CN101074950A

CN101074950A - 凝胶芯片检测方法与检测装置

Info

Publication number: CN101074950A
Application number: CN 200710024651
Authority: CN
Inventors: 陆祖宏; 潘志强; 李燕强; 肖鹏峰
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2007-06-26
Filing date: 2007-06-26
Publication date: 2007-11-21
Anticipated expiration: 2027-06-26
Also published as: CN101074950B

Abstract

一种凝胶芯片检测方法，检测步骤为：将与探针杂交后的凝胶芯片用去离子水清洗；去离子水清洗后的凝胶芯片插入芯片卡槽内，再将卡槽放入芯片清洗容器中进行超声处理，清洗1～10片凝胶芯片时，超声波发生器的功率设置为20W，此后每10片为一个数量级，功率相应增加10瓦，超声时间为5～30秒；将凝胶芯片取出用去离子水清洗后，氮气吹干进行芯片扫描。一种凝胶芯片检测装置，该装置由超声波发生器、功率调节器和芯片清洗容器组成，其中芯片清洗容器设于超声波发生器内，且芯片清洗容器内设有芯片卡槽。该处理方法具有很高的稳定性与重复性。

Description

凝胶芯片检测方法与检测装置

一、技术领域

本发明属于生物芯片检测领域，特别涉及一种提高凝胶芯片检测灵敏度的方法与装置。

二、背景技术

现有技术：在过去的十年里，芯片技术已经在生命科学研究中起到了举足轻重的作用，也带来了深广的影响。随着学科交叉的不断深入，生物芯片已成为国际上的研究前沿和热点。特别是具有三维结构的凝胶芯片对核酸有很强的的固定能力，像聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶已经被用于三维凝胶芯片的制备之中。作为能够在医疗诊断上应用的芯片，如何提高其检测灵敏度是获得高质量芯片数据的关键，而影响这两个指标的重要因素，一是如何将凝胶芯片表面未杂交的探针有效去除，它是提高芯片灵敏性的关键因素之一；二是如何有效的去除杂交后芯片表面结合的杂质，特别是牢固吸附在凝胶芯片的不带电荷杂质，这是提高芯片的信噪比，增强芯片检测的灵敏性的又一关键因素。目前，提高芯片检测芯片灵敏性的的方法，通常是在芯片进行点样前，对芯片进行各种处理，如用硅烷化试剂进行疏水或亲水化处理，以减小玻片在反应过程中对容易结合杂质的吸附，但它不能从根本上解决杂交后非配对探针或杂质的污染问题；另一种措施是在芯片杂交后进行处理，如采用0.1×SSC-0.1％SDS溶液进行，或采用电泳方法将未结合探针或带电荷的杂质去除等，这些方法虽然对提高芯片灵敏性都能起到一定的效果，但是第一种方法对于非特异结合在检测目标上的探针的去除很难，而第二种方法虽然对非特异结合的探针和带电荷的杂质去除有一定的效果，但是仍有很大一部分非带电荷杂质很难去除。

鉴于芯片在临床与科研上已被广泛应用，但是芯片特别是凝胶芯片仍然具有灵敏性不高的限制，因此，急需一种简单高效提高灵敏性的处理方法与装置。

三、发明内容

本发明针对上述技术问题，提供一种检测灵敏度高，可以有效去除检测目标上的非特异结合探针和非带电荷杂质的检测方法和检测装置。

本发明的技术解决方案为：一种凝胶芯片检测方法，检测步骤为：将与探针杂交后的凝胶芯片用去离子水清洗；去离子水清洗后的凝胶芯片插入芯片卡槽内，再将卡槽放入芯片清洗容器中进行超声处理，清洗1～10片凝胶芯片时，超声波发生器的功率设置为20W，此后每10片为一个数量级，功率相应增加10瓦，超声时间为5～30秒；将凝胶芯片取出用去离子水清洗后，氮气吹干进行芯片扫描。一种凝胶芯片检测装置，该装置由超声波发生器、功率调节器和芯片清洗容器组成，其中芯片清洗容器设于超声波发生器内，且芯片清洗容器内设有芯片卡槽。

芯片构成材料可以是由玻璃、石英、尼龙膜、陶瓷、金属等构成；芯片功能上可以包括基因芯片、肽芯片、蛋白芯片、组织芯片等。从芯片表面的修饰特征上可以是有三维结构的聚丙烯酰胺凝胶芯片、聚甲烯酰胺凝胶芯片、琼脂糖凝胶芯片，也可以是有二维结构的醛基片、羧基片、氨基片等。杂交探针可以是各种形式的DNA荧光探针或非荧光探针，也可以是RNA荧光探针或非荧光探针，也可以是PNA肽核酸荧光探针或非荧光探针，也可以带有标记的蛋白抗原或抗体。芯片上的杂质是指芯片杂交或反应后，除了芯片片及和芯片相耦联的目标物的载体、检测目标以及检测标记以外的任何物质，尤其是不带电荷的非特异吸附物。错配杂交的探针是指DNA探针或RNA探针与目标检测物有一个或两个或更多个碱基的错配，它可能是已经同目标检测物部分杂交或未杂交的游离状态的探针。它也可以是错误结合的抗原或抗体。

本发明产生的有益效果为：提供了一种新颖的杂交后芯片特别是凝胶芯片的处理方法与装置。本发明与现行的芯片处理技术相比具有以下优点：

1.装置新颖。该装置由一个超声发生装置，一个超声大小调节器和数字显示器，以及一个内置芯片卡槽的清洗容器组成。

2.简单快速，对于杂交后的芯片的整个超声过程仅需要5～30秒时间。

3.清洗功率调节方便，超声时的功率大小由清洗芯片的多少通过超声大小调节器来调节，清洗1～10片设置为20W，10～20片设为30W，依次类推190～200片设置为210W。

4.对核酸或探针无损伤。对于固定的核酸和杂交的探针无损伤，对于荧光探针无淬灭，低功率的超声波振动所产生的能量不会对检测核酸或探针造成损伤。

5.能提高信号检测灵敏性。本方法不仅能够有效去除错配的杂交探针或未杂交的探针，而且能够将芯片上的杂质特别是不带电荷的杂质有效去除，因而芯片背景得到极大的降低。

6.该处理方法具有具有很高的稳定性与重复性。

四、附图说明

图1为凝胶芯片检测装置示意图，图中(1)超声发生器；(2)数字显示面板；(3)超声功率调节器；(4)芯片清洗容器；(5)芯片卡槽；

图2为凝胶芯片检测装置中芯片清洗容器俯视图，图中(6)芯片内卡槽区一；(7)芯片内卡槽区二；(8)放置芯片的内卡槽；

图3为芯片杂交后通过常用的摇床清洗后的表面效果，图中由上而下，各排依次是：空白对照、信号1、信号2、信号3、空白对照；

图4为芯片通过本技术方案进行清洗后的表面效果图，图中由上而下，各排依次是：空白对照、信号1、信号2、信号3、空白对照。

五、具体实施方式

实施例1：利用丙烯酰胺凝胶芯片同时固定的1000个人的PCR产物，对同一SNP位点进行分型

5’GCTTTCTTGTTTGTTTTCCCTCCTTTACCAY(C/T)CCAGAAATCCATTTGAGTCTGCTCCTTGT-3‘序列中的Y(C/T)，是一个与高血稠脂肪蛋白基因突变(Homo sapiens dystrobrevin binding protein 1，DTNBP1)有关的一个基因位点。通过一对引物(反向引物具有丙烯酰胺修饰)用PCR分别扩增出1000个人的含有该位点一段基因序列，直接将5～10ulPCR产物或纯化过的产物与丙烯酰胺(丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺单体)、过硫酸铵、丙三醇和水混合成预聚合物，并将其转移到384孔板中，通过芯片点样仪将1000个样点在同一张玻片上点成微阵列。然后将该芯片置于80℃烘烤30秒后取出，将芯片放在0.1M的NaOH溶液中，用超声波超声处理10秒，从而将固定在凝胶上的双链DNA变性，制备出具有单链DNA的凝胶微阵列芯片。最后将该微阵列与一对荧光探针(5‘-TTTACCACCCAGAA-3‘和5‘-TTTACCATCCAGAA-3‘)杂交，由于正配的探针与序列可以杂交而错配得不可以或杂交极少。杂交后将杂交芯片用1×TBE冲洗1遍后，再置于1×TBE缓冲液中进行超声5秒，然后将芯片用去离子水冲洗一遍即可进行芯片扫描，通过扫描就可以对800人的SNP情况进行准确分型。

实施例2：通过该方法对基因测序中的凝胶芯片进行快速处理

将一个通用的PCR反向引物PR用丙烯酰胺修饰，而另一个正向的引物PF则不修饰。将上述反向引物与与丙烯酰胺(丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺单体)、过硫酸铵、丙三醇和水混合成预聚合物，点于芯片上。然后将该芯片放在盛TEMED激发剂的器皿中进行减压真空抽虑，由于TEMED挥发到凝胶表面，从而激发过硫酸铵释放自由基而将预聚物凝胶，从而制备出含有扩增引物的凝胶微阵列芯片。将一个较大的基因组DNA用超声波打断后，然后在每个片段的两端分别连接上的相同的通用连接子(与固定在凝胶中的反向引物互补)，将其用PCR溶液(含有Taq酶，缓冲液、PF和dNTP)流过凝胶微阵列，使每一个凝胶微阵列平均分配一个DNA片段或没有。这样便得到了每个凝胶微阵列只包含有单克隆的DNA片段。然后用石蜡油将其密封进行在片PCR扩增完成后，将芯片放在0.1M的NaOH溶液中，用超声波超声处理10秒，从而将固定在凝胶上的双链DNA变性，制备出具有单链DNA的凝胶微阵列芯片。用该凝胶芯片每进行一次单碱基延伸后，先将该凝胶芯片用1×TBE冲洗1遍，再置于1×TBE缓冲液中进行超声5秒，然后将芯片用去离子水冲洗一遍即可进行芯片扫描，从而得到每个微阵列上该次碱基延伸的情况，通过反复延伸、超声去杂就可以得到凝胶芯片上大量微阵列上核酸的碱基序列组成信息。

实施例3：利用该装置与方法对琼脂糖蛋白芯片对650个人进行抗原抗体检测过程中芯片处理

先将琼脂糖溶化，均匀铺于玻片表面，凝固后用高碘酸钠处理，并清洗干净。从650个人的尿样中离心后沉淀沙眼衣原体蛋白，然后将其通过PBS缓冲液将其稀释，并用点样仪点于芯片上，并37℃静置30分钟，将芯片置于超声发生器中超声5s，并用PBS冲洗干净。再把带有链酶亲和素的抗体均匀铺于芯片表面37℃反应30分钟，超声5s并用PBS冲洗一遍，然后将带有生物素标记的荧光Cy3同已标记的亲和素抗体的抗原28℃抚育1小时。最后再将芯片置于超声发生器中超声5s，并用PBS冲洗干净，最后进行扫描来检测荧光强度。通过荧光强度的有无及强弱来判断这650个人是否已被沙眼衣原体感染及感染程度如何。

实施例4：对800个人P16内含子I区的CpG岛进行甲基化检测过程的凝胶芯片进行快速处理

直接把800个人的血样适当稀释后为扩增模板，用一个正向引物和一个具有丙烯酰胺基团修饰的反向引物进行PCR扩增。扩增后将PCR产物用四倍的无水乙醇沉淀1小时，离心后去上清，将沉淀配成5％的丙烯酰胺预聚物，其中不含有TEMED，将这些样品预聚物移入384孔板，用芯片点样仪点样。将其放在盛有TEMED的真空抽滤器中抽滤将凝胶芯片聚合。聚合后将其用NaOH处理变性，并用该装置超声5秒后用干净的去离子水清洗一遍。再用亚硫酸钠处理固定的单链DNA，再用该超声装置超声5秒后，用去离子水清洗一遍。最后同检测探针杂交2小时。然后再将芯片超声5秒后，用去离子水清洗，氮气吹干后扫描图像，对800个人的CpG岛进行甲基化进行定性检测。

实施例5

步骤同实施例4，芯片数为200，功率为210w，超声时间设定为30秒。

实施例6

步骤同实施例4，芯片数为5，功率为20w，超声时间设定为15秒。

实施例7：

一种凝胶芯片检测装置，该装置由超声波发生器1、超声功率调节器3和芯片清洗容器4组成，其中芯片清洗容器4设于超声波发生器1内，且芯片清洗容器内设有芯片卡槽区一6和芯片内卡槽区二7，芯片卡槽区内设有多排放置芯片的内卡槽8，数字显示面板2和超声功率调节器3设在超声波发生器外壳上。超声功率靠调节器调节，所设定的功率显示在数字面板上。

实施例8：

步骤同实施例1，与之不同之处在于，实例1中的PCR产物中的引物通过肽PNA来合成的，且反向引物是通过丙烯酰胺修饰的，PCR时是将四种脱氧核苷酸用肽核酸来代替进行扩增，所以最后制备出的芯片为肽芯片。

实施例9：

将实施例1中的PCR引物的修饰是用氨基修饰，PCR产物则是固定在醛基片上，其它步骤均同实施例1。

实施例10：

将实施例1中的PCR引物的修饰是用羧基修饰，PCR产物则是固定在胺基片上，其它步骤均同实施例1。

实施例11：

将实施例1中的PCR产物用甲酰胺和过硫酸铵混合后将PCR产物固定，该凝胶芯片为聚甲酰胺凝胶芯片，其它步骤均同实施例1。

实施例12：

步骤同实施例1，与之不同之处在于用来杂交的探针是带有荧光标记的PNA肽核酸探针。

实施例13：

凝胶芯片检测方法，检测步骤为：将带有丙烯酰胺修饰的不同的PCR产物同丙烯酰胺、过硫酸铵以及水相混合，用点样仪将讲它们点在玻片上形成微阵列，待凝胶微阵列凝固后，将该芯片用NaOH变性处理2分钟，去离子水清洗完毕后，与2.5μM的检测探针杂交2小时；然后将凝胶芯片用去离子水清洗；去离子水清洗后的凝胶芯片插入芯片卡槽内，再将卡槽放入芯片清洗容器中进行超声处理，清洗1～10片凝胶芯片时，超声波发生器的功率设置为20W，此后每10片为一个数量级，功率相应增加10瓦，超声时间为5～30秒；将凝胶芯片取出用去离子水清洗后，氮气吹干进行芯片扫描。

实施例14：

图3和图4是丙烯酰胺凝胶DNA芯片经过不同处理后进行扫描的效果图。这两个凝胶芯片从凝胶微阵列的点样、单链DNA的制备、探针的杂交三个过程都是平行制备的过程，唯一的区别则在于芯片杂交后的处理过程不同。图3是杂交后将芯片用去离子水清洗一遍后，将该芯片放置在摇床上盛有1×TBE的缓冲液中的平面皿中震荡清洗5分钟后，再将该芯片用去离子水冲洗一遍再用氮气吹干，进行芯片扫描的效果图，该图中的信号电平均强度只有15000，背景噪音平均强度则达到3500，所以信噪比较差只有4.3∶1左右。从图中空白对照可以看出空白胶中吸附的非特异性杂质经过摇床清洗很难去除，以致于产生的背景噪音很高。到图4则是杂交后将芯片用去离子水清洗一遍后，将该芯片放置在该发明装置中的盛有1×TBE的缓冲液芯片容器中超声8秒后，再将该芯片用去离子水冲洗一遍用氮气吹干后，进行芯片扫描的效果图，该图中的信号电平均强度只有25000，背景噪音平均强度则只有500左右，所以信噪比很高。从图中空白对照可以看出空白胶中吸附的非特异性杂质经过该发明的方法很容易去除，所以产生的背景噪音也很高，可以达到50∶1左右。对于基因的单核苷酸的多态性的分型来说很容易区别开来。图3和图4中的信号1为GBGRA2基因的252944A/A，信号2为252944A/G，信号3为GBGRA2基因的252944G/G。

Claims

1.一种凝胶芯片检测方法，其特征在于检测步骤为：

a.将带有丙烯酰胺修饰的不同的PCR产物同丙烯酰胺、过硫酸铵以及水相混合，用点样仪将讲它们点在玻片上形成微阵列，待凝胶微阵列凝固后，将该芯片用NaOH变性处理，去离子水清洗完毕后，与检测探针杂交；

b.然后将凝胶芯片用去离子水清洗；

c.去离子水清洗后的凝胶芯片插入芯片卡槽内，再将卡槽放入芯片清洗容器中进行超声处理，清洗1～10片凝胶芯片时，超声波发生器的功率设置为20W，此后每10片为一个数量级，功率相应增加10瓦，超声时间为5～30秒；

d.将凝胶芯片取出用去离子水清洗后，氮气吹干进行芯片扫描。

2.一种在权力要求1中c步骤运用的凝胶芯片检测装置，其特征在于该装置由超声波发生器(1)、超声功率调节器(3)和芯片清洗容器(4)组成，其中芯片清洗容器(4)设于超声波发生器内(1)，且芯片清洗容器(4)内设有芯片卡槽(5)。

3.根据权利要求1所述的凝胶芯片检测方法，其特征在于所述的凝胶芯片为：基因芯片、肽芯片、蛋白芯片。

4.根据权利要求1所述的凝胶芯片检测方法，其特征在于所述的凝胶芯片为：有三维结构的聚丙烯酰胺凝胶芯片、聚甲烯酰胺凝胶芯片、琼脂糖凝胶芯片或有二维结构的醛基片、羧基片、氨基片。

5.根据权利要求1所述的凝胶芯片检测方法，其特征在于所述探针为DNA荧光探针或非荧光探针，RNA荧光探针或非荧光探针，PNA荧光探针或非荧光探针，带有标记的蛋白抗原或抗体。