针点样区域，每个点样区域的面积为7mm*7mm，在每个点样区域内的阵列式分布的基因探针：第1行为位点GSTP1*B的野生型和突变型探针，第2行为位点GSTP1*B的阴性质控探针和阳性质控探针；第3行为位点MTHFR 677C＞T的野生型和突变型探针，第4行为位点MTHFR 677C＞T的阴性质控探针和阳性质控探针；第5行为位点UGT1A1*6的野生型和突变型探针，第6行为位点UGT1A1*6的阴性质控探针和阳性质控探针；第7行为位点UGT1A1*28的野生型和突变型探针，第8行为位点UGT1A1*28的阴性质控探针和阳性质控探针；第9行为位点CAD*3的野生型和突变型探针，第10行为位点CAD*3的阴性质控探针和阳性质控探针；第11行为位点TPMT*3C的野生型和突变型探针，第12行为位点TPMT*3C的阴性质控探针和阳性质控探针；第13行为针对EGFR缺失突变的野生型和Del_L747-P753ins S突变型探针，第14行为针对EGFR缺失突变的Del_L747-T751 ins S突变型和Del_E746-A750 ins S突变型探针，第15行为针对EGFR缺失突变的阴性质控探针和阳性质控探针；第16行为位点EGFR L858R的野生型和突变型探针，第17行为位点EGFR L858R的阴性质控探针和阳性质控探针；第18行为位点EGFR L861Q的野生型和突变型探针，第19行为位点EGFR L861Q的阴性质控探针和阳性质控探针。
各检测位点的探针(包括野生型探针和突变型探针)序列及参照探针(包括阳性参照探针和阴性参照探针)序列如下：
3.4.点样与点样后处理：
(1)探针溶液各取2μl，用点样仪按上述格式打印到处理过的基片上；
(2)室温干燥放置18小时；
(3)室温干燥后立即使用或贮存于4℃备用。
3.5.恶性肿瘤个体化用药相关基因突变芯片检测系统的组成
检测系统主要由寡核苷酸芯片、杂交液、洗涤母液、各检测基因位点的PCR反应液(包括引物、dNTP、buffer等)、生物酶和阳性参照DNA标本等组分构成，寡核苷酸芯片4℃冷藏保存，其他组分于-20℃冷冻保存，其中PCR反应液需避光。各检测基因位点PCR反应液中的引物根据SEQ ID NO.72-89所示的序列设计。
【实施例2】用实施例1中的芯片检测系统对GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突变、EGFR L858R、EGFR L861Q九种恶性肿瘤药物治疗相关基因突变进行检测。
1.具体试剂和所用仪器：
【芯片检测系统的组成】(表6)
PCR反应液1～9为实施例1中分别按照SEQ ID NO.72～73、SEQ ID NO.74～75、SEQID NO.76～77、SEQ ID NO.78～79、SEQ ID NO.80～81、SEQ ID NO.82～83、SEQ IDNO.84～85、SEQ ID NO.86～87、SEQ ID NO.88～89序列设计的PCR引物。
【其他仪器及试剂】
PCR仪、电泳仪、杂交仪、激光共聚焦芯片扫描仪(具有635nm波长的通道)、紫外分光光度计、Promega DNA抽提试剂盒。
2.具体检测过程如下：
【临床样本的处理】
采集待检测个体的外周静脉血2ml，使用Promega DNA抽提试剂盒抽提DNA，也可用自配的DNA抽提试剂进行抽提，两种方法均为本领域技术人员所公知。DNA浓度应大于200ng/ul，用紫外分光光度计检测A260/A280比值，此比值应介于1.60～1.80之间。
【PCR扩增】
在0.2mL的Eppendorf管中加入PCR反应液18.8μl，模板DNA 0.8μl，及酶10.2μl，酶20.2ul，构成20.0μl反应体系(利用PCR反应液1～9共配成A、B、C、D、E、F、G、H、I共9管反应体系)。PCR扩增程序为：
37℃600秒
95℃240秒
70℃120秒
注意：上述成分充分混匀，最后加入Taq酶并混匀，但不可剧烈振荡；放置PCR管于PCR仪上。
用PCR方法扩增染色体基因特定片段的方法已经是本领域的公知技术，其中的关键在于引物设计，利用本发明公布的引物序列，本领域的技术人员可根据经验或有关文献确定反应体系和扩增程序，独立完成该操作步骤。
【杂交】
取经43℃预热的杂交液7.5μl，加(A)(B)(C)(D)(E)(F)(G)(H)(I)PCR产物各3μl，然后加入阳参1μl，混匀，吸取20μl混合液，转移到芯片的点样区域；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进43℃水浴保温2小时。
本发明扩增产物与基因芯片之间的杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般技术人员依照经验可以确定有关缓冲液、样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。
【洗片】
打开杂交舱，取出芯片，用洗涤液1漂洗30秒，再置于去离子水中于室温洗涤30秒，取出，在离心机上瞬时离心30秒，甩去芯片上残留液体。
【扫描分析】
(1)将干燥后的芯片立即用GenePix4100A扫描仪扫描，PMT设置为600，激光波长为635nm；
(2)扫描图像用扫描仪自带的图像分析软件GenePix 6.0对扫描结果进行定量分析，并保存分析结果；
(3)利用与芯片检测系统配套的结果分析软件进行结果分析与整理。
(4)打印检测报告单。
3.对检测结果的分析过程如下：
通过芯片扫描仪得到的扫描图谱为一矩阵图谱，自第1行至第19行，由上至下即检测GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突变、EGFR L858R、EGFR L861Q位点的基因型。探针分布情况如下表(表8)所示：
| 1-5点 | 6-10点 | |
| 第1行 | GSTP1*B野生型探针 | GSTP1*B突变型探针 |
| 第2行 | GSTP1*B阴性质控探针 | 阳性参照 |
| 第3行 | MTHFR 677C＞T野生型探针 | MTHFR 677C＞T突变型探针 |
| 第4行 | MTHFR 677C＞T阴性质控探针 | 阳性参照 |
| 第5行 | UGT1A1*6野生型探针 | UGT1A1*6突变型探针 |
| 第6行 | UGT1A1*6阴性质控探针 | 阳性参照 |
| 第7行 | UGT1A1*28野生型探针 | UGT1A1*28突变型探针 |
| 第8行 | UGT1A1*28阴性质控探针 | 阳性参照 |
| 第9行 | CAD*3野生型探针 | CAD*3突变型探针 |
| 第10行 | CAD*3阴性质控探针 | 阳性参照 |
| 第11行 | TPMT*3C野生型探针 | TPMT*3C突变型探针 |
| 第12行 | TPMT*3C阴性质控探针 | 阳性参照 |
| 第13行 | EGFR野生型探针 | Del_L747-P753 ins S突变型探针 |
| 第14行 | Del_L747-T751 ins S突变型探针 | Del_E746-A750 ins S突变型探针 |
| 第15行 | EGFR阴性质控探针 | 阳性参照 |
| 第16行 | EGFR L858R野生型探针 | EGFR L858R突变型探针 |
| 第17行 | EGFR L858R阴性质控探针 | 阳性参照 |
| 第18行 | EGFR L861Q野生型探针 | EGFR L861Q突变型探针 |
| 第19行 | EGFR L861Q阴性质控探针 | 阳性参照 |
对标本进行检测，当某一位点只有野生型探针出现信号时该位点为野生型，只有突变型探针出现信号时该位点为突变型，当同时出现信号时为杂合子。
根据检测出的基因型，参照表1的内容提出用药调整意见。
【实施例3】不同碱基数的探针杂交效果比较
在本发明中，对于SEQ ID NO.1-48中所示序列的探针实际使用时可以选择连续14-25个碱基序列来合成探针，以下实验旨在证明上述碱基数的差异并不影响结果的灵敏度和特异性。
针对GSTP1*B合成以下不同长度的突变及正常探针：
野生型探针I(SEQ ID NO.1第13～26位碱基序列，共14个碱基)
5’-gggaga
gtatttg-3’
突变型探针I(SEQ IDNO.3第13～26位碱基序列，共14个碱基)
5’-gggaga
gtatttg-3’
野生型探针II(SEQ ID NO.1第12～30位碱基序列，共19个碱基)
5’-tgagggaga
gtatttgca-3’
突变型探针II(SEQ IDNO.3第12～30位碱基序列，共19个碱基)
5’-tgagggaga
gtatttgca-3’
野生型探针III(SEQ ID NO.1第10～32位碱基序列，共23个碱基)
5’-gat gagggaga
gtatttgcagc-3’
突变型探针III(SEQ ID NO.3第10～32位碱基序列，共23个碱基)
5’-gatgagggaga
gtatttgcagc-3’
以上述序列合成的探针按照实施例1的方法制备芯片A、B和C，按照实施例1的方法扩增CYP2C9*3野生型和突变型质粒，分别与芯片A、B和C杂交，结果显示见图2、3、4。
由上图可见，不同长度的探针均取得了较好的杂交结果，由此证明不同碱基数的探针均具有良好的灵敏度和特异性。
以上对本发明的描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明做出各种改变和调整，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。【实施例4】阴性质控探针和阳性质控探针设计方案
在本发明中，对于SEQ ID NO.49-71中所示序列的探针实际使用时可以选择连续14-25个碱基序列来合成各个位点的阴性质控探针，选用SEQ ID NO.81作为阳性质控探针。以下实验旨在证明选用上述序列作为阴性质控探针和阳性质控探针可以确实起到控制杂交过程的作用。
针对GSTP1*B设计野生、突变以及阴性质控探针，序列如下：
将上述4个序列点制在同一芯片上，分别扩增GSTP1*B野生和突变的质粒，将产物以及与阳性质控探针互补的阳性参照和芯片进行杂交，杂交扫描图如图5所示。
从杂交扫描图中我们可以看出，无论使用野生质粒或者突变质粒扩增产物，阴性质控探针都没有杂交信号，而阳性质控探针信号稳定而且特异的信号，说明本发明中的阴性质控探针以及阳性质控探针可以确实起到控制杂交过程的作用。
以上对本发明的描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明做出各种改变和调整，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
序列表
<110>中南大学
<120>一种基于等位基因特异性扩增的双探针基因突变检测方法及其专用芯片和试剂盒
<160>151
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atgctgtggt gcacgaggtc cagagataca 30
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atggggcagg ctggtgggga gaaggtcaag 30
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ctaaagtcca ggaagagatt gaacgtgtca 30
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ctgcatgcag gggctccggt ttctgccaac 30
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gtgaaggaag ccctgattga tcttggagag 30
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
agtgggaaat ggcctcttcc agaaaactcg 30
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
tgaaaacatc aggattgtaa gcaccccctg 30
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gaagcaaaaa acttggcctt acctggatct 30
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ggaatctggg tcatacatgt ggatatatgt 30
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ctattccacg aagcatatta cccatgaacg 30
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
agtgatgagt ggtgttcgca ggtgtgtgcc 30
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
tttgtgataa cagccaccga ggggactcca 30
<210>13
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
cccttcattt gcagacctgt tccgcacgcc 30
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
tcaggatgaa ggtgcgcttc ctcaggcgca 30
<210>15
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
accgcgtggg ccgcatctac cccatggcca 30
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
gcaggctgcc cccgccaaca aatttgacac 30
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
ctcactggag gtggttgcag ttcacagttg 30
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
atagagcaag aagaagaagt tgggcagaga 30
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
agatgggcag actgggccct gcacctcccg 30
<210>20
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
ccgggtaggc ctgcaaatgc tagcagccct 30
<210>21
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
ccatggttga cacagagatg ccattctggc 30
<210>22
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
atccacggag ctgatcccaa agttggtggc 30
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
gctgttctac tgctattagc tctgcccggt 30
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
ggcccttgag tcgtggtttc ctggtcatgc 30
<210>25
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
cctcctacac tgatataaac tatatgaagg 30
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
tgtgtctagg ccttagttaa taatgaatga 30
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
tgctgacacg cctggcagag gaccctgccg 30
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
cctccgctgg cgggcacggt acctgggctt 30
<210>29
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
gagctgccca ggaatatcca ggcaagaatg 30
<210>30
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
agaggcctga gtaattatca gaatatggta 30
<210>31
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
gcgggcggcg c 11
<210>32
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
gctggtgggg agaaggtcaa tgtatctctg gacctcgtgc a 41
<210>33
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
tgcacgaggt ccagagatac cttgaccttc tccccaccag c 41
<210>34
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
ggggctccgg tttctgccaa tgacacgttc aatctcttcc t 41
<210>35
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
aggaagagat tgaacgtgtc gttggcagaa accggagccc c 41
<210>36
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
tggcctcttc cagaaaactc ctctccaaga tcaatcaggg c 41
<210>37
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
gccctgattg atcttggaga cgagttttct ggaagaggcc a 41
<210>38
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
aacttggcct tacctggatc cagggggtgc ttacaatcct g 41
<210>39
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
caggattgta agcaccccctagatccaggt aaggccaagt t 41
<210>40
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
gaagcatatt acccatgaac acatatatcc acatgtatga c 41
<210>41
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
gtcatacatg tggatatatg cgttcatggg taatatgctt c 41
<210>42
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
acagccaccg aggggactcc ggcacacacc tgcgaacacc a 41
<210>43
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
tggtgttcgc aggtgtgtgc tggagtcccc tcggtggctg t 41
<210>44
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
aggtgcgctt cctcaggcgc ggcgtgcgga acaggtctgc a 41
<210>45
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
tgcagacctg ttccgcacgc tgcgcctgag gaagcgcacc t 41
<210>46
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
ccccgccaac aaatttgaca tggccatggg gtagatgcgg c 41
<210>47
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
gccgcatcta ccccatggcc gtgtcaaatt tgttggcggg g 41
<210>48
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
gaagaagaag ttgggcagag caactgtgaa ctgcaaccac c 41
<210>49
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
ggtggttgca gttcacagtt tctctgccca acttcttctt c 41
<210>50
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
cctgcaaatg ctagcagccc cgggaggtgc agggcccagt c 41
<210>51
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
gactgggccc tgcacctccc agggctgcta gcatttgcag g 41
<210>52
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
gctgatccca aagttggtgg gccagaatgg catctctgtg t 41
<210>53
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
acacagagat gccattctgg gccaccaact ttgggatcag c 41
<210>54
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
gtcgtggttt cctggtcatg accgggcaga gctaatagca g 41
<210>55
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
ctgctattag ctctgcccgg gcatgaccag gaaaccacga c 41
<210>56
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
gccttagtta ataatgaatg ccttcatata gtttatatca g 41
<210>57
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>57
ctgatataaa ctatatgaag tcattcatta ttaactaagg c 41
<210>58
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>58
gcgggcacgg tacctgggct cggcagggtc ctctgccagg c 41
<210>59
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>59
gcctggcaga ggaccctgcc aagcccaggt accgtgcccg c 41
<210>60
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>60
agtaattatc agaatatggt cattcttgcc tggatattcc t 41
<210>61
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>61
aggaatatcc aggcaagaat taccatattc tgataattac t 41
<210>62
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<400>62
ctcacattag gaaacatttc ttgcatagtt ttataaggct ggcataatct taatatcaaa 60
<210>63
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>63
tatcagctaa agtccaggaa gagattgaac gtgtgattgg cagaaaccgg 50
<210>64
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<400>64
cagtgtactg ttcacagaaa ttccaatgaa tctagagata aattatgaat agtgattagt 60
<210>65
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>65
ttatcatcaa ttgtcatatt ctttgtctct tcttacagtt ttcgtcttga 50
<210>66
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>66
agacaatttg acttcctctc atcctatttc aataccattt atttctttct 50
<210>67
<211>53
<212>DNA
<213>人工序列
<400>67
gcctgtgtga ctgaataaaa gcatacaaat acaatgaaaa tatgaatcta agt 53
<210>68
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>68
agtaaacaca aaactagtca atgaatcaca aatacgcaag cagtcacata 50
<210>69
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>69
gttaattcga gattaatgta aaagtgatgt gttgatttta tgcatgccaa 50
<210>70
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>70
atcaaaagga ggaatatagg gaatacagtg gggttggagg taaggtgatg 50
<210>71
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<400>71
gcagcataag aatggactaa tacaccatat tgtcaaagtt tgcaaagtga atataaatta 60
cttgtact 68
<210>72
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>72
ccagaaccca gccccagatt cagtgatgtg agatacccct tcctagattt 50
<210>73
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>73
agtctttgag ttgtaccctc ctcgtcccat ttgaaatcct ggtgtcatcg 50
<210>74
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>74
ttgctttatg agctgtgtca ccttgaggaa gttaactaac ctctctgggg 50
<210>75
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>75
gtgaaatcta ggaaggggta tctcacatca ctgaatctgg ggctgggttc 50
<210>76
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<400>76
tggactgtaa aactttgaat aatgacaccc agcttataga tcaacattag a 51
<210>77
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>77
ttgctctagg gcattctaaa cccagtgatt catgctcttt ctccatctgc 50
<210>78
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>78
tgattgattg gtatggtctg tctggagtgt catgttggcc ttatctgtga 50
<210>79
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>79
cctattcctt agtagccaga gttacagtta agttccatat actataagag 50
<210>80
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>80
tgcttctgga aactgatgct ggcataggcg cttaaatcct cacttgagcg 50
<210>81
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>81
atgcaggtgg atgactctgt ggtggcccag aacatgcacg agaccatcct 50
<210>82
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>82
gtcatacttg taatctgcaa ccactggatc tgttcttgtg aatggaatgt 50
<210>83
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>83
tatcacaaaa cagcctagac agcactaata aggtggttat gttcttttct 50
<210>84
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>84
ctgtgatgaa agaggccaga aacattctta cctggatctc ctttctcacc 50
<210>85
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>85
tgggaaaatt agaggagtgt catctgtgca atcactgaat tcataatctt 50
<210>86
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>86
gaatcagaat atgaatgtac tgggaatagg gatgagggtg aagatgggaa 50
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<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>87
agagattaga caggggagga ggggcagcta aagatggctc aggcaaacaa 50
<210>88
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>88
gttctgcacg atgaggatca ggatggccag tgggcactcc tcagtcacca 50
<210>89
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>89
gaagtgaagt gggacccagg tggaggtaag gaagagtctg gtggggagtt 50
<210>90
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>90
tgggatgggc tgatgggttg aatgtggggt atgaaagaaa agagcaatcg 50
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<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>91
catttgatga ttgttttgtt aatggcttgc aggtcagatt ttcatctttt 50
<210>92
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<400>151
tgagtaatta tcagaatatg tta 23
Claims (8)
1.一种用于检测恶性肿瘤个体化用药相关基因突变的基因芯片，包括固相支持物、有序固定在固相支持物上的基因探针和用于扩增样本中突变基因片段的PCR引物，基因探针包括检测不同基因位点突变的野生型检测探针、突变型检测探针、阴性质控探针及阳性质控探针，其特征在于其中所述基因探针和PCR引物均是针对下列任意两个或多个基因突变位点设计：GSTP1*B、MTHFR677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突变(DelL747-P753insS)、EGFR缺失突变(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突变(DelE746-A750insS)、EGFR L858R、EGFR L861Q。
2.根据权利要求1所述的用于检测恶性肿瘤个体化用药相关基因突变的基因芯片，其特征在于所述基因探针和PCR引物均是针对下列突变位点或位点组合设计的：GSTP1*B；MTHFR 677C＞T；CAD*3；TPMT*3C；UGT1A1*6和UGT1A1*28的组合；EGFR缺失突变(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突变(DelL747-T751insS)和EGFR缺失突变(Del E746-A750insS)的组合；EGFR L858R和EGFR L861Q的组合；EGFR缺失突变(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突变(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突变(Del E746-A750insS)、EGFR L858R和EGFR L861Q的组合。
3.根据权利要求1所述的用于检测恶性肿瘤个体化用药相关基因突变的基因芯片，其特征在于所述基因探针和PCR引物均是针对GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突变(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突变(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突变(Del E746-A750insS)、EGFR L858R、EGFR L861Q这11个突变位点的组合设计。
4.根据权利要求1、2或3所述的用于恶性肿瘤个体化用药相关基因突变检测的基因芯片，其特征在于所述检测不同突变位点的寡核苷酸探针序列，包括正向野生型探针、正向突变型探针、反向野生型探针、反向突变型探针，由序列SEQ ID NO.1-48中的任意连续14～25个碱基组成，序列中包含基因突变位点时，选择的连续14～25个碱基中必须包含该突变位点。
5.根据权利要求1、2或3所述的用于恶性肿瘤个体化用药相关基因突变检测的基因芯片，其特征在于所述检测不同突变位点的阴性参照探针序列，包括正向阴性参照探针和反向阴性参照探针，由序列SEQ ID NO.49-70中的任意连续14～25个碱基组成，序列中包含基因突变位点时，选择的连续14～25个碱基中必须包含该突变位点。
6.根据权利要求1、2或3所述的用于恶性肿瘤个体化用药相关基因突变检测的基因芯片，其特征在于，所述固定于固相支持物上的阳性质控探针序列为SEQID NO.71。
7.根据权利要求1、2或3所述的用于恶性肿瘤个体化用药相关基因突变检测的基因芯片，其特征在于，所述用于扩增样本中突变基因片段的PCR引物序列由序列SEQ ID NO.72-89中的任意连续17～25个碱基组成。
8.权利要求1至7之一所述的用于恶性肿瘤个体化用药相关基因突变检测的基因芯片，可应用于检测GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突变(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突变(DelL747-T751insS)、EGFR缺失突变(Del E746-A750insS)、EGFR L858R、EGFRL861Q这11个基因突变。
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Granted publication date: 20120516 |