CN114107572A - 一种基于多重pcr技术检测不同新冠病毒突变株的引物探针组、检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于多重PCR技术检测不同新冠病毒突变株的引物探针组、检测试剂盒及其应用，属于病毒检测技术领域。本发明下载14种新冠病毒突变株序列，确定有检测意义的新冠病毒S蛋白突变位点和保守序列，设计多重扩增引物，经单管多重PCR扩增，扩增产物与探针杂交，根据新冠病毒保守序列检测结果判断被检样本是否含有新型冠状病毒检测，根据S蛋白突变位点检测结果判断为新型冠状病毒突变株。本发明检测范围广、特异性强、检测灵敏度高、抗干扰能力强，且能有效评估受检者感染的SARS‑CoV‑2的传播性、致病性以及是否对疫苗有免疫逃逸，也有助于分析研究SARS‑CoV‑2的变异规律，启发控制流行和预防再流行的新思路。

Description

一种基于多重PCR技术检测不同新冠病毒突变株的引物探针 组、检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种基于多重PCR技术检测不同新冠病毒突变株的引物探针组、检测试剂盒及其应用。
背景技术
新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）是单股正链RNA病毒，直径60~140 nm，该病毒基因组约由29903个核苷酸构成，编码4种结构蛋白：核蛋白（nucleocapsid，N）、包膜（envelop，E）、基质蛋白（membrane，M）、刺突蛋白（spike，S），以及RNA依赖性RNA聚合酶（RNAdependent DNA polymerase，RdRp）。 S蛋白是重要的结构蛋白，其主要功能是通过受体结合结构域（receptorbinding domain，RBD）、N端结构域（N-Terminal RNAbinding domain，NTD）促进病毒包膜与宿主细胞的血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）结合，使宿主细胞和病毒融合。由于ACE2在广泛部位和器官（如呼吸道、心血管、胃肠道、肾脏等）高度表达。SARS-CoV-2 变异，尤其是S蛋白上的特定位点的突变，不仅能影响病毒与人体细胞的亲和力，改变病毒的传染性和致病性，S蛋白作为诱发机体产生细胞和体液免疫的重要成分还可影响机体免疫应答、疫苗的抗体转化和单克隆抗体的中和作用。目前指定的VOCs有Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron变异株；VOIs有Lambda和Mu。
D614G变异是病毒S蛋白上第614位天冬氨酸（D）突变为甘氨酸（G）。D614G突变增强了病毒与宿主受体ACE2的结合，增加了病毒的复制与传播能力，因而在短短几个月后D614G变异株迅速成为全球主要流行株，逐渐演变为全球最流行的B.1系变异株。上述Alpha、Beta、Eta、Gamma、Kappa、Lambda、lota、B.1.427、B.1.429、Delta、Zeta、P.3、Mu、Omicron突变株均含有此突变位点。有体外研究显示D614G突变增加了单克隆抗体对病毒的敏感性。推测可能由于D614G变异株的RBD更大，在表达G614的S蛋白中暴露得更多，增加免疫原性。N501Y突变出现在Alpha、Beta、Gamma和P. 3 等变异株中。N501Y突变位于RBM，该突变会增强病毒与细胞受体ACE2的亲和力。HV69-70del缺失突变出现于Alpha和Eta 等变异株。HV69-70del可引起S蛋白S1亚基构象改变。研究表明，HV69-70del主要与造成免疫逃逸的突变位点同时出现，增强病毒的细胞感染力。E484K突变出现在 501Y.V2、P.1、P.2等变异株中。E484K突变位于RBM，E484位点突变均可增强病毒株的免疫逃逸能力，例如对单克隆抗体（C121、C144、REGN10989、REGN10934、2B04、1B07、SARS2-01、SARS2-02、SARS2-16、SARS2-32）以及部分康复者血清具有明显的抵抗作用。E484Q具有E484K突变相似的特点，二者都提供了变异株免疫逃逸的基础。K417N或K417T突变出现于501Y.V2和P.1变异株中。K417N/T突变位于RBM以外的区域，K417N 突变同样使病毒具有免疫逃逸能力；研究显示，其对单克隆抗体CB6、COVA2-07以及COVA2-04具有免疫逃逸能力，对部分康复者血清产生抵抗。L452R突变位于RBM，有研究表明L452R使病毒的感染性增加，S蛋白表达量增加0.32 倍。携带L452R突变的假病毒能够逃逸单克隆抗体（SARS2-01、SARS2-02、SARS2-32、LY-CoV555）以及部分康复者血清的中和作用，对单克隆抗体X593和P2B-2F6出现明显的抵抗作用。T478K位于S蛋白与ACE2受体的相互作用域内，该突变可能会影响病毒与人类细胞的亲和性，可能造成传染性增强。P681H是S蛋白受体S1和S2区域连接处的弗林蛋白酶切割位点的一部分。该连接处的变化增强了S蛋白上切割位点对蛋白酶的敏感性，能明显提高病毒的传播效率P681R类似Alpha（B.1.1.7）变异株中P681H突变，也能提高病毒的传播效率。
为了对新型冠状病毒SARS-CoV-2野生株和任一突变株不漏检，且能有效评估受检者感染的SARS-CoV-2的传播性、致病性以及是否对疫苗有免疫逃逸，亟需发明一种能够一次性检测SARS-CoV-2保守序列和上述突变株具有研究意义突变位点的试剂盒。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于多重PCR技术检测不同新冠病毒突变株的引物探针组、检测试剂盒，能够一次性对新型冠状病毒SARS-CoV-2野生株和任一突变株实现检测，且不漏检，操作简便高效。
本发明提供了一种基于多重PCR技术检测不同新冠病毒突变株的引物探针组，包括检测新冠病毒保守序列的引物探针组和检测新冠病毒突变株S基因突变位点的引物探针组；
所述新冠病毒突变株S基因突变位点包括S基因HV69-70del位点、S基因N501Y位点、S基因D614G位点、S基因E484K位点、S基因E484Q位点、S基因K417N位点、S基因K417T位点、S基因L452R位点、S基因T478K位点、S基因P681H位点、S基因P681R位点；
检测S基因HV69-70del位点的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物；
检测S基因N501Y位点、S基因E484K/Q位点、S基因K417N/T位点、S基因L452R位点和S基因T478K位点的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物；
检测S基因D614G位点和S基因P681H/R位点的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物；
检测新冠病毒野生株S基因HV69-70del位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
检测新冠病毒突变株S基因HV69-70del位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
检测新冠病毒野生株S基因N501Y位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
检测新冠病毒突变株S基因N501Y位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
检测新冠病毒野生株S基因E484K或E484Q位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
检测新冠病毒突变株S基因E484K位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
检测新冠病毒突变株S基因E484Q位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
检测新冠病毒野生株S基因K417N或K417T位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
检测新冠病毒突变株S基因K417N位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
检测新冠病毒突变株S基因K417T位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；
检测新冠病毒野生株S基因L452R位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；
检测新冠病毒突变株S基因L452R位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；
检测新冠病毒野生株S基因T478K位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；
检测新冠病毒突变株S基因T478K位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；
检测新冠病毒野生株S基因D614G位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
检测新冠病毒突变株S基因D614G位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；
检测新冠病毒野生株S基因P681H或P681R位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；
检测新冠病毒突变株S基因P681H位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；
检测新冠病毒突变株S基因P681R位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。
优选的，包括检测新冠病毒保守序列的引物探针组包括检测N基因保守序列的引物探针组、检测ORF1ab基因保守序列的引物探针组；
优选的，所述检测N基因保守序列的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示的探针；
优选的，所述检测ORF1ab基因保守序列的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ IDNO:29所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示的反向引物和核苷酸序列如SEQID NO:31所示的探针。
优选的，还包括检测人内参性基因的引物探针组和监控杂交的DNA探针。
优选的，所述检测人内参性基因的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示的探针；
所述监控杂交的DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示。
优选的，所述引物探针组中涉及的引物均采用生物素标记。
优选的，所述引物探针组中涉及的探针点阵式固定在载体上形成基因芯片。
本发明提供了一种同时检测不同新冠病毒突变株的试剂盒，包括所述引物探针组、PCR酶系和PCR反应试剂。
优选的，所述PCR酶系包括热启动Taq酶、UDG酶和逆转录酶；
所述PCR反应试剂包括Tris-HCl、KCl、MgCl2、Triton® X-100、胆酸钠、dATP、dTTP、dUTP、dCTP、dGTP组。
本发明提供了所述引物探针组在制备检测不同新冠病毒突变株的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种非诊断目的的检测不同新冠病毒突变株的方法，包括以下步骤：
以待测样品的核酸为模板，用所述引物探针组中引物进行多重PCR扩增，所得扩增产物进行杂交，根据杂交结果判断待测样本具体的新冠病毒类型。
本发明提供的基于多重PCR技术检测不同新冠病毒突变株的引物探针组，包括检测新冠病毒保守序列的引物探针组和检测新冠病毒突变株S基因突变位点的引物探针组，其中通过检测新冠病毒保守序列判断待测样品中是否存在新冠病毒，检测新冠病毒突变株S基因突变位点的引物探针组用来鉴别待测样本具体属于哪种新冠病毒类型。本发明通过确定具有检测意义的S蛋白突变位点，设计多重特异性引物，进行单管多重PCR检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的11个S蛋白突变位点和保守序列，较现有技术报道的检测方法具有更广的检测范围，更有助于对新冠突变株病毒传播力、致病力和免疫原性进行综合有效评估，也有助于分析研究SARS-CoV-2的变异规律，启发控制流行和预防再流行的新思路。
同时本发明提供的引物探针组与部分已上市的产品对比，具有更高灵敏度（500copies/mL），满足《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）“对集中隔离人员，应选择高灵敏（检测限≤500 copies/mL）的试剂”的要求。
进一步的，所述引物探针组还设置针对RNA检测的内控系统，较部分已上市产品更能有效来监测样本采集、提取过程，避免假阴性结果；PCR检测体系包含UNG酶和dUTP防污染措施，将可能存在的PCR产物污染充分降解，避免引起的假阳性结果。
附图说明
图1为本发明提供的基因芯片中各S基因突变位点分布示意图；其中N501Y-N表示N501Y位点野生型；N501Y-M表示N501Y位点突变生型；D614G-N表示D614G位点野生型；D614G-M表示D614G位点突变型；K417N/T-N表示K417N/T位点野生型；K417N-M表示K417N/T位点为K417N突变；K417T-M表示K417N/T位点为K417T突变；E484K/Q-N表示E484K/Q位点野生型；E484K-M表示E484K/Q位点为E484K突变；E484Q-M表示E484K/Q位点为E484KQ突变；L452R-N表示L452R位点野生型；L452R-M表示L452R位点突变生型；T478K-N表示T478K位点野生型；T478K-M表示T478K位点突变生型；P681H/R-N表示P681H/R位点野生型；P681H-M表示P681H/R位点为P681H突变；P681R-M表示P681H/R位点为P681R突变；69-70del-N表示HV69-70del位点野生型；69-70del-M表示HV69-70del位点突变型；ORF1ab表示该位点检测ORF1ab基因；N gene表示该位点检测N基因；IC表示该位点检测人内参性基因；Bio表示该位点检测杂交过程；
图2为杂交结果示意图；
图3-1为不同浓度下ORF1ab和N基因假病毒、内参B2M假病毒、S基因HV69-70del位点位点假病毒和S基因N501Y位点假病毒的检测结果；
图3-2为不同浓度下S基因D614G位点假病毒、S基因E484K位点假病毒、S基因E484Q位点假病毒、S基因K417N位点假病毒的检测结果；
图3-3为S基因L452R位点假病毒、S基因T478K位点假病毒、S基因P681H位点假病毒、S基因P681R位点假病毒、S基因野生型假病毒在不同浓度下的检测结果；
图4-1为Alpha突变株人工模拟样本的准确度检测结果；
图4-2为Beta突变株人工模拟样本准确度检测结果；
图4-3为Eta突变株人工模拟样本准确度检测结果；
图4-4为Kappa突变株人工模拟样本准确度检测结果；
图4-5为Gamma突变株人工模拟样本准确度检测结果；
图4-6为Lambda突变株人工模拟样本准确度检测结果；
图4-7为Zeta/Iota突变株人工模拟样本准确度检测结果；
图4-8为B.1.427/B.1.429突变株人工模拟样本准确度检测结果；
图4-9为Delta突变株人工模拟样本准确度检测结果；
图4-10为P.3/Mu突变株人工模拟样本准确度检测结果；
图4-11为Omicron突变株人工模拟样本准确度检测结果；
图4-12为SARS-CoV-2野生型突变株人工模拟样本准确度检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种基于多重PCR技术检测不同新冠病毒突变株的引物探针组，包括检测新冠病毒保守序列的引物探针组和检测新冠病毒突变株S基因突变位点的引物探针组。
在本发明中，所述检测新冠病毒保守序列的引物探针组用来检测待测样品中是否为新冠病毒感染。所述检测新冠病毒保守序列的引物探针组包括检测N基因保守序列的引物探针组、检测ORF1ab基因保守序列的引物探针组。所述检测N基因保守序列的引物探针组优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:26（aaatggtaggacagggttatcaaac）所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:27（acgattgtgcatcagctga）所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:28（gcatgggttcgcggagttg）所示的探针。所述检测ORF1ab基因保守序列的引物探针组优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:29（ggggaacttctcctgctagaat）所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:30（cagacattttgctctcaagctg）所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:31（gctttgctgctgcttgacag）所示的探针。
在本发明中，所述检测新冠病毒突变株S基因突变位点的引物探针组用来区分属于新冠病毒具体突变株或野生株。所述新冠病毒突变株S基因突变位点包括S基因HV69-70del位点、S基因N501Y位点、S基因D614G位点、S基因E484K位点、S基因E484Q位点、S基因K417N位点、S基因K417T位点、S基因L452R位点、S基因T478K位点、S基因P681H位点、S基因P681R位点。不同类型的新冠病毒突变株在S基因不同位点呈现一定的突变规律，表1展示了目前新冠病毒突变株的主要突变位点情况。
表1 各突变株主要突变位点
Figure 400023DEST_PATH_IMAGE001
检测S基因各突变位点对应的引物和探针见表2。
表2 检测S基因各突变位点对应的引物和探针信息
Figure 565294DEST_PATH_IMAGE002
Figure 286125DEST_PATH_IMAGE003
在本发明中，所述引物探针组优选还包括检测人内参性基因的引物探针组和监控杂交的DNA探针。在本发明实施例中，所述检测人内参性基因的引物探针组优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:32（gatgagtatgcctgccgtgtg）所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ IDNO:33（aaagcaagcaagcagaatttg）所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:34（cgtccaaggggaaactgatct）所示的探针。所述监控杂交的DNA探针如SEQ ID NO:35（tccaaggggaaactgatct）所示。所述引物探针组中涉及的引物均优选采用生物素标记，以便后续检测过程中与对应的检测试剂结合，实现检测。所述引物探针组中涉及的22条探针具有相近的Tm值，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性显著增加。
在本发明中，所述引物探针组中涉及的引物和监控杂交的DNA探针均采用生物素标记。所述引物探针组中涉及的探针点阵式固定在载体上形成基因芯片。所述基因芯片的载体优选选自硝酸纤维素、醋酸纤维素、玻璃片、硅胶晶片、尼龙膜、聚丙烯膜和微缩磁珠中的任意一种。所述基因芯片的制备方法，优选将各探针制备成稀释液后，点样至预处理的载体上，固定，得到基因芯片。所述稀释用溶液优选为pH8.4的0.5M Na2CO3和0.5M NaHCO3的水溶液。所述载体的预处理方法优选为将载体置于0.1M HCl溶液中浸泡去除残余溶液，再在20%的EDAC溶液中浸泡，洗涤后去除水分。所述点样的体积优选为0.4μL。各探针的点样位置如图1所示，基因芯片总共24个格子，其中右下角的格子标记“-”为空白，没有探针；其他每个格子对应一条探针。所述固体的方法将点样后的载体室温下放置15min，再在氢氧化钠下浸泡停止反应，干燥后得到基因芯片。
基于所述引物探针组能够同时准确检测各新冠病毒突变类型，因此本发明提供了所述引物探针组在制备检测不同新冠病毒突变株的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种同时检测不同新冠病毒突变株的试剂盒，包括所述引物探针组、PCR酶系和PCR反应试剂。
在本发明实施例中，所述引物的工作浓度优选为0.1~0.3μM，更优选为0.2μM。所述探针的浓度优选为20~30μM。
在本发明中，所述PCR酶系优选包括热启动Taq酶、UDG酶和逆转录酶。在本发明实施例中，所述PCR酶系为One Step U+ Enzyme Mix，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
在本发明中，所述PCR反应试剂优选包括Tris-HCl、KCl、MgCl2、Triton® X-100、胆酸钠、dATP、dTTP、dUTP、dCTP、dGTP组。在本发明实施例中，所述PCR反应试剂为2 × OneStep U+ Mix，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括酶标液、封阻液、洗涤液、溶液A、显色液、阳性质控品和阴性质控品。所述阳性质控品包括新型冠状病毒Omicron突变株S基因假病毒、2019-nCoV ORF1ab和N基因假病毒和内参B2M假病毒。所述阴性质控品优选为灭菌生理盐水。所述酶标液优选为带有链霉亲和素标记的碱性磷酸酶的TBS溶液，作用是通过链霉亲和素与扩增产物中的生物素结合，使碱性磷酸酶与靶基因片段形成复合物，基于酶解显色结果指示靶基因的存在。所述显色液优选为NBT/BCIP，作为酶解显色底物。所述封阻液优选为含质量浓度0.25%脱脂奶粉、质量浓度0.05%硫柳汞的水溶液，作用是封闭基因芯片上未结合的位点。所述洗涤液（WB1）优选为含质量浓度0.1%SDS的0.5×SSC液，洗脱未与基因芯片上探针结合的DNA片段。所述溶液A优选为含体积浓度0.1% Tween20、0.05%叠氮钠的TBS液，作用是洗脱未结合的酶标液。
本发明提供了一种非诊断目的的检测不同新冠病毒突变株的方法，包括以下步骤：
以待测样品的核酸为模板，用所述引物探针组中引物进行多重PCR扩增，所得扩增产物进行杂交，根据杂交结果判断待测样本属于新冠病毒具体类型。
在本发明中，所述方法的检测原理优选如下：
探针固相于载体上，当体系中存在靶基因序列时，靶基因序列被引物特异性扩增，扩增产物与探针杂交从而捕捉样品中靶基因，检测扩增产物与探针形成的复合物，阳性结果提示样品中含有待测靶核酸序列。所述杂交时，采用导流杂交仪对扩增产物进行导流杂交（flow-through hybridization）。所述检测优选利用化学显色对结果进行判读来进行新型冠状病毒突变情况的鉴定。各新冠病毒突变株的杂交结果见图2。与图2中各突变株中显色情况比较，显色结果一致的表明待测样本为对应新冠病毒突变株。
本发明对待测样品的核酸的提取方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的RNA病毒核酸的提取方法即可。
在本发明中，所述多重PCR扩增的反应体系优选为50μL：2× one step U+ Mix 25μL、各条引物浓度为0.1～0.3μM、One Step U+ Enzyme Mix 0.02～0.4U/μL。所述多重PCR扩增的反应程序优选为：95℃热启动2min；95℃变性30 sec、56℃退火30 sec、72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸5min。
在本发明中，利用各引物探针分别对不同浓度的SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因的假病毒、S基因野生型假病毒、S基因HV69-70del位点假病毒、S基因N501Y位点假病毒、S基因D614G位点假病毒、S基因E484K位点假病毒、S基因E484Q位点假病毒、S基因K417N位点假病毒、S基因K417T位点假病毒、S基因L452R位点假病毒、S基因T478K位点假病毒、S基因P681H位点假病毒、S基因P681R位点假病毒进行检测，ORF1ab、N基因以及11个S蛋白突变位点假病毒可检测出的最低浓度均可达到500copies/ml，检出率均为100％，可见，本发明提供的引物探针组或检测试剂盒的检测灵敏度较高，符合《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）“对集中隔离人员，应选择高灵敏（检测限≤500 copies/mL）的试剂”的规定。同时还对引物探针组的检测准确性和特异性分别进行检测，结果表明，所述引物探针组或其试剂盒仅对新冠病毒实现特异性检测，而对其他微生物（其他种类的病毒、支原体、致病细菌和致病真菌等）无法得到阳性检测结果。同时，本发明还开展了抗干扰能力的测试，将呼吸道病原体治疗药物添加至各突变株弱阳性人工模拟样本中，结果表明，上述药物对检测结果无明显干扰，阳性检出率均为100％。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于多重PCR技术检测不同新冠病毒突变株的引物探针组、检测试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种检测15种传染病病原体的试剂盒，其包括：基因芯片（含22条特异性探针组合和1条非靶标标记生物素点的DNA序列）、PCR酶系、PCR反应体系、阳性质控品、阴性质控品。
1.引物探针的序列如表2所示，基因芯片包括尼龙膜和固定在尼龙膜上的新型冠状病毒特异性探针组合、内参探针和显色体系控制探针，基因芯片包括用于定位探针的位置标记。备注：引物的5’端均标记有生物素。
表2 检测S基因各突变位点对应的引物和探针信息
Figure 107319DEST_PATH_IMAGE004
Figure 611113DEST_PATH_IMAGE005
Figure 630891DEST_PATH_IMAGE006
2. 假病毒的制备
通过上海捷瑞生物工程有限公司合成含各突变位点的S基因、ORF1ab和N基因目的片段的质粒。采用带内切酶BamH I和HindIII位点的特异性引物对阴性拭子样本中RNA内参B2M进行扩增，获得内参基因目的片段。用内切酶BamH I和HindIII分别对pET-MS质粒、靶基因、内参基因目的片段进行双酶切，37℃酶切过夜。酶切后利用T4连接酶使pET-MS载体大片段分别与靶基因和内参基因目的片段进行连接。连接产物转化至大肠杆菌BL21中，并加入终浓度为0.05mmol/L的IPTG，28℃，180~200 转/分钟过夜诱导表达，之后通过离心收集菌体沉淀，用TE缓冲液洗涤并重新悬于TSM缓冲液中，进行超声破碎。将破碎完全的表达产物离心收集上清液，即为含假病毒颗粒的表达产物。
3.基因芯片的制备
（1）探针的排列
各探针在基因芯片上的具体分布位置见图1，本发明的基因芯片总共，24个格子，其中右下角的格子标记“-”为空白，没有探针；其他每个格子对应一条探针。
（2）DNA探针的固定方法
对尼龙膜进行处理，首先放入0.1M HCl溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放入20%的EDAC溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200mL的纯化水冲洗10秒钟，此步骤重复3次，再放到吸水纸上除去多余的残液。转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时。将已烘干的尼龙膜用Kimwipes纸隔开，转入封口薄膜袋中，放进点膜间的冰箱中，贮藏在4℃的温度下，备用。
将DNA探针用探针稀释液（pH8.4的0.5M Na2CO3和0.5M NaHCO3的溶液）混合。启动DNA点样装置，在芯片制作程序的控制下，进行DNA探针的打印。通过DNA打印针每次取一种DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传递到指定的点样位置，每滴0.4μL。完成一次打印后，荷样打印针清洗、干燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。
通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在上述的尼龙膜上。点膜结束后，将膜放置于室温15分钟，进行反应。然后将膜转入0.1M NaOH溶液中浸泡10分钟，停止反应。将洗好的膜转入温度为20℃、湿度为45%的烘干箱内烘干12小时，即制得基因芯片。
试剂盒第一容器内包含PCR反应体系。PCR反应体系包括6对引物对、2×One StepU+ Mix和灭菌注射用水。2×One Step U+ Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。具体组成为50 mM Tris-HCl（pH 8.9）、160 mM KCl、4 mM MgCl2、0.2 % Triton® X-100、0.2% 胆酸钠、0.6 mM dATP、0.3 mM dTTP、0.3 mM dUTP、0.6 mM dCTP、0.6 mM dGTP；引物的5’端均标记有生物素。
试剂盒第二容器内包含PCR酶系One Step U+ Enzyme Mix，One Step U+ EnzymeMix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。具体成分为Champagne TaqTM DNA Polymerase终浓度1 U/μL、HiScript® II Reverse Transcriptase终浓度10 U/μL、Heat-labile UDG终浓度0.5 U/μL、Murine RNase inhibitor终浓度10 U/μL；
试剂盒第三容器包含阳性质控品，阳性质控品为新型冠状病毒Omicron突变株S基因假病毒、2019-nCoV ORF1ab和N基因假病毒和内参B2M假病毒。
试剂盒第四容器包含阴性质控品，阴性质控品为灭菌生理盐水。
试剂盒第五容器包含杂交液（2×SSC/0.1%SDS）、溶液WB1（含0.1%SDS的0.5×SSC液，42℃温浴）、封阻液（含0.25%脱脂奶粉和0.05%硫柳汞的水溶液）、酶标液（溶解的带有链霉亲和素标记的碱性磷酸酶酶的TBS液）、溶液A（TBS液含0.1% Tween20及0.05%叠氮钠）和显色液（NBT/BCIP）。
实施例2
利用实施例1中检测试剂盒对待测样品检测的方法
（1）待测样本核酸提取
本试剂盒搭配核酸提取或纯化试剂（产品备案号：粤潮械备20210003号）进行待测样本和质控品提取，获得核酸提取物。
（2）PCR扩增
采用实施例1中的各引物对待测样品进行PCR扩增，每人份PCR反应液43μL，每人份PCR酶系2μL，DNA加样量5μL，每人份总反应体积为50μL。PCR扩增的反应体系具体如表3所示。
表3 每人份PCR反应体系
Figure 929148DEST_PATH_IMAGE007
RT-PCR扩增程序为：50℃逆转录15min，95℃热启动2min，95℃变性30 sec、56℃退火30 sec、72℃延伸45 sec，共35个循环，最后一步72℃延伸5min。
（3）利用基因芯片进行检测。
将获得的扩增产物在95℃下变性5~10分钟，迅速转移到冰水混合物中，放置2分钟。然后加入到预先温浴到45℃的0.5 mL杂交液中，混合后加入杂交仪的反应孔中，应用于制得的基因芯片，45℃杂交15分钟，然后用溶液WB1清洗3~4遍。加入0.5mL封阻液，25℃封闭5分钟。抽干后加入0.5mL的酶标液，酶标5分钟。用0.8mL溶液A清洗4遍，然后加入0.5mL的显色液，避光显色5分钟。最后用溶液B冲洗3遍，晾干，分析显色情况，判读结果。
（4）肉眼观察尼龙膜上呈现的深蓝色斑点则作为阳性杂交结果，具体结果示意如图2所示。
实施例3
SARS-CoV-2的ORF1ab、N基因以及11个S蛋白突变位点检测试剂盒的检测限测试
将SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因的假病毒、S基因野生型假病毒、S基因HV69-70del位点假病毒、S基因N501Y位点假病毒、S基因D614G位点假病毒、S基因E484K位点假病毒、S基因E484Q位点假病毒、S基因K417N位点假病毒、S基因K417T位点假病毒、S基因L452R位点假病毒、S基因T478K位点假病毒、S基因P681H位点假病毒、S基因P681R位点假病毒、内参B2M假病毒做为初始样本分别稀释至浓度为1000copies/ml、500copies/ml、250copies/ml，搭配核酸提取或纯化试剂（产品备案号：粤潮械备20210003号），验证实施例1试剂盒的检测限。
结果表明，对不同浓度的假病毒进行检测，ORF1ab、N基因以及11个S蛋白突变位点假病毒可检测出的最低浓度均可达到500copies/ml，检出率均为100％(如图3所示)。
实施例4
SARS-CoV-2的ORF1ab、N基因以及11个S蛋白突变位点检测试剂盒的准确性测试
将以已定值的假病毒用阴性口咽拭子样本稀释成1000copies/mL各种突变株弱阳性人工模拟样本和SARS-CoV-2野生型模拟样本，如下所示。使用实施例1的试剂盒对上述样本进行检测。
样本1：Alpha突变株ORF1ab、N基因、S基因假病毒混合阴性口咽拭子样本，检测结果见图4-1。
样本2：Beta突变株ORF1ab、N基因、S基因假病毒混合阴性口咽拭子样本，检测结果见图4-2。
样本3：Eta突变株ORF1ab、N基因、S基因假病毒混合阴性口咽拭子样本，检测结果见图4-3；
样本4：Kappa 突变株ORF1ab、N基因、S基因假病毒混合阴性口咽拭子样本，检测结果见图4-4；
样本5：Gamma 突变株ORF1ab、N基因、S基因假病毒混合阴性口咽拭子样本，检测结果见图4-5；
样本6：Lambda 突变株ORF1ab、N基因、S基因假病毒混合阴性口咽拭子样本，检测结果见图4-6；
样本7：:Zeta/Iota突变株ORF1ab、N基因、S基因假病毒混合阴性口咽拭子样本，检测结果见图4-7；
样本8：B.1.427/B.1.429突变株ORF1ab、N基因、S基因假病毒混合阴性口咽拭子样本，检测结果见图4-8；
样本9：Delta突变株ORF1ab、N基因、S基因假病毒混合阴性口咽拭子样本，检测结果见图4-9；
样本10：P.3/Mu突变株ORF1ab、N基因、S基因假病毒混合阴性口咽拭子样本，检测结果见图4-10；
样本11：Omicron突变株ORF1ab、N基因、S基因假病毒混合阴性口咽拭子样本，检测结果见图4-11；
样本12：SARS-CoV-2 野生型ORF1ab、N基因、S基因假病毒混合阴性口咽拭子样本，检测结果见图4-12。
结果表明，各种突变株弱阳性人工模拟样本和SARS-CoV-2野生型模拟样本可以准确检测。
实施例5
SARS-CoV-2 的ORF1ab、N基因以及11个S蛋白突变位点检测试剂盒的特异性性（交叉反应）测试
以与新型冠状病毒SARS-CoV-2种属相近或引起症状相似的地方性人类冠状病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、MERS冠状病毒；H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季节性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C组，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，肠道病毒A、B、C、D组，人偏肺病毒（人间质肺病毒）、EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、轮状病毒、诺如病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒；肺炎支原体、肺炎衣原体；军团菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌；烟曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌等、人类基因组DNA为特异性参考品，测试实施例1的试剂盒的特异性。结果表明，对上述临床样本进行检测，阴性符合均为100％。
实施例6
SARS-CoV-2的ORF1ab、N基因以及11个S蛋白突变位点检测试剂盒的特异性性（抗干扰能力）测试
分别向500copies/ml的实施例4的样本1~12中加入呼吸道病原体治疗药物，如2%(v/v)全血、2.5%(w/v)粘蛋白、苯福林、倍氯美松、氟尼缩松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松、利巴韦林、帕拉米韦、利托那韦、阿比多尔、阿奇霉素、美罗培南、妥布霉素、头孢曲松、达菲(奥司他韦)、羟甲唑啉、PHNY滴鼻剂、地塞米松、左氧氟沙星、盐酸组胺、生理盐水鼻喷雾剂、α-干扰素、洛匹那韦、扎那米韦作为干扰物质测试样本，以不含干扰物质的假病毒作为对照，搭配核酸提取或纯化试剂（产品备案号：粤潮械备20210003号），使用实施例1的试剂盒对上述样本进行检测，测试干扰物质对结果判读的影响。结果表明，上述干扰物质对检测结果无明显干扰，阳性检出率均为100％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 潮州凯普生物化学有限公司
广东凯普生物科技股份有限公司
广州凯普医药科技有限公司
<120> 一种基于多重PCR技术检测不同新冠病毒突变株的引物探针组、检测试剂盒及其应用
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caactcagga cttgttctta cct 23
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 32
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<210> 33
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<212> DNA
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<400> 33
aaagcaagca agcagaattt g 21
<210> 34
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<212> DNA
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<400> 34
cgtccaaggg gaaactgatc t 21
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tccaagggga aactgatct 19

Claims (10)

1.一种基于多重PCR技术检测不同新冠病毒突变株的引物探针组，其特征在于，包括检测新冠病毒保守序列的引物探针组和检测新冠病毒突变株S基因突变位点的引物探针组；
所述新冠病毒突变株S基因突变位点包括S基因HV69-70del位点、S基因N501Y位点、S基因D614G位点、S基因E484K位点、S基因E484Q位点、S基因K417N位点、S基因K417T位点、S基因L452R位点、S基因T478K位点、S基因P681H位点、S基因P681R位点；
检测S基因HV69-70del位点的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物；
检测S基因N501Y位点、S基因E484K/Q位点、S基因K417N/T位点、S基因L452R位点和S基因T478K位点的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO:4所示的反向引物；
检测S基因D614G位点和S基因P681H/R位点的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物；
检测新冠病毒野生株S基因HV69-70del位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
检测新冠病毒突变株S基因HV69-70del位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
检测新冠病毒野生株S基因N501Y位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
检测新冠病毒突变株S基因N501Y位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
检测新冠病毒野生株S基因E484K或E484Q位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
检测新冠病毒突变株S基因E484K位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
检测新冠病毒突变株S基因E484Q位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；
检测新冠病毒野生株S基因K417N或K417T位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
检测新冠病毒突变株S基因K417N位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
检测新冠病毒突变株S基因K417T位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；
检测新冠病毒野生株S基因L452R位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；
检测新冠病毒突变株S基因L452R位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；
检测新冠病毒野生株S基因T478K位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；
检测新冠病毒突变株S基因T478K位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；
检测新冠病毒野生株S基因D614G位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
检测新冠病毒突变株S基因D614G位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；
检测新冠病毒野生株S基因P681H或P681R位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；
检测新冠病毒突变株S基因P681H位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；
检测新冠病毒突变株S基因P681R位点的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。
2.根据权利要求1所述引物探针组，其特征在于，包括检测新冠病毒保守序列的引物探针组包括检测N基因保守序列的引物探针组、检测ORF1ab基因保守序列的引物探针组；
所述检测N基因保守序列的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示的探针；
所述检测ORF1ab基因保守序列的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:30所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示的探针。
3.根据权利要求1或2所述引物探针组，其特征在于，还包括检测人内参性基因的引物探针组和监控杂交的DNA探针。
4.根据权利要求3所述引物探针组，其特征在于，所述检测人内参性基因的引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示的探针；
所述监控杂交的DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示。
5.根据权利要求1、2和4任意一项所述引物探针组，其特征在于，所述引物探针组中涉及的引物均采用生物素标记。
6.根据权利要求1、2和4任意一项所述引物探针组，其特征在于，所述引物探针组中涉及的探针点阵式固定在载体上形成基因芯片。
7.一种同时检测不同新冠病毒突变株的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~6任意一项所述引物探针组、PCR酶系和PCR反应试剂。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述PCR酶系包括热启动Taq酶、UDG酶和逆转录酶；
所述PCR反应试剂包括Tris-HCl、KCl、MgCl2、Triton® X-100、胆酸钠、dATP、dTTP、dUTP、dCTP、dGTP组。
9.权利要求1~6任意一项所述引物探针组在制备检测不同新冠病毒突变株的试剂盒中的应用。
10.一种非诊断目的的检测不同新冠病毒突变株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待测样品的核酸为模板，用权利要求1~6任意一项所述引物探针组中引物进行多重PCR扩增，所得扩增产物进行杂交，根据杂交结果判断待测样本具体的新冠病毒类型。
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