CN116004807A - Ugt1a1基因多位点扩增引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents
Ugt1a1基因多位点扩增引物组、试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种UGT1A1基因多位点扩增引物组、试剂盒及检测方法。本发明提供的一种UGT1A1基因多位点扩增引物组，包括如下引物组的混合物：如SEQ ID NO.1‑12所示；上述的引物组的混合物可以在同一PCR反应体系中进行多重PCR扩增，UGT1A1基因的不同位点均能得到充分的扩增，利用该充分扩增的产物，能够准确的、高灵敏度的进行UGT1A1基因的不同位点的突变检测，且采用多重PCR扩增，通量高，快速简单成本低。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种UGT1A1基因多位点扩增引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(uridinediphosphate-glucuronyl transferase，UGT)1A1是一种位于肝细胞中催化脂溶性非结合胆红素，使之与葡萄糖醛酸结合生成胆红素的一种催化酶。UGT1A1酶的功能完全或部分丧失会导致未结合胆红素在人体内积累从而导致黄疸。目前研究发现，UGT1A1基因突变的存在可不同程度降低UGT1A1酶活性，临床上，根据UGT1A1酶活性水平的不同，可将高间接胆红素血症分为三种：Crigler-Najjar综合征Ⅰ型(CN-I)，Crigler-Najjar综合征Ⅱ型(CN-II)，Gilbert综合征(Gilbert syndrome，GS)。CNS-Ⅰ患者UGT1A1酶活性严重缺乏甚至消失，黄疸严重，总胆红素(TBIL)>342μmol/L，易进展为核黄疸，病死率极高；CNS-Ⅱ患者UGT1A1酶活性约占正常值的10％，TBIL多波动于103～342μmol/L，给予苯巴比妥60～120mg.d-1治疗后胆红素水平较前降低超过25％。目前，遗传性高间接胆红素血症以GS多见，发病率高达5％～10％。在GS患者体内，UGT活性仅为正常人的30％，直接导致了患者的高间接胆红素血症，此外，研究发现UGT1A1基因多态性会增加胆结石、心血管疾病、癌症等的发病风险。
既往的CNS依靠肝功能检测、低热卡试验、苯巴比妥实验、利福平试验、肝组织活检等来协助诊断，单这些检测特异性不高，而对UGT1A1基因突变的检测可明确辅助诊断高间接胆红素血症，对该病及早的诊断和基因检查可以避免过度治疗，减轻患者的心理负担和经济负担。
p.G71R、p.P229Q、p.Y486D、p.P364L、A(TA)7TAA和UGT1A1*60是UGT1A1基因的几个致病突变位点，这些位点突变可引起高间接胆红素血症。现今国内外已报道的UGT1A1基因突变的检测方法主要有高分辨熔解曲线(HRM)技术、直接测序法，聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术(PCR-SSCP)，聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)，高效液相色谱(DHPLC)技术，基因芯片技术、实时荧光定量PCR技术等，但缺点是这些基因诊断方式花费高、繁琐，在临床上开展困难。此外，这些技术有的操作程序复杂，设备耗材昂贵，成本较高，有的灵敏度低，不能定性，有的易于造成交叉污染，出现假阳性结果。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种UGT1A1基因多位点扩增引物组、试剂盒及检测方法，能够简单快速、准确的检测出UGT1A1基因多位点突变，且灵敏度较高，成本较低。
为此，本发明提供了如下的技术方案：
一种UGT1A1基因多位点扩增引物组，包括如下所有引物组的混合物：
p.G71R引物组，包括：正向引物p.G71R-F，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；反向引物p.G71R-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
p.P229Q引物组，包括：正向引物p.P229Q-F，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；反向引物p.P229Q-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
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UGT1A1*60引物组，包括：正向引物UGT1A1*60-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；反向引物UGT1A1*60-R，其核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。
可选的，所述的UGT1A1基因多位点扩增引物组的5’端或3’端结合标记物；
可选的，所述的UGT1A1基因多位点扩增引物组的5’端结合生物素。
一种UGT1A1基因多位点扩增试剂盒，包括所述的UGT1A1基因多位点扩增引物组。
可选的，还包括PCR MIX和DNA聚合酶；
可选的，还包括PCR扩增体系，以30μL为计：
PCR MIX总体积为27.5μL，包括：UGT1A1基因多位点扩增引物组，每个引物组各1μL，各引物的浓度10μM，正向引物和反向引物各加入体积0.5μL/1个反应；10×PCR buffer(购买自诺唯赞)，3μL/1个反应；dNTP(购自诺唯赞)浓度为25mM，0.5μL/1个反应；Mgcl2(购自诺唯赞)浓度为1M，0.1μL/反应；余量用纯水补足至27.5μL；
DNA聚合酶，酶活为5U/μL，加入体积为0.5μL/1个反应；
DNA模板，加入体积为2μL/1个反应。
一种UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒，包括所述的UGT1A1基因多位点扩增引物组或所述的UGT1A1基因多位点扩增试剂盒。
可选的，还包括探针组，包括如下探针组中的至少一组：
p.G71R探针组，包括：p.G71R野生型探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示；
p.G71R突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
p.P229Q探针组，包括：p.P229Q野生型探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示；
p.P229Q突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
p.Y486D探针组，包括：p.Y486D野生型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
p.Y486D突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
p.P364L探针组，包括：p.P364L野生型探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示；
p.P364L突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
A(TA)7TAA探针组，包括：A(TA)7TAA野生型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
A(TA)7TAA突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
UGT1A1*60探针组，包括：UGT1A1*60野生型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
UGT1A1*60突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
生物素标记的监控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
可选的，所述探针组固定连接基因芯片上，所述基因芯片的固定载体为尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃片、硅胶晶片、聚丙烯膜或微缩磁珠。
所述的UGT1A1基因多位点扩增引物组、所述的UGT1A1基因多位点扩增试剂盒或所述的UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒在制备UGT1A1基因多位点突变检测产品中的用途。
一种UGT1A1基因多位点突变检测方法，包括如下步骤：
S1、获得待测样本的DNA；
S2、以待测样本的DNA为模板，利用所述的UGT1A1基因多位点扩增引物组、所述的UGT1A1基因多位点扩增试剂盒所述的UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒配制PCR扩增体系，进行PCR扩增；
S3、将获得的PCR扩增产物和所述的UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒中的探针组进行杂交，通过化学显色对结果判读。
可选的，所述PCR扩增的反应条件为：
95℃保持8min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共42个循环，最后一步72℃延伸7min；和/或
所述杂交为导流杂交；和/或
所述待测样本为静脉全血样本或血斑卡样本。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供的一种UGT1A1基因多位点扩增引物组，包括如下引物组中至少一组的混合物：p.G71R引物组，包括：正向引物p.G71R-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物p.G71R-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；p.P229Q引物组，包括：正向引物p.P229Q-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；反向引物p.P229Q-R，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；p.Y486D引物组，包括：正向引物p.Y486D-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；反向引物p.Y486D-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；p.P364L引物组，包括：正向引物p.P364L-F，其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；反向引物p.P364L-R，其核苷酸序列如SEQID NO.8所示；A(TA)7TAA引物组，包括：正向引物A(TA)7TAA-F，其核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；反向引物A(TA)7TAA-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；或UGT1A1*60引物组，包括：正向引物UGT1A1*60-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；反向引物UGT1A1*60-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；上述的引物组的混合物可以在同一PCR反应体系中进行多重PCR扩增，UGT1A1基因的不同位点均能得到充分的扩增，利用该充分扩增的产物，能够准确的、高灵敏度的进行UGT1A1基因的不同位点的突变检测，且采用多重PCR扩增，通量高，快速简单成本低。
2、本发明提供的一种UGT1A1基因多位点扩增引物组，所述的引物结合标记物，所述标记物为生物素，使得PCR扩增的产物也带有生物素修饰，便于后续的UGT1A1基因多位点突变检测中，与碱性磷酸酶(AP酶)结合从而显色，使得检测结果的呈现更为简洁且更易读懂，通过肉眼观察显色位置即可对结果进行判读，降低了判读的复杂性。
3、本发明提供的一种UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒，可检测较低浓度的DNA样本，灵敏度高，准确度高，相比于对Tm值参考范围及DNA模板浓度要求较严格的HRM等技术，利用本发明试剂盒的检测方法只需进行多重PCR扩增后即可杂交检测，快速简单成本低，综上，整个检测流程约2-3h即可完成，操作流程简单，成本低，检测特异性高、灵敏度高，准确度高，可快捷方便的应用于UGT1A1基因多位点突变的检测，帮助临床上对三种遗传性高间接胆红素血症的诊断；
上述的试剂盒中，各位点的探针组分别设置突变型探针及其野生型探针，可明确分辨出突变位点的纯合或杂合之分，从而实现同步联合检测，提高检测特异性，降低成本，对临床中辅助高间接胆红素血症的诊断具有重要意义；
进一步的，上述的试剂盒检测的UGT1A1基因位点包括p.G71R、p.P229Q、p.Y486D、p.P364L、A(TA)7TAA和UGT1A1*60。因突变位点突变率差异，其中p.G71R和A(TA)7TAA是UGT1A1基因中较为常见的突变位点，除此外，本发明试剂盒还可检测p.P229Q、p.Y486D、p.P364L和UGT1A1*60四个突变位点，其中UGT1A1*60所在的基因序列PBREM是长290bp的UGT1A1基因的增强子序列，其表达可以提高GS患者对苯巴比妥的反应能力，位于启动子TATA盒的上游，且UGT1A1*60突变一般和A(TA)7TAA突变或编码区域其他突变点联合引起GS，而本发明所示检测方法可检测出UGT1A1*60突变是否与p.G71R、p.P229Q、p.Y486D、p.P364L、A(TA)7TAA五种突变一起出现，从而达到联合突变的辅助诊断效果。
4、本发明提供的一种UGT1A1基因多位点突变检测方法，通过导流杂交的方法可大大提高杂交速度及杂交率，可极大减少操作时间，提高杂交效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例3中基因芯片上探针的点膜位置排布；
图2为本发明UGT1A1基因6个突变位点的纯合突变结果图；
图3为本发明UGT1A1基因6个突变位点的杂合突变结果图；
图4是本发明实验例中灵敏度测试结果；
图5是本发明实验例中特异性测试结果；
图6是本发明实施例4中凝胶电泳结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中的标记生物素的引物组、探针组(每条探针5’或3’端进行了胺基化处理)、标记生物素的监控探针均由上海百力格生物技术有限公司合成。
2×SSC/0.1％SDS购自西陇科学股份有限公司；
杂交仪购自广州凯普生物技术有限公司，型号是HB-2012A；
酶标液(TBS溶解的带有链酶亲和素标记的AP酶)购自SurModics公司；
显色液(NBT/BCIP)购自Moss公司；
PCR buffer(购买自诺唯赞)、dNTP(购自诺唯赞)及Mgcl2(购自诺唯赞)。
实施例1UGT1A1基因多位点扩增引物组
本实施例根据检测基因p.G71R,p.P229Q、p.Y486D、p.P364L、A(TA)7TAA和UGT1A1*60六个突变位点设计引物组，所述引物组中的每条引物的5’端标记生物素。所述引物组如下：
p.G71R引物组，包括：正向引物p.G71R-F，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；反向引物p.G71R-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
p.P229Q引物组，包括：正向引物p.P229Q-F，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；反向引物p.P229Q-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
p.Y486D引物组，包括：正向引物p.Y486D-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；反向引物p.Y486D-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
p.P364L引物组，包括：正向引物p.P364L-F，其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；反向引物p.P364L-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
A(TA)7TAA引物组，包括：正向引物A(TA)7TAA-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；反向引物A(TA)7TAA-R，其核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；和
UGT1A1*60引物组，包括：正向引物UGT1A1*60-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；反向引物UGT1A1*60-R，其核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。
实施例2UGT1A1基因多位点扩增试剂盒
本实施例提供了一种UGT1A1基因多位点扩增试剂盒，包括：
实施例1的UGT1A1基因多位点扩增引物组。
还包括UGT1A1基因多位点的PCR扩增体系，以30μL为计：
PCR MIX，总体积为27.5μL，包括：10×PCR buffer，3μL/1个反应；dNTP浓度为25mM，0.5μL/1个反应；MgCl2浓度为1M，0.1μL/1个反应；UGT1A1基因多位点扩增引物组(p.G71R引物组、p.P229Q引物组、p.Y486D引物组、p.P364L引物组、A(TA)7TAA引物组和UGT1A1*60引物组)，每个引物组各1μL(各引物的浓度10μM，正向引物和反向引物各加入体积0.5μL/1个反应)；余量用纯水补足至27.5μL；
DNA聚合酶，酶活为5U/μL，加入体积为0.5μL/1个反应；
DNA模板，加入体积为2μL/1个反应。
实施例3UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒
本实施例提供了一种UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒，包括：
实施例2所述的UGT1A1基因多位点扩增试剂盒；
还包括基因芯片，所述基因芯片上连接有探针组，所述探针组为：p.G71R探针组，包括：p.G71R野生型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
p.G71R突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
p.P229Q探针组，包括：p.P229Q野生型探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示；
p.P229Q突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
p.Y486D探针组，包括：p.Y486D野生型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
p.Y486D突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
p.P364L探针组，包括：p.P364L野生型探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示；
p.P364L突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
A(TA)7TAA探针组，包括：A(TA)7TAA野生型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
A(TA)7TAA突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
UGT1A1*60探针组，包括：UGT1A1*60野生型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
UGT1A1*60突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；和
生物素标记的监控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
上述的基因芯片的制备方法，包括如下步骤：
(1)探针混合溶液：将5’或3’端经过胺基化处理的选择一个探针使用超纯水溶解，将所得溶液和生物素母液(100μM)共同加入至含有Na2CO3和NaHCO3的混合溶液(pH＝8.4，碳酸根离子浓度为0.5M)中，使得最终的混合溶液中探针的终浓度为10μM，生物素浓度为10μM。将剩余的探针分别按照上述方法制备得到探针混合溶液。
(2)尼龙膜活化处理：将尼龙膜放入0.1M HCl溶液中浸泡30秒，之后放入20％(质量百分比)的EDAC(碳二亚胺)溶液中浸泡15min，最后用200mL纯水冲洗10秒，重复清洗3次，放于吸水纸上吸除多余残液，之后放入温度为20℃，湿度为45％的烘箱中烘12h。已烘干的尼龙膜贮藏于4℃冰箱中备用。
(3)点膜：用移液器吸取步骤(1)中制备好的探针混合液分别点在活化好的尼龙膜(一滴约0.4μml)上不同的位置(探针的点膜位置排布具体见图1，每个位置代表不同基因型别，N表示野生型，M表示突变型，Biotin表示生物素标记的监控探针)，点膜完成后，将膜置于室温反应15min，然后将膜放入0.1M的NaOH溶液中浸泡10min，停止反应。将洗好的膜放入温度为20℃，湿度为45％的烘箱中烘12h，烘干后即得基因芯片。
实施例4UGT1A1基因多位点突变检测方法
本实施例提供了一种UGT1A1基因多位点突变检测方法，包括如下步骤：
(1)获得待测样本的DNA，将待测样本(静脉全血样本或质粒)采用基因组DNA提取试剂盒提取获得待测样本的DNA；
(2)以上述获得的DNA作为模板，利用实施例3中所述的UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒配制PCR扩增体系，进行PCR扩增，所述PCR扩增的反应体系，以30μL为计：
PCR MIX，总体积为27.5μL，包括：10×PCR buffer，3μL/1个反应；dNTP浓度为25mM，0.5μL/1个反应；MgCl2浓度为1M，0.1μL/1个反应；UGT1A1基因多位点扩增引物组(p.G71R引物组、p.P229Q引物组、p.Y486D引物组、p.P364L引物组、A(TA)7TAA引物组和UGT1A1*60引物组，如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12所示的引物序列)，每个引物组各1μL(各引物的浓度10μM，正向引物和反向引物各加入体积0.5μL/1个反应)；余量用纯水补足至27.5μL；
DNA聚合酶，酶活为5U/μL，加入体积为0.5μL/1个反应；
DNA模板，加入体积为2μL/1个反应。
所述PCR扩增的反应条件为：
95℃保持8min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共42个循环，最后一步72℃延伸7min。将扩增得到的多重PCR产物进行凝胶电泳验证，电泳结果如图6所示，从图6中可以看到平行8次的检测结果，(由于是同一基因，且片段大小差不多，因此每个平行检测结果(每条泳道)及条带位置如图所示)，可以说明本发明一管即可完成所有引物的扩增。
(3)、杂交检测：1)将获得的PCR扩增产物在95℃下变性5min，迅速转移至冰水混合物中放置2min；
2)将实施例3中所述的UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒中的基因芯片放入杂交仪中，向杂交仪中加入45℃预热好的杂交液(2×SSC/0.1％SDS)，每个反应孔0.8mL；
3)将1)中获得的PCR产物加入到杂交仪反应孔中，47℃杂交20min，杂交结束后排出杂交液，加入洗脱液1(0.5×SSC/0.1％SDS)清洗3次。
4)排出洗脱液1，加入0.5mL封阻液(0.25wt％脱脂奶粉，0.05v/v％硫柳汞)在25℃封闭5min；
5)排出封阻液，加入0.5mL酶标液(TBS溶解的带有链酶亲和素标记的AP酶)酶标5min。
6)排出酶标液，加入0.8mL溶液A(TBS,0.1v/v％Tween 20及0.05wt％叠氮钠)清洗4次，随后加入0.5mL显色液(NBT/BCIP)，避光显色5min。
7)排出显色液，加入溶液A冲洗3次，晾干，分析显色情况，对结果进行判读，通过化学显色对结果判读。
使用UGT1A1基因中包含p.G71R位点以及其上下游各自100-200bp的片段、包含p.P229Q位点以及其上下游各自100-200bp的片段、包含p.Y486D位点以及其上下游各自100-200bp的片段、包含p.P364L位点以及其上下游各自100-200bp的片段、包含A(TA)7TAA位点及其上下游各自100-200bp的片段、包含UGT1A1*60位点及其上下游各自100-200bp的片段，使用上述片段插入质粒构建质粒样本，构建1种位点纯合突变质粒和5种位点野生型的质粒混合(为6种质粒混合，如1种是包含p.G71R位点纯合突变的片段的质粒，剩余5种质粒分别是包含p.P229Q位点野生型的片段的质粒、包含p.Y486D位点野生型的片段的质粒、包含p.P364L位点野生型的片段的质粒、包含A(TA)7TAA位点野生型的片段的质粒、包含UGT1A1*60位点野生型的片段的质粒，每种质粒浓度为6×106copies/μl，然后以1:1:1:1:1:1的体积比例混合)样本(为委托通用生物技术有限公司合成)作为待测样本的检测结果如图2所示，图2中从上至下数第一排，从左至右依次对应UGT1A1基因p.G71R纯合突变(其他位点为野生型)、p.P229Q纯合突变(其他位点为野生型)、p.Y486D纯合突变(其他位点为野生型)的检测结果，图2中从上至下数第二排，从左至右依次对应UGT1A1基因p.P364L纯合突变(其他位点为野生型)、A(TA)7TAA纯合突变(其他位点为野生型)和UGT1A1*60纯合突变(其他位点为野生型)的检测结果。
使用UGT1A1基因p.G71R、p.P229Q、p.Y486D、p.P364L、A(TA)7TAA和UGT1A1*60位点分别杂合突变(其他位点为野生型)的质粒混合(6种质粒混合，如前述构建方法，如1种是包含p.G71R位点杂合突变的片段的质粒，剩余5种质粒分别是包含p.P229Q位点野生型的片段的质粒、包含p.Y486D位点野生型的片段的质粒、包含p.P364L位点野生型的片段的质粒、包含A(TA)7TAA位点野生型的片段的质粒、包含UGT1A1*60位点野生型的片段的质粒，每种质粒浓度为6×106copies/μl，然后以1:1:1:1:1:1的体积比例混合)样本(为委托通用生物技术有限公司合成)作为待测样本以及野生型混合质粒样本(6种位点均为野生型的质粒混合样本，混合浓度及比例同上)的检测结果如图3所示，图3中从上至下数第一排，从左至右依次对应UGT1A1基因p.G71R杂合突变(其他位点为野生型)、p.P229Q杂合突变(其他位点为野生型)、p.Y486D杂合突变(其他位点为野生型)的检测结果，图3中从上至下数第二排，从左至右依次对应UGT1A1基因p.P364L杂合突变(其他位点为野生型)、A(TA)7TAA杂合突变(其他位点为野生型)和UGT1A1*60杂合突变(其他位点为野生型)的检测结果，图3中从上至下数第三排，对应的是野生型(UGT1A1基因p.G71R、p.P229Q、p.Y486D、p.P364L、A(TA)7TAA和UGT1A1*60位点均为野生型)的检测结果。
实验例5灵敏度、特异性和准确性测试
(1)灵敏度及准确性测试
使用UGT1A1基因中包含p.G71R位点以及其上下游各自100-200bp的片段、包含p.P229Q位点以及其上下游各自100-200bp的片段、包含p.Y486D位点以及其上下游各自100-200bp的片段、包含p.P364L位点以及其上下游各自100-200bp的片段、包含A(TA)7TAA位点及其上下游各自100-200bp的片段、包含UGT1A1*60位点及其上下游各自100-200bp的片段，使用上述片段插入质粒构建质粒样本，6个位点依次纯合突变的质粒样本(如包含p.G71R位点纯合突变的片段的质粒)(为委托通用生物技术有限公司合成)分别作为待测样本，经过梯度稀释，稀释的浓度依次为1×107copies/μl,1×106copies/μl和1×105copies/μl。然后将上述的稀释的DNA分别作为模板按照实施例4的方法进行检测。
检测结果如图4所示，图中从上至下依次为p.G71R、p.P229Q、p.Y486D、p.P364L、A(TA)7TAA和UGT1A1*60位点的灵敏度检测结果，图中从左至右的检测浓度依次为1×107copies/μl,1×106copies/μl和1×105copies/μl，由图中结果可看出，利用本发明所述引物和探针检测样本结果准确性良好，从核酸倍比稀释检测浓度结果可知，其最低检出限为1×105copies/μl。
(2)特异性及准确性检测
本发明使用野生型样本(UGT1A1基因的质粒样本，为委托通用生物技术有限公司合成)、其他突变类型样本(耳聋基因(GJB2)突变样本c.109G>A，常规方法提取获得)、非人类基因组(大肠杆菌DNA，常规方法提取)、UGT1A1同源序列(NC_000067.7)、非核酸干扰物(甘油三脂溶液，浓度为6.0mmol/L)、血红蛋白(含血红蛋白的水溶液，浓度为100g/L)等样本对本发明所述引物和探针进行特异性及准确度测试。将上述样本分别作为DNA模板，按照实施例4的方法进行检测。
检测结果如图5所示，图中从上至下第一排从左至右分别对应野生型样本、耳聋基因突变样本(c.109G>A)、大肠杆菌DNA的检测结果，第二排从左至右分别对应UGT1A1同源序列、非核酸干扰物的检测结果，第三排对应的是血红蛋白的检测结果，检测结果均为阴性且符合相应的基因型，非核酸类或非人类物质不会对检测结果产生干扰，野生型样本检测为阴性，本发明所述引物探针组合的特异性及准确度良好。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种UGT1A1基因多位点扩增引物组，其特征在于，包括如下引物组的混合物：
p.G71R引物组，包括：正向引物p.G71R-F，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；反向引物p.G71R-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
p.P229Q引物组，包括：正向引物p.P229Q-F，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；反向引物p.P229Q-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
p.Y486D引物组，包括：正向引物p.Y486D-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；反向引物p.Y486D-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
p.P364L引物组，包括：正向引物p.P364L-F，其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；反向引物p.P364L-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
A(TA)7TAA引物组，包括：正向引物A(TA)7TAA-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；反向引物A(TA)7TAA-R，其核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示；和
UGT1A1*60引物组，包括：正向引物UGT1A1*60-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；反向引物UGT1A1*60-R，其核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。
2.根据权利要求1所述的UGT1A1基因多位点扩增引物组，其特征在于，所述的UGT1A1基因多位点扩增引物组的5’端或3’端结合标记物；
可选的，所述的UGT1A1基因多位点扩增引物组的5’端结合生物素。
3.一种UGT1A1基因多位点扩增试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的UGT1A1基因多位点扩增引物组。
4.根据权利要求3所述的UGT1A1基因多位点扩增试剂盒，其特征在于，还包括PCR MIX和/或DNA聚合酶；
可选的，还包括PCR扩增体系，以30μL为计：
PCR MIX，包括：10×PCR buffer，3μL/1个反应；dNTP浓度为25mM，0.5μL/1个反应；MgCl2浓度为1M，0.1μL/1个反应；UGT1A1基因多位点扩增引物组，每个引物组各1μL，各引物的浓度10μM，正向引物和反向引物各加入体积0.5μL/1个反应；余量用纯水补足至27.5μL；
DNA聚合酶，酶活为5U/μL，加入体积为0.5μL/1个反应；
DNA模板，加入体积为2μL/1个反应。
5.一种UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的UGT1A1基因多位点扩增引物组或权利要求3或4所述的UGT1A1基因多位点扩增试剂盒。
6.根据权利要求5所述的UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒，其特征在于，还包括探针组，包括如下探针组中的至少一组：
p.G71R探针组，包括：p.G71R野生型探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示；
p.G71R突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
p.P229Q探针组，包括：p.P229Q野生型探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示；
p.P229Q突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
p.Y486D探针组，包括：p.Y486D野生型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
p.Y486D突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
p.P364L探针组，包括：p.P364L野生型探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示；
p.P364L突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
A(TA)7TAA探针组，包括：A(TA)7TAA野生型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
A(TA)7TAA突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
UGT1A1*60探针组，包括：UGT1A1*60野生型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
UGT1A1*60突变型探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
生物素标记的监控探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
7.根据权利要求6所述的UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒，其特征在于，所述探针组固定连接基因芯片上，所述基因芯片的固定载体为尼龙膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、玻璃片、硅胶晶片、聚丙烯膜或微缩磁珠。
8.权利要求1或2所述的UGT1A1基因多位点扩增引物组、权利要求3或4所述的UGT1A1基因多位点扩增试剂盒或权利要求5-7任一项所述的UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒在制备UGT1A1基因多位点突变检测产品中的用途。
9.一种UGT1A1基因多位点突变检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、获得待测样本的DNA；
S2、以待测样本的DNA为模板，利用权利要求1或2所述的UGT1A1基因多位点扩增引物组、权利要求3或4所述的UGT1A1基因多位点扩增试剂盒或权利要求5-7任一项所述的UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒配制PCR扩增体系，进行PCR扩增；
S3、将获得的PCR扩增产物和权利要求5-7任一项所述的UGT1A1基因多位点突变检测试剂盒中的探针组进行杂交，通过化学显色对结果判读。
10.根据权利要求9所述的UGT1A1基因多位点突变检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：
95℃保持8min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共42个循环，最后一步72℃延伸7min；和/或
所述杂交为导流杂交；和/或
所述待测样本为静脉全血样本或血斑卡样本。
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