CN104805199A - 一种Gilbert综合征基因突变检测试剂盒 - Google Patents
一种Gilbert综合征基因突变检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104805199A CN104805199A CN201510174851.2A CN201510174851A CN104805199A CN 104805199 A CN104805199 A CN 104805199A CN 201510174851 A CN201510174851 A CN 201510174851A CN 104805199 A CN104805199 A CN 104805199A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- acrylamide
- detection kit
- gene mutation
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及Gilbert综合征基因突变检测试剂盒，属于生物技术领域。该试剂盒由丙烯酰胺修饰的PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰的玻片上而制成的DNA微阵列芯片，6种核苷酸探针部分组成。本试剂盒采用DNA微阵列技术，操作简便，价格低廉，可用于基因突变所致的Gilbert 综合征的相关疾病筛选和临床辅助诊断。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测试剂盒，具体涉及一种Gilbert综合征基因突变检测试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
Gilbert综合征(Gilbert syndrome，GS)，由Gilbert和Lereboullet在 1901年首次报道，又称体质性肝功能不良性黄疸，是一种常见的遗传性非结合胆红素血症。该病患者由于肝细胞摄取非结合胆红素(unconjugated bilirubin, UCB)功能障碍及微粒体内葡萄糖醛酸转移酶（uridine diphosphate glucuronosyl transferase，UGT）不足，导致血中UCB增高而出现黄疸。患者主要表现为以间接胆红素升高为主的非溶血性间歇性黄疸，一些患者可出现乏力、消化不良、肝区不适和脂肪不耐受。
随着分子生物学技术的发展，人们对Gilbert 综合征的研究已非常深入。研究发现，胆红素在肝内的代谢主要是通过尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）实现的，UGT1A1基因异常可导致肝脏微粒体的胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶表达下降，从而引起胆红素代谢障碍。目前已在Gilbert 综合征患者及其家系中发现3 种类型的UGT1A1 基因异常，包括远端加强序列即苯巴比妥反应增强元件（PBREM）-3279位点突变，PBREM约位于TATA上游，沈健等人在《胃肠病学》2007年12卷392-396页中的标题为《 1例中国Gilbert综合征家系UGT1A1基因遗传分析.》报道了我国首例PBREM区存在T-3279G突变，此突变与基因转录活性下降导致的胆红素水平升高显著相关；启动子区域TA 盒中TA 碱基序列插入突变，表现为二核苷酸（TA）插入到UGT1A1基因启动子上游约25~35个bp处的TATA盒中，使正常野生型A（TA）6TAA突变为A（TA）7TAA；UGT1A1 基因外显子区域的单碱基突变，包括G71R、G493R、P364L、P229Q、F83L、R367G及Y486D，以核苷酸211位点G→A点突变（G71R）最为频繁，常见于亚洲人。
现有技术中，Gilbert综合征的诊断可采用UGT1A多克隆抗体的肝组织免疫组织化学检查，测定肝内UGT的活性程度，或通过分子生物学技术检测相关的UGT1A基因启动子区TATAA序列的遗传学多态性。目前主要通过PCR测序技术来检测Gilbert综合征基因突变，但是测序价格较贵，因此必须寻找一种应用简单、 结果可靠、价格低廉的技术来开发Gilbert综合征基因检测试剂盒。
DNA微阵列芯片是按照特定的排列方式固定有大量基因探针的硅片、玻片、塑料片，能够高效地大规模获取相关生物信息。DNA微阵列芯片技术是新开发的一种DNA序列变异检测工具，应用领域主要有基因突变及多态性分析、基因测序，疾病诊断和预测、药物筛选等，为现代医学，医学诊断学的发展提供了强而有力的工具。
发明内容
本发明的目的是将DNA微阵列芯片技术应用于Gilbert综合征基因突变检测，开发一种新型的Gilbert综合征基因突变检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明包含下述技术方案：
一种Gilbert综合征基因突变检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒由丙烯酰胺修饰的PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰的玻片上而制成的DNA微阵列芯片，6种核苷酸探针部分组成， 其中，所述的丙烯酰胺修饰的PCR产物部分由4种引物PCR扩增获得，其中 引物序列分别为:
SEQ ID NO.1: 5’-CAACTCATCCTTATTCTGAT -3’
SEQ ID NO.2: 5’-丙烯酰胺-CTCATGCCTCCTCTCTAACC-3’
SEQ ID NO.3: 5’-CCGAGCTACCTTTGTGGACT-3’
SEQ ID NO.4: 5’-丙烯酰胺-CACGATGCCCGAGACTAACTAA -3’
所述6种核苷酸探针部分序列分别为，
SEQ ID NO.5: 5’-TTCTGTTTGAAGA -3’
SEQ ID NO.6: 5’ -TTCTGTGTGAAGA -3’
SEQ ID NO.7: 5’ -GCCATATATATATATATAAG -3’
SEQ ID NO.8: 5’ -GCCATATATATATATATATAAG -3'
SEQ ID NO.9: 5’ - AGAG TCGGAGCTT -3’
SEQ ID NO.10: 5’ -AGAGTCAGAGCTT - 3’。
在本发明的一个较佳实施例中，所述的其他成分为30% 丙烯酰胺、50%丙三醇和10%过硫酸铵组成的混合溶液。
在本发明的一个较佳实施例中，所述的检测试剂盒还包括阳性质控品，所述的阳性质控品为UGT1A1增强元件PBREM基因片段，UGT1A1启动子区片段和外显子1基因片段。
在本发明的一个较佳实施例中，采用PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰的玻片上，制成的DNA微阵列芯片，用于与相应探针进行杂交反应。
在本发明的一个较佳实施例中，所述的杂交反应中的杂交温度为30－40℃，杂交时间为1－3h。
在本发明的一个较佳实施例中，所述的检测试剂盒用于基因突变所致的Gilbert 综合征的疾病筛选和临床辅助诊断。
本发明还另外提出了一个新的技术方案，提出了一种的Gilbert综合征基因突变检测试剂盒所用的DNA微阵列芯片的制备方法，包括如下步骤：
（1）点样：将丙烯酰胺修饰的PCR产物和其他成分混合成预聚合物，然后将上述预聚合物溶液和空白对照点样于丙烯基团修饰的玻片上，其中，所述的其他成分为30% 丙烯酰胺、50%丙三醇和10%过硫酸铵组成的混合溶液。所述空白对照为水和30% 丙烯酰胺、50%丙三醇以及10%过硫酸铵混合成的预聚合物。。
（2）固定：制备DNA微阵列芯片：点样完成后，将玻片置于潮湿的盛有TEMED的容器中，在真空状态下当TEMED挥发到玻片表面时，丙烯基团之间会发生共聚合反应，得DNA微阵列芯片，
其中，所述的丙烯酰胺修饰的PCR产物部分由4种引物PCR扩增获得，
其中 引物序列分别为:
SEQ ID NO.1: 5’-CAACTCATCCTTATTCTGAT -3’
SEQ ID NO.2: 5’-丙烯酰胺-CTCATGCCTCCTCTCTAACC-3’
SEQ ID NO.3: 5’-CCGAGCTACCTTTGTGGACT-3’
SEQ ID NO.4: 5’-丙烯酰胺-CACGATGCCCGAGACTAACTAA -3’。
在本发明的一个较佳实施例中，所述的聚合反应的反应时间为30 -60min，温度为20－30℃，真空度1000 Pa。
本试剂盒采用DNA微阵列技术，可对Gilbert综合征基因突变位点进行检测，操作简便快捷、价格低廉，可用于基因突变所致的Gilbert 综合征的相关疾病筛选和临床辅助诊断。
附图说明
图1 是PCR电泳图；
图2为3个已知增强元件-3279位点的新鲜血样本位点扩增后荧光杂交图像；
图3为3个已知增强元件-3279位点的新鲜血样本位点扩增后荧光杂交图像的相对荧光强度图；
图4是3个已知启动子区A（TA)6TAA/A(TA)7TAA插入突变的新鲜血样本位点扩增后荧光杂交图像；
图5为3个已知启动子区A（TA)6TAA/A(TA)7TAA插入突变的新鲜血样位点扩增后荧光杂交图像的相对荧光强度图；
图6是3个已知外显子区域211位点的新鲜血样本位点扩增后荧光杂交图像；
图7为3个已知外显子区域211位点的新鲜血样位点扩增后荧光杂交图像的相对荧光强度；
图中：M、DNA marker，A、启动子区片段和外显子1片段，B、PBREM片段。0、空白对照，1、野生型纯合子-3279T/T样本，2、突变纯合子-3279G/G样本，3、杂合子-3279T/G样本，4、空白对照，5、野生型纯合子A(TA)6TAA样本，6、突变纯合子A(TA)7TAA样本，7、杂合子A（TA)6/7TAA样本，8、空白对照，9、野生型纯合子211G/G样本，10、突变型纯合子211A/A样本，11、杂合子211G/A样本。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。
本发明公开一种Gilbert综合征基因突变检测试剂盒，该试剂盒由丙烯酰胺修饰的PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰的玻片上而制成的DNA微阵列芯片，6种核苷酸探针部分组成， 其中，所述的丙烯酰胺修饰的PCR产物部分由2对引物PCR扩增获得，包括如下序列，
根据UGT1A1 基因的苯巴比妥反应增强元件（PBREM）设计上游引物F1和下游引物R1，其中所述的F1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述的R1的序列如SEQ ID NO：2所示，
根据UGT1A1 基因启动子区域TA 盒设计上游引物F2和下游引物R2，根据UGT1A1 基因外显子区域的211位点设计上游引物F3和下游引物R3，其中，所述的F2的序列与所述的F3的序列为相同序列，如SEQ ID NO：3所示，所述的 R2的序列与所述R3的序列为相同序列，如SEQ ID NO：4所示；
表1 4种引物序列
| 名称 | 序列号 | 序列（5’ -3’） |
| F1 | 1 | CAACTCATCCTTATTCTGAT |
| R1 | 2 | 丙烯酰胺- CTCATGCCTCCTCTCTAACC |
| F2 | 3 | CCGAGCTACCTTTGTGGACT |
| R2 | 4 | 丙烯酰胺- CACGATGCCCGAGACTAACTAA |
所述6种核苷酸探针部分序列分别为，
根据UGT1A1 基因的苯巴比妥反应增强元件（PBREM）-3279位点设计的野生型探针W1和突变型探针M1，其中所述的W1的序列如SEQ ID NO：5所示，且采用CY3荧光标记，所述的M1的序列如SEQ ID NO：6所示，且采用CY5荧光标记。
根据UGT1A1 基因启动子区域TA 盒设计的野生型探针W2和突变型探针M2，其中所述的W2的序列如SEQ ID NO：7所示，且采用CY3荧光标记，所述的M2的序列如SEQ ID NO：8所示，且采用CY5荧光标记，;
根据UGT1A1 基因外显子区域的211位点设计的野生型探针W3和突变型探针M3，其中所述的W3的序列如SEQ ID NO：9所示，且采用CY3荧光标记，所述的M3的序列如SEQ ID NO：10所示，且采用CY5荧光标记，
表2 具体探针序列如下：
| 名称 | 序列号 | 序列（5’ -3’） | 荧光标记 |
| W1 | 5 | TTCTGTTTGAAGA | Cy3 |
| M1 | 6 | TTCTGTGTGAAGA | Cy5 |
| W2 | 7 | GCCATATATATATATATAAG | Cy3 |
| M2 | 8 | GCCATATATATATATATATAAG | Cy5 |
| W3 | 9 | AGAG TCGGAGCTT | Cy3 |
| M3 | 10 | AGAGTCAGAGCTT | Cy5 |
在本发明中，其他成分为30% 丙烯酰胺、50%丙三醇和10%过硫酸铵组成的混合溶液。检测试剂盒中采用阳性质控品为UGT1A1增强元件PBREM基因片段，UGT1A1启动子区片段和外显子1基因片段，使用时候采用PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰的玻片上，制成的DNA微阵列芯片，用于与相应探针进行杂交反应。所述的杂交反应中的杂交温度为30－40℃，杂交时间为1－3h。，检测试剂盒用于基因突变所致的Gilbert 综合征的疾病筛选和临床辅助诊断。
在本发明中由丙烯酰胺修饰的PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰的玻片上而制成的DNA微阵列芯片的具体过程如下:
（1）点样：将丙烯酰胺修饰的PCR产物和其他成分混合成预聚合物，然后将上述预聚合物溶液和空白对照点样于丙烯基团修饰的玻片上，其中，所述的其他成分为30% 丙烯酰胺、50%丙三醇和10%过硫酸铵组成的混合溶液，所述空白对照为水和30% 丙烯酰胺、50%丙三醇以及10%过硫酸铵混合成的预聚合物。
（2）点样完成后，将玻片置于潮湿的盛有TEMED的容器中，在真空状态下当N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）挥发到玻片表面时，丙烯基团之间会发生共聚合反应，反应时间为30 -60min，温度为20-30℃，真空度1000 Pa。得DNA微阵列芯片，
其中，所述的丙烯酰胺修饰的PCR产物部分由2对引物PCR扩增获得，包括如下序列，
根据UGT1A1 基因的苯巴比妥反应增强元件（PBREM）增强元件设计上游引物F1和下游引物R1，其中所述的F1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述的R1的序列如SEQ ID NO：2所示，
根据UGT1A1 基因启动子区域TA 盒设计上游引物F2和下游引物R2，根据UGT1A1 基因外显子区域211位点设计上游引物F3和下游引物R3，其中，所述的F2的序列与所述的F3的序列为相同序列，如SEQ ID NO：3所示，所述的 R2的序列与所述R3的序列为相同序列，如SEQ ID NO：4所示。具体见表1，引物序列表。
实施例 1 Gilbert综合征基因突变位点检测试剂盒及其使用
1、制备包括下表中各组成成分的试剂盒 ：
| 序号 | 产品组成 | 主要成分 | 20人份配给量 |
| 1 | PBREM PCR反应液 | Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq酶、PBREM引物等 | 700μl×1管 |
| 2 | TA211 PCR 反应液 | Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq酶、TA211引物 | 700μl×2管 |
| 3 | 阳性质控品1 | UGT1A1增强元件（PBREM）基因片段 | 300μl×1管 |
| 4 | 阳性质控品2 | UGT1A1启动子区片段和外显子1基因片段 | 300μl× 2管 |
| 5 | 30% 丙烯酰胺 | 丙烯酰胺 | 60μl×1管 |
| 6 | 50% 丙三醇 | 丙三醇 | 200μl×1管 |
| 7 | 10% 过硫酸铵 | 过硫酸铵 | 60μl×1管 |
上表中PBREM引物序列为：上游引物：5’- CAACTCATCCTTATTCTGAT -3’；下游引物：5’-（丙烯酰胺）CTCATGCCTCCTCTCTAACC -3’。
TA211引物序列为：上游引物：5’- CCGAGCTACCTTTGTGGACT -3’；下游引物：5’-（丙烯酰胺）CACGATGCCCGAGACTAACTAA -3’。
2、适用标本类型 ：全血（采取病人全血2ml，抗凝紫色管。冷冻或冷藏保存）。本实施例的所采用的标本为：（1）3个已知增强元件-3279位点的新鲜血样本，分别为野生型纯合子-3279T/T样本，突变纯合子-3279G/G样本和杂合子-3279T/G样本； （2） 3个已知启动子区的新鲜血样本，分别为野生型纯合子A(TA)6TA样本， 突变纯合子A(TA)7TAA样本，杂合子A（TA)6/7TAA；（3）3个已知外显子区域211位点的新鲜血样本，分别为野生型纯合子211G/G，突变纯合子211A/A样本，杂合子211G/A样本。
3、核酸提取：推荐使用QIAGEN QIAamp blood mini kit，具体操作参见该试剂盒说明书，最后收集到200μl DNA 溶液，直接进行检测或保存于-20℃。
4、PCR扩增及检测
4.1 试剂准备：按比例取相应量的 PCR 反应液(35μl/人份)，按 35μl/管分装成 PCR 反应管，备用。
4.2加样：向PCR反应管中，分别加入提取后的DNA溶液15μl，阳性质控品15μl。
4.3 PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 30sec, 57℃ sec, 72℃ 45sec; 32cycles；72℃ 10min。
4.4 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果请参阅图1。
5、PCR产物的点样及固定
PCR产物经无水乙醇沉淀后与30% 丙烯酰胺、50%丙三醇、10%过硫酸铵混合成预聚合物，然后将PCR产物预聚合物和空白对照预聚合物手动点样于丙烯基团修饰的玻片上，在本实施例中，点样模式为：每一类型的基因片段点在一张玻片上，点成四行，每张玻片上每个样本重复点样2次。
点样完成后，将玻片置于潮湿的盛有TEMED的容器中，在真空状态下当TEMED挥发到玻片表面时，丙烯基团之间会发生共聚合反应，从而将丙烯酰胺修饰的PCR产物固定于用丙烯基团修饰的玻片上。
6、杂交
固定完成后，为了获得杂交所需的单链DNA，将固定在玻片上的双链DNA用0.10M的NaOH溶液处理10min以变性，然后在37℃分别与表2中相应的10μM的探针杂交2小时。
7、电泳去除非特异性杂交的探针
杂交完成后，玻片在1xTBE缓冲溶液中常温下，38 V/cm电压下电泳25分钟。
8、激光共焦扫描仪扫描
电泳后的玻片用水冲洗，然后用氮气吹干，最后用激光共焦扫描仪扫描得到杂交结果扫描图像，请参阅图2，图4和图6，并将图像转化为相对荧光结果强度数据，得相对荧光强度图，请参阅图3，图5和图7。
结合图2和图3，可以得出相关检测结果，见表3
| 样本编号 | 已知PCR测序样本 | 荧光信号及颜色 | 荧光强度和相对荧光强度 |
| 1 | 野生型纯合子-3279T/T样本 | 强的Cy3荧光信号，显绿色 | Cy3荧光强度为11328，Cy5的荧光强度为682，Cy3/Cy5为17 |
| 2 | 突变纯合子-3279G/G样本 | 强的Cy5荧光信号，显红色 | Cy5荧光强度为10027，Cy3的荧光强度515， Cy5/Cy3为20 |
| 3 | 杂合子-3279T/G样本 | Cy3的荧光信号和Cy5荧光信号，两种染料叠加后，为强的黄色荧光信号 | Cy3荧光强度为9106，Cy5的荧光强度为8544，Cy3/Cy5为1.07 |
结合图4和图5，可以得出相关检测结果，见表4
| 样本编号 | PCR测序样本 | 荧光图像 | 荧光强度和相对荧光强度 |
| 5 | 野生型纯合子A(TA)6TAA样本 | 强的Cy3荧光信号，显绿色 | Cy3荧光强度为16024，Cy5的荧光强度为485，Cy3/Cy5为33 |
| 6 | 突变纯合子A(TA)7TAA样本 | 强的Cy5荧光信号，显红色 | Cy5荧光强度为13200，Cy3的荧光强度549， Cy5/Cy3为24 |
| 7 | 杂合子 A（TA)6/7TAA样本 | Cy3的荧光信号和Cy5荧光信号，两种染料叠加后，为强的黄色荧光信号 | Cy3荧光强度为11658，Cy5的荧光强度为10134，Cy3/Cy5为1.15 |
结合图6和图7，可以得出相关检测结果，见表5
| 样本编号 | PCR测序样本 | 荧光图像及颜色 | 荧光强度和相对荧光强度 |
| 9 | 野生型纯合子211G/G样本 | 强的Cy3荧光信号，显绿色 | Cy3荧光强度为10889，Cy5的荧光强度为551，Cy3/Cy5为20 |
| 10 | 突变型纯合子211A/A样本 | 强的Cy5荧光信号，显红色 | Cy5荧光强度为12294，Cy3的荧光强度638， Cy5/Cy3为19 |
| 11 | 杂合子211G/A样本 | Cy3的荧光信号和Cy5荧光信号，两种染料叠加后，为强的黄色荧光信号 | Cy3荧光强度为7612，Cy5的荧光强度为8233，Cy3/Cy5为0.92 |
从表3，表4和表5可以得出，通过扫描得到的结果与PCR测序结果相一致。由此可见，本发明可用于替代PCR测序技术用于检测Gilbert综合征基因突变。该DNA微阵列芯片操作简便、价格低廉更适用于大多数Gilbert综合征患者的检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 吴旭平
<120> 一种Gilbert综合征基因突变检测试剂盒
<130> DN-2015
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 根据特定核苷酸设计，以用作PCR扩增引物
<400> 1
caactcatcc ttattctgat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 根据特定核苷酸设计，以用作PCR扩增引物
<400> 2
ctcatgcctc ctctctaacc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 根据特定核苷酸设计，以用作PCR扩增引物
<400> 3
ccgagctacc tttgtggact 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 根据特定核苷酸设计，以用作PCR扩增引物
<400> 4
cacgatgccc gagactaact aa 22
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 根据特定核苷酸设计，以用作芯片杂交反应探针
<400> 5
ttctgtttga aga 13
<210> 6
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 根据特定核苷酸设计，以用作芯片杂交反应探针
<400> 6
ttctgtgtga aga 13
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 根据特定核苷酸设计，以用作芯片杂交反应探针
<400> 7
gccatatata tatatataag 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 根据特定核苷酸设计，以用作芯片杂交反应探针
<400> 8
gccatatata tatatatata ag 22
<210> 9
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 根据特定核苷酸设计，以用作芯片杂交反应探针
<400> 9
agagtcggag ctt 13
<210> 10
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 根据特定核苷酸设计，以用作芯片杂交反应探针
<400> 10
agagtcagag ctt 13
Claims (8)
1.一种Gilbert综合征基因突变检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒由丙烯酰胺修饰的PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰的玻片上而制成的DNA微阵列芯片，6种核苷酸探针部分组成， 其中，所述的丙烯酰胺修饰的PCR产物部分由4种引物PCR扩增获得，其中 引物序列分别为:
SEQ ID NO.1: 5’-CAACTCATCCTTATTCTGAT -3’
SEQ ID NO.2: 5’-丙烯酰胺-CTCATGCCTCCTCTCTAACC-3’
SEQ ID NO.3: 5’-CCGAGCTACCTTTGTGGACT-3’
SEQ ID NO.4: 5’-丙烯酰胺-CACGATGCCCGAGACTAACTAA -3’
所述6种核苷酸探针部分序列分别为，
SEQ ID NO.5: 5’-TTCTGTTTGAAGA -3’
SEQ ID NO.6: 5’ -TTCTGTGTGAAGA -3’
SEQ ID NO.7: 5’ -GCCATATATATATATATAAG -3’
SEQ ID NO.8: 5’ -GCCATATATATATATATATAAG -3'
SEQ ID NO.9: 5’ - AGAG TCGGAGCTT -3’
SEQ ID NO.10: 5’ -AGAGTCAGAGCTT - 3’。
2.根据权利要求1所述的Gilbert综合征基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的其他成分为30% 丙烯酰胺、50%丙三醇和10%过硫酸铵组成的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的Gilbert综合征基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒还包括阳性质控品，所述的阳性质控品为UGT1A1增强元件PBREM基因片段，UGT1A1启动子区片段和外显子1基因片段。
4.根据权利要求1所述的Gilbert综合征基因突变检测试剂盒，其特征在于，采用PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰的玻片上，制成的DNA微阵列芯片，用于与相应探针进行杂交反应。
5. 根据权利要求1所述的Gilbert综合征基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的杂交反应中的杂交温度为30－40℃，杂交时间为1－3h。
6.根据权利要求1所述的Gilbert综合征基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒用于基因突变所致的Gilbert 综合征的疾病筛选和临床辅助诊断。
7.一种如权利要求1所述的Gilbert综合征基因突变检测试剂盒的所用的DNA微阵列芯片制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）点样：将丙烯酰胺修饰的PCR产物和其他成分混合成预聚合物，然后将上述预聚合物溶液和空白对照点样于丙烯基团修饰的玻片上，其中，所述的其他成分为30% 丙烯酰胺、50%丙三醇和10%过硫酸铵组成的混合溶液，所述空白对照为水和30% 丙烯酰胺、50%丙三醇以及10%过硫酸铵混合成的预聚合物；
（2）固定：制备DNA微阵列芯片：点样完成后，将玻片置于潮湿的盛有TEMED的容器中，在真空状态下当TEMED挥发到玻片表面时，丙烯基团之间会发生共聚合反应，得DNA微阵列芯片，
其中，所述的丙烯酰胺修饰的PCR产物部分由4种引物PCR扩增获得，
其中 引物序列分别为:
SEQ ID NO.1: 5’-CAACTCATCCTTATTCTGAT -3’
SEQ ID NO.2: 5’-丙烯酰胺-CTCATGCCTCCTCTCTAACC-3’
SEQ ID NO.3: 5’-CCGAGCTACCTTTGTGGACT-3’
SEQ ID NO.4: 5’-丙烯酰胺-CACGATGCCCGAGACTAACTAA -3’。
8.根据权利要求7所述的DNA微阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述的聚合反应的反应时间为30 -60min，温度为20－30℃，真空度1000 Pa。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510174851.2A CN104805199B (zh) | 2015-04-14 | 2015-04-14 | 一种Gilbert综合征基因突变检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510174851.2A CN104805199B (zh) | 2015-04-14 | 2015-04-14 | 一种Gilbert综合征基因突变检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104805199A true CN104805199A (zh) | 2015-07-29 |
| CN104805199B CN104805199B (zh) | 2017-12-29 |
Family
ID=53690394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510174851.2A Active CN104805199B (zh) | 2015-04-14 | 2015-04-14 | 一种Gilbert综合征基因突变检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104805199B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106434876A (zh) * | 2016-08-24 | 2017-02-22 | 张家港华旭医药科技有限公司 | 一种ugt1a1基因突变位点检测试剂盒 |
| CN112592970A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-04-02 | 首都医科大学附属北京友谊医院 | Gilbert综合征UGT1A1基因多位点变异检测试剂盒 |
| CN116004807A (zh) * | 2022-12-28 | 2023-04-25 | 广州凯普医药科技有限公司 | Ugt1a1基因多位点扩增引物组、试剂盒及检测方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109371127A (zh) * | 2018-10-22 | 2019-02-22 | 江苏美因康生物科技有限公司 | 一种同时快速检测ugt1a1*6型与ugt1a1*28型基因多态性的试剂盒及方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101619350A (zh) * | 2009-01-23 | 2010-01-06 | 周宏灏 | 用于恶性肿瘤个体化用药相关基因突变检测的基因芯片及其应用 |
| CN102071254A (zh) * | 2010-12-10 | 2011-05-25 | 东南大学 | 一种用于预测抗抑郁剂治疗效应的生物芯片及应用 |
-
2015
- 2015-04-14 CN CN201510174851.2A patent/CN104805199B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101619350A (zh) * | 2009-01-23 | 2010-01-06 | 周宏灏 | 用于恶性肿瘤个体化用药相关基因突变检测的基因芯片及其应用 |
| CN102071254A (zh) * | 2010-12-10 | 2011-05-25 | 东南大学 | 一种用于预测抗抑郁剂治疗效应的生物芯片及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 车芳: "UGT1A1基因在Gilbert综合征及Crigler-Najjar综合征发病机制中研究进展", 《中华实用诊断与治疗杂志》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106434876A (zh) * | 2016-08-24 | 2017-02-22 | 张家港华旭医药科技有限公司 | 一种ugt1a1基因突变位点检测试剂盒 |
| CN112592970A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-04-02 | 首都医科大学附属北京友谊医院 | Gilbert综合征UGT1A1基因多位点变异检测试剂盒 |
| CN116004807A (zh) * | 2022-12-28 | 2023-04-25 | 广州凯普医药科技有限公司 | Ugt1a1基因多位点扩增引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN116004807B (zh) * | 2022-12-28 | 2023-11-03 | 广州凯普医药科技有限公司 | Ugt1a1基因多位点扩增引物组、试剂盒及检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104805199B (zh) | 2017-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101176091B1 (ko) | 염색체 이상의 검출방법 | |
| CN114277135B (zh) | 胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒 | |
| CN107058538B (zh) | 一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用 | |
| CN104805199A (zh) | 一种Gilbert综合征基因突变检测试剂盒 | |
| CN102834525B (zh) | 使用未经加工的血液的pcr和hla分型的方法 | |
| CN100338227C (zh) | 实时定量pcr技术检测人21号染色体数目的方法 | |
| KR20130103110A (ko) | 간암 특이적 과메틸화 ＣｐＧ 서열을 이용한 간암의 검출방법 | |
| CN110564861A (zh) | 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 | |
| JP5258760B2 (ja) | メチル化核酸又は非メチル化核酸を増幅する方法 | |
| CN102399900B (zh) | 基因多态检测方法及试剂盒 | |
| Akutsu et al. | Precise and comprehensive determination of multiple body fluids by applying statistical cutoff values to a multiplex reverse transcription-PCR and capillary electrophoresis procedure for forensic purposes | |
| US10745764B2 (en) | Methods to detect and genotype Cryptococcus species | |
| Zhang et al. | Genotyping of multiple clinical samples with a combined direct PCR and magnetic lateral flow assay | |
| KR101387663B1 (ko) | 방광암 특이적 메틸화 마커 유전자를 이용한 방광암 검출방법 | |
| CN109355362B (zh) | 一种高灵敏的SNPs检测体系及应用 | |
| CN112322722B (zh) | 检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用 | |
| US10227655B2 (en) | Method for analyzing body fluid samples | |
| KR20120122948A (ko) | 아세트알데히드 탈수소 효소2 및 알코올 탈수소 효소2의 유전자 변이를 동시에 검출하는 방법 | |
| JP2003144153A (ja) | 遺伝子検出方法、遺伝子検出用プライマー、ｄｎａマイクロアレイ及び遺伝子検出用キット | |
| CN109312397B (zh) | Penta E基因座多态性人体鉴定 | |
| TWI570242B (zh) | 用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法 | |
| CN110885884A (zh) | 用于同步检测cyp2c19基因*2、*3、*17位点基因多态性的方法 | |
| KR100868883B1 (ko) | 신경모세포종 세포의 검출 | |
| RU2795019C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:P681R SARS-CoV-2 | |
| RU2795016C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:delVYY143-145 SARS-CoV-2 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |