CN101092648A - 男性y染色体微缺失基因检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
男性y染色体微缺失基因检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因缺失检测领域,尤其涉及一种男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括:特异性扩增Y染色体AZF的30条引物,和特异性扩增男性特有Sry基因的2条引物。采用本发明所述试剂盒对男性Y染色体微缺失基因进行检测,具有高效、低成本、结果稳定等优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因缺失检测领域,尤其涉及一种男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒及检测方法。
背景技术
全世界约有15%的夫妇被不育所困扰,其中男性因素约占一半。在排除输精管梗阻、克氏症和其他泌尿生殖系统原因后,严重少精症和无精子症最有可能的原因就是精子发生基因的异常。关于精子发生基因,特别关注Y染色体长臂11间隔。Y染色体构成人类基因组的2%, 由短臂(Yp)和长臂(Yq)组成。无精子症和严重少精子症的细胞遗传学和分子生物学研究也证实Y染色体上存在着无精子因子(azoospermia factor,AZF),它有四个清楚的、非重叠的亚区,即AZFa、AZFb、AZFc和AZFd区。这些区域的基因微缺失可引起精子发生障碍,继而引起男性不育。因此Y染色体微缺失现在被认为是男性特发性不育最重要的遗传学病因。随着辅助生殖技术的进展,卵细胞胞浆内精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技术被认为是男性不育症治疗上的一次革命。然而该技术可能将携带染色体畸形、缺失或基因突变的精子注入到卵胞浆内,使卵子受精,从而将上述各种遗传缺陷传给下一代。因此,为了确定是否需要治疗,临床医生建议所以精子浓度<5×106/mL的男性都要进行Y染色体微缺失的分子诊断。
AZF的片段较小,常规核型分析不易发现其缺失,故一般通过对STSs进行PCR扩增来获取Y染色体微缺失信息。常用的技术有:
1.多重PCR电泳:多重PCR是目前Y染色体微缺失检测应用得最广泛的方法,具有简单、快速、灵敏、特异、经济和高通量的特点,是检测AZF的理想方法,但与常规PCR相比有更高的技术要求,且缺少标准筛查方案,各实验室结果不尽相同。
2.探针技术:用特异探针进行Southern blot或Northern blot是研究AZF微缺失与男性不育关系的有效方法,但方法过于繁琐,难以推广,多用于实验室研究。
3.其他:(1)基因芯片技术:个别报道用基因芯片技术同时对多个热点基因进行研究,有助于筛选和研究无精子症相关基因,详尽了解无精子症的发病机制。(2)毛细管电泳技术:具有高通量、高灵敏度、快速及进样量少的优点,但需要专门的毛细管电泳仪。
中国专利200410043918.0公开了特异性扩增Y染色体上微缺失STS中的sY87和sY143的两对引物序列,但作为Y染色体微缺失检测方法,不符合欧洲生殖学会检测至少6个STS(sY254、sY255、sY84、sY86、sY127、sY134)的最低要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒,该试剂盒能稳定、高效地对男性Y染色体微缺失基因进行检测。
本发明的另一个目的在于提供一种男性Y染色体微缺失基因检测方法,该方法建立在多重PCR和凝胶电泳基础上,提高了多重PCR的稳定性和均一性。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒,其特征在于所述试剂盒包括:
特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY82序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示;
特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY84序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示;
特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY86序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示;
特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY124序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示;
特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY127序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示;
特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY128序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示;
特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY133序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示;
特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY134序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示;
特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY143序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;
特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY239序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示;
特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY242序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示;
特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY254序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;
特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY255序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示;
特异性扩增Y染色体AZFd亚区sY145序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示;
特异性扩增Y染色体AZFd亚区sY152序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示;
和特异性扩增男性特有Sry基因的引物,其碱基序列如SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:32所示;
上述所有序列可由其碱基互补序列替换。
所述试剂盒还包括PCR扩增所需试剂:MgCl2、甜菜碱、热启动酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP和PCR反应缓冲液。
所述MgCl2反应终浓度为1.5mM。
所述甜菜碱反应终浓度为1.3M。
所述dATP反应终浓度为200μM、dCTP反应终浓度为200μM、dGTP反应终浓度为200μM、dUTP反应终浓度为400μM。
一种男性Y染色体微缺失基因检测方法,包括以下步骤:
1)从抗凝全血中提取人基因组DNA;
2)以步骤1)所得DNA为模板,利用权利要求1所述特异性扩增Y染色体AZF的引物进行PCR扩增;
3)PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析。
所述PCR扩增分四管进行,第一管包括10条引物,其碱基序列如SEQ ID NO:1-8和SEQ ID NO:31-32所示;第二管包括8条引物,其碱基序列如SEQ ID NO:9-14和SEQ ID NO:31-32所示;第三管包括10条引物,其碱基序列如SEQ ID NO:15-22和SEQ ID NO:31-32所示;第四管包括10条引物,其碱基序列如SEQ ID NO:23-30和SEQ ID NO:31-32所示。
所述PCR反应体系中含有甜菜碱,其反应终浓度为1.3M。
所述PCR扩增条件为:
本发明设计了15对PCR引物分别特异地扩增AZF STSs序列,并同时设计1对内控PCR引物,扩增男性特有的SRY(sex-determiningregion of Y-chromesome)基因,以指示PCR正常进行。为了解决多重PCR扩增不稳定、不均一的问题,本发明将该15个STSs分属到4个PCR反应当中,并都添加SRY PCR引物,在同一条件下进行4个独立的扩增反应,最后再一起进行电泳分析。通过反复实验,调整各引物对浓度,使用热启动酶,并在PCR反应液里添加甜菜碱等增效剂,最终实现稳定和均一地扩增。本发明PCR产物用普通琼脂糖凝胶电泳来进行检测,因此设计的各引物对扩增产物片段大小必须能够被肉眼识别。本专利将15个STSs分属4个PCR反应,在每一个反应中各PCR产物片段大小必须相差至少30bp,所有片段大小不超过400bp(不包括SRY引物扩增产物,SRY扩增片段为470bp)。各引物对Tm值相差不超过2℃。因为采用了热启动酶和UNG酶(防污染)所以在PCR程序上也作了相应的变化。
采用本发明所述试剂盒对男性Y染色体微缺失基因进行检测,具有高效、低成本、结果稳定等优点。
附图说明
图1是正常男性Y染色体微缺失基因检测结果。
图2是非正常男性Y染色体微缺失基因检测结果。
附图标号说明:
I、第一管PCR;II、第二管PCR;III、第三管PCR;IV、第四管PCR;
1,5,9,13:正常对照;
2,6,10,14:样品1;
3,7,11,15:样品2;
4,8,12,16:阴性对照。
具体实施方式
实施例1
一、材料
1.仪器:PCR仪、离心机
2.引物设计:本发明设计了15对PCR引物分别特异地扩增AZFSTSs序列,并同时设计1对内控PCR引物,扩增男性特有的Sry(sex-determining region of Y-chromesome)基因,以指示PCR正常进行。
表1 引物列表
引物名称 | 序号 | 扩增对象 |
sY254-FsY254-R | SEQ ID NO:1SEQ ID NO:2 | 特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY254序列 |
Sy143-FsY143-R | SEQ ID NO:3SEQ ID NO:4 | 特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY143序列 |
sY242-FsY242-R | SEQ ID NO:5SEQ ID NO:6 | 特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY242序列 |
sY255-FsY255-R | SEQ ID NO:7SEQ ID NO:8 | 特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY255序列 |
sY84-FsY84-R | SEQ ID NO:9SEQ ID NO:10 | 特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY84序列 |
sY239-FsY239-R | SEQ ID NO:11SEQ ID NO:12 | 特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY239序列 |
sY152-FsY152-R | SEQ ID NO:13SEQ ID NO:14 | 特异性扩增Y染色体AZFd亚区sY152序列 |
sY86-FsY86-R | SEQ ID NO:15SEQ ID NO:16 | 特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY86序列 |
sY127-FsY127-R | SEQ ID NO:17SEQ ID NO:18 | 特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY127序列 |
sY145-FsY145-R | SEQ ID NO:19SEQ ID NO:20 | 特异性扩增Y染色体AZFd亚区sY145序列 |
sY124-FsY124-R | SEQ ID NO:21SEQ ID NO:22 | 特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY124序列 |
sY134-FsY134-R | SEQ ID NO:23SEQ ID NO:24 | 特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY134序列 |
sY82-FsY82-R | SEQ ID NO:25SEQ ID NO:26 | 特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY82序列 |
sY128-FsY128-R | SEQ ID NO:27SEQ ID NO:28 | 特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY128序列 |
sY133-FsY133-R | SEQ ID NO:29SEQ ID NO:30 | 特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY133序列 |
SRY-FSRY-R | SEQ ID NO:31SEQ ID NO:32 | 特异性扩增男性特有Sry基因 |
3、试剂:
1 XPCR buffer:50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃)和0.1%TritonX-100
MgCl2、甜菜碱、热启动酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP
二、方法
1、基因组DNA的获取
用常规分子生物学方法或市售试剂盒从抗凝全血中提取人基因组DNA。分别提取三名男子基因组DNA和一名女子基因组DNA。
2、PCR扩增
取PCR反应管,在管壁上做好标记,而后分别加入已提取的样本gDNA 4μL(含基因组DNA200-500ng)、引物及PCR反应试剂,最后加入无菌水至25μl反应总体系。该过程需在冰上操作,每个样品同时做4个PCR扩增进行检测,且每次检测都应同时设立一组阳性对照(正常男性基因组DNA)及阴性对照(女性基因组DNA),PCR反应体系见表2。
表2 PCR反应体系
第一管PCR | 第二管PCR | 第三管PCR | 第四管PCR | ||||
试剂 | 终浓度 | 试剂 | 终浓度 | 试剂 | 终浓度 | 试剂 | 终浓度 |
PCRbuffer | 1X | PCRbuffer | 1X | PCRbuffer | 1X | PCRbuffer | 1X |
MgCl2 | 1.5mM | MgCl2 | 1.5mM | MgCl2 | 1.5mM | MgCl2 | 1.5mM |
甜菜碱 | 1.3M | 甜菜碱 | 1.3M | 甜菜碱 | 1.3M | 甜菜碱 | 1.3M |
热启动酶 | 2.5U | 热启动酶 | 2.5U | 热启动酶 | 2.5U | 热启动酶 | 2.5U |
UNG酶 | 0.3U | UNG酶 | 0.3U | UNG酶 | 0.3U | UNG酶 | 0.3U |
dATP | 200uM | dATP | 200uM | dATP | 200uM | dATP | 200uM |
dCTP | 200uM | dCTP | 200uM | dCTP | 200uM | dCTP | 200uM |
dGTP | 200uM | dGTP | 200uM | dGTP | 200uM | dGTP | 200uM |
dUTP | 400uM | dUTP | 400uM | dUTP | 400uM | dUTP | 400uM |
sY254-F | 0.4uM | sY84-F | 0.3uM | sY86-F | 0.2uM | sY134-F | 0.4uM |
sY254-R | 0.4uM | sY84-R | 0.3uM | sY86-R | 0.2uM | sY134-R | 0.4uM |
sY143-F | 0.3uM | sY239-F | 0.4uM | sY127-F | 0.4uM | sY82-F | 0.3uM |
sY143-R | 0.3uM | sY239-R | 0.4uM | sY127-R | 0.4uM | sY82-R | 0.3uM |
sY242-F | 0.1uM | sY152-F | 0.3uM | sY145-F | 0.3uM | sY128-F | 0.3uM |
sY242-R | 0.1uM | sY152-F | 0.3uM | sY145-R | 0.3uM | sY128-R | 0.3uM |
sY255-F | 0.2uM | SRY-F | 0.2uM | sY124-F | 0.4uM | sY133-F | 0.2uM |
sY255-F | 0.2uM | SRY-F | 0.2uM | sY124-R | 0.4uM | sY133-R | 0.2uM |
SRY-F | 0.8uM | SRY-F | 0.2uM | SRY-F | 0.2uM | ||
SRY-R | 0.8uM | SRY-R | 0.2uM | SRY-R | 0.2uM | ||
模板DNA | 200-500ng | 模板DNA | 200-500ng | 模板DNA | 200-500ng | 模板DNA | 200-500ng |
PCR按以下条件进行扩增:
3、电泳检测
取10μL PCR产物加2μL 6×上样缓冲液,(10uLPCR产物是针对1mm×3mm上样孔,可根据上样孔的大小作适当调整)混和均匀后经2.0%琼脂糖电泳,先用电压8V/cm电泳约3分钟使DNA迁移出上样孔,降低电压至4v/cm至溴酚蓝迁移出2-3厘米,即可在紫外灯下观察结果,如条带不能充分区分,可继续电泳至能区分为止。凝胶质量对条带的区分十分关键,推荐使用Promega或Biowest等进口琼脂糖,大多数国产的琼脂糖无法获得理想效果,并建议使用凝胶成像系统。
三、结果分析
(1)阴性对照:以女性基因组DNA为模板的反应管内,应无任何特异性产物扩增
(2)阳性对照:以正常男性基因组DNA为模板的反应管内应扩出以下条带:
I | 片断大小(bp) | 位点 | II | 片断大小(bp) | 位点 | III | 片断大小(bp) | 位点 | IV | 片断大小(bp) | 位点 |
Sry | 470 | Sry | 470 | Sry | 470 | Sry | 470 | ||||
sY254 | 380 | C | sY84 | 326 | A | sY86 | 320 | A | sY134 | 301 | B |
sY143 | 310 | B | sY239 | 200 | C | sY127 | 270 | B | sY82 | 264 | A |
sY242 | 230 | C | sY152 | 125 | D | sY145 | 140 | D | sY128 | 228 | B |
sY255 | 126 | C | sY124 | 109 | B | sY133 | 177 | B |
其中男性样品都应扩出内控带。若待测男性样品中无此带,说明其基因组DNA未抽提成功,应重新抽提DNA。
从图1可以看出,该样品扩增出了以正常男性基因组DNA为模板应该扩增出的全部条带,说明该样品正常,该男子Y染色体无微基因缺失。
从图2可以看出,样品1未扩增出sY84序列,样品2未扩增出sY254、sY242、sY239、sY152和sY128序列,说明样品1:部分A座位缺失,样品2:C座位和部分B、D座位联合缺失。
Y染色体微缺失的检测应用在医学领域具有如下功能:
(1)通过对无精子症或少精子症患者进行缺失筛查,指导临床诊断及治疗措施的选择,从而避免不必要的药物及手术治疗。
(2)单精子胞浆内注射技术(int ra2cytoplasmic sperminjection,ICSI)使许多少精症甚至是无精症患者可以生育下一代,但这种技术也可能将生殖缺陷人为地传给后代,导致子代男性生殖力下降或不育,通过术前筛查可以避免这种传递并指导ICSI后代的生育。
SEQUENCE LISTING
<110>亚能生物技术(深圳)有限公司
<120>男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒及检测方法
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<170>PatentIn version 3.3
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gcacgtgcag ccatagttga g 21
Claims (8)
1.男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒,其特征在于所述试剂盒包括:
特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY82序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示;
特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY84序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示;
特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY86序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示;
特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY124序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示;
特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY127序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示;
特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY128序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:2 7和SEQ ID NO:28所示;
特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY133序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示;
特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY134序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示;
特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY143序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;
特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY239序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示;
特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY242序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示;
特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY254序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;
特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY255序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示;
特异性扩增Y染色体AZFd亚区sY145序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示;
特异性扩增Y染色体AZFd亚区sY152序列的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示;
和特异性扩增男性特有Sry基因的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示;
上述所有序列可由其碱基互补序列替换。
2.根据权利要求1所述的男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒,其特征在于所述试剂盒还包括PCR扩增所需试剂:MgCl2、甜菜碱、热启动酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP和PCR反应缓冲液。
3.根据权利要求2所述的男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒,其特征在于所述MgCl2反应终浓度为1.5mM。
4.根据权利要求2所述的男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒,其特征在于所述甜菜碱反应终浓度为1.3M。
5.根据权利要求2所述的男性Y染色体微缺失基因检测试剂盒,其特征在于所述dATP反应终浓度为200μM、dCTP反应终浓度为200μM、dGTP反应终浓度为200μM、dUTP反应终浓度为400μM。
6.男性Y染色体微缺失基因检测方法,包括以下步骤:
1)从抗凝全血中提取人基因组DNA;
2)以步骤1)所得DNA为模板,利用权利要求1所述特异性扩增Y染色体AZF的引物进行PCR扩增;
3)PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析。
7.根据权利要求5所述的男性Y染色体微缺失基因检测方法,其特征在于所述PCR扩增分四管进行,第一管包括10条引物,其碱基序列如SEQ ID NO:1-8和SEQ ID NO:31-32所示;第二管包括8条引物,其碱基序列如SEQ ID NO:9-14和SEQ ID NO:31-32所示;第三管包括10条引物,其碱基序列如SEQ ID NO:15-22和SEQ ID NO:31-32所示;第四管包括10条引物,其碱基序列如SEQ ID NO:23-30和SEQ ID NO:31-32所示。
8.根据权利要求5所述的男性Y染色体微缺失基因检测方法,其特征在于所述PCR反应体系中含有甜菜碱,其反应终浓度为1.3M。
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