CN106434876A

CN106434876A - 一种ugt1a1基因突变位点检测试剂盒

Info

Publication number: CN106434876A
Application number: CN201610709985.4A
Authority: CN
Inventors: 吴旭平
Original assignee: Zhangjiagang Asahi Medical Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Zhangjiagang Asahi Medical Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2016-08-24
Filing date: 2016-08-24
Publication date: 2017-02-22

Abstract

本发明公开了一种UGT1A1基因突变位点检测试剂盒，所述的试剂盒是由DNA微列阵芯片及4种核苷酸探针部分组成，所述的DNA微列阵芯片是由丙烯酰胺修饰的PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰的玻片上制成，其中，所述的丙烯酰胺修饰的PCR产物部分由4种引物PCR扩增获得，所述的引物序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示，所述的核苷酸探针部分序列分别如SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8所示。本发明的检测试剂盒，可替代PCR测序技术来检测UGT1A1基因突变位点，与PCR测序技术相比，其操作简便、价格低廉、结果可靠，更适用于临床实验室检测。

Description

一种UGT1A1基因突变位点检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因检测试剂盒，具体地涉及一种UGT1A1基因突变位点检测试剂盒。

背景技术

胆红素在肝脏内的代谢主要是通过尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)实现的，UGT1A1基因异常可导致肝脏微粒体的胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶表达下降，从而引起胆红素代谢障碍。目前UGT1A1基因异常，包括远端加强序列即苯巴比妥反应增强元件(PBREM)-3279位点突变，PBREM约位于TATA上游，此突变与基因转录活性下降导致的胆红素水平升高显著相关；启动子区域TA盒中TA碱基序列插入突变，表现为二核苷酸(TA)插入到UGT1A1基因启动子上游约25～35个bp处的TATA盒中，使正常野生型A(TA)6TAA突变为A(TA)7TAA。

现有技术中，主要通过PCR测序技术来检测UGT1A1基因突变位点，但是测序价格较贵，耗时较长，增加了患者的经济负担。因此必须寻找一种应用简单、结果可靠、价格低廉的技术来开发UGT1A1基因突变位点检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种UGT1A1基因突变位点检测试剂盒，采用该检测试剂盒来对UGT1A1基因突变位点进行检测时，其测序价格低廉、耗时短、结果可靠，减轻了患者的经济负担。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种UGT1A1基因突变位点检测试剂盒，所述的试剂盒是由DNA微列阵芯片及4种核苷酸探针部分组成，所述的DNA微列阵芯片是由丙烯酰胺修饰的PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰的玻片上制成的，其中，所述的丙烯酰胺修饰的PCR产物部分由4种引物PCR扩增获得，所述的引物序列分别如SEQ IDNO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示，所述的核苷酸探针部分序列分别如SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8所示。

优选地，所述的其他成分是由浓度为42％的丙烯酰胺、浓度为38％的丙三醇以及浓度为18％的过硫酸铵组成的混合溶液。

优选地，采用PCR产物及其成分固定于丙烯基团修饰的玻片上所制成的DNA微阵列芯片，用于与相应的探针进行杂交反应。

进一步优选地，在25℃～30℃的温度条件下进行所述杂交反应。

优选地，所述的检测试剂盒还包括阳性质控品，所述的阳性质控品为UGT1A1增强元件PBREM基因片段及UGT1A1启动子区片段。

优选地，所述DNA微列阵芯片的制备步骤如下：

1)点样，将所述由丙烯酰胺修饰后的PCR产物经无水乙醇沉淀后与其他成分混合成PCR产物预聚合物，然后将所述的PCR产物预聚合物和空白对照预聚合物手动点样于丙烯基团修饰的玻片上，其中，所述的其他成分为由浓度为42％的丙烯酰胺、浓度为38％的丙三醇以及浓度为18％的过硫酸铵组成的混合溶液，所述的空白对照预聚合物为水和所述的其他成分混合成的预聚合物；

2)固定，点样完成后，将玻片置于潮湿的盛有TEMED的容器中，在真空状态下当TEMED挥发到玻片表面时，丙烯基团之间会发生共聚合反应，从而将丙烯酰胺修饰的PCR产物固定于用丙烯基团修饰的玻片上得到所述的DNA微列阵芯片。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明的UGT1A1基因突变位点检测试剂盒，可替代PCR测序技术来检测UGT1A1基因突变位点，与PCR测序技术相比，其操作简便、价格低廉、结果可靠，更适用于临床实验室检测。

附图说明

附图1为3个已知增强元件-3279位点的新鲜血样本位点扩增后荧光杂交图像；

附图2为3个已知启动子区A(TA)6TAA/A(TA)7TAA插入突变的新鲜血样本位点扩增后荧光杂交图像。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案作进一步说明，应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中所采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

本发明公开了一种UGT1A1基因突变位点检测试剂盒，该试剂盒是由DNA微列阵芯片及4种核苷酸探针部分组成，DNA微列阵芯片是由丙烯酰胺修饰的PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰的玻片上制成，其中，丙烯酰胺修饰的PCR产物部分由4种引物PCR扩增获得，所述的引物序列参见表一，分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ IDNO.4所示，所述的核苷酸探针部分序列参见表二，分别如SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQID NO.7，SEQ ID NO.8所示。

表一4种引物序列

序列号	序列(5’-3’)
		1	AACTCATCCTTATTCTGA
2	丙烯酰胺-TCATGCCTCCTCTCTAAC
		3	CGAGCTACCTTTGTGGAC
4	丙烯酰胺-ACGATGCCCGAGACTAACT

表二核苷酸探针序列

序列号	序列(5’-3’)
		5	TTCTGTTTGAAG
6	TTCTGTGTGAAG
		7	CATATATATATATATAAG
8	CATATATATATATATATAAG

本发明中，所述的其他成分是由浓度为42％的丙烯酰胺、浓度为38％的丙三醇以及浓度为18％的过硫酸铵组成的混合溶液。

采用PCR产物及其成分固定于丙烯基团修饰的玻片上所制成的DNA微阵列芯片，用于与相应的探针进行杂交反应。具体的，在25℃～30℃的温度条件下进行上述杂交反应。

本例中，该DNA微列阵芯片的制备步骤如下：

1)点样，将由丙烯酰胺修饰后的PCR产物经无水乙醇沉淀后与其他成分混合成PCR产物预聚合物，然后将的PCR产物预聚合物和空白对照预聚合物手动点样于丙烯基团修饰的玻片上，其中，的其他成分为由浓度为42％的丙烯酰胺、浓度为38％的丙三醇以及浓度为18％的过硫酸铵组成的混合溶液，的空白对照预聚合物为水和的其他成分混合成的预聚合物；

2)固定，点样完成后，将玻片置于潮湿的盛有TEMED的容器中，在真空状态下当TEMED挥发到玻片表面时，丙烯基团之间会发生共聚合反应，从而将丙烯酰胺修饰的PCR产物固定于用丙烯基团修饰的玻片上得到的DNA微列阵芯片。

实施例1制备UGT1A1基因突变位点检测试剂盒

表三 UGT1A1基因突变位点检测试剂盒的组成成分

该检测试剂盒的具体制作方法如下：

1、核酸提取：推荐使用QIAGEN QIAamp blood mini kit，具体操作参见该试剂盒说明书，最后收集到200μl DNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。

2、PCR扩增及检测

2.1试剂准备：按比例取相应量的PCR反应液(35μl/人份)，按35μl/管分装成PCR反应管，备用。

2.2加样：向PCR反应管中，分别加入提取后的DNA溶液15μl，阳性质控品15μl。

2.3PCR扩增条件：94℃5min；94℃30sec,55℃50sec,72℃45sec；32cycles；72℃10min。

2.4 PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

3、PCR产物的点样及固定

PCR产物经无水乙醇沉淀后与浓度为42％的丙烯酰胺、浓度为38％的丙三醇、浓度为18％的过硫酸铵混合成预聚合物，然后将PCR产物预聚合物和空白对照预聚合物手动点样于丙烯基团修饰的玻片上，在本实施例中，点样模式为：每一类型的基因片段点在一张玻片上，点成四行，每张玻片上每个样本重复点样2次。

点样完成后，将玻片置于潮湿的盛有TEMED的容器中，在真空状态下当TEMED挥发到玻片表面时，丙烯基团之间会发生共聚合反应，从而将丙烯酰胺修饰的PCR产物固定于用丙烯基团修饰的玻片上。

4、杂交

固定完成后，为了获得杂交所需的单链DNA，将固定在玻片上的双链DNA用0.10M的NaOH溶液处理10min以变性，然后在37℃分别与表三中相应的10μM的探针杂交2小时。

5、电泳去除非特异性杂交的探针

杂交完成后，玻片在1xTBE缓冲溶液中常温下，38V/cm电压下电泳25分钟。

6、激光共焦扫描仪扫描

电泳后的玻片用水冲洗，然后用氮气吹干，最后用激光共焦扫描仪扫描得到杂交结果扫描图像，参见图1、图2。

图1中的四个荧光杂交图像所对应的样本分别为：1、空白对照；2、野生型纯合子-3279T/T样本；3、突变纯合子-3279G/G样本；4、杂合子-3279T/G样本；

图2中的四个荧光杂交图像所对应的样本分别为：5、空白对照；6、野生型纯合子A(TA)6TAA样本；7、突变纯合子A(TA)7TAA样本；8、杂合子A(TA)6/7TAA样本。

结合图1、图2可得出相关结果，见表四。

表四

从表四中可以得出，通过扫描得到的结果与PCR测序结果相一致，由此可见，采用本发明的检测试剂盒可替代PCR测试技术用于检测UGT1A1基因突变位点。而本发明的检测试剂盒操作简便、结果可靠、价格低廉，大大减少了患者的经济负担。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种UGT1A1基因突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒是由DNA微列阵芯片及4种核苷酸探针部分组成，所述的DNA微列阵芯片是由丙烯酰胺修饰的PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰的玻片上制成的，其中，所述的丙烯酰胺修饰的PCR产物部分由4种引物PCR扩增获得，所述的引物序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示，所述的核苷酸探针部分序列分别如SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ IDNO.7，SEQ ID NO.8所示。

2.根据权利要求1所述的UGT1A1基因突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述的其他成分是由浓度为42%的丙烯酰胺、浓度为38%的丙三醇以及浓度为18%的过硫酸铵组成的混合溶液。

3.根据权利要求1所述的UGT1A1基因突变位点检测试剂盒，其特征在于，采用PCR产物及其成分固定于丙烯基团修饰的玻片上所制成的DNA微阵列芯片，用于与相应的探针进行杂交反应。

4.根据权利要求3所述的UGT1A1基因突变位点检测试剂盒，其特征在于，在25℃~30℃的温度条件下进行所述杂交反应。

5.根据权利要求1所述的UGT1A1基因突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒还包括阳性质控品，所述的阳性质控品为UGT1A1增强元件PBREM基因片段及UGT1A1启动子区片段。

6.根据权利要求1所述的UGT1A1基因突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述DNA微列阵芯片的制备步骤如下：

1）点样，将所述由丙烯酰胺修饰后的PCR产物经无水乙醇沉淀后与其他成分混合成PCR产物预聚合物，然后将所述的PCR产物预聚合物和空白对照预聚合物手动点样于丙烯基团修饰的玻片上，其中，所述的其他成分为由浓度为42%的丙烯酰胺、浓度为38%的丙三醇以及浓度为18%的过硫酸铵组成的混合溶液，所述的空白对照预聚合物为水和所述的其他成分混合成的预聚合物；

2）固定，点样完成后，将玻片置于潮湿的盛有TEMED 的容器中，在真空状态下当TEMED挥发到玻片表面时，丙烯基团之间会发生共聚合反应，从而将丙烯酰胺修饰的PCR产物固定于用丙烯基团修饰的玻片上得到所述的DNA微列阵芯片。